Abstract
A adesão célula-célula é fundamental para a vida multicelular e é mediada por uma série diversa de proteínas da superfície celular. No entanto, as interacções adesivas para muitas destas proteínas são mal compreendidos. Aqui apresenta-se um método simples e rápido para a caracterização das propriedades adesivas das moléculas de adesão de células homofílicas putativos. As células em cultura são HEK293 transfectadas com o plasmídeo de ADN que codifica uma secretado, o ectodomínio de epitopo marcado com uma proteína da superfície celular. Usando grânulos funcionalizados específicos para o marcador de epitopo, solúvel, da proteína de fusão segregado é capturado a partir do meio de cultura. Os grânulos revestidos podem, então, ser utilizada directamente em ensaios de agregação de grânulos ou em grânulo fluorescente triagem ensaios para testar quanto à adesão homofílica. Se desejado, a mutagénese pode ser usada para elucidar os ácidos aminados ou domínios específicos necessários para a aderência. Este ensaio requer apenas pequenas quantidades de proteínas expressas, não requer a produção de linhas celulares estáveis, e pode ser Accomplished em 4 dias.
Introduction
A adesão célula-célula é essencial para o desenvolvimento e a integridade dos organismos multicelulares e é mediada por uma série diversa de moléculas da superfície celular. Muitas dessas moléculas de adesão foram identificados e caracterizados, embora muitos continuam a ser descobertos. Vários métodos são utilizados para pesquisar as propriedades das moléculas de adesão celular (CAMs), incluindo ensaios de separação de células, ensaios de agregação de células 1-8 e métodos biofísicos, tais como microscopia de força atómica e força espectroscopia superfície 9-12.
A complexidade do mesmo simplificada em sistemas in vitro utilizando linhas celulares torna difícil determinar as propriedades adesivas de uma CAM putativo. Tipicamente, uma molécula é considerada uma CAM se que induz a agregação de células, quando transfectados para uma linha de células não adesivas. No entanto, é evidente que esta não é uma evidência directa de actividade adesiva. Por exemplo, facilitar a entrega da superfície celular ou a estabilidade de umCAM também resultaria em aumento da agregação de células 1,13. Além disso, um verdadeiro CAM pode falhar para mediar a agregação de células, se a linha de células não possui outros co-factores necessários para a entrega de superfície celular ou de estabilização.
Para evitar essas complicações, ensaios mais diretas podem ser empregadas que são baseados na idéia de que as interações adesivas deve ser uma propriedade bioquímica intrínseca do domínio extracelular. Enquanto contas foram inicialmente utilizados para caracterizar Ng-CAM 2, estes ensaios foram alargadas, a fim de investigar a adesão 12,14,15 mediada por caderina. Usando fusão das fusões C-caderina-Fc ectodomínio, o laboratório Gumbiner mostrou que múltiplas repetições caderina contribuem para interacções homofílicas 14. Usando ensaios de agregação de talão comparáveis, E-caderina e N-caderina de adesão foram também caracterizados 12,15, como tem um número de protocadherins 1,15-18 e isoformas Dscam de Drosophila
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Protocol
1. celular Preparação (Dia -2 a 0)
- Dividir células HEK293 1: 5, utilizando 0,05% de solução de tripsina-EDTA e incubar em Meio de Crescimento a 37 ° C com 5% de CO 2 até os 60 - 80% confluentes (2-3 dias). Para cada condição, as células de cultura em 2 x 100 mm pratos.
2. transfecção celular (Dia 1)
- Transfectar células HEK293 com o plasmídeo que codifica a Fc-fusão usando um reagente de transfecção, tais como Lipofectamina. Podem também ser utilizados métodos alternativos, que resultam em maior eficiência de transfecção comparável.
- Voltar células transfectadas para incubadora por 24 horas.
3. celular Propagation (Dia 2)
- Pré-aqueça o Meio de Crescimento, sem soro fetal de bovino (-FBS) a 37 ° C.
- Lavar pratos 2x com 10 ml de Meio de Crescimento -FBS, e retornar as placas para a incubadora a 37 ° C durante 1 hora.
- Lavar a culturas pratos mais uma vez com 10 ml de Meio de Crescimento -FBS, para um total de 3 lavagens.
- INCUbate as células HEK293 transfectadas a 37 ° C por mais 48 horas sem FBS antes de coletar mídia.
4 Bead Aggregation (dia 4)
- Para a coleta de mídia a partir de placas de cultura, transferir mídia de cada par de pratos para 50 ml tubos cônicos e rotação a 500 xg durante 5 min para sedimentar os restos celulares.
- O meio filtrante de tubo de 50 ml em um filtro centrífugo usando uma seringa de 30 ml e 0,45 mm filtro de seringa.
- Girar filtros centrífugos a 4.000 xg e 4 ° C até que o volume de meio de cultura concentrado é de cerca de 500 mL (aproximadamente 15 min). Repita até que todos os meios de cultura foi adicionado e concentrada.
- Adicionar 1,5 uL de proteína G contas magnéticas para 1 ml de tampão de ligação arrefecido em gelo, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada amostra, em lugar de um íman e remover o tampão. Imediatamente adicionar o meio de cultura concentrado de proteína G esferas magnéticas.
