Abstract
Cel-cel adhesie is fundamenteel voor meercellig leven en wordt gemedieerd door een divers scala aan eiwitten van het celoppervlak. Echter, de bindingsinteracties voor veel van deze eiwitten slecht begrepen. Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de klevende eigenschappen van vermeende homofiele celadhesiemoleculen. Gekweekte HEK293 cellen getransfecteerd met DNA dat codeert voor een uitgescheiden, epitoop-gelabelde ectodomein van een celoppervlakte-eiwit. Met gefunctionaliseerde kralen specifiek voor het epitoop tag, wordt de oplosbare, uitgescheiden fusie-eiwit gevangen uit het kweekmedium. De beklede korrels kunnen vervolgens direct in kraal aggregatie assays of fluorescente kralen sortering assays om te testen op homofiele adhesie. Desgewenst kan mutagenese dan worden gebruikt om de specifieke aminozuren of domeinen die voor hechting helderen. Deze test vereist slechts kleine hoeveelheden van tot expressie gebracht eiwit, niet vereist de productie van stabiele cellijnen en kan worden ACCOmplished in 4 dagen.
Introduction
Adhesie van cellen is essentieel voor de ontwikkeling en integriteit van meercellige organismen en wordt gemedieerd door een diverse reeks van celoppervlakmoleculen. Veel van deze adhesiemoleculen zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd, hoewel velen nog worden ontdekt. Verschillende methoden worden gebruikt om de eigenschappen van celadhesie moleculen (CAMs), inclusief celsortering assays, cel aggregatie assays 1-8 en biofysische werkwijzen zoals atomic force microscopie en oppervlaktekracht spectroscopie 9-12 onderzoeken.
De complexiteit zelfs vereenvoudigde in vitro systemen die cellijnen bemoeilijkt de kleefeigenschappen van een vermeende CAM bepalen. Typisch wordt een molecuul als een CAM indien induceert cel aggregatie bij getransfecteerd in een niet hechtende cellijn. Het is echter duidelijk dat dit niet direct bewijs kleefmiddel activiteit. Bijvoorbeeld, het celoppervlak levering of stabiliteit van een vergemakkelijkingCAM leidt ook tot verhoogde celaggregatie 1,13. Bovendien kan een echte CAM niet aan celaggregatie mediëren als de cellijn mist andere co-factoren nodig zijn voor celoppervlak levering of stabilisatie.
Om deze complicerende factoren te vermijden, meer direct testen kunnen worden gebruikt die zijn gebaseerd op het idee dat bindingsinteracties dient een intrinsieke biochemische eigenschap van het extracellulaire domein. Terwijl korrels aanvankelijk gebruikt Ng-CAM 2 karakteriseren, zijn deze assays uitgebreid om-cadherine-gemedieerde adhesie 12,14,15 onderzoeken. Met fusie van de C-cadherine ectodomein-Fc-fusies, de Gumbiner lab bleek dat meerdere cadherine herhalingen bijdragen tot 14 homofiele interacties. Met vergelijkbare kraal aggregatie assays, E-cadherine en N-cadherine hechting zijn ook gekarakteriseerd 12,15, evenals een aantal protocadherines 1,15-18 en Dscam isovormen van Drosophila
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Cell Voorbereiding (dag -2 tot 0)
- Split HEK293 cellen 1: 5 met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing en incubeer in groeimedia bij 37 ° C met 5% CO2 totdat 60 - 80% confluent (2-3 dagen). Voor elke aandoening, cultuur cellen in 2 x 100 mm gerechten.
2 celtransfectie (Dag 1)
- Transfecteren HEK293 cellen met plasmide codeert Fc-fusie met een transfectie reagens zoals Lipofectamine. Alternatieve methoden die resulteren in vergelijkbare transfectie efficiënties kunnen ook worden gebruikt.
- Terug getransfecteerde cellen incubator gedurende 24 uur.
3 Cell Voortplanting (Dag 2)
- Verwarm Growth Media zonder foetaal runderserum (-FBS) tot 37 ° C.
