Abstract
सेल सेल आसंजन बहुकोशिकीय जीवन के लिए मौलिक है और कोशिका की सतह प्रोटीन की एक विविध सरणी द्वारा मध्यस्थता है. हालांकि, इन प्रोटीनों से कई के लिए चिपकने वाला बातचीत खराब समझ रहे हैं. यहाँ हम ख्यात homophilic सेल आसंजन अणुओं के चिपकने वाला गुण निस्र्पक के लिए एक सरल, तेजी से विधि प्रस्तुत करते हैं. संवर्धित HEK293 कोशिकाओं के डीएनए प्लाज्मिड एक कोशिका की सतह प्रोटीन की एक स्रावित, मिलान टैग ectodomain एन्कोडिंग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. मिलान टैग के लिए विशिष्ट functionalized मोती का उपयोग, घुलनशील, स्रावित संलयन प्रोटीन संस्कृति के माध्यम से कब्जा कर लिया है. लिपटे मोतियों तो homophilic आसंजन के लिए परीक्षण करने के लिए assays छँटाई मनका एकत्रीकरण assays में या फ्लोरोसेंट मनका में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है. अगर वांछित, उत्परिवर्तजनन तो आसंजन के लिए आवश्यक विशिष्ट एमिनो एसिड या डोमेन को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख स्थिर सेल लाइनों के उत्पादन की आवश्यकता नहीं है, व्यक्त प्रोटीन की ही छोटी राशि की आवश्यकता है, और ACCO किया जा सकता है4 दिनों में mplished.
Introduction
सेल सेल आसंजन बहुकोशिकीय जीव के विकास और अखंडता के लिए आवश्यक है और कोशिका की सतह अणुओं की एक विविध सरणी द्वारा मध्यस्थता है. कई खोज की जा रह है, हालांकि इन आसंजन अणुओं में से कई की पहचान और लक्षण वर्णन किया गया है. कई तरीकों ऐसे परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी और सतह बल स्पेक्ट्रोस्कोपी 9-12 के रूप में सेल छँटाई assays, सेल एकत्रीकरण assays 1-8 और biophysical तरीकों, सहित सेल आसंजन अणुओं के गुणों (cams), जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है.
यहां तक कि सेल लाइनों का उपयोग कर इन विट्रो प्रणालियों में सरलीकृत की जटिलता यह मुश्किल एक ख्यात सीएएम के चिपकने वाला गुण निर्धारित करने के लिए बनाता है. आमतौर पर, एक अणु एक गैर चिपकने वाला सेल लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट जब यह सेल एकत्रीकरण लाती है तो एक सीएएम माना जाता है. हालांकि, यह इस चिपकने वाला गतिविधि का प्रत्यक्ष प्रमाण नहीं है कि स्पष्ट है. उदाहरण के लिए, एक की कोशिका की सतह वितरण या स्थिरता की सुविधासीएएम भी बढ़ सेल एकत्रीकरण 1,13 नतीजा होगा. इसके अलावा, एक सच्चे सीएएम सेल लाइन कोशिका की सतह वितरण या स्थिरीकरण के लिए आवश्यक अन्य सह कारकों का अभाव अगर सेल एकत्रीकरण मध्यस्थता विफल हो सकता है.
इन उलझी कारकों से बचने के लिए विचार के आधार पर कर रहे हैं कि अधिक प्रत्यक्ष assays के नियोजित किया जा सकता चिपकने वाला बातचीत कोशिकी डोमेन का अभिन्न जैव रासायनिक संपत्ति होना चाहिए. मोती शुरू में एनजी कैमरा 2 विशेषताएँ इस्तेमाल कर रहे थे, इन assays cadherin की मध्यस्थता आसंजन 12,14,15 की जांच के क्रम में विस्तारित किया गया है. सी cadherin ectodomain-एफसी fusions के संलयन का उपयोग, Gumbiner प्रयोगशाला कई cadherin दोहराता बातचीत 14 homophilic में योगदान कर दिखाया. ड्रोसोफिला से protocadherins 1,15-18 और Dscam isoforms की एक संख्या है, के रूप में तुलनीय मनका एकत्रीकरण assays, ई cadherin और एन cadherin आसंजन का प्रयोग भी, 12,15 विशेषता किया गया है
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Protocol
1 सेल तैयार (दिवस -2 0 तक)
- स्प्लिट HEK293 कोशिकाओं 1: - 80% मिला हुआ (2 - 3 दिन) और 0.05% trypsin EDTA समाधान का उपयोग कर 5 से 60 तक 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर विकास मीडिया में सेते हैं. हर हालत के लिए, 2 एक्स 100 मिमी बर्तन में संस्कृति कोशिकाओं.
