Abstract
Hücre-hücre yapışması çok-hücreli yaşam için esas olduğunu ve hücre yüzeyi proteinlerinin çeşitli bir dizi aracılık eder. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu için yapışma etkileşimlerini tam olarak anlaşılamamıştır. Burada farazi homofilik hücre yapışma moleküllerinin yapışkanlık özelliklerini karakterize etmek için basit ve hızlı bir yöntem sunuyoruz. Kültürlenmiş HEK293 hücreleri DNA plazmid, bir hücre yüzeyi proteini, salgılanan, epitop takılı ekto sahası kodlayan yapılarla transfekte edilir. Epitop takısı için spesifik işlevselleştirilmiş boncuk kullanılarak, çözünür, salgılanan füzyon proteini kültür ortamından tespit edilir. Kaplı boncuklar, homofilik yapışma test etmek üzere deneyler sıralama boncuk agregasyonu deneylerinde ya da floresan boncuğu direkt olarak kullanılabilir. Eğer arzu edilirse, o zaman mutagenez yapışması için gerekli olan özel amino asitleri ya da etki aydınlatmak için kullanılabilir. Bu deney, stabil hücre hatlarının üretilmesini gerektirmez, ifade edilen proteinin sadece küçük miktarlarda gerektirir ve acco edilebilir4 gün içinde mplished.
Introduction
Hücre-hücre yapışma çok hücreli organizmaların gelişimi ve bütünlüğü için gerekli olan ve hücre yüzeyi zengin bir molekül dizisi aracılık eder. Birçok tespit edilmesi gerekmektedir, bu da yapışma moleküllerinin çoğu, tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. Çeşitli yöntemler, atomik kuvvet mikroskopisi ve yüzey kuvvet spektroskopisi 9-12 gibi hücre sıralama deneyleri, hücre toplama deneyleri 1-8 ve biyofiziksel yöntemler dahil olmak üzere, hücre yapışma moleküllerinin özellikleri (CAMlar) araştırmak için kullanılır.
Da hücre dizileri kullanılarak in vitro sistemlerde basitleştirilmiş karmaşıklığı zor bir varsayımsal CAM yapışkanlık özelliklerini belirlemek için yapar. Tipik olarak, bir molekül, bir yapışkan olmayan hücre hattı içine geçirildiğinde, hücre birikmesinin sebep olursa CAM olarak kabul edilir. Ancak, bu yapışkan etkinliğinin doğrudan bir kanıt olmadığı açıktır. Örneğin, bir hücre yüzeyi dengesini ve çıkışını kolaylaştırmakTAT aynı zamanda, artmış hücre toplanmasının 1,13 ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, gerçek bir TAT hücre çizgisi, hücre yüzeyi gönderilmesi veya stabilizasyonu için gerekli diğer ko-faktörlerini sahip olmayan hücre toplanmasını aracılık başarısız olabilir.
Bu komplike faktörleri önlemek için, fikrine dayanır daha doğrudan tahlilleri kullanılabilecektir yapışma etkileşimlerini hücre dışı bir alanındaki bir içsel özelliği biyokimyasal olmalıdır. Boncuklar, Ng-CAM, başlangıçta 2 karakterize etmek için kullanıldı ise de, bu deneyler, kaderin-aracılı adhezyon 12,14,15 araştırmak amacıyla genişletilmiştir. C-kaderin ekto-Fc füzyon füzyonlarının kullanarak, çok sayıda laboratuar Gumbiner kadherin tekrarlar etkileşimleri 14 homofilik katkıda bulunduğunu göstermiştir. Drosophila 'dan gelen protocadherins 1,15-18 ve Dscam izoformlarının bir dizi gibi benzer topuk kısmı agregasyon analizleri, E-kadherin ve N-kadherin yapışma kullanılması da, 12,15 karakterize edilmiştir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Hazırlanması (Gün 0 -2)
- Bölünmüş HEK293 hücreleri: 1 -% 80 konfluent (2-3 gün) ve% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak 5 60 kadar,% 5 CO2 37 ° C'de büyüme ortamı içinde inkübe edilir. Her durum için, 2 x 100 mm'lik tabaklar içerisinde kültürü hücreleri.
2. Hücre transfeksiyonu (Gün 1)
- Bu Lipofectamine gibi bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak plazmid kodlayan Fc füzyonu ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri. Benzer transfeksiyon verimliliği neden alternatif yöntemleri de kullanılabilir.
- 24 saat boyunca kuluçka transfekte hücreleri dönün.
