Abstract
细胞 - 细胞粘连是基本多细胞生命，并通过细胞表面的蛋白质得到大量不同的介导。然而，对于许多这些蛋白质的粘合剂的相互作用是知之甚少。在这里，我们提出一个简单，快速的方法表征假定同嗜细胞粘附分子的粘接性能。培养HEK293细胞被转染的DNA质粒，编码细胞表面蛋白的分泌，抗原表位标记的胞外结构域。使用特定的表位标签官能珠，可溶的，分泌的融合蛋白是从该培养基中捕获。经涂覆的珠粒然后可以在珠凝集测定法或荧光珠分选试验来测试同嗜性粘附直接使用。如果需要的话，诱变可以被用来阐明所需粘附特定氨基酸或结构域。该测定中，只需要少量的表达的蛋白质，不要求生产稳定的细胞系，并且可以ACCOmplished在4天。
Introduction
细胞 - 细胞粘连是多细胞生物体的发展和完整性必不可少的，是由细胞表面分子的大量不同的介导。许多这些粘附分子已经确定和特点，尽管很多有待发现。有几种方法用于研究细胞粘附分子的性质（粘附分子），包括细胞分选测定法，细胞聚集测定法1-8和生物物理方法，如原子力显微镜和表面力谱9-12。
偶数简化在使用的细胞系的体外系统的复杂性使得很难确定推定的CAM的粘合性能。通常情况下，分子被认为是CAM，如果它诱导细胞聚集时，转染到非粘着的细胞系。然而，很明显，这不是粘附活性的直接证据。例如，便于在细胞表面输送的或稳定CAM也会导致更多的细胞聚集1,13。此外，一个真正的CAM可能无法介导细胞聚集，如果该细胞系缺乏所需的细胞表面运送或稳定等共同因素。
为了避免这些复杂的因素，即是基于这样的构思更直接测定法可以采用该粘合剂的相互作用应该是胞外结构域的一个固有的生化特性。而珠最初用于表征伍-CAM 2中 ，已扩展这些测定已为了研究钙粘蛋白介导的粘附12,14,15。使用融合在C-cadherin的胞外域Fc融合后，Gumbiner实验表明，多种钙粘蛋白重复导致同种相互作用14。使用类似的珠子聚集试验，E-钙粘蛋白和N-cadherin的附着力也被定性12,15，因为有许多protocadherins 1,15-18和唐氏综合症黏附分子亚型的果蝇
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Protocol
1，细胞的制备（日-2至0）
- 分裂的HEK293细胞1:5使用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液孵育在生长培养基，在37℃，5％CO 2，直到60 - 80％汇合（2 - 3天）。对于每种条件，培养的细胞在2×100毫米培养皿中。
2，细胞转染（第1天）
- 转染HEK293细胞与质粒编码的Fc-融合使用转染试剂，如脂质体。也可以使用这导致可比较的转染效率的替代方法。
- 回到转染的细胞来孵化24小时。
3，细胞增殖（第2天）
- 预热生长培养基不胎牛血清（-FBS）至37℃。
- 涮菜2倍用10毫升生长培养基-FBS，并返回菜到37℃培养箱中培养1小时。
- 涮菜的文化再一次用10毫升生长培养基-FBS，共3次洗涤。
- INCU大怒的转染HEK293细胞，在37℃下再48小时无FBS收集媒体面前。
4，珠聚合（4日）
- 收集从培养皿媒体，从各对菜肴传输媒体到50ml锥形管中并旋转，在500×g离心5分钟以沉淀细胞碎片。
- 从50ml锥形管中的过滤介质为使用30ml的注射器和0.45微米注射器式滤器的离心过滤。
- 旋转离心过滤器在4000 XG和4℃直至浓缩培养基的体积为约500微升（约15分钟）。重复，直到所有培养基添加了浓缩。
- 加入1.5微升蛋白G磁珠到1ml冰冷的1.5ml微量离心管中的每个样品结合缓冲液，代替上的磁铁和除去缓冲。立即将浓缩的培养基加入到蛋白G磁珠。
