Abstract
Значительная часть пост-эмбрионального развития дрозофилы, дрозофилы, происходит в рамках набора SAC-как структуры, называемые имагинальные диски. Эти диски порождают высокий процент взрослых структур, которые находятся в пределах взрослого лету. Здесь мы опишем протокол, который был оптимизирован для восстановления этих дисков и подготовить их для анализа с антителами, транскрипционных репортеров и белковых ловушек. Эта процедура лучше всего подходит для тонких тканей, таких как имагинальных дисках, но может быть легко модифицирована для использования с более толстыми тканей, таких как личиночной мозга и взрослых яичника. Письменное протокол и сопровождающие видео поможет читателя / зрителя через рассечения третьей возрастной стадии личинок, фиксации ткани и лечения имагинальных дисках с антителами. Протокол может быть использован, чтобы рассекать имагинальные диски от младшего личинок первой и второй возрастной стадии а. Преимущество этого протокола является то, что она является относительно коротким, и он имеет бытьан оптимизирован для сохранения высокого качества из рассеченной ткани. Еще одним преимуществом является то, что процедура фиксации, который используется хорошо работает с подавляющим числом антител, которые распознают Drosophila белки. По нашему опыту, есть очень небольшое количество чувствительных антител, которые не очень хорошо работают с этой процедурой. В таких ситуациях, появится средство, чтобы быть использовать альтернативный коктейль фиксации, продолжая следовать указаниям, которые мы, предъявляемым к шагов рассечение и инкубации антител.
Introduction
Для более века плодовой мушки, дрозофилы, был главным система для изучения развития, поведение и физиологию. Развитие в лету можно разделить на две большие стадии: эмбриональных и пост-эмбриональных с большей частью последнего, происходящих в монослоя эпителия называемых имагинальные диски 1-3. Чертежи имагинальных дисках были впервые опубликованы в 1864 году Августом Вейсмана в рамках своего широкого монографии о развитии насекомых 1. Эти диски начинают свое развитие во время эмбриогенеза, по образцу в течение личиночной стадии, пережить массовое гистолиза ранних куколки, и в конечном итоге привести к высоким процентом взрослых структур, которые находятся в пределах взрослой мухи 1-14. Во время развития личинок каждый диск делает несколько важных решений относительно судьбы, формы и размера. В первом и втором личиночных возрастов, диски поручено принятия первичный судьбу, establisповесят границы отсека, приняв правильную форму и генерации необходимого количества клеток 15-16. Во время третьего личиночного возраста и ранней стадии предварительного куколки, имагинальные диски продолжают делиться и с рисунком, как клетки принять свои терминальные судьбы 16.
В ранней истории Drosophila биологии развития, имагинальные диски были изучены почти исключительно в контексте нормального развития и в ограниченных случаях, когда утрата или усиления из-функции мутант жизнеспособным. Использование рентгеновских лучей, чтобы побудить митотический рекомбинации позволило летальных мутаций, которые будут проанализированы в клеточных клонов в рамках взрослой и личиночной тканей. Этот метод был усовершенствован путем введения трансгенных методов для анализа потерь и получить-из-функции мутации в обеих личинок и взрослых тканей. Количество антитела, транскрипционных репортеров и белка ловушки для описания молекулярной ландшафт дикого типа и мутантных тканей также строительстваantly растет. Используя эти молекулярные маркеры для анализа потерь и получить-из-функции мутант клонов клеток сделало более целесообразным, чтобы получить в режиме реального времени понимание того, как мутантные клетки отклоняются от своих диких родственников типа в процессе разработки. Чтобы правильно воспользоваться этими инструментами и реагентов важно иметь качественные препараты имагинальных дисках, которые можно просматривать, сфотографировали и проанализированы. Цель этой рукописи является обеспечение оптимизированный протокол для выделения и подготовки глаз-усиков диска комплекса (Рисунок 1А). Она также может быть успешно использован для выделения широкий спектр дополнительных дисков, включая те, которые приводят к возникновению крылья, жужжальцам, T1-T3 ног и половых органов (Рисунок 1В-E). Эта процедура, с незначительными изменениями, был использован для изоляции имагинальные диски из Drosophila в течение почти восьмидесяти лет.