- Spoel schotels 2x met 10 ml Groei Media -FBS, en de terugkeer van de gerechten tot de 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Spoel de kweken gerechten een keer met 10 ml kweekmedium -FBS, voor een totaal van 3 wasbehandelingen.
- Incubate de getransfecteerde HEK293 cellen bij 37 ° C gedurende nog 48 uur zonder FBS voor het verzamelen media.
4 Bead Aggregation (dag 4)
- Om media vanaf kweekschaaltjes verzamelen, overbrengen media van elk paar gerechten tot 50 ml conische buizen en draaien op 500 xg gedurende 5 minuten om cellulaire puin neer te slaan.
- Filter media uit 50 ml conische buis in een centrifugaal filter met behulp van een 30 ml spuit en 0,45 pm spuitfilter.
- Spin centrifugale filters bij 4.000 xg en 4 ° C tot het volume geconcentreerd kweekmedium is ongeveer 500 pi (ongeveer 15 min). Herhaal dit tot alle kweekmedia toegevoegd en geconcentreerd.
- Voeg 1,5 ul Proteïne G magnetische kralen 1 ml ijskoude bindingsbuffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis voor elk monster, plaats op een magneet en verwijdert buffer. Voeg onmiddellijk de geconcentreerde kweekmedium aan de Proteïne G magnetische korrels.
- Draai buizen bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Place-buizen op een magneet en verwijder media. Snel wassen kralen tweemaal met ijskoud 1 ml Binding Buffer, en vervolgens opnieuw in suspensie kralen in 300 ul Binding Buffer.
- Split geresuspendeerd parels in 2 buizen, 150 ul in elke buis en voeg 1,5 ul van 200 mM CaCl2 en 200 mM EDTA de "calcium" en "no calcium" omstandigheden respectievelijk.
- Breng 100 pi van elke aandoening depressie goed glijden en laat microfoto met een doorvallend licht microscoop (figuur 2). Verzamel beelden van 5 gezichtsveld voor elk experiment op elk gewenst tijdstip.
5 Data Analysis
- Met behulp van ImageJ, of vergelijkbare software voor beeldanalyse, opent u een van de vijf beelddatasets behulp van de Import / Afbeelding Sequence ... uit het File pulldown menu. Deze wordt geopend als afbeeldingsstapel.
- In het Beeld / Eigenschappen ... dialoogvenster veranderen de image eenheden naar pixels en stel Pixel Breedte en Pixel Hoogte tot 1,0.
- Converteer de beelden naar binair via de Adjust / Drempel ... commando in het Afbeelding pulldown menu. Stel de drempel om pixels die bijdragen aan kralen of kralen aggregaten omvatten, maar dat uitgesloten achtergrond en kleine deeltjes. Toegepast op alle beelden in de stapel.
- Klik in het dialoogvenster Metingen Set doos, controleer dan de dozen Ruimte en Stack Position.
- Run Analyseer Deeltjes ... in het Analyseren pulldown menu. Dit zal een lijst van de geïdentificeerde deeltjes, met inbegrip van hun grootte (gebied) en het beeld waarin ze werden geïdentificeerd genereren.
- Herhaal dit proces voor die experiment en experimentele conditie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld experiment wordt gepresenteerd in figuur 2, die calcium afhankelijk bead aggregatie toont het ectodomein van N-cadherine gefuseerd aan Fc (NcadEC-Fc). Aangezien calcium, parels vertonen weinig of geen neiging tot aggregeren en er is geen toename in korrelgrootte tijd (Figuur 1 A, C). In de aanwezigheid van calcium, kralen bekleed met NcadEC-Fc tonen robuuste aggregatie, met totale grootte verhoging in de tijd (Figuur 1B, C). Dit experiment werd driemaal herhaald, telkens met beelden van vijf niet-overlappende gebieden. De deeltjesgrootte pixeloppervlak werd voor elk aggregaat in de vijf velden. Deze gegevens werden gemiddeld voor elk tijdpunt in elk experiment. De gegevens van drie experimenten werden gemiddeld om en standaardafwijking meetfouten op elk tijdstip (figuur 2C) te bepalen.