3. Hücre Yayılma (Gün 2)
- 37 ° C'ye kadar Cenin Sığır Serumu (-FBS olmadan) ön ısıtma Büyüme Ortamı.
- Tabaklar 10 mi Büyüme Ortamı -FBS ile 2x durulayın ve 1 saat boyunca 37 ° C inkübatör bulaşıkları döner.
- 3 yıkamadan toplam, 10 mL büyüme ortamında -FBS ile kültürler yemekler bir kez daha çalkalayın.
- Incuasitleme ortam toplama önce FBS'siz diğer bir 48 saat boyunca 37 ° C 'de transfekte edilmiş HEK293 hücreleri.
4. Boncuk Toplama (Gün 4)
- Kültür kaplarından ortamı toplamak için, hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 5 dakika boyunca 500 x g'de 50 ml konik tüp ve hızlı yemekler her biri bir medya transferi.
- 30 ml şırınga ve 0.45 mikron şırınga filtre kullanarak bir santrifüj filtre içine 50 ml konik tüp filtre medya.
- Konsantre kültür ortamı hacmi yaklaşık 500 ul (yaklaşık 15 dakika) kadar 4000 x g ve 4 ° C'de santrifüj filtresi Spin. Tüm kültür ortamı ilave edildi ve konsantre edildi edilene kadar yineleyin.
- Bir mıknatıs üzerinde buz her bir numune için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü Bağlama Tamponu soğuk, yer 1 ml Protein G, manyetik boncuk 1.5 ul tampon ve çıkartın. Hemen Protein G, manyetik boncuklar, konsantre kültür ortamı eklenir.
- 2 saat boyunca 4 ° C'de tüpler döndürün.
- Plbir mıknatıs üzerinde ace tüpleri ve ortamı çıkarın. Çabuk buz ile iki kez Bağlama Buffer 1 ml boncuk yıkayın ve sonra Bağlama Tamponu 300 ul boncuklar tekrar süspansiyon.
- Bölünmüş 2 boru, her bir tüpe 150 ul boncuk halinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve daha sonra sırasıyla, "kalsiyum" ve "Kalsiyum" koşulları için 200 mM CaCl2 ya da 200 mM EDTA, 1.5 ul ekleyin.
- Bir depresyon Transfer her durumda 100 ul iyi kaydırın ve iletilen ışık mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak mikrograflannı toplamak. İstenen her bir zaman noktasında her bir deney için 5 bakış alanları görüntü toplayın.
5. Veri Analizi
- ImageJ veya karşılaştırılabilir görüntü analiz yazılımı, Dosya açılan menüden İthalat / Görüntü Sırasını ... kullanarak beş görüntü veri setleri açık birini kullanma. Bu bir görüntü yığını olarak açılacaktır.
- Görüntü / Özellikler ... iletişim kutusunda, i değiştirmek1.0 piksel ve set Piksel Genişlik ve Piksel Yükseklik büyücü birimleri.
- Görüntü açılan menüde ayarlayın / Eşiği ... komutunu kullanarak ikili görüntüleri dönüştürmek. Boncuk veya boncuk agrega katkıda pikselleri dahil etmek eşiğini ayarlamak, ama o arka plan ve küçük parçacıkları hariç. Yığınının tüm resimlere uygulayın.
- Set Ölçümler iletişim kutusunda, Alan ve Stack Pozisyon onay kutularını.
- Açılan menüyü analiz içinde ... Parçacıklar analiz çalıştırın. Bu onların büyüklüğü (alanı) ve bunların tespit edildiği görüntü dahil tespit parçacıkların bir listesini oluşturacaktır.
- Deney ve deneysel koşul için bu işlemi tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir örnek deney Fc (NcadEC-Fc) bağlı olarak N-kaderin-ekto-saha ile kalsiyuma bağlı boncuk toplanmasını gösterir, Şekil 2, sunulmuştur. Kalsiyum yokluğunda, taneler bir araya çok az veya hiç bir eğilim göstermedikleri ve zaman (Şekil 1A, C), olan, toplam ebadında bir artış vardır. Kalsiyum varlığında, tanecikler toplam miktarı zaman (Şekil 1B, C) üzerinde giderek artan NcadEC-Fc göstermek sağlam birleştirilmesi ile kaplanmıştır. Bu deney, beş örtüşmeyen alanlardan görüntülerden oluşan her bir durumda, üç kez tekrar edildi. Piksel alanında parçacık boyutu beş alanda her bir agrega için belirlendi. Bu veriler, her bir deney için her bir zaman noktası için ortalaması alındı. Deneylerden elde edilen veriler, her bir zaman noktasında (Şekil 2C) ve ölçüm araçları için standart hatayı saptamak için ortalaması alınmıştır.
