Abstract
細胞 - 細胞接着は多細胞生命の基本であり、細胞表面タンパク質の多様な配列によって媒介される。しかし、これらのタンパク質の多くのための接着剤の相互作用はほとんど解明されていない。ここでは、推定される同種親和性細胞接着分子の接着特性を特徴付けるための、シンプルで迅速な方法を提示する。培養されたHEK293細胞は、細胞表面タンパク質の分泌、エピトープタグ外部ドメインをコードするDNAプラスミドでトランスフェクトされる。エピトープタグに特異的な官能化されたビーズを用いて、可溶性の分泌された融合タンパク質を培地から捕捉される。コーティングされたビーズは、その後、ビーズ凝集アッセイにおいて、または同種親和性接着を試験するためのアッセイを選別蛍光ビーズに直接使用することができる。所望の場合、突然変異誘発は、その後の接着に必要な特定のアミノ酸又はドメインを解明するために使用することができる。このアッセイは、発現されたタンパク質の少量のみを必要とする安定な細胞株の産生を必要とせず、アコすることができ4日間でmplished。
Introduction
細胞間接着は、多細胞生物の発生および完全性に必須であり、細胞表面分子の多様な配列によって媒介される。これらの接着分子の多くは、多くはまだ発見されていないものの、同定され、特徴付けられている。いくつかの方法は、アッセイを、細胞選別、細胞凝集アッセイ1-8と、原子間力顕微鏡、表面力分光法9-12のような生物物理学的方法を含む細胞接着分子（CAM）の特性を調べるために使用される。
偶数細胞株を用いてインビトロ系において簡略化の複雑さは、それが困難な推定上のCAMの接着特性を決定することを可能にする。非接着細胞株にトランスフェクトした場合には細胞凝集を誘導する場合、通常、分子はCAMと考えられている。しかし、これは接着活性の直接的な証拠はないことは明らかである。例えば、細胞表面の配信または安定性を促進するCAMはまた、増加した細胞凝集1,13をもたらすであろう。また、真のCAMは、細胞株は、細胞表面送達または安定化に必要なその他の補助因子を欠いている場合、細胞凝集を媒介することに失敗することがあります。
これらの複雑な要因を回避するために、より直接的なアッセイは、接着性相互作用は、細胞外ドメインの固有の生化学的性質であるべきであるという考えに基づいていることを採用することができる。ビーズは最初に呉-CAM 2を特徴付けるために使用されたが、これらのアッセイは、カドヘリン介在性接着12,14,15を調べるために拡張されている。 C-カドヘリン細胞外ドメイン-Fc融合の融合を使用して、Gumbinerラボは、複数のカドヘリンリピートが相互作用14を同種親和性に寄与することを示した。 ショウジョウバエからプロト1,15-18とDSCAMアイソフォームの数を持っているように、同等のビーズ凝集アッセイ、E-カドヘリンとN-カドヘリン接着を使用すると、、12,15を特徴づけられている
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Protocol
1。細胞調製（日-2〜0）
- 分割HEK293細胞1： - 80％コンフルエント（2 - 3日間）および0.05％トリプシン-EDTA溶液を用いて5〜60まで、5％CO 2、37℃で増殖培地中でインキュベートする。各条件については、2×100mm皿内の培養細胞。
2細胞トランスフェクション（1日目）
- そのようなリポフェクタミンなどのトランスフェクション試薬を使用してコードするプラスミドFc融合でHEK293細胞をトランスフェクトする。同等のトランスフェクション効率をもたらす代替的な方法を用いてもよい。
- 24時間インキュベーターにトランスフェクトされた細胞を返します。
3セルの伝播（2日目）
- 37℃までのウシ胎児血清（-FBS）なしの予熱増殖培地。
- 料理は10ミリリットルの成長メディア-FBSで2回すすぎ、1時間、37℃のインキュベーターに皿を返す。
- 合計3回の洗浄のために、10ミリリットルの成長メディア-FBSと文化の料理をもう一度洗浄します。
- Incuお譲りしたメディアを収集する前に、FBSを含まない別の48時間、37℃でトランスフェクトされたHEK293細胞。
4。ビーズ集約（4日目）
- 培養皿からメディアを収集するには、細胞破片をペレット化し、5分間500×gで50ミリリットルコニカルチューブとスピンに料理の各ペアからメディアを転送します。
- 30ミリリットルの注射器、0.45μmのシリンジフィルターを用いて遠心フィルターに50ミリリットルコニカルチューブからフィルターメディア。
- 濃縮された培養培地の体積は約500μlの（約15分）まで、4,000×gで、4℃で遠心分離フィルタースピン。すべての培養培地を添加して、濃縮されるまで繰り返します。
- 、各サンプルについて1.5mlのマイクロチューブに結合バッファーの氷冷1mlにプロテインG磁気ビーズを1.5μl加え、磁石上の場所とバッファを削除します。すぐにプロテインG磁気ビーズに濃縮した培養培地を追加します。
- 2時間、4℃で管を回転させます。