Как описано выше, так как большинство гены экспрессируются во муltiple стадиях развития и в множестве тканей, часто невозможно, чтобы изучить эффекты, что нулевые мутанты имеют на всей глазом как животное умирает задолго до третьего возраста личиночной стадии. Четыре метода сделали изучение более развитых тканей, таких как сетчатка значительно более сговорчивым. Первым из них является метод Flippase (ФЛП) / Flippase рекомбинация Целевая (FRT) генерировать мутантных клонов клеток в противном случае дикого типа ткани 17-19. В данном случае мутантный ткань идентифицированы по отсутствию визуального маркера, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его можно сравнить с окружающей ткани дикого типа, в которых присутствует GFP (2D) Рис. Второй метод "ар-аут", в котором трансген экспрессируется в популяции клеток 20. В этом случае клеточные клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP репортер (Рисунок2E). Третий является анализ Мозаика с репрессируемый сотовый Маркер (MARCM) техники, которая сочетает в себе элементы мутантного клона ФЛП / FRT и ФЛП-из выражений систем 21. С помощью этого метода трансген может быть выражена в популяции клеток, которые одновременно мутанта для индивидуального генетического локуса. Как ФЛП-из клонов, MARCM клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP маркер (Рисунок 2F). И, наконец, гены и РНК-интерференции конструкции могут быть выражены в имагинальных тканей под контролем конкретных промоутер-GAL4 конструкций. Эти четыре метода увеличили интерес к изучению имагинальные диски с мутантные или Сверхэкспрессия клоны или узоры можно напрямую сравнивать с соседней дикого типа ткани. Метод, описанный в этой процедуре была разработана таким образом, что исследователи, изучающие постэмбрионального развития взрослых тканях у дрозофилы,особенно те, которые получены из глаз-усиков диска, смогут получить качественное ткани для анализа. Хотя отдельные исследователи сделали небольшие изменения, в основе этой процедуры (которые мы опишем здесь) остается практически неизменным. После получения высокого качества ткани имеет решающее значение для изучения имагинальных дисков мы надеемся, что это написано протокол и сопровождающие видео будет служить в качестве ценного учебного ресурса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка личинок
- Заполните 35 мм чашки Петри с рассечение буфера.
- Поместите личинок в чашку Петри и дать им возможность плавать вокруг в течение нескольких минут (самоочищающиеся шаг).
- Трансфер личинок в пул рассечение буфера на основе силикона вскрытии пластины. Этот пул должна быть на одном краю пластины. Рассечение пластина состоит из силиконового раствора, который был наливают и закаленной в стеклянную чашку Петри.
- Использование Пастера-пипетки, разместить большее объединение рассечение буфера в середине вскрытии пластины.
- Использование # 5 щипцы, передачи одного очищенный личинку из небольшого бассейна на более широкий круг рассечение буфера.
2 Грубый Рассечение личинок
- В то время как личинка все еще находится в большой луже рассечение буфера обхватить личинку с пинцетом. Одна пара щипцов следует использовать, чтобы захватить рот крючки в то время как другая пара щипцов используется для хранения Анималь-прежнему (захватить личинку осторожно в 1/3 длины тела).
- Держите стабилизировать пару щипцов, содержащих кутикулу вблизи устья крючков в то время как быстро потянув остальную часть тела прочь с второй парой щипцов.
- Когда личинка начинает рвать на части вы почувствуете легкое освобождение напряженности. Отпустите личинку от щипцов и позволяют "внутренности" личинки выливаться. Это позволяет имагинальных дисков, чтобы оставаться в своей нормальной конформации и предотвращает их от деформации.