- Rodar os tubos a 4 ° C durante 2 horas.
- Pltubos ace em um ímã e remover a mídia. Lavar rapidamente contas duas vezes com o frio do gelo 1 ml tampão de ligação e, em seguida ressuspender contas em 300 mL tampão de ligação.
- Dividir contas ressuspenso em 2 tubos de 150 mL em cada tubo, e em seguida, adicione 1,5 mL de mM CaCl2 ou 200 EDTA 200 mM para o "cálcio" e condições "não cálcio", respectivamente.
- Transferir 100 uL de cada condição para uma depressão bem deslizar e recolher micrografias usando um microscópio de luz transmitida (Figura 2). Recolha de imagens a partir de 5 campos de visão de cada experiência em cada ponto de tempo desejado.
Análise de Dados 5.
- Usando ImageJ, ou software de análise de imagem comparável, abra um dos cinco conjuntos de dados de imagem usando o Import / sequência de imagens ... no menu suspenso Arquivo. Estes irão ser aberto como uma pilha de imagens.
- Na caixa de diálogo ... Imagem / Propriedades, altere o iunidades mago pixels e definir Pixel Largura e Altura Pixel é 1.0.
- Converta as imagens para binário usando o / Threshold Ajuste ... comando no menu suspenso Imagem. Definir o limite de incluir pixels que contribuem para esferas ou agregados de contas, mas que exclui fundo e pequenas partículas. Aplicar a todas as imagens da pilha.
- Na caixa de diálogo Medidas Set, marque as caixas área e Pilha Posição.
- Executar análise Partículas ... menu suspenso na Análise. Isto vai gerar uma lista de partículas identificados, incluindo o seu tamanho (área) e a imagem em que foram identificadas.
- Repetir este processo por que experimento e condição experimental.
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Representative Results
Um exemplo experiência é apresentado na Figura 2, que mostra a agregação de grânulo dependente de cálcio pelo ectodomínio de N-caderina fundido com Fc (NcadEC-Fc). Na ausência de cálcio, esferas exibem pouca ou nenhuma tendência para se agregar e não há aumento do tamanho do agregado, com o tempo (Figura 1A, C). Na presença de cálcio, contas revestidas com NcadEC-Fc mostra a agregação robusta, com tamanho de agregado crescente ao longo do tempo (Figura 1B, C). Esta experiência foi repetida três vezes, com cada exemplo de imagens que consiste em cinco campos que não se sobreponham. O tamanho de partícula na área de pixel foi determinada para cada conjunto de cinco campos. Estes dados foram a média para cada ponto de tempo em cada experiência. Os dados dos três estudos, foi usada para determinar os meios e os erros padrão de medição em cada ponto de tempo (Figura 2C).
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Figura 1 Uso de secretadas, ectodom�ios marcadas no epitopo em ensaios de agregação de talão. (A) Diagrama esquemático que mostra a organização de uma típica, de passagem única molécula de adesão celular transmembranar (parte superior), que tem uma sequência de sinal (S), um ectodomínio, um domínio transmembranar (T) e um domínio intracelular (ICD). Para gerar uma forma secretada do ectodomínio, um segmento que não possui os domínios transmembranares e intracelulares, é fundida com a região Fc de IgG humana (parte inferior). (B) Quando transfectado em células de cultura, a fusão ectomain-Fc é expressa e segregada o meio de cultura, onde ele pode ser capturado e purificado em Proteína A ou Proteína G esferas magnéticas. Proteína A ou Proteína G são mostradas como círculos pretos nas esferas. (C) Depois da lavagem, as esferas magnéticas revestidas com Fc-ectodomínio podem agregar, como um teste de interacções de adesão homofílica."target =" ig1highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. ensaio de agregação do grânulo. (A) As caderinas clássicas, tais como a N-caderina e E-caderina, mediar dependente de cálcio, a adesão homofílica. Na ausência de cálcio (sem cálcio e EDTA 2 mM adicionado), caderinas não conseguem mediar interacções adesivas. Aqui é mostrada uma imagem de Proteína G esferas magnéticas revestidas com o ectodomínio do peixe-zebra de N-caderina fundido com Fc (NcadEC-Fc). (B)-Fc NcadEC esferas revestidas foram deixadas a agregar durante 1 hora na presença de CaCl 2 mM 2. Adesão homofílica por ectodomínios N-caderina é aparente a partir da formação de grandes agregados de talão. (C) Como uma medida semi-quantitativa da adesão, o tamanho de agregados pode ser medido. Um método para realizar isto é medir a área ocupada pelaagregados distintas em imagens de luz transmitida. O tamanho médio da área total pode ser representada graficamente como uma função do tempo, como mostrado aqui, ou a razão da média de superfície total na presença ou na ausência de cálcio pode ser calculado. A agregação de NcadEC-Fc esferas revestidas na presença de cálcio (círculos fechados) e na ausência de cálcio (círculos abertos) foi determinada em intervalos de 15 minutos ao longo de 1 hora. favor clique aqui para ver uma versão maior da presente figura.
