Abstract
Межклеточной адгезии является основополагающим для многоклеточных организмов и опосредуется множеством разнообразных белков клеточной поверхности. Тем не менее, адгезивные взаимодействия для многих из этих белков, плохо понимал. Здесь мы представляем простой, быстрый метод для определения характеристик адгезионных свойств предполагаемых гомофильной молекул клеточной адгезии. Культивируемые клетки НЕК293 трансфицировали плазмидой ДНК, кодирующую секретируемый, эпитоп-меченый эктодомен белка клеточной поверхности. Использование функционализированных шарики специфичными к эпитопу тега, растворимый, слитый белок, секретируемый захватывается из культуральной среды. Шарики с покрытием затем может быть использован непосредственно в бортовых агрегации анализов или в флуоресцентного шарик сортировки анализов для проверки гомофильной адгезии. При желании, мутагенез может быть использован для выяснения специфические аминокислоты или домены, необходимые для сцепления. Этот анализ требуется только небольшое количество экспрессированного белка, не требует производства стабильных клеточных линий, и может быть АККОmplished в 4 дня.
Introduction
Межклеточной адгезии имеет важное значение для развития и целостности многоклеточных организмов и опосредуется множеством разнообразных молекул клеточной поверхности. Многие из этих молекул адгезии были идентифицированы и охарактеризованы, хотя многие должны быть еще открыты. Некоторые методы используются для изучения свойств молекул клеточной адгезии (-кам), в том числе клеточных сортировки анализов, агрегации клеток анализов 1-8 и биофизических методов, таких как атомно-силовой микроскопии и поверхности силовой спектроскопии 9-12.
Сложность даже упрощается в системах пробирке с использованием линий клеток делает его трудно определить адгезионные свойства предполагаемого CAM. Как правило, молекулы считается САМ, если он вызывает агрегацию клеток при трансфекции в не-клейкой клеточной линии. Тем не менее, очевидно, что это не прямое свидетельство адгезивной активности. Например, облегчая доставку клеточной поверхности или стабильностьCAM также привести к увеличению агрегации клеток 1,13. Кроме того, настоящий САМ может не опосредуют агрегацию клеток, если линия клеток не хватает других сопутствующих факторов, необходимых для доставки на клеточной поверхности или стабилизации.
Чтобы избежать этих усложняющих факторов, более прямые анализы могут быть использованы, которые основаны на идее о том, что адгезивные взаимодействия должны быть неотъемлемой биохимические свойство внеклеточного домена. В то время как бусины первоначально использовались для характеристики NG-CAM 2, эти анализы были расширены с целью изучения кадгеринов-опосредованной адгезии 12,14,15. Использование слияние C-кадгерина эктодомен-Fc слияния, лаборатория Gumbiner показали, что несколько повторов кадгерином способствовать гомофильной взаимодействия 14. Использование сопоставимых агрегации шарик анализов, E-кадгерина и N-кадгерина адгезии также характеризуется 12,15, а есть ряд protocadherins 1,15-18 и DSCAM изоформ от дрозофилы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Приготовление клеток (День -2 до 0)
- Сплит НЕК293 1: 5, используя 0,05% раствора трипсина-ЭДТА и инкубировать в ростовой среде при 37 ° С с 5% CO 2 до 60 - 80% сливной (2 - 3 дней). Для каждого состояния, культуры клеток в 2 х 100-мм чашек.
2 трансфекции клеток (день 1)
- Трансфекции клеток НЕК293 с плазмиды, кодирующей Fc-слияния, используя реагента для трансфекции, такие как Lipofectamine. Также могут быть использованы альтернативные способы, которые приводят к повышению эффективности трансфекции сопоставимых.
- Вернуться трансфекции клеток в инкубаторе в течение 24 часов.
3 Cell Распространение (День 2)
- Разогреть Рост Медиа без эмбриональной телячьей сыворотки (-FBS) до 37 ° С.
- Промыть блюда 2x с 10 мл питательной среды -FBS, и вернуть посуду в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
- Промойте культур блюда еще раз с 10 мл питательной среды -FBS, в общей сложности 3 стирок.
- INCUБАТЭ трансфектированные НЕК293 при 37 ° С для другого 48 часов без FBS до сбора средств массовой информации.
4 из бисера Объединение (День 4)
- Для сбора средств массовой информации от чашек для культивирования, передачу мультимедийных файлов из каждой пары блюд до 50 мл конические пробирки и спиновых при 500 мкг в течение 5 мин для осаждения остатков клеток.
- Фильтрующие материалы от 50 мл коническую трубку в центробежный фильтр с помощью шприца 30 мл и шприц фильтр 0,45 мкм.
- Спин центробежные фильтры на 4000 мкг и 4 ° С до объема концентрированной культуральной среде не примерно 500 мкл (примерно 15 мин). Повторяйте, пока не была добавлена вся культура СМИ и концентрируют.