- Plの磁石上のエースチューブとは、メディアを取り出します。すばやく結合バッファーの氷冷1で2回ビーズを洗浄した後、結合緩衝300μlのビーズを懸濁します。
- スプリットは2管、各チューブに150μlの中にビーズを再懸濁し、その後、それぞれ、「カルシウム」と「いいえカルシウム」の条件について200のCaCl 2または200のEDTA、1.5μlを添加する。
- うつ病への転送、各条件からの100μlをうまくスライドさせ、透過光顕微鏡（ 図2）を使用して、顕微鏡写真を収集します。所望の各時点での各実験のために5視野からの画像を収集します。
5。データ解析
- [ファイル ]プルダウンメニューから... ImageJの、または同等の画像解析ソフト、 インポート/イメージシーケンスを使用して、5つの画像データセットのオープン1を使用した。これらは、画像スタックとして開かれます。
- イメージ / プロパティ...]ダイアログボックスで、私を変更ピクセルにメイジユニットおよび1.0にピクセルの幅と高さをピクセル単位で設定します。
- 画像プルダウンメニューで調整/しきい値...コマンドを使ってバイナリに画像を変換します。ビーズやビーズ凝集体に貢献する画素が含まれるようにしきい値を設定しますが、その背景と小さい粒子を除外します。スタック内のすべての画像に適用します。
- セットの測定 ]ダイアログボックスで、 エリアとスタックポジションチェックボックスをオンにします。
- プルダウンメニューの分析に...粒子を分析し実行します。これは、それらの大きさ（面積）およびそれらが同定された画像を含む同定された粒子のリストを生成する。
- 実験と実験条件について、この手順を繰り返します。
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Representative Results
実験例は、FC（NcadEC-Fc）のに融合したN-カドヘリンの細胞外ドメインによってカルシウム依存性ビーズの凝集を示した図2に示されている。カルシウムの非存在下では、ビーズは凝集するほとんど又は全く傾向を示す、時間（ 図1A、C）との凝集体サイズの増加はない。カルシウムの存在下では、ビーズは、凝集体サイズが（ 図1B、C）は、時間の経過とともに増加し、NcadEC-Fcのショー堅牢な集約でコーティング。この実験は、5つの非重複視野からの画像からなる各インスタンスで、3回繰り返した。画素領域内の粒子サイズは、5つのフィールド内の各集合体について決定した。これらのデータは、各実験における各時点について平均した。 3回の実験のデータは、各時点（ 図2C）における手段と測定の標準誤差を決定するために平均化した。
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ビーズ凝集アッセイ中の分泌、エピトープタグの外部ドメインの図1。使用。 （A）図は、シグナル配列（S）、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（T）、および細胞内ドメイン（ICD）を有する典型的なシングルパス膜貫通細胞接着分子（上）の組織を示す。細胞外ドメイン、ヒトIgG（下部）。（B）培養細胞にトランスフェクトのFc領域に融合される膜貫通および細胞内ドメインを欠いているセグメントの分泌形態を生成するために、ectomain-Fc融合体を発現させ、中に分泌されるそれは捕捉され、プロテインAまたはプロテインG磁気ビーズ上で精製することができる培養培地。プロテインAまたはプロテインGはビーズ上の黒丸で示されている。（C）洗浄後、外部ドメイン-Fcをコーティングした磁気ビーズを同種親和性接着剤の相互作用のテストとして、凝集させている。ig1highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2ビーズ凝集アッセイ図。 （A）は、N-カドヘリンおよびE-カドヘリンのような古典的なカドヘリンは、カルシウム依存性、同種親和性接着を媒介する。カルシウムの非存在下では、カドヘリンの接着相互作用を媒介することができない（無カルシウムおよび2mM EDTAを添加しない）。ここに示されたFc（NcadEC-Fc）のに融合したゼブラフィッシュN-カドヘリンの細胞外ドメインで被覆したプロテインG磁気ビーズの画像である。（B）NcadEC-Fcをコーティングしたビーズを、2mMの塩化カルシウムの存在下で1時間凝集させた2。 N-カドヘリンの細胞外ドメインによってホモフィリックな接着性が大きいビーズ凝集体の形成から明らかである。（C）密着性の半定量的尺度として、凝集体のサイズを測定することができる。これを達成する一つの方法は、占有面積を測定することである透過光画像では明瞭な凝集。ここに示されているように凝集体面積の平均サイズは、時間の関数としてプロットすることができ、またはカルシウムの存在下または非存在下での平均アグリゲート面積の比を算出することができる。 NcadEC-Fcの集約カルシウム（黒丸）の存在下でコーティングしたビーズやカルシウム（白丸）が存在しない場合には、1時間かけて15分間隔で測定した。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。フィギュア。