- С одной парой щипцов понять рот крючки снова, чтобы удерживать передний конец личинки на месте. Использование другой парой щипцов удалить ниже 2/3 личинок в том числе внутренних кишки. Примечание: комплекс, содержащий рот крючки, глаз-усиков диски, полушарий мозга, вентральной ганглиозных, слюнных желез, некоторые диски ног, и перекрывающие кутикула останется.
- С парой щипцов осторожно удалите облегающего кутикулу, слюнных желез, диски ног идругой ткани. Примечание: только ткани, которая должна остаться в рот крючки, глазные-усиков диски, полусферы мозга и вентральный нервный узел (рисунок 3).
- Повторите шаги 2.1-2.5 с дополнительной личинок в течение 15-20 мин. Примечание: имагинальные диски, которые остаются в рассечение буфера в течение более длительных периодов времени, как правило, ухудшает и в конечном счете будет выглядеть как далеко не идеальных образцов, которые будут фотографировать. Таким образом, после того, как максимум 20 мин все рассеченные ткани должны быть переданы в PLP фиксатора (смотри ниже).
3 Фиксация и окрашивание ткани с антителами
- Использование Pipetman P-200, передать расчлененные тканей к часовым стеклом, содержащего холодную Параформальдегид-лизин-Периодатное (ПЛП) фиксатором. Ограничение объем переданного буфера рассечение до 50 мкл для минимизации разбавление PLP. Обязательно обрежьте кончик лезвием бритвы так, чтобы отверстие наконечника достаточно большой, чтобы разместить отсеченных тканей. Использование пару щипцов иливольфрамовой иглы убедитесь, что расчлененный ткани полностью погружены для того, чтобы собственно фиксация происходит. Инкубируйте рассеченные ткани в холодной PLP фиксатором в течение 45 мин. Это инкубирование может происходить при комнатной температуре без перемешивания.
- Использование Pipetman P-200, передать расчлененные ткани мыть буфер (RT) с помощью другого сократить желтый наконечник в течение 45 мин. Ограничение объем передаваемой PLP до 50 мкл для минимизации разбавление промывочного буфера. Примечание: все расчлененные ткани должны быть полностью погружены.
- Трансфер 20-30 комплектов расчлененный ткани до 1,5 мл пробирке. Примечание: если большее число глазных-усиков комплексов диска объединены внутри трубки, существует возможность того, что ткани в нижней части трубки не будут подвергаться образом с антителами. Для получения оптимальных результатов не более 20-30 глаз-усиков комплексы дисковые не должны присутствовать в одной пробирке. Рассеченные ткани будет оседать на дне пробирке. Поэтому в последующие этапы UС.Е. Pipetman удалить и заменить промывочного буфера, блокирующий решение, и антитела.
- Удалить промывочного буфера и заменить 100 мкл блокирующего раствора: 10% нормальной козьей сывороткой в промывочного буфера. Выдержите при комнатной температуре с легким вращением на столе ротатора в течение 10 мин.
- Удалить блокирующий решение и заменить 100 мкл первичных антител, которые соответствующим образом разведенных в 10% нормальной козьей сывороткой. Инкубируют при комнатной температуре при осторожном вращении в течение 16 часов.
- Удалить первичных антител и заменить 750 мкл промывочного буфера. Поместите трубки на nutator и позволяют nutate при комнатной температуре в течение 10 мин. Примечание: первичное антитело может быть сохранен (хранить при 4 ° С) и повторно позже. Повторное использование антител одного раза может помочь в снижении неспецифического связывания.
- Разрешить головки оседают на дне пробирки, а затем удалить промывочного буфера и добавить 100 мкл вторичных антител, которые соответствующим образом разбавленного в 10% нормальной сывороткой. Выдержите при комнатной температуре с легким вращением для 2̵1; 4 ч.