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Discussion
A adesão celular é um elemento essencial da vida multicelular e é mediada por uma ampla gama de proteínas de superfície da célula. Destes, as propriedades adesivas são detalhados compreendido por apenas uma proporção relativamente pequena. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples, rápido para investigar a capacidade adesiva homofica de ectodom�ios secretadas fundido com um epítopo marcador conveniente. Esta abordagem tem um número de vantagens importantes. Em primeiro lugar, as linhas de células estáveis não são necessários 14,20, como quantidades suficientes de proteína pode ser gerada por transfecção transitória de placas de 100 mm. Isso permite a exibição de um maior número de construções - por exemplo, de ponto ou de exclusão mutantes - sem o esforço ea despesa de gerar e manter um grande número de linhas celulares. Em segundo lugar, estes ensaios são ensaios directos de talão das propriedades bioquímicas de moléculas de adesão putativos em um sistema reduzida. Portanto, a adesão pode ser diretamente atribuído à proteínasob investigação, em vez de potenciais efeitos indiretos. Em terceiro lugar, para investigar os efeitos de possíveis co-factores, as células podem ser co-transfectadas com as formas segregadas da molécula de adesão putativo e o seu co-factor de putativo, cada um com uma etiqueta de epitopo distinto. Além disso, esta abordagem é flexível, uma vez que pode ser adaptado para utilização com uma variedade de marcadores de epitopo adequados. Por exemplo, pérolas magnéticas são de dimensão uniforme disponíveis que são conjugados com proteína A ou G (tag Fc), estreptavidina (Strep tag II), glutationa (marcador GST), ou TALON ou Ni: NTA (6x His). Finalmente, a disponibilidade de pérolas fluorescentes permite que o mesmo protocolo de ser adaptados para os ensaios de triagem simples para investigar a especificidade homofílicas. Neste cenário, as esferas fluorescentes vermelhas e verdes, cada uma revestida com uma CAM distinta, são misturados e o grau de entrecruzamento, ou de segregação é avaliada.
Apesar destas vantagens, há também ressalvas. Em primeiro lugar, fragmentos de proteínas sobre contas em solução nãorecapitular a complexidade da situação in vivo. As células individuais expressam complementos específicos de proteínas da superfície celular e as suas efectores intracelulares. Cada um deles pode ter efeitos diretos ou indiretos sobre a adesão, e muitos desses efeitos não serão refletidas em ensaios de talão. Por exemplo, uma molécula pode mediar a adesão forte, heterofílico (é uma CAM), mas não induzir a agregação talão nestes ensaios. Em segundo lugar, os ensaios de contas são apenas semi-quantitativa e não fornecem informações quantitativas confiáveis sobre a força relativa das interações adesivas. Finalmente, todas as moléculas que foram investigadas são de tipo I, proteínas de membrana de uma só passagem no qual o domínio de adesivo está presente numa única, polipeptídeo contíguo. É provável que muitas das CAMs pode ser proteínas transmembranares de múltiplas passagens que possuem uma interface adesiva construído a partir de várias regiões do ectodomínio. Este ensaio não seria facilmente adaptável para tais moléculas.
Foensaios r talão de ser confiável, as condições precisam ser reprodutível. Existem duas fontes potenciais de variabilidade nestes ensaios. O primeiro é a variabilidade no teor de proteínas. Se existe uma variabilidade nos níveis de expressão, devido à variação na eficiência de transfecção ou uma proteína mal-expresso, os grânulos não podem ser saturados e os resultados podem não ser fiáveis. Implementações agregação talão anteriores utilizam uma quantidade definida de proteína purificada ectodomínio-fusão. Tipicamente, esta proteína de fusão é purificado, em grandes lotes de linhas celulares estáveis e podem ser utilizados em múltiplos ensaios. À medida que a quantidade de grânulos utilizados em cada experiência e a quantidade de proteína necessária é muito pequena, uma reprodutibilidade comparáveis podem ser alcançados com a transfecção transiente. As esferas magnéticas que usamos tem uma capacidade de ligação de ~ 250 ng / L de grânulos em suspensão. Uma transfecção típica de 2 x placas de 100 mm resulta num vasto excesso de proteína, o que pode ser verificado com um passo de ligação secundária, utilizando o supernatant após a ligação inicial da proteína de fusão para os grânulos. A segunda fonte potencial de variabilidade é a quantidade de grânulos usados. As esferas magnéticas que usamos são fornecidas como a 30 mg / ml suspensão que se instala rapidamente. Para a reprodutibilidade, os grânulos devem ser ressuspensas e completamente o volume relevante extraído rapidamente, antes de os grânulos começam a assentar. Uma alternativa é a de pré-diluir uma quantidade definida de grânulos num volume maior. Estes grânulos de pré-diluída pode ser adicionada num volume maior (15 L, em vez de 1,5 L) para evitar erros de pipetagem. Se os cuidados adequados não forem tomadas, haverá variabilidade experimento-a-experiência na quantidade de contas utilizadas. Isso pode afetar a taxa de agregação, levando a diferenças de tamanho dos agregados em uma hora determinada.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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