Abstract
جزء كبير من التنمية في مرحلة ما بعد الجنينية في ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يحدث ضمن مجموعة من الهياكل التي تشبه الكيس تسمى أقراص تخيلي. هذه الأقراص تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها داخل ذبابة الكبار. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم الأمثل لاستعادة هذه الأقراص وإعدادهم للتحليل مع الأجسام المضادة للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين. هو الانسب هذا الإجراء لأنسجة رقيقة مثل أقراص تخيلي، ولكن يمكن تعديلها بسهولة للاستخدام مع الأنسجة سمكا مثل اليرقات الدماغ والكبار المبيض. سوف بروتوكول مكتوبة والفيديو المصاحبة توجيه القارئ / المشاهد من خلال تشريح يرقات الطور الثالث، تثبيت الأنسجة، والعلاج من أقراص تخيلي مع الأجسام المضادة. بروتوكول يمكن استخدامها لتشريح أقراص تخيلي من الأصغر سنا يرقات الطور الأول والثاني كذلك. وميزة هذا البروتوكول هو أنه قصير نسبيا ولها أن تكونأون الأمثل للحفاظ جودة عالية من الأنسجة تشريح. ميزة أخرى هي أن الإجراء التثبيت أن يعمل يعمل بشكل جيد مع العدد الهائل من الأجسام المضادة التي تعترف البروتينات ذبابة الفاكهة. في تجربتنا، وهناك عدد قليل جدا من الأجسام المضادة الحساسة التي لا تعمل بشكل جيد مع هذا الإجراء. في هذه الحالات، فإن العلاج يبدو أن لاستخدام كوكتيل تثبيت البديل مع الاستمرار في اتباع المبادئ التوجيهية التي وضعناها عليها للخطوات تشريح وحضانات الأجسام المضادة.
Introduction
لأكثر من قرن من الزمان ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، فقد كان نظام رئيس الوزراء لدراسة تطوير والسلوك وعلم وظائف الأعضاء. ويمكن تقسيم تطور في الطيران إلى مرحلتين رئيسيتين: الجنينية وبعد الجنينية مع الكثير من أخذ مكان الأخير ضمن أحادي الطبقة الظهارة تسمى أقراص تخيلي 1-3. ونشرت رسومات من أقراص تخيلي لأول مرة في عام 1864 بحلول أغسطس ايزمان كجزء من له دراسة واسعة النطاق على التنمية الحشرات 1. هذه الأقراص تبدأ تنميتها خلال مرحلة التطور الجنيني، ونمط خلال مراحل اليرقات، البقاء على قيد الحياة تحلل النسج الهائل من المراحل المبكرة العذراء، وفي نهاية المطاف تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها ضمن الكبار يطير 1-14. خلال نمو اليرقات كل أسطوانة يجعل عدة قرارات حاسمة بشأن مصير والشكل والحجم. ضمن الأعمار اليرقية الأولى والثانية، وكلف الأقراص مع اعتماد مصير الابتدائي، تأسيس العهدهينج حدود المقصورة، واعتماد الشكل الصحيح وتوليد العدد المطلوب من الخلايا 15-16. خلال الطور اليرقي الثالث وأوائل مرحلة ما قبل العذراء، ما زالت أقراص تخيلي لتقسيم ومنقوشة كما تعتمد خلايا مصائرهم الطرفية 16.