2 सेल अभिकर्मक (दिन 1)
- ऐसे Lipofectamine के रूप में एक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग प्लाज्मिड एन्कोडिंग एफसी संलयन के साथ HEK293 कोशिकाओं Transfect. तुलनीय अभिकर्मक क्षमता में परिणाम है कि वैकल्पिक तरीकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं लौटें.
3 सेल प्रचार (2 दिन)
- 37 डिग्री सेल्सियस तक भ्रूण गोजातीय सीरम (-FBS) के बिना पहले से गरम ग्रोथ मीडिया.
- व्यंजन 10 मिलीलीटर ग्रोथ मीडिया -FBS साथ 2x कुल्ला, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर व्यंजन वापसी.
- 3 washes के एक कुल के लिए, 10 मिलीलीटर ग्रोथ मीडिया -FBS साथ संस्कृतियों व्यंजन एक बार और कुल्ला.
- Incuपीटा मीडिया का संग्रह से पहले FBS के बिना एक और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं.
4 मनका एकत्रीकरण (4 दिन)
- संस्कृति व्यंजन से मीडिया को इकट्ठा करने के लिए, सेलुलर मलबे गोली 5 मिनट के लिए 500 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और स्पिन के लिए व्यंजनों की एक जोड़ी से मीडिया स्थानांतरण.
- एक 30 मिलीलीटर सिरिंज और 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर एक केन्द्रापसारक फिल्टर में 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से फिल्टर मीडिया.
- संस्कृति केंद्रित मीडिया की मात्रा लगभग 500 μl (लगभग 15 मिनट) है जब तक 4000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर केन्द्रापसारक फिल्टर स्पिन. सभी संस्कृति मीडिया गयी और ध्यान केंद्रित किया गया है जब तक दोहराएँ.
- एक चुंबक पर बर्फ प्रत्येक नमूने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बंधन बफर ठंड, जगह की 1 एमएल प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों की 1.5 μl जोड़ें और बफर हटा दें. तुरंत प्रोटीन जी चुंबकीय मोती संस्कृति केंद्रित मीडिया जोड़ें.
- 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब घुमाएँ.
- Plएक चुंबक पर इक्का ट्यूब और मीडिया को दूर. जल्दी बर्फ ठंड के साथ दो बार बंधन बफर 1 मिलीलीटर मोती धो लें और फिर बंधन बफर 300 μl में मोती resuspend.
- स्प्लिट 2 ट्यूब, प्रत्येक ट्यूब में 150 μl में मोती resuspended, और उसके बाद क्रमशः, "कैल्शियम" और "कोई कैल्शियम" स्थितियों के लिए 200 मिमी 2 CaCl या 200 मिमी EDTA के 1.5 μl जोड़ें.
- एक अवसाद पर स्थानांतरण प्रत्येक हालत से 100 μl अच्छी तरह से स्लाइड और एक संचरित प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) का उपयोग micrographs इकट्ठा. प्रत्येक वांछित समय बिंदु पर एक प्रयोग के लिए देखने के 5 क्षेत्रों से छवियों को ले लीजिए.
5 डेटा विश्लेषण
- ImageJ, या तुलनीय छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, फ़ाइल लटकते मेनू से आयात / छवि अनुक्रम ... का उपयोग कर पांच छवि डेटासेट के खुले एक का उपयोग करना. ये एक छवि ढेर के रूप में खोला जाएगा.
- छवि / गुण ... संवाद बॉक्स में, मैं बदल1.0 पिक्सल और सेट पिक्सेल चौड़ाई और पिक्सेल ऊंचाई को दाना इकाइयों.