1762 / 51762fig1highres.jpg "/>
Figuur 1 Het gebruik van uitgescheiden, epitoop-gemerkte ectodomeinen in kraal aggregatie assays. (A) Schematische toont de organisatie van een typische single-pass transmembraan celadhesiemolecuul (boven), dat een signaalsequentie (S), een ectodomein heeft, een transmembraandomein (T) en een intracellulair domein (ICD). Om een afgescheiden vorm van het ectodomein, een segment dat de transmembraan en intracellulaire domeinen gefuseerd aan het Fc-gebied van humaan IgG (onder). (B) wanneer getransfecteerd in gekweekte cellen mist genereren, wordt de ectomain-Fc-fusie tot expressie gebracht en uitgescheiden in het kweekmedium, waar het kan worden opgevangen en gezuiverd op Proteïne A of Proteïne G magnetische korrels. Proteïne A of Proteïne G worden weergegeven als zwarte cirkels op de korrels. (C) Na wassen worden de ectodomein-Fc beklede magnetische korrels mogen aggregeren als een test homofiele bindingsinteracties.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Bead aggregatie-assay. (A) De klassieke cadherines, zoals N-cadherine en E-cadherine, bemiddelen calcium-afhankelijke, homofiele adhesie. Aangezien calcium (geen toegevoegd calcium en 2 mM EDTA), cadherinen niet lijm interacties mediëren. De afbeelding toont een afbeelding van Proteïne G magnetische korrels bekleed met het ectodomein van zebravis N-cadherine gefuseerd aan Fc (NcadEC-Fc). (B) NcadEC-Fc beklede bolletjes werden toegestaan om te aggregeren gedurende 1 uur in de aanwezigheid van 2 mM CaCl 2. Homofiele hechting door de N-cadherine ectodomeinen blijkt uit de vorming van grote kraal aggregaten. (C) Als een semi-kwantitatieve maat van de hechting, kan de grootte van de aggregaten worden gemeten. Een methode om dit te bereiken is het gebied bezet door metenverschillende aggregaten in doorgelaten licht beelden. De gemiddelde grootte van de totale gebied kan worden uitgezet als functie van de tijd, zoals hier getoond, of de verhouding van de gemiddelde totale ruimte in de aanwezigheid of afwezigheid van calcium kan worden berekend. De samenvoeging van NcadEC-Fc gecoate kralen in de aanwezigheid van calcium (gesloten cirkels) en in afwezigheid van calcium (open cirkels) werd bepaald op 15 min intervallen in de loop van 1 uur. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celhechting een essentieel kenmerk van meercellig leven en wordt gemedieerd door een brede reeks celoppervlak eiwitten. Hiervan worden de gedetailleerde kleefeigenschappen begrepen slechts een relatief klein deel. Hier hebben we een eenvoudige, snelle protocol beschreven voor het onderzoeken van de homofiele hechtmiddel aantal uitgescheiden ectodomeinen gefuseerd aan een geschikte epitoop tag. Deze benadering heeft een aantal belangrijke voordelen. Eerst worden stabiele cellijnen niet nodig 14,20, voldoende hoeveelheden eiwit worden geproduceerd door tijdelijke transfectie van 100 mm schalen. Dit maakt de screening van grote aantallen constructen - bijvoorbeeld point of deletiemutanten - zonder de moeite en de kosten van het genereren en onderhouden van een groot aantal cellijnen. Ten tweede, deze bead assays zijn directe testen van de biochemische eigenschappen van vermeende adhesiemoleculen in een verminderde systeem. Daarom kan de hechting direct worden toegeschreven aan het eiwitin onderzoek, in plaats van de potentiële indirecte effecten. Ten derde, om de effecten van mogelijke co-factoren onderzoeken cellen kunnen worden co-getransfecteerd met uitgescheiden vormen van de vermeende adhesie molecuul en de vermeende co-factor, die elk een epitoop tag. Bovendien is deze benadering is flexibel, aangezien het kan worden aangepast voor gebruik met een verscheidenheid van geschikte epitoop-merkers. Bijvoorbeeld, uniforme grootte magnetische korrels zijn die zijn geconjugeerd met Proteïne A of G (Fc tag) Streptavidin (StrepII), glutathion (GST tag), of TALON of Ni: NTA (6x His-tag). Tenslotte, de beschikbaarheid van fluorescerende kralen kan dezelfde protocol worden aangepast voor eenvoudige sortering assays homophilic specificiteit te onderzoeken. In dit scenario, rode en groene fluorescerende kralen, elk bekleed met een eigen CAM, gemengd en de mate van vermenging of afzonderen beoordeeld.