- Удалить решений вторичное антитело из ткани и замены с 500 мкл промывочного буфера. Разрешить ткани оседают на дне пробирки.
- Использование P-200 и вырезать желтый наконечник, передать все расчлененные тканей в луже промывочного буфера, который был размещен на вскрытии блюдо. В то время как приступить к следующему шагу изобразительного вскрытия, ткань будет инкубировать в промывочного буфера. Это помогает удалить избыток вторичного антитела.
4 Изысканные Рассечение Eye-усиков Disc комплексов и Монтаж на слайдах
- Используйте одну пару щипцов обхватить кутикулу устами крючков с вентральной стороне комплекса вниз. Со вторым пинцета удалите из двух долей мозга, закрыв вторую щипцов в пространстве между головного мозга и глаз дисков (рисунок 3, красная стрелка) и стремительно тянет мозг от устья крючков.
- Продолжая удерживать на рот крючки, отщипнутьткань как можно ближе к связи между усиков части глаз-усиков диска и рта крючков (рис 3, синяя стрелка). Примечание: глазные-усиков комплексы дисковые должны быть свободны от всех тканей (рисунок 1А). Продолжайте, пока все желаемый ткани желательно, чтобы можно поместить на слайды не была расчленена. Этот протокол может быть адаптирован, чтобы изолировать крыло, haltere, ноги и генитальные имагинальные диски (рис 1B-E).
- Добавьте две небольшие кусочки папиросной бумаги (ширина покровные) около 3 в. Друг от друга на вскрытии блюдо. Поместите предметное стекло на блюдо - два куска тонкой бумаги должны находиться под концах слайде. Это предотвратит сползание от прилипания к силиконовой основе рассекает блюдо.
- Использование P-20 с неразрезанного наконечником, добавить 9 мкл анти-отбеливающего агента в середине стекло микроскопа. Это предотвращает обесцвечивание ткани, если смотреть с флуоресцентнойсвет.
- Используя тот же режиссерский совет, собрать все глаза-усиков диски и добавьте их в капле анти-отбеливающего реагента. Сведение к минимуму количества промывочного буфера, который осуществляется более. Попытка ограничить объем промывочного буфера 10 мкл или менее.
- Используйте пару щипцов для разделения и распростерла глаз-усиков дисков в капле анти-отбеливающего реагента. Разрешить диски для инкубации в анти-отбеливающего реагента в течение нескольких минут. Примечание: диски получится ясно, как ткань поглощает анти-отбеливающий реагент.
- Использование тонкой кистью аккуратно опустите покровное на образец. Это предотвращает образование воздушных пузырьков.
- Магазин скользит при -20 ° С до готовности для просмотра глаза усиков или другие имагинальные диски, используя свет или флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод, описанный выше надежно производит высококачественный материал для анализа с в точке зондов, транскрипционных репортеров, белковых ловушек и антител. На рисунке 1 мы показываем глаз-антенны, генитальный, крыло, haltere и ног диски, которые обычно восстановленные с помощью этого метода. Эти диски были обработаны с фаллоидином-конъюгированного флуорофора, который связывается с F-актина и, следовательно, описание каждого элемента. Если ткань была зафиксирована должным образом, то морфогенетическое борозду диска глаз, края концентрической ткани складки в половых, усиков и ног дисков, и спинной-вентральной оси крыла и haltere дисков будет все выглядеть как острые края . Если ткань надежно закреплен, то антитела, флуоресцентные белки и в точке зондов также покажет острые узоры. Несколько примеров показано на рисунке 2. Тройке Панели индикации диски, которые были окрашенных различных антител в то время какнижние три панели показывают дисков, на которых GFP используется для обозначения популяции клеток.