- छवि अधोगामी मीनू में समायोजित / थ्रेसहोल्ड ... आदेश का उपयोग द्विआधारी छवियों कन्वर्ट. मोती या मोती समुच्चय में योगदान पिक्सल है कि शामिल करने के लिए सीमा निर्धारित है, लेकिन उस पृष्ठभूमि और छोटे कणों को बाहर. ढेर सारे छवियों को लागू करें.
- सेट माप संवाद बॉक्स में, क्षेत्र और ढेर स्थिति बॉक्स की जाँच करें.
- अधोगामी मीनू विश्लेषण में ... कणों का विश्लेषण करें चलाएँ. यह उनके आकार (क्षेत्र) और वे पहचान की गई है जिसमें छवि सहित पहचान कणों की एक सूची उत्पन्न होगी.
- जो प्रयोग और प्रयोगात्मक हालत के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं.
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Representative Results
एक उदाहरण प्रयोग एफसी (NcadEC-एफसी) के लिए जुड़े हुए एन cadherin की ectodomain से कैल्शियम निर्भर मनका एकत्रीकरण से पता चलता है जो चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है. कैल्शियम के अभाव में, मोती कुल के लिए कम या कोई प्रवृत्ति दिखा रहे हैं और समय (चित्रा 1 ए, सी) के साथ कुल आकार में कोई वृद्धि हुई है. कैल्शियम की उपस्थिति में, मोती कुल आकार समय (चित्रा 1 बी, सी) में वृद्धि के साथ, NcadEC-एफसी शो मजबूत एकत्रीकरण के साथ लेपित. इस प्रयोग से पांच गैर अतिव्यापी क्षेत्रों से छवियों से मिलकर प्रत्येक उदाहरण के साथ, तीन बार दोहराया गया था. पिक्सेल क्षेत्र में कण आकार पांच क्षेत्रों में प्रत्येक कुल के लिए निर्धारित किया गया था. ये आंकड़े एक प्रयोग में प्रत्येक समय बिंदु के लिए औसत थे. तीन प्रयोगों से डेटा हर समय बिंदु (चित्रा -2) में साधन और माप के मानक त्रुटियों का निर्धारण करने के लिए औसतन थे.
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मनका एकत्रीकरण assays में स्रावित, मिलान टैग ectodomains की संख्या 1 का प्रयोग करें. एक संकेत अनुक्रम (एस), एक ectodomain है जो एक ठेठ, एकल पास transmembrane सेल आसंजन अणु (ऊपर) के संगठन दिखा रहा है (ए) योजनाबद्ध, एक transmembrane डोमेन (टी) और एक intracellular डोमेन (आईसीडी). Ectodomain, मानव आईजीजी (नीचे). (बी) संवर्धित कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट जब एफसी क्षेत्र से जुड़े हुए है transmembrane और intracellular डोमेन का अभाव है कि एक खंड के एक स्रावित प्रपत्र उत्पन्न करने के लिए, ectomain-एफसी संलयन व्यक्त की और में स्रावित होता है यह कब्जा कर लिया और एक प्रोटीन या प्रोटीन जी चुंबकीय मोती पर शुद्ध किया जा सकता है, जहां संस्कृति मध्यम,. एक प्रोटीन या प्रोटीन जी मोती पर काले हलकों के रूप में दिखाया जाता है. (सी) धोने के बाद, ectodomain-एफसी लेपित चुंबकीय मोती homophilic चिपकने वाला बातचीत का एक परीक्षण के रूप में, कुल के लिए अनुमति दी जाती है.ig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