Ondanks deze voordelen zijn er ook kanttekeningen. Eerst eiwitfragmenten op korrels in oplossing nietrecapituleren de complexiteit van de in vivo situatie. Individuele cellen brengen specifieke complementen van het celoppervlak eiwitten en hun intracellulaire effectoren. Elk van deze kan hetzij directe of indirecte effecten op adhesie, en veel van deze effecten niet weergegeven in bead assays. Bijvoorbeeld kan een molecuul sterk heterofiele hechting mediëren (het is een CAM), maar niet kraal aggregatie in deze testen induceren. Tweede kraal assays zijn alleen semi-kwantitatief en geen betrouwbare kwantitatieve gegevens over de relatieve sterkte van bindingsinteracties niet over. Tenslotte alle moleculen die we hebben onderzocht zijn type, single-pass membraaneiwitten waarbij de kleefstof domein aanwezig op een enkel aansluitend polypeptide. Het is waarschijnlijk dat veel CAMs kan meerdere doorlopen transmembraan eiwitten met lijmril opgebouwd uit meerdere ectodomein regio's. Deze test zou niet gemakkelijk aan dergelijke moleculen.
For kraal assays betrouwbaar is, de voorwaarden moeten reproduceerbaar. Er zijn twee mogelijke bronnen van variabiliteit in deze testen. De eerste variatie in eiwitniveaus. Als er variatie in expressieniveaus, door variatie in transfectie-efficiëntie of slecht-eiwit tot expressie kunnen de korrels niet verzadigd en de resultaten kunnen onbetrouwbaar zijn. Voorafgaand implementaties kraal aggregatie gebruiken een bepaalde hoeveelheid gezuiverd ectodomein-fusie-eiwit. Typisch wordt dit fusie-eiwit in grote series van stabiele cellijnen gezuiverd en kan worden gebruikt in meerdere experimenten. Als de hoeveelheid korrels die in elk experiment en de hoeveelheid benodigde eiwit is zeer klein, kan een vergelijkbare reproduceerbaarheid worden bereikt transiënte transfectie. De magnetische bolletjes die we gebruiken hebben een bindend vermogen van ~ 250 ng / L van geresuspendeerde kralen. Een typisch transfectie van 2 x 100 mm schalen resulteert in een grote overmaat eiwit, dat kan worden geverifieerd met een tweede bindende stap, met de supernatant na de initiële binding van het fusie-eiwit aan de kralen. De tweede mogelijke bron van variabiliteit is de hoeveelheid kralen gebruikt. De magnetische bolletjes die we gebruiken worden geleverd als een 30 mg / ml suspensie die snel bezinkt. Voor reproduceerbaarheid, moet de kralen volledig worden gesuspendeerd en de relevante volume snel gewonnen, voordat de kralen beginnen om zich te vestigen. Een alternatief is het pre-verdun een gedefinieerde hoeveelheid korrels in groter volume. Deze pre-verdunde kralen kunnen worden toegevoegd in groter volume (15 L in plaats van 1,5 L) te pipetteren fouten te voorkomen. Als de juiste zorg niet wordt genomen, zal er experiment tot experiment variabiliteit in de hoeveelheid kralen gebruikt worden. Dit kan invloed hebben op de snelheid van de aggregatie, wat leidt tot verschillen in de totale omvang op een bepaald tijdstip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