Один из самых поразительных особенностей глаза-усиков диска морфогенетическое борозда (1А), который можно рассматривать как углубление в ткани, проходящей вдоль спинной-вентральной оси 1, 22. До третьего личиночного возраста все клетки в разработки глаз являются без рисунка, недифференцированные, и морфологически неотличимы друг от друга. В начале третьего личиночного возраста морфогенетическое борозда инициирует на заднем крае поля глаз и прогрессирует вперед к глаз / усиков границы 22. Как борозда прогрессирует по полю глаз море неупорядоченных клеток превращается в упорядоченный массив периодически расположенных единичных глаза или омматидиев (Рисунок 1А) 22-23. Впереди борозды регуляторная сеть ген, который включает в себя Рах6 гомологов Eyeless (EY) каналов клеткик глазным судьбы (Рисунок 2А) 15. Инициации и прогрессировании самой борозды зависит от деятельности Hedgehog (Hh) и Decapentaplegic (DPP) пути 24-29 сигнализации. Действительно репортер DPP-LacZ точно отражает экспрессию DPP локуса в борозде (Рисунок 2B) 30-31. Как клетки выйти из борозды и начинают принимать свои терминальные судьбы, они выражают маркеры клеток конкретных, таких как эмбриональное смертельной аномальной видения (Elav), который кодирует пан-нейронов РНК-связывающий белок (Рисунок 2C) 32-34.
Рис.1 В имагинальные диски из дрозофилы. (
Рисунок 2 Клональный и выражение анализ глаз имагинального диска (- F). Конфокальные образы глазных имагинальных дисках. () Рах6 белок Eyeless (Ey) распространяется широко впереди морфогенетическом борозды. (B) DPP-LacZ транскрипции REPORTEг реагирует на сигнализации Hh и выражается в морфогенетическом борозды. (C) пан-нейронов РНК-связывающий белок Elav распространяется во всех развивающихся фоторецепторов за морфогенетическом борозды. (D) глаз диск, содержащий с потерей функции клонов генерируемых системой, ФЛП / FRT. Клоны обозначены на отсутствие GFP (E). Глаз диск, содержащий более-выражения клонов, созданных с помощью ФЛП-системе. Клоны положительно отмечены GFP. (F) глаз диск, содержащий MARCM клонов. Как FLP-системе, в MARCM клоны могут быть идентифицированы по наличию GFP. Все обнаруженные белки и генотипы, перечислены в рисунке. Передняя находится справа и спинной вверх.
Рисунок 3 Eye-антенна-мозг комплекса. SCHEmatic рисунок первого дня грубых продуктов рассечение. Единственные ткани, которые должны быть установлены в рот крючки, диски глаз-антенна и мозг (часто раз брюшной ганглий останется прикрепленные а - не показаны). Фиолетовый = мозг, зеленый = глаз-антенна диски, коричневый = рот крючки. Передняя находится справа. Если рассекает ногу, крыло, haltere и генитальные диски, внешний кутикула личинки еще должны быть прикреплены к этим тканям. Не снимайте лежащего кутикулу, как вы могли потерять имагинальные диски во время последующих переводов по различным антител, блоков и моющих растворов. Избыток ткани могут быть удалены в течение мелкими шагами рассечение (4.1-4.2).
Рисунок 4 Положение имагинальных дисках внутри личинки дрозофилы. Схемыкрестики чертеж относительного положения глаз-антенн, ног, крыльев, haltere и половых дисков в третьей возрастной стадии личинки. Глаз-усиков диск окрашивается в зеленый, диски ноги находятся в синий, повод диск находится в фиолетовый, крыло диск находится в коричневый / оранжевый и половых диск находится в светло-коричневый. Передняя находится справа.
| Название Solution |
| 8% параформальдегидом |
| 0,2 М одноосновного фосфата натрия |
| 0,2 М фосфат натрия Disbasic |
| 1 N гидроксида натрия |
| 10% тритона |
| 0,1 М натрий-фосфатный буфер (Буфер Препарирование) |
| 0,1 М натрий-фосфатного буфера + 0,1% Тритон (промывочного буфера) |
| Лизин буфера |
| 2% Параформальдегид-лизин-Периодатное Фиксатив (ПЛП) |
| 10% нормальной козьей сывороткой |
Таблица 1: Перечень необходимых решений.