1762 / 51762fig1highres.jpg "/>
Boncuk toplama tahlillerde salgılanan, epitop ektoalanlarının Şekil 1. Kullanım. Bir sinyal dizisi, (S), bir ekto sahası olan tipik bir tek zar-geçişli hücre yapışma molekülü (üstte) organizasyonunu gösteren (A) şematik, bir transmembran alanı (T) ve bir hücre içi alan (ICD). Ektoalan, insan IgG (alt). (B), kültürlenmiş hücreler içine transfekte Fc bölgesine kaynaştırılır transmembran ve hücre içi alanları olmayan bir segmentin bir salgılanmış bir biçimini oluşturmak için ectomain-Fc füzyon ifade içine salgılanır yakalanır ve Protein A veya Protein G, manyetik boncuklar üzerinde saflaştırılabilir kültür ortamı. Protein A veya Protein G, boncuklar üzerinde siyah dairelerle gösterilmiştir. (C) yıkandıktan sonra, ekto-Fc kaplı manyetik boncuklar homofilik yapışma etkileşimlerinde bir test olarak, bir araya izin verilir.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Boncuk toplama deneyi Şekil. (A), örneğin N-kaderin ve E-kadherin gibi klasik kadherinler, kalsiyuma bağımlı, homofilik yapışmayı aracılık eder. Kalsiyum yokluğunda, kadherinler yapıştırıcı etkileşimlerin aracılık başarısız (hiç kalsiyum ve 2 mM EDTA ilave edildi). Burada gösterilen Fc (NcadEC-Fc) kaynaştırılmış zebra balığı, N-kaderin ekto sahası ile kaplanmış Protein G, manyetik tanecikler bir görüntüsüdür. (B) 'NcadEC-Fc kaplı boncuklar, 2 mM CaCl varlığında, 1 saat boyunca bir araya bırakıldı 2. N-kadherin ektoalanlarının ile homofilik yapışma büyük kordon agregatlarının formasyonuna olduğu açıktır. Yapışma bir yarı-nicel ölçüsü olarak (C), agregatların boyutu ölçülebilir. Bunu gerçekleştirmek için bir yöntem, kapladığı alanı ölçmek içiniletilen ışık görüntü belirgin toplar. Burada gösterildiği gibi toplam alanının ortalama büyüklüğü, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilen veya varlığında veya yokluğunda kalsiyum ortalama toplam alanına oranı hesaplanabilir. Kalsiyum (kapalı daireler) varlığında NcadEC-Fc kaplı boncuklar agregasyonu ve kalsiyum yokluğunda (açık daireler) ile 1 saat boyunca 15 dakika aralıklarla saptandı. , bu daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen rakam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre yapışması, çok hücreli yaşamının önemli bir özelliğidir ve hücre yüzey proteinleri, geniş bir dizi aracılık eder. Bunlardan, ayrıntılı, yapışkan özellikleri sadece nispeten küçük bir kısmı için anlaşılır. Burada, uygun bir epitop ucuna birleştirilen bir salgılanan ektoalanlarının homofilik yapışkanlı araştırmak için basit, hızlı bir protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, önemli avantajlara sahiptir. Amaçla yeterli miktarlarda protein, 100 mm'lik tabaklar geçici transfeksiyonu ile elde edilebilir Üretim, stabil hücre hatları, 14,20 gerekli değildir. , Örneğin, nokta veya silme mutantlarının - - çaba olmadan ve jeneratör ve hücre çizgileri çok sayıda muhafaza gider bu yapıların yüksek sayıda tarama sağlar. İkinci olarak, bu boncuk deneyler, indirgenmiş sistemde varsayılan yapışma moleküllerinin biyokimyasal özelliklerinin doğrudan bir testtir. Bu nedenle, yapışma proteine doğrudan bağlanabilirSoruşturma ziyade potansiyel dolaylı etkileri altında. Üçüncü olarak, olası ko-faktörlerin etkisini incelemek için, hücre adhezyon molekülünün putatif salgılanan biçimleri ve varsayılan yardımcı faktör, ayrı bir epitop takısı ile her biri ile ko-transfekte edilebilir. Uygun epitop etiketleri çeşitli ile kullanım için adapte edilebilir Buna ek olarak, bu yaklaşım, esnektir. Örneğin, eşit büyüklükte manyetik boncuk Protein A veya G (Fc etiketi) konjuge edilir kullanıma hazır Streptavidin (II Strep etiket), glutatyon (GST künyesi) veya TALON veya Ni: NTA (6x His etiketi). Son olarak, floresan boncuk kullanılabilirliği basit ayırma deneyleri, homofilik spesifitesinin incelenmesi için aynı protokol adapte edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu senaryoda, kırmızı ve yeşil flüoresan boncuklar olarak, her biri ayrı bir CAM ile kaplanmış karıştırılır ve karışma ya da ayrıştırma derecesi değerlendirilir.