- Добавить 1,5 мкл белка G магнитных шариков с 1 мл охлажденного льдом буфера для связывания в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для каждого образца, месте на магните и удалить буфер. Сразу добавить концентрированный питательных сред с белком G магнитных шариков.
- Поворот трубы при 4 ° С в течение 2 часов.
- Plтуз трубки на магнит и не извлекайте носитель. Быстро мыть шарики дважды ледяной 1 мл буфера для связывания, а затем ресуспендируют бусины в 300 мкл буфера для связывания.
- Сплит ресуспендировали бусы на 2 трубки, 150 мкл в каждую пробирку, а затем добавить 1,5 мкл 200 мМ CaCl 2 или 200 мМ ЭДТА для "кальция" и "нет кальция» условиях, соответственно.
- Передача 100 мкл из каждой состоянии депрессии хорошо скользить и собирать микрофотографии с помощью микроскопа проходящего света (рисунок 2). Сбор изображений с 5 полей зрения для каждого эксперимента на каждом нужной точке времени.
Анализ 5. данных
- Использование ImageJ или сопоставимое программное обеспечение для анализа изображений, открытый одним из пяти изображений наборов данных с использованием Импорт / последовательности изображений ... из выпадающего меню Файл. Они будут открыты в качестве стека изображений.
- В ... диалогового окна Image / Свойства измените Iмаг единиц в пикселях и установить Pixel Ширина и Pixel Высота до 1,0.
- Преобразовать образы в двоичную систему с помощью Adjust / Threshold ... команду в меню Image выпадающем. Установите порог включить пикселей, которые способствуют шариков или бортовых агрегатов, но, что исключает фон и мелких частиц. Применить ко всем изображениям в стеке.
- В диалоговом Измерения Box Set, флажки Площадь и Stack положении.
- Запустите анализировать частицы ... в Анализировать выпадающее меню. Это создаст перечень выявленных частиц, в том числе их размера (площади) и изображения, в котором они были определены.
- Повторите этот процесс, для которого эксперимент и экспериментальное условие.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример эксперимента представлены на рисунке 2, который показывает кальций-зависимую агрегацию шарик по эктодомена N-кадгерина, слитого с Fc (NcadEC-Fc). В отсутствие кальция, шарики обладают практически не тенденцию к агрегации и нет увеличение совокупного размера с течением времени (фиг.1А, С). В присутствии кальция, гранулы, покрытые NcadEC-Fc-шоу надежной агрегации, с совокупный размер увеличивается с течением времени (Фиг.1В, С). Этот эксперимент был повторен три раза, при этом каждый Например, состоящей из изображений из пяти неперекрывающихся областях. Размер частиц в пиксельной области была определена для каждого агрегата в пяти полей. Эти данные были усреднены для каждой временной точке в каждом эксперименте. Данные от трех экспериментов были усреднены для определения средств и стандартные ошибки измерения в каждый момент времени (Рисунок 2C).
1762 / 51762fig1highres.jpg "/>
Рис.1 Использование выделяемых, эпитоп-тегами эктодоменов в агрегации шарик анализов. (А) Схематическое изображение организацию типичной, однопроходный адгезия трансмембранный клеток молекулы (верхней), который имеет сигнальную последовательность (S), эктодомен, трансмембранный домен (T) и внутриклеточный домен (МКБ). Для генерации секретируемой формы эктодомена, сегмент, который испытывает недостаток трансмембранные и внутриклеточные домены слит с Fc-областью человеческого IgG (внизу). (B) при трансфекции в культивируемых клетках, слитый ectomain-Fc выражается и секретируется в культуральную среду, где он может быть захвачен и очищали на протеин А или белок G магнитных шариков. Белок или белок G показаны черными кругами на шариках. (C) После промывки эктодомен-Fc покрытием магнитные шарики разрешается объединять, как испытание гомофильной адгезивных взаимодействий.ig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. бисера Анализ агрегации. (А) Классические кадгерины, такие как N-кадгерина и Е-кадгерина, посредником кальций-зависимую адгезию, гомофильной. не в отсутствие кальция (без добавления кальция и 2 мМ ЭДТА), кадгерины не в опосредуют адгезивные взаимодействия. Здесь показано изображение Белок G магнитных шариков, покрытых эктодомена данио N-кадгерина, слитого с Fc (Fc-NcadEC). (B) NcadEC-Fc шарики с покрытием были допущены к агрегации в течение 1 ч в присутствии 2 мМ CaCl 2. Гомофильной адгезия по N-кадгерина эктодоменов видно из образованию больших бортовых агрегатов. (C) В полуколичественного меры адгезии, размер агрегатов может быть измерена. Один способ сделать это состоит в измерении площади, занимаемойразличные агрегаты в проходящем свете изображения. Средний размер общей площадью могут быть нанесены в виде функции времени, как показано здесь, или отношение средней общей площадью в присутствии или в отсутствие кальция может быть вычислена. Агрегация бисером NcadEC-Fc покрытием в присутствии кальция (закрытых кругах) и в отсутствие кальция (кружки) была определена в минутными интервалами 15 в течение 1 