| 8% Параформальдегид раствор |
| К 50 мл коническую колбу добавить следующее: |
| 2,0 г параформальдегида |
| 23,0 мл дистиллированной воды |
| 4,0 капли 1 N гидроксида натрия (из стекла пастеровской пипетки) |
| Смешайте и тепла на магнитной мешалки до решения не достигнет нежному кипению |
| Разрешить, чтобы мягко кипятить до тех пор, параформальдегиде полностью не растворится |
| Поместите на льду до холодной (сделать свежий перед каждым вскрытия) |
| 0,1 М фосфатного буфера (Препарирование (Р) буфера) |
| К 50 мл коническую трубку добавить следующее: |
| 18,0 мл 0,2 М двухосновного фосфата натрия |
| 7,0 мл 0,2 М одноосновного фосфата натрия |
| 25,0 мл дистиллированной воды |
| Хранить при температуре 4 ° С (1 неделя сроков годности) |
| 0,1 М фосфатный + Моющее средство буфера (Wash (W) буфера) |
| К 50мл коническую трубку добавить следующее: |
| 18,0 мл 0,2 М двухосновного фосфата натрия |
| 7,0 мл 0,2 М одноосновного фосфата натрия |
| 25,0 мл дистиллированной воды |
| 0,5 мл 10% Тритон |
| Хранить при комнатной температуре (1 неделя срок годности) |
| Лизин (L) Буфер |
| К 50 мл коническую трубку добавить следующее: |
| 0,4 г Лизин |
| 1,2 мл 0,2 М двухосновного фосфата натрия |
| 8.0 мл Рассечение (P) Буфер |
| 10,0 мл дистиллированной воды |
| Встряхнуть решение до лизина полностью не растворится |
| Поместите на льду до холодной (сделать свежий перед каждым вскрытия) |
| 2% Параформальдегид - лизин - Периодатное (ПЛП) фиксатор |
| 0,1 г натрия Периодатное |
| 15,0 мл лизин (L) буфера |
| 5,0 мл 8% параформальдегидом |
| Встряхнуть решение хорошо, пока периодат натрия полностью не растворится |
| Поместите на льду до холодной (сделать свежий перед каждым вскрытия) |
Таблица 2: Рецепты для искомых решений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя эта процедура в значительной степени сосредоточены на изоляции и последующего лечения глазных-усиков дисков, она поддается используется выделить и проанализировать крыло, haltere, ногу и генитальные диски (Рисунок 4). Единственным обязательным модификация протокола для выделения этих дисков (в отличие от глаз-усиков диска) является метод грубой вскрытия (раздел 2 протокола). Первый грудной ноги (Т1) пара находится в передней части личинки и могут быть восстановлены с помощью следующих протокол для изоляции диска глазного-усиков. Однако второй грудной ноги (Т2) диски прикреплены к кутикуле. Для выделения этих дисков пара щипцов должны использоваться для хранения рот крючки (как описано выше), а другая пара щипцов следует использовать обхватить брюшной кутикулы животного (убедитесь, что обхватить личинку о 1/3 от рот крючки. Личинка можно просто нарезать филе, оторвав вентральной кутикулу от остальной части стива. Т2 ноги будут оставаться прикрепленной к кутикуле. Третий грудной (T3) нога крепится к крылу и haltere дисков как часть комплекса, которая сама по себе также прикрепленной к кутикуле. Вы можете выбрать, чтобы отделить диска комплекс и ноги T2 от кутикулы на данном этапе или сохранить кутикулы-диска комплекс вместе в течение последующих фиксации / антитело этапов инкубации и изолировать диски во время тонкой рассечение части процедуры (раздел 4) . Для восстановления генитальные диски, лучше понять личинок на миделе с одной парой щипцов, а затем очистить брюшной кутикулы прочь с другой парой щипцов, начиная с средней части и заканчивая на заднем конце тела личинки. Рекомендуется щипцы использоваться, чтобы убрать все лишние ткани, а затем передать только генитальный диск для закрепляющего раствора с использованием P-200 Pipetman и желтую кончик конец которой был сокращен с лезвием бритвы.