خلال التاريخ المبكر للذبابة الفاكهة البيولوجيا التطورية، وتمت دراسة أقراص تخيلي تقريبا حصرا في سياق التطور الطبيعي وفي حالات محدودة حيث كانت الخسارة أو الربح من وظيفة متحولة قابلة للحياة. استخدام الأشعة السينية للحث على إعادة التركيب الإنقسامية يسمح للطفرات مميتة ليتم تحليلها في استنساخ خلايا داخل أنسجة اليرقات والكبار. تم تحسين هذه الطريقة من خلال إدخال الأساليب المعدلة وراثيا لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة الطفرات في كل أنسجة اليرقات والكبار. عدد الأجسام المضادة، للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين لوصف المشهد الجزيئي من النوع البري والأنسجة متحولة هو أيضا CONSTتزايد antly. جعلت استخدام هذه الواسمات الجزيئية لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة استنساخ خلية متحولة من الممكن على نحو متزايد لاكتساب فهم في الوقت الحقيقي كيف تنحرف خلايا متحولة من أبناء عمومة النوع البري من خلال التنمية. لاتخاذ صحيح الاستفادة من هذه الأدوات والكواشف فمن الأهمية بمكان أن يكون الإعداد عالية الجودة من أقراص تخيلي التي يمكن مشاهدتها وتصويرها وتحليلها. الهدف من هذا المخطوط هو توفير بروتوكول الأمثل لعزل وإعداد مجمع القرص العين antennal (الشكل 1A). فإنه يمكن أيضا أن تستخدم بنجاح لعزل طائفة واسعة من أقراص إضافية بما في ذلك تلك التي تؤدي إلى الأجنحة، halteres والساقين T1-T3 والأعضاء التناسلية (الشكل 1B-E). هذا الإجراء، مع تعديلات طفيفة، وقد استخدمت لعزل أقراص تخيلي من ذبابة الفاكهة ما يقرب من ثمانين عاما.
كما هو موضح أعلاه، حيث يتم التعبير عن معظم الجينات خلال موltiple مراحل التنمية وفي العديد من الأنسجة، وغالبا ما يكون من المستحيل لدراسة الآثار التي المسوخ فارغة لها على العين بأكملها كما يموت الحيوان جيدا قبل مرحلة اليرقات الطور الثالث. حققت أربع طرق دراسة الأنسجة الأكثر تقدما مثل شبكية العين بشكل ملحوظ أكثر لين العريكة. الأول هو طريقة Flippase (FLP) / Flippase إعادة التركيب الهدف (FRT) لتوليد الحيوانات المستنسخة خلية متحولة ضمن نوع الأنسجة البرية خلاف 17-19. في هذه الحالة يتم التعرف على الأنسجة متحولة بسبب عدم وجود علامة بصرية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ويمكن مقارنة المحيطة البرية نوع الأنسجة التي GFP هو الحاضر (الشكل 2D). والثاني هو الأسلوب "FLP التدريجي" الذي يتم التعبير التحوير في مجموعة من الخلايا 20. في هذه الحالة يتم تحديد استنساخ الخلية وجود GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر مراسل GFP (الشكل2E). والثالث هو تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM) تقنية، الذي يجمع بين عناصر من استنساخ متحولة FLP / FRT وأنظمة التعبير عن FLP من 21. مع هذا الأسلوب التحوير يمكن التعبير ضمن مجموعة من الخلايا التي هي في نفس الوقت متحولة لموضع الجيني الفردي. مثل الحيوانات المستنسخة، FLP بها، ويتم تحديد استنساخ MARCM بحضور GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر إلى علامة GFP (الشكل 2F). وأخيرا، فإن الجينات ويبني رني يمكن التعبير داخل أنسجة تخيلي تحت سيطرة بنيات محددة المروج-GAL4. هذه الطرق الأربعة قد زادت من الاهتمام في دراسة أقراص تخيلي منذ استنساخ متحولة أو الإفراط في التعبير أو أنماط يمكن مقارنتها مباشرة إلى الأنسجة المجاورة نوع البرية. وقد تم تطوير الطريقة الموضحة في هذا الإجراء حتى أن الباحثين الذين يدرسون تطور آخر الجنينية من أنسجة البالغين في ذبابة الفاكهة،لا سيما تلك المتأتية من القرص العين antennal، سوف تكون قادرة على الحصول على الأنسجة جودة عالية للتحليل. على الرغم من جعلت الباحثين الأفراد تعديلات طفيفة، ظلت جوهر هذا الإجراء (الذي وصفنا هنا) دون تغيير إلى حد كبير. منذ الحصول على الأنسجة جودة عالية أمر بالغ الأهمية لدراسة أقراص تخيلي نأمل أن هذا البروتوكول المكتوبة والفيديو المرافق بمثابة مورد التدريس قيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد يرقات
- ملء طبق بيتري 35 ملم مع عازلة تشريح.
- وضع اليرقات في طبق بتري والسماح لهم تسبح حولها لبضع دقائق (الخطوة التنظيف الذاتي).
- نقل اليرقات إلى مجموعة من العازلة تشريح على طبق تشريح القائمة على السيليكون. يجب أن تكون على حافة واحدة من لوحة هذا التجمع. تتكون لوحة تشريح حل السيليكون التي تم سكب وتصلب داخل طبق بتري الزجاج.