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клеточная адгезия является существенным признаком многоклеточных и опосредуется широким кругом белков клеточной поверхности. Из них подробные адгезионные свойства понимаются только сравнительно небольшая часть. Здесь мы описали простой, быстрый протокол для исследования гомофильной адгезию секретируемых эктодоменов слитых в удобное эпитопной меткой. Этот подход имеет ряд важных преимуществ. Прежде всего, стабильные клеточные линии, не требуется 14,20, так как достаточное количество белка могут быть получены путем кратковременной трансфекции в 100 мм чашках. Это позволяет скрининг большего числа конструкций - например, точечных или мутантов с делецией - без усилий и счет генерации и поддержания большого числа клеточных линий. Во-вторых, эти бусинки анализы являются прямыми испытания биохимических свойств предполагаемых молекул адгезии в приведенной системы. Таким образом, адгезия может быть непосредственно отнесены к белкупод следствием, а не потенциальных косвенного воздействия. В-третьих, для расследования последствий возможных сопутствующих факторов, клетки могут быть котрансфицируют секретируемых форм предполагаемого молекулы адгезии и ее предполагаемого кофактора, каждая с отдельной эпитопной меткой. Кроме того, этот подход является гибким, поскольку он может быть адаптирован для использования с различными соответствующими тегами эпитоп. Например, равномерно размера магнитных шариков доступны, что сопряжены с белком А или G (Fc тега), Стрептавидин (Стрептококковое II тег), глутатион (GST тег), или TALON или Ni: NTA (6x Его тег). Наконец, наличие флуоресцентных шариков позволяет и тот же протокол, чтобы быть адаптированы для сортировки простые тесты, чтобы исследовать гомофильной специфичность. В этом случае, красный и зеленый флуоресцентных шариков, покрытых друг с отчетливым CAM, смешивают и степень перемешивания или сегрегации оценивают.
Несмотря на эти преимущества, есть и подводные камни. Во-первых, фрагменты белка на шариках в растворе неПовторим сложность в естественных условиях ситуации. Индивидуальные клетки экспрессируют специфические дополнения из белков клеточной поверхности и их внутриклеточных эффекторов. Каждый из них может иметь либо прямое или косвенное воздействие на адгезию, и многие из этих эффектов не будут отражены в бортовых анализов. Например, молекула может опосредовать сильную адгезию, гетерофильных (это САМ), но не будет вызывать агрегацию шарик в этих анализах. Во-вторых, шарик анализы только полуколичественный и не обеспечивают надежную количественную информацию об относительном прочность адгезионных взаимодействий. Наконец, все молекулы, которые мы исследованных являются типа я, однопроходных мембранные белки, в которых домен клей присутствует на единый, непрерывный полипептида. Вполне вероятно, что многие САМ может быть несколько частот трансмембранные белки, которые имеют интерфейс клейкой построенный из нескольких областей эктодомена. Этот анализ не был бы легко приспособить к таким молекулам.
ФоR шарик анализы, чтобы быть надежным, условия должны быть воспроизводимыми. Есть два потенциальных источника изменчивости в этих анализах. Первый изменчивость уровней белка. Если есть различия в уровне экспрессии, за счет вариации в эффективности трансфекции или слабо-экспрессированного белка, гранулы, не может быть насыщенным, и результаты могут быть ненадежными. До реализации агрегации шарик использовать определенное количество очищенного белка эктодомена-синтеза. Как правило, этот слитый белок очищают с большими партиями из стабильных клеточных линий, и может быть использован в нескольких экспериментах. Как количество шариков, используемых в каждом опыте и количество белка, необходимого очень мала, сравнимой воспроизводимость может быть достигнуто с временной трансфекции. Магнитные шарики, которые мы используем имеют связывающую способность ~ 250 нг / л ресуспендированных бисером. Типичный трансфекции 2 х 100 мм блюда результатов в большом избытке белка, которые могут быть проверены с вторичной стадии связывания, используя суперnatant после начального связывания слитого белка с гранулами. Второй потенциальный источник изменчивости является количество шариков, используемых. Магнитные шарики, которые мы используем поставляются как 30 мг / мл суспензии, который располагается быстро. Для воспроизводимости, шарики должны быть ресуспендировали полностью и соответствующий объем извлекается быстро, до того, как шарики начинают оседать. Одним из вариантов является предварительно разбавленной определенное количество шариков в большем объеме. Эти предварительно разбавлено шарики могут быть добавлены в большем объеме (15 л вместо 1,5 л), чтобы избежать ошибок пипетки. Если надлежащем уходе не принято, будет эксперимент-на-эксперимента изменчивость в количестве шариков, используемых. Это может повлиять на скорость агрегации, что приводит к различиям в совокупном размере на определенное время.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