- 旋转管在4℃下搅拌2小时。
- PL在磁铁的王牌管和删除媒体。迅速用冰冷的洗两次珠1ml结合缓冲液，然后重悬珠300μL结合缓冲液。
- 分裂悬浮珠粒成2管，加入150μl到每一个试管中，然后加入1.5微升200mM的氯化钙或200mM的EDTA为“钙”和“无钙”的条件下，分别。
- 传递来自每个条件100μl到一个凹陷以及滑动并收集用透射光显微镜（ 图2）的显微照片。收集从图5场图像的每个实验中，在每个期望的时间点。
5，数据分析
- 使用ImageJ，或类似的图像分析软件， 使用 Import /图像序列......从文件下拉菜单中的五个图像数据集开放的。这些将被打开的图像堆栈。
- 在图像 / 属性...对话框中，更改I法师单位为像素，并设置像素宽度和像素高度为1.0。
- 转换的图像通过调整/阈值...命令，在图像下拉菜单中的二进制文件。设置阈值，以包括有助于珠或珠粒料的像素，但排除背景和小颗粒。适用于堆叠中的所有图像。
- 在设置测量对话框，检查区和堆栈中的位置框。
- 运行分析颗粒...在分析下拉菜单。这将产生鉴定粒子，包括它们的尺寸（面积），并在其被识别的图像的列表。
- 重复此过程的实验和实验条件。
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Representative Results
一个示例实验示于图2，其示出钙依赖性珠聚合用N-钙粘蛋白与Fc融合（NcadEC-Fc）的胞外域。在不存在的钙，珠表现出很小或没有聚集倾向并有随时间（ 图1A，C），没有增加的聚集体尺寸。在钙离子的存在下，珠粒涂有NcadEC-Fc的节目健壮聚集，以聚集体大小随时间增加（ 图1B中的C）。本实验重复3次，以每一个实例包括图像从五个非重叠领域。粒径在像素区域中的五个字段每个骨料进行测定。这些数据的平均值在每个时间点，在每个实验中。来自三个实验中的数据进行平均，以确定装置和测量的标准误差在每个时间点（ 图2C）。
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图1：使用分泌，表位标记的珠子聚集测定胞外结构域。 （一）示意图显示了一个典型的单次跨膜细胞粘附分子（上方）的组织，其中有一个信号序列（S），胞外域，跨膜结构域（T）和胞内结构域（ICD）。来产生胞外结构域，一个段缺少融合到人IgG（底部）（B）当转染到培养的细胞的Fc区的跨膜和胞内结构域的分泌形式，该ectomain-Fc融合表达并分泌到培养基中，在那里它可以被捕获和纯化的蛋白A或蛋白G磁珠。蛋白A或蛋白G被示为在小珠黑圆（C）洗涤后，将胞外域-Fc包被的磁珠被允许聚集，作为同嗜性粘合剂相互作用测试。ig1highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
图2珠聚集试验。 （一）经典钙粘素，如N-cadherin和E-钙粘蛋白，介导钙依赖性，同嗜附着力。在不存在钙的（不添加钙和2mM EDTA），钙粘素不能介导粘附相互作用。这里展示的是涂有斑马鱼Ñ-钙粘蛋白与Fc融合（NcadEC-Fc的）的胞外结构域的蛋白G磁珠的图像（B）NcadEC-Fc包被的珠子被允许在为2mM氯化钙存在下聚合1小时2。通过N型钙粘蛋白胞外结构域同嗜性粘附力是从大珠的聚集体的形成明显的（C）作为粘合性的半定量测量，聚集体的尺寸可以被测量。一种方法来完成，这是测量所占据的区域不同的集合在透射光图像。聚合区域的平均大小可以被绘制为时间的函数，如下所示，或平均聚合区中存在或不存在的钙的比例是可以计算出来的。的NcadEC-Fc包珠中的钙（实心圆）存在的聚集和在没有钙（空心圆）在15分钟的时间间隔超过1小时的过程中确定的。 请点击这里查看这个放大版图。