2 मनका एकत्रीकरण परख चित्रा. (क) एन cadherin और ई cadherin के रूप में शास्त्रीय cadherins, कैल्शियम निर्भर, homophilic आसंजन मध्यस्थता. कैल्शियम के अभाव में, cadherins चिपकने वाला बातचीत में मध्यस्थता करने में विफल (कोई कैल्शियम और 2 मिमी EDTA गयी). यहाँ दिखाया एफसी (NcadEC-एफसी) के लिए जुड़े हुए zebrafish एन cadherin की ectodomain साथ लेपित प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों की एक छवि है. (बी) NcadEC-एफसी लिपटे मोतियों 2 मिमी CaCl की उपस्थिति में 1 घंटे के लिए कुल की अनुमति दी गई 2. एन cadherin ectodomains द्वारा Homophilic आसंजन बड़े मनका समुच्चय के गठन से स्पष्ट है. आसंजन की एक अर्द्ध मात्रात्मक उपाय के रूप में (सी), समुच्चय के आकार को मापा जा सकता है. यह पूरा करने के लिए एक विधि द्वारा कब्जा क्षेत्र को मापने के लिए हैप्रेषित प्रकाश छवियों में अलग समुच्चय. जैसा कि यहाँ दिखाया कुल क्षेत्र का मतलब आकार, समय के एक समारोह के रूप में साजिश रची जा सकता है, या उपस्थिति या कैल्शियम के अभाव में मतलब कुल क्षेत्रफल के अनुपात की गणना की जा सकती है. कैल्शियम (बंद हलकों) की उपस्थिति में NcadEC-एफसी लिपटे मोतियों का एकत्रीकरण और कैल्शियम के अभाव में (खुला हलकों) 1 घंटा के पाठ्यक्रम पर 15 मिनट के अंतराल पर निर्धारित किया गया था. इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा.
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Discussion
कोशिका आसंजन बहुकोशिकीय जीवन का एक अनिवार्य विशेषता है और कोशिका की सतह प्रोटीन की एक व्यापक सरणी द्वारा मध्यस्थता है. इनमें से विस्तृत चिपकने वाला गुण केवल एक अपेक्षाकृत छोटे से अनुपात के लिए समझ रहे हैं. यहाँ, हम एक सुविधाजनक मिलान टैग के लिए जुड़े हुए स्रावित ectodomains की homophilic चिपकने की क्षमता की जांच के लिए एक सरल, तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. इस दृष्टिकोण से महत्वपूर्ण लाभ के एक नंबर है. प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा 100 मिमी व्यंजन की क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है के रूप में पहले, स्थिर सेल लाइनों, 14,20 आवश्यकता नहीं है. जैसे, बिंदु या विलोपन म्यूटेंट - - प्रयास के बिना और पैदा करने और सेल लाइनों की बड़ी संख्या को बनाए रखने की कीमत इस निर्माणों की बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है. दूसरा, इन मनका assays के एक कम प्रणाली में ख्यात आसंजन अणुओं की जैव रासायनिक गुणों का प्रत्यक्ष परीक्षण कर रहे हैं. इसलिए, आसंजन सीधे प्रोटीन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता हैजांच के बजाय संभावित अप्रत्यक्ष प्रभाव के तहत. तीसरा, संभव सह कारकों के प्रभाव की जांच करने के लिए, कोशिकाओं ख्यात आसंजन अणु की secreted रूपों और अपने ख्यात सह कारक, एक अलग मिलान टैग के साथ प्रत्येक के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. यह उचित मिलान टैग की एक किस्म के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में इसके अलावा, इस दृष्टिकोण, लचीला है. उदाहरण के लिए, समान आकार के चुंबकीय मोती के एक प्रोटीन या जी (एफसी टैग) संयुग्मित हैं जो उपलब्ध हैं, streptavidin (strep द्वितीय टैग), glutathione (जीएसटी टैग), या नाखून या नी: NTA (उनकी टैग 6x). अंत में, फ्लोरोसेंट मोतियों की उपलब्धता आसान छँटाई assays homophilic विशिष्टता की जांच करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल अनुकूलित करने की अनुमति देता है. इस परिदृश्य, लाल और हरे रंग का फ्लोरोसेंट मोतियों में, प्रत्येक एक अलग सीएएम के साथ लेपित मिश्रित कर रहे हैं और intermixing या अलगाव की डिग्री मूल्यांकन किया है.