- باستخدام الماصة باستور، ضع مجموعة أكبر من العازلة تشريح في منتصف لوحة التشريح.
- باستخدام # 5 ملقط، نقل يرقة واحدة تنظيفها من تجمع صغير إلى مجموعة أكبر من العازلة تشريح.
2. الخشنة تشريح اليرقات
- في حين اليرقة لا تزال ضمن مجموعة كبيرة من العازلة تشريح قفل اليرقة مع ملقط. زوج واحد من ملقط ينبغي أن تستخدم للاستيلاء على السنانير الفم بينما يتم استخدام زوج آخر من ملقط لعقد أنيمالله لا يزال (والاستيلاء على يرقة بلطف في 1/3 طول الجسم).
- ثابتا زوج من ملقط تحتوي على بشرة بالقرب من السنانير الفم حين سحب بسرعة بقية الجسم بعيدا مع الزوج الثاني من الملقط.
- عندما تبدأ اليرقة بتمزيق ستشعر بيان طفيف في التوتر. الافراج عن يرقة من ملقط والسماح ل "الشجاعة" لليرقة لسفك بها. وهذا يسمح للأقراص تخيلي أن تبقى في التشكل وضعها الطبيعي ويمنعهم من التعرض للتشوه.
- مع زوج واحد من ملقط فهم السنانير الفم مرة أخرى لعقد الواجهة الأمامية لليرقة في مكان. استخدام زوج آخر من ملقط إزالة 2/3 أقل من اليرقات بما في ذلك الشجاعة الداخلية. ملاحظة: ستكون معقدة تحتوي على السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية، والغدد اللعابية، وبعض الأقراص الساق، ويبقى بشرة المغطي.
- مع زوج من ملقط إزالة بلطف بشرة المغطي، والغدد اللعابية، وأقراص الساق والأنسجة الأخرى. ملاحظة: الأنسجة إلا أنه ينبغي أن يظل هو السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية (الشكل 3).
- كرر الخطوات من 2.1-2.5 مع يرقات إضافية لمدة 15-20 دقيقة. ملاحظة: أقراص تخيلي التي تبقى في المخزن تشريح لفترات أطول من الوقت تميل إلى أن تتحلل وستظهر في نهاية المطاف أنها أقل من عينات مثالية لتصويرها. وهكذا، وبعد مدة أقصاها 20 دقيقة يجب نقل جميع أنسجة تشريح لتثبيتي PLP (انظر أدناه).
3. تثبيت وتلون الأنسجة مع الأجسام المضادة
- باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لكوب الساعات التي تحتوي على امتصاص العرق البارد ليسين-بريودات (حزب العمال التقدمي) مثبت. الحد من حجم نقل عازلة تشريح إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من حزب العمال التقدمي. تأكد من قطع رأس بشفرة الحلاقة بحيث افتتاح غيض هو كبير بما يكفي لاستيعاب الأنسجة تشريح. باستخدام زوج من ملقط أوإبرة التنغستن تضمن تشريح الأنسجة وغرقت تماما من أجل التثبيت السليم للتحدث. احتضان الأنسجة تشريح في تثبيتي PLP البارد لمدة 45 دقيقة. هذه الحضانة يمكن أن تتم في RT دون الانفعالات.
- باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لغسل عازلة (RT) باستخدام طرف الأصفر خفض آخر لمدة 45 دقيقة. حجم الحد من حزب العمال التقدمي نقل إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من غسل العازلة. ملاحظة: جميع أنسجة تشريح يجب مغمورة تماما.
- نقل مجموعات من 20-30 تشريح الأنسجة إلى 1.5 مل microfuge أنبوب. ملاحظة: إذا تم الجمع بين أعداد أكبر من المجمعات القرص العين antennal داخل أنبوب، هناك إمكانية أن الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب لن يتعرض بشكل صحيح إلى الأجسام المضادة. لأفضل النتائج يجب أن لا يزيد عن 20-30 المجمعات القرص العين antennal الحالي ضمن أنبوب واحد. سوف تشريح الأنسجة تستقر في قاع microfuge أنبوب. الخطوات لذلك، في لاحقة شحد ذاته pipetman لإزالة واستبدال غسل العازلة، حل حظر، والأجسام المضادة.