Bu avantajlara rağmen, aynı zamanda uyarılar vardır. İlk olarak, çözelti içinde, boncuklar üzerinde protein fragmanları yok, in vivo durumu karmaşıklığını büyük ölçüde özetleyebildiğini. Ayrı ayn hücreler, hücre yüzeyi proteinleri ve hücre içi efektör belirli tamamlar ifade eder. Bunların her biri yapışması üzerinde doğrudan veya dolaylı olarak etki yapabilir ve bu etkilerin çok boncuk deneylerinde yansıtılmaz. Örneğin, bir molekülün (bir CAM), güçlü heterofil yapışmasına aracılık edebilir, fakat bu deneylerde boncuk toplanmasını neden olmaz. İkincisi, boncuk deneyleri sadece yarı-nicel ve yapışkan etkileşimlerin göreceli gücünü güvenilir, kantitatif bilgi vermemektedir. Son olarak, araştırdık moleküllerin tüm yapışkan alan tek bir bitişik polipeptid üzerinde mevcut olduğu tip I, tek-geçişli bir membran proteinleridir. Birçok CAMlar birden ekto bölgelerinden yapılmış, yapışkan bir arayüze sahip çok geçişli transmembran proteinleri olabilir muhtemeldir. Bu deney, bu tür moleküller için de uyarlanabilir olmaz.
For boncuk deneyleri güvenilir olması, koşulların tekrarlanabilir olması gerekir. Bu deneylerde değişkenlik iki potansiyel kaynağı vardır. Birinci protein seviyelerinde değişkenliktir. Transfeksiyon etkinliğindeki veya yetersiz eksprese edilen protein, farklılıklardan dolayı değişkenlik ekspresyon seviyeleri, varsa, boncuklar, doymuş olabilir ve sonuçlar güvenilir olmayabilir. Önceki boncuk toplama uygulamaları saflaştırılmış ektoalan-füzyon proteininin tanımlanmış bir miktarda kullanın. Tipik haliyle, bu füzyon proteini, stabil hücre hatları büyük partiler halinde saflaştırılır ve birden çok deneylerde kullanılabilir. Her bir deneyde kullanılan boncuk miktarı ve gereken protein miktarı çok düşük olduğu için, benzer bir yeniden üretilebilirlik geçici transfeksiyonu ile elde edilebilir. Kullandığımız manyetik boncuk tanelerin yeniden süspansiyon haline getirilmiş ~ 250 ng / L bir bağlama kapasitesine sahiptir. Süper kullanarak, bir sekonder birleştirme aşaması ile doğrulanabilir bir protein büyük aşırılıkta 2 x 100 mm çanağı sonuçlarının tipik transfeksiyonu,yüzen boncuklara füzyon proteininin ilk bağlanma sonra. Değişkenlik ikinci bir olası kaynağı, kullanılan boncuk miktarıdır. Kullandığımız manyetik boncuk hızla yerleşir 30 mg / ml bulamaç olarak verilir. Yeniden üretilebilirlik sağlamak için, taneler tamamen yeniden süspansiyon haline getirilmiş olması ve boncuklar yerine başlamadan önce, ilgili hacim, hızlı bir şekilde ekstrakte edilmiştir. Bir alternatif, daha büyük bir hacim içinde tanelerin önceden belirlenmiş bir miktarda-seyreltilmesidir. Bu önceden seyreltilmiş boncuk pipetleme hatalarını önlemek için, daha büyük bir hacimde (15 L yerine 1,5 L) içinde ilave edilebilir. Uygun bakım alınmazsa, kullanılan boncuk miktarda deney-to-deney değişkenlik olacaktır. Bu, belirli bir zamanda toplam boyut farklılıklara yol toplama oranını etkileyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