Эта процедура лучше всего подходит для TISSЕЭС ограниченной толщины, такие как имагинальных дисках и работает лучше, если антитела используются отличаются высоким титром и специфичности. Тем не менее, он может быть адаптирован, чтобы хорошо работать с более толстыми тканей, таких как взрослого яичника, яичка, и головного мозга, а также с низким титром антител или те, которые дают больше, чем желаемой "фонового" окрашивания. При работе с более толстых тканей, предполагается, что оптимальные результаты могут быть получены путем простого увеличения концентрации параформальдегида и / или инкубации в PLP фиксатором в течение более длительных периодов времени. Поскольку собственно фиксация расчлененный тканей имеет важное значение для успеха с этим протоколом он также предположил, что эффективность увеличения концентрации параформальдегида и / или увеличения длины фиксации оцениваться с фаллоидином (Рисунок 1). В частности, особое внимание следует обратить на "резкость" клеточных контуров и других физических ориентиров в ткани (т.е. morphogenetic корпусов). Еще один способ убедиться, что ваш ткани (особенно толстые образцы) фиксируется должным образом подготовить 8% параформальдегида и PLP решения свежие перед каждым вскрытия. И, наконец, общее качество вскрытия может быть увеличена, если вырезали ткань в течение коротких периодов времени и ткани переносят в закрепителя как можно скорее. Предполагается, что рассекает не более чем на 15-20 мин. Пройдя на более короткие сроки повышает качество сохранения тканей.
Этот протокол хорошо работает с широким спектром антител, но это правда, что некоторые антитела не очень хорошо работают с PLP фиксатором. Один печально известный пример является антитело, которое распознает Грубый (Ro) транскрипционный фактор. Грубый выражается в и необходим для спецификации подмножества разработке фоторецепторы 35. Анти-Ro антитела работает лучше, а не с PLP, а с ТРУБ - ЭГТА - MgSO 4 (PEM) бuffer 36. Аналогичным образом, другие антитела могут работать лучше всего на ткани, которые были инкубированных в еще других фиксаторов. Предполагается, что, если не указано иное, PLP фиксатор следует вначале. Если неудачно, то процесс поиска альтернативный фиксатор должен начать.
Один общий вопрос, чтобы противостоять является рабочая концентрация антитела идет речь. Часто вы можете быть первым исследователем использовать определенный антитела для обнаружения белков в вашем интересующей ткани. Рабочая концентрация может отличаться от того, что сообщалось в других тканях. Предполагается, что рекомендуемая концентрация судить в первую очередь. Увеличение концентрации антитела, если сигнал не может быть замечено. С другой стороны, если рекомендуемая концентрация дает высокий фон окрашивание с последующим разбавлением антитела должны предстать перед судом. Рабочие концентрации между антителами может изменяться. Например, анти-Глаза отсутствуют (Еуа) антитело разводили 1: 5, а анти-Elav антитела хорошо работает даже при разведении 1: 500. Некоторые антитела даже можно разбавить как далеко вниз, как 1: 3000. Кроме того, эта процедура, как написано, лучше всего работает с высоким антител специфичности. Однако, как многие испытали, некоторые антитела могут связываться неспецифически к ткани, и это может создать неоптимальный изображение. Эта ситуация может быть часто корректируется путем инкубации разбавленный антитела с фиксированными эмбрионов или личинок туш перед добавлением к основным имагинальных дисках. В зависимости от уровня неспецифической фоновой окраски, требуемая длина «до поглощения" может варьироваться и должны быть разработаны на экспериментальной основе. Кроме того, можно увеличить отношение сигнал / шум на повторное использование антител несколько раз или путем проведения нескольких раундов предварительной поглощения.