इन फायदों के बावजूद भी निरंतर कर रहे हैं. सबसे पहले, समाधान में मोतियों पर प्रोटीन टुकड़े नहीं करतेइन विवो स्थिति की जटिलता पुनरावृत्ति. व्यक्ति की कोशिकाओं सेल सतह प्रोटीन और उनके intracellular प्रभावोत्पादक के विशिष्ट पूरक व्यक्त करते हैं. इनमें से प्रत्येक आसंजन पर प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से या तो प्रभाव पड़ सकता है, और इन प्रभावों के कई मनका assays में दिखाई नहीं देंगे. उदाहरण के लिए, एक अणु (यह एक कैमरा है) मजबूत, heterophilic आसंजन मध्यस्थता कर सकते हैं, लेकिन इन assays में मनका एकत्रीकरण प्रेरित नहीं होगा. दूसरा, मनका assays केवल अर्द्ध मात्रात्मक हैं और चिपकने वाला बातचीत के रिश्तेदार ताकत पर विश्वसनीय, मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करते हैं. अंत में, हम जांच की है कि अणु के सभी चिपकने वाला डोमेन एक एकल, सन्निहित पॉलीपेप्टाइड पर मौजूद है, जिसमें प्रकार मैं, एकल पास झिल्ली प्रोटीन होते हैं. यह कई CAMs कई ectodomain क्षेत्रों से निर्मित एक चिपकने वाला अंतरफलक है कि बहु पास transmembrane प्रोटीन हो सकता है कि संभावना है. इस परख ऐसे अणुओं को आसानी से निभा नहीं होगा.
एफओआर मनका assays विश्वसनीय हो, शर्तों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की आवश्यकता है. इन assays में परिवर्तनशीलता के दो संभावित स्रोत हैं. पहले प्रोटीन के स्तर में परिवर्तनशीलता है. अभिकर्मक दक्षता या एक खराब व्यक्त प्रोटीन में बदलाव की वजह से अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तनशीलता, वहाँ है, तो मोती संतृप्त नहीं किया जा सकता है और परिणाम अविश्वसनीय हो सकती है. पिछले मनका एकत्रीकरण कार्यान्वयन शुद्ध ectodomain संलयन प्रोटीन का एक निर्धारित राशि का उपयोग करें. आमतौर पर, इस संलयन प्रोटीन स्थिर सेल लाइनों से बड़े समूहों में शुद्ध होता है और कई प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल मोतियों की मात्रा और आवश्यक प्रोटीन की मात्रा बहुत छोटा है, एक तुलनीय reproducibility क्षणिक अभिकर्मक के साथ प्राप्त किया जा सकता है. कि हम इस्तेमाल चुंबकीय मोती resuspended मोतियों की ~ 250 एनजी / एल की एक बाध्यकारी क्षमता है. सुपर उपयोग कर, एक माध्यमिक बाध्यकारी कदम के साथ सत्यापित किया जा सकता है, जो प्रोटीन का एक विशाल अधिक 2 x 100 मिमी व्यंजन परिणामों का एक विशिष्ट अभिकर्मक,natant मोती संलयन प्रोटीन की प्रारंभिक बंधन के बाद. परिवर्तनशीलता के दूसरे संभावित स्रोत इस्तेमाल किया मोतियों की मात्रा है. कि हम इस्तेमाल चुंबकीय मोती जल्दी से सुलझेगी, जो एक 30 मिलीग्राम / एमएल घोल के रूप में आपूर्ति की जाती है. Reproducibility के लिए, मोती पूरी तरह से resuspended किया जाना चाहिए और मोती व्यवस्थित करने के लिए शुरू करने से पहले प्रासंगिक मात्रा, जल्दी से निकाला. एक वैकल्पिक एक बड़ी मात्रा में मोतियों की एक निर्धारित राशि पूर्व पतला करने के लिए है. इन पूर्व पतला मोती pipetting त्रुटियों से बचने के लिए एक बड़ी मात्रा में (15 एल बजाय 1.5 एल) में जोड़ा जा सकता है. उचित देखभाल नहीं लिया है, तो इस्तेमाल किया मोतियों की मात्रा में प्रयोग करने के लिए प्रयोग परिवर्तनशीलता हो जाएगा. यह एक निर्धारित समय में कुल आकार में अंतर करने के लिए अग्रणी, एकत्रीकरण की दर को प्रभावित कर सकता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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