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Discussion
细胞粘附是多细胞生命的一个基本特征，是由细胞表面蛋白的一系列广泛的介导。在这些中，具体的粘合性能被理解为仅一个相对小的比例。在这里，我们描述了一个简单，快速的协议，用于研究融合到一个方便的表位标签分泌的胞外结构域的同种粘附能力。这种方法具有许多重要的优点。第一，稳定细胞株不要求14,20，如可以通过100毫米培养皿中的瞬时转染来产生足够量的蛋白质。这使得构建大数量的筛选- 如点或缺失突变体-没有精力和费用产生和保持大量的细胞系。其次，这些磁珠检测是公认的粘附分子的生物化学特性的降低了系统的直接考验。因此，粘附可直接归因于蛋白质根据调查，而不是潜在的间接影响。第三，探讨可能的辅因子的作用，细胞可以被共转染的推定的粘附分子的分泌形式和其假定的辅因子，每一个不同的表位标签。此外，这种方法是灵活的，因为它可以适于与多种合适的表位标签的使用。例如，均匀尺寸的磁珠可被缀合到蛋白质A或G（Fc的标记），链亲和素（链球菌II标签），谷胱甘肽（GST标签），或者TALON或Ni：NTA（6倍His标签）。最后，荧光珠的可用性允许适于相同的协议进行简单的排序分析，调查同嗜特异性。在这种情况下，红色和绿色的荧光珠，每涂有不同的CAM，混合和掺混或偏析的程度进行评估。
尽管有这些优势，也有注意事项。首先，在溶液中珠蛋白片段不扼要重述的体内状况的复杂性。单个细胞表达的细胞表面蛋白的表达及其细胞内作用的特定互补的。每个这些可能对粘附性的直接或间接的影响，并且许多这样的效果不会反映在珠测定。例如，一个分子可介导强，异嗜性粘附力（它是一个CAM），但不会诱发在这些测定法珠凝聚。第二，珠测定是仅半定量的，并且不提供对粘合剂的相互作用的相对强度可靠的定量信息。最后，所有这些我们已经调查了分子是I型，单通膜蛋白，其中所述粘合剂结构域存在于单一的，连续的多肽。很可能是许多粘附分子可以是具有从多个胞外结构域的区域建立的粘合界面的多跨膜蛋白。该测定中也不会很容易适应这样的分子。
佛ř珠测定是可靠的，该条件必须是可重复的。有变异性的这些分析中两个潜在来源。第一是变性的蛋白质的水平。如果有变化的表达水平，由于变化的转染效率或欠佳的表达的蛋白质中，珠子可能不饱和，其结果可能是不可靠的。此前珠聚集实现使用规定的纯化胞外结构域融合蛋白的量。通常情况下，该融合蛋白纯化中从稳定细胞株大批量，并且可以在多个实验中使用。由于在每个实验中所用珠的量和所需的蛋白质的量是非常小的，可比较的再现性可以通过瞬时转染来实现。我们使用的磁珠有重悬珠〜250纳克/升的结合能力。的2×100毫米培养皿中的结果的典型的转染在广阔的过量的蛋白质，它可与第二结合步骤进行验证，使用超游泳后的融合蛋白的小珠的初始结合。变异性的第二电势源是用于珠子的数量。我们使用的磁珠提供为30毫克/毫升的浆液很快平息。再现性，将珠粒必须完全重新悬浮和相关量提取很快，珠开始沉淀之前。一种替代方法是预先稀释在一个较大的体积限定的微珠量。这些预稀释珠可以在一个更大的体积（15L，而不是1.5升）加入，以避免移液误差。如果不采取适当的照料，将有实验对实验变异性中的使用珠子的数量。这可能会影响聚合速率，从而导致在特定时间中的聚集体尺寸的差异。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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