При принятии решения, на которых диски должны использоваться в публикациях и / или презентации, то лучше выбрать диски, которые были ориентированы с апикальной стороны ориентированной вверх подопечные. Это также лучше использовать диски, которые не сложенные. Это особенно верно в отношении глаз-усиков диска. Брюшная сторона диска, как правило, раз и, к сожалению, мало что можно сделать, чтобы предотвратить это. Одним из решений является рассекать молодых диски, так как они, как правило, раз гораздо меньше. Другим вариантом является просто рассекать большое количество дисков, пока не получите тот, который полностью плоским. Общая форма глаз-усиков диска может зависеть от скорости, с которой личинка раздираемой. Если один тянет личинку кроме слишком быстро отверстие, через которое мозг-диск комплекс проходит небольшой и глаз-усиков диск выходит сложить и / или растягивается. Лучше медленно потяните, пока личинка не начнет рвать раз отверстие будет больше. Тогда вы можете продолжать медленно потяните диска комплекс мозга и глаз-усиков. Имейте в виду, что вы никогда не можете тянуть слишком медленно. Кроме того, обратите внимание, что скорость, с которой разорвать ткань не является фактором в изоляции из других тканей.
ve_content "> Жизненный цикл дрозофилы состоит из трех личинок фаз. Важные события развития состоится в течение каждого одного из этих фаз, таким образом, это может быть важно, чтобы изолировать ткани не только от третьих личиночных возрастов (которая находится в центре внимания этой процедуры) но также и от первого и второго личиночных возрастов, а также. С одним незначительным исключением, эта процедура может быть использована, как написано, чтобы изолировать вторую диски Instar. Во тонкой рассечение части процедуры (раздел 4) рекомендуется резкое вольфрама провод должен быть использован, чтобы отделить глаз-усиков диск от посторонней ткани, как рот крючки, головного мозга и слюнных желез. вольфрамовой проволоки также может быть использован для разделения T2 / T3 нога, крыло и haltere диски друг от друга и вышележащих кутикулы . Это рекомендуется, что один конец проволоки вольфрама (конец, который будет использоваться для разделения ткани) затачиваться нагреванием в кипящей бане нитрата натрия Другой конец может быть вставлена в контактный тиски;. йявляется позволит вам более легко держать вольфрамовой проволоки. К сожалению, это значительно более трудно выделить неповрежденные личиночных диски, поэтому она рекомендуется поместить весь глаз-усиков диск / мозга / рот крюка комплекс на слайде и накрыть покровным. Количество расчлененный ткани может быть сведено к минимуму с помощью резкого вольфрамовой проволоки, чтобы удалить слюнные железы и перекрывающих кутикулы до монтажа крюка комплекс диска / мозга / рот на предметное стекло. Это сравнительно легко идентифицировать личиночных глаз-усиков диск, когда он по-прежнему ассоциируются с мозга и рта крючков (рис 6А, D из Кумар и Моисея, 2001) 37. Другие имагинальные диски должны быть отделены от кутикулы и помещают на предметное стекло для просмотра.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Дональда Ready и Кевин Моисею для обучения JPK оригинальный имагинальную процедуру диск рассечение. Мы также благодарим Бонни Weasner для половых диска в рисунке 1b и глаз диска в рисунке 2А, Брэндон Weasner для рисунке 3, Блумингтон дрозофилы со Центр лету пятен и Развивающие Исследования Hybridoma банк антител. CMS была поддержана стипендией от Национальных институтов здравоохранения (NIH) GCMS подготовки Гранта (T32-GM007757), Фрэнк У. Патнэм исследовательский грант, и исследовательский грант Роберт Бриггс. JPK поддерживается грантом Национального института глаза (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