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Discussion
細胞接着は多細胞生命の本質的な特徴であり、細胞表面タンパク質の広範な配列によって媒介される。このうち、詳細な接着性が比較的小さい割合と理解される。ここでは、便利なエピトープタグに融合された分泌された外部ドメインの同種親和性接着剤能力を調査するための、シンプルで迅速なプロトコルを記載している。このアプローチは、多くの重要な利点を有している。タンパク質の十分な量が100mm皿の一過性トランスフェクションによって生成することができるように、まず、安定した細胞株は、14,20を必要としない。 例えば点または削除変異体- -これは構造体のより多くのスクリーニングを可能にする細胞株を大量に生成し、維持するための努力と費用をかけずに。第二に、これらのビーズアッセイは、減少し、システム内の推定上の接着分子の生化学的性質の直接的な試験である。そのため、接着は直接タンパク質に起因することができます調査ではなく、潜在的な間接的影響下に。第三に、可能な補因子の効果を調べるために、細胞を、推定上の接着分子とその推定上の補因子の分泌された形態の、別個のエピトープタグとのそれぞれに同時トランスフェクトすることができる。それは、適切なエピトープタグのさまざまな使用に適合させることができるように加えて、このアプローチは、柔軟である。例えば、均一な大きさの磁気ビーズはプロテインAまたはG（Fcタグ）に結合されているが利用可能である、ストレプトアビジン（ストレップIIタグ）、グルタチオン（GSTタグ）、またはTALONまたはNi：国税庁（Hisタグを6倍）。最後に、蛍光ビーズの利用可能性は、同じプロトコルは同種親和性の特異性を調べるための簡単な選別アッセイのために適合されることを可能にする。このシナリオでは、赤色および緑色蛍光ビーズに、それぞれ、別個のCAMで被覆された混合され、ミキシングや偏析の程度が評価される。
これらの利点にもかかわらず、また、注意点がある。まず、溶液中のビーズ上のタンパク質断片にはありませんin vivoでの状況の複雑さを再現。個別の細胞は、細胞表面タンパク質、およびその細胞内エフェクターの特定の相補体を発現する。これらのそれぞれが接着に直接的または間接的な効果を有していてもよく、これらの効果の多くはビーズアッセイに反映されません。例えば、分子は、（それがCAM）に強い、異好性接着を媒介することができるが、これらのアッセイにおいて、ビーズの凝集を誘導しないであろう。第二に、ビーズアッセイは、半定量的であり、接着剤の相互作用の相対的な強さに関する信頼できる、定量的な情報を提供しない。最後に、調査したすべての分子は、接着ドメインは、単一の連続ポリペプチド上に存在するタイプI、シングルパス膜タンパク質である。それは多くのCAMは、複数の外部ドメイン領域から構築接着界面を持つマルチパス膜貫通タンパク質であり得る可能性がある。このアッセイは、このような分子に容易に適応できない。
フォーr個のビーズアッセイが信頼できると、条件が再現可能である必要がある。これらのアッセイにおける変動性の二つの潜在的な源がある。最初は、タンパク質レベルの変動である。トランスフェクション効率または低発現型タンパク質における変化による発現レベルの変動がある場合、ビーズは飽和されず、結果が信頼できないかもしれない。前のビーズ凝集の実装は、精製されたエクトドメイン融合タンパク質の定義された量を使用する。典型的には、この融合タンパク質は、安定な細胞株からの大きなバッチで精製し、複数の実験に使用することができる。各実験で使用されるビーズの量と必要なタンパク質の量が非常に小さいため、同程度の再現性は、一過性トランスフェクションで達成することができる。私たちが使用した磁気ビーズを再懸濁し、ビーズの〜250 ngの/ Lの結合能力を持っている。スーパーを使用して、二次結合ステップで確認することができ、タンパク質の広大超える2×100mm皿結果の代表的なトランスフェクション、浮遊性のビーズへの融合タンパク質の最初の結合の後に。変動性の第二の電位源が使用されるビーズの量である。私たちが使用する磁気ビーズはすぐに安定する30 mg / mlのスラリーとして供給されている。再現性のために、ビーズが沈降し始める前に、ビーズを完全に再懸濁されている必要があり、関連するボリュームをすばやく抽出した。一つの選択肢は、より大きな体積のビーズの規定量を事前に希釈することである。これらの予め希釈したビーズをピペッティングエラーを回避するために、より大きな容積（15 Lではなく1.5 L）を添加することができる。適切なケアがとられていない場合は、使用したビーズの量で実験間のばらつきがあるでしょう。これは、指定された当時の凝集サイズの違いにつながる、凝集の速度に影響を与える可能性があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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