- إزالة غسل العازلة واستبدالها مع 100 ميكرولتر من عرقلة الحل: 10٪ مصل الماعز العادي في غسل العازلة. في احتضان RT مع دوران طيف على أحد كبار المدورة الجدول لمدة 10 دقيقة.
- الحل إزالة الحجب واستبدالها مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية التي تم مخففة بشكل مناسب في 10٪ مصل الماعز العادي. في احتضان RT مع دوران طيف لمدة 16 ساعة.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية واستبدالها مع 750 ميكرولتر من غسل العازلة. وضع أنابيب على nutator والسماح لnutate في RT لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية يمكن حفظ (مخزن في 4 درجات مئوية) وإعادة استخدامها في وقت لاحق. يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة عدة مرات مساعدة في الحد غير محددة وملزمة.
- سماح رؤساء لتستقر في قاع الأنبوب، ثم إزالة غسل العازلة وإضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية التي تم المخفف مناسب في 10٪ مصل طبيعي. في احتضان RT مع دوران طيف ل2̵1، 4 ساعة.
- إزالة حلول الأجسام المضادة الثانوية من الأنسجة واستبدالها مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة. تسمح الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب.
- استخدام P-200 وتلميح قطع الأصفر، ونقل جميع أنسجة تشريح لمجموعة من غسل العازلة التي تم وضعها على طبق تشريح. في حين الشروع في الخطوة التالية من تشريح ما يرام، فإن احتضان الأنسجة في غسل العازلة. هذا يساعد على إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة.
4. تشريح الجميلة في العين Antennal القرص مجمعات وتصاعد على الشرائح
- استخدام زوج واحد من ملقط لقفل بشرة بواسطة السنانير الفم مع الجانب البطني من مجمع أسفل. مع الزوج الثاني من ملقط إزالة فصوص الدماغ اثنين عن طريق إغلاق ملقط الثانية في الفضاء بين أقراص المخ والعين (الشكل 3، السهم الأحمر) وبسرعة سحب الدماغ بعيدا عن السنانير الفم.
- مع الاستمرار في التمسك السنانير الفم، قرصة قبالةالأنسجة أقرب وقت ممكن للاتصال بين قسم antennal من القرص العين antennal والسنانير الفم (الشكل 3، السهم الأزرق). ملاحظة: يجب أن تكون المجمعات القرص العين antennal خالية من جميع الأنسجة (الشكل 1A). تستمر حتى تم تشريح جميع الأنسجة المرجوة المرجوة التي يمكن وضعها على الشرائح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل الجناح، haltere والساق وأقراص تخيلي التناسلية (الشكل 1B-E).
- إضافة اثنين من قطع صغيرة من المناديل الورقية (حجم coverslips) حوالي 3 في. بصرف النظر على طبق تشريح. وضع شريحة زجاجية على الطبق - يجب أن قطعتين من المناديل الورقية تكون تحت نهايات الشريحة. هذا سيمنع الشريحة من الالتصاق إلى قاعدة سيليكون للطبق تشريح.
- استخدام P-20 مع تلميح غير المصقول، إضافة 9 ميكرولتر من وكيل لمكافحة تبييض لمنتصف شريحة المجهر والزجاج. هذا يمنع تبييض الأنسجة عند عرضها مع الفلورسنتالضوء.
- باستخدام نفس الطرف غير المصقول، وجمع كل أسطوانة العين antennal وإضافتها إلى قطرة مكافحة تبييض كاشف. تقليل كمية من غسل العازلة التي يتم ترحيلها. في محاولة للحد من كمية من غسل العازلة إلى 10 ميكروليتر أو أقل.
- استخدام زوج من ملقط لفصل وانتشرت الأقراص العين antennal داخل قطرة مكافحة تبييض كاشف. تسمح أقراص لاحتضان في مكافحة تبييض كاشف لعدة دقائق. ملاحظة: سوف تتحول الأقراص واضح الأنسجة تمتص كاشف مكافحة التبييض.
- باستخدام فرشاة الرسام غرامة خفض بلطف ساترة على العينة. هذا يمنع تشكيل فقاعات الهواء.
- تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لعرض أقراص تخيلي العين antennal أو غيرها باستخدام الضوء أو المجهري الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طريقة الموضح أعلاه موثوق تنتج مواد ذات جودة عالية للتحليل مع تحقيقات في الموقع، للصحفيين النسخي، والفخاخ البروتين والأجسام المضادة. في الشكل 1 نعرض العين الهوائي، والأعضاء التناسلية، الجناح، haltere والساق الأقراص التي يتم استردادها بشكل روتيني مع هذا الأسلوب. وقد تمت معالجة هذه الأقراص مع fluorophore-phalloidin مترافق التي تربط لF-الأكتين وبالتالي يحدد كل خلية. إذا تم إصلاح الأنسجة بشكل صحيح ثم ثلم تخلقية من القرص العين، حواف الأنسجة متحدة المركز في طيات أقراص التناسلية، antennal والساق، وسوف المحور الظهري البطني للأقراص الجناح وhaltere تظهر كافة حواف حادة و . إذا تم إصلاح الأنسجة بشكل صحيح ثم الأجسام المضادة، والبروتينات الفلورية تحقيقات في الموقع سوف تكشف أيضا عن أنماط حادة. وتظهر العديد من الأمثلة في الشكل 2. وأعلى أقراص عرض ثلاث لوحات التي تم ملطخة الأجسام المضادة المختلفة في حين أنتظهر أقل الألواح ثلاثة أقراص في GFP الذي يستخدم للاحتفال السكان من الخلايا.
واحدة من أبرز سمات القرص العين antennal هو ثلم مخلق (الشكل 1A)، والتي يمكن أن ينظر إليها على أنها المسافة البادئة داخل الأنسجة على امتداد البطني الظهري محور 1، 22. مسبق إلى الطور اليرقي الثالث جميع الخلايا داخل العين النامية unpatterned، غير متمايزة، ويمكن تمييزها شكليا عن بعضها البعض. في بداية الطور اليرقي الثالث يبدأ ثلم تخلقية على الهامش الخلفي للحقل العين وتقدم نحو الأمام العين / antennal الحدود 22. كما تقدم ثلم عبر الميدان العين يتحول البحر من خلايا المختلين في صفيف أمر من العيون وحدة متباعدة بشكل دوري أو ommatidia (الشكل 1A) 22-23. قبل ثلم شبكة تنظيمية الجينات التي تتضمن Pax6 homolog بلا عيون (EY) قنوات خلايانحو مصير العين (الشكل 2A) 15. بدء وتطور ثلم نفسه يعتمد على أنشطة القنفذ (ح ح) وDecapentaplegic (DPP) مسارات إشارات 24-29. في الواقع مراسل DPP-lacZ يعكس بأمانة التعبير عن موضع النيابة العامة داخل ثلم (الشكل 2B) 30-31. كخلايا خروج من ثلم وتبدأ في تبني مصائرهم الطرفية، يعبرون عن علامات معينة من الخلايا الجنينية مثل الرؤية غير طبيعية قاتلة (elav)، الذي يشفر بروتين RNA ملزم لعموم العصبية (الشكل 2C) 32-34.
الشكل 1. أقراص تخيلي من ذبابة الفاكهة السوداء البطن. (
الشكل 2. تحليل نسيلي والتعبير من القرص تخيلي العين (A - F). الصور متحد البؤر العين أقراص تخيلي. (A) يتم توزيع البروتين Pax6 بلا عيون (EY) على نطاق واسع من قبل ثلم مخلق. (ب) DPP-lacZ أوردته النسخيص يستجيب لسمو الإشارات ويتم التعبير داخل ثلم مخلق. (C) والبروتين RNA ملزم لعموم العصبية يتم توزيع Elav في جميع المستقبلات الضوئية تطوير راء ثلم مخلق. (D) قرص العين تحتوي على الخسارة من وظيفة الحيوانات المستنسخة ولدت من قبل النظام FLP / FRT. يتم تحديد الحيوانات المستنسخة بسبب عدم وجود GFP (E). قرص العين تحتوي على الإفراط في التعبير الحيوانات المستنسخة ولدت مع نظام FLP بها. وتتميز الحيوانات المستنسخة بإيجابية مع GFP. (F) قرص العين تحتوي على استنساخ MARCM. مثل نظام FLP خارج، ويمكن تحديد الحيوانات المستنسخة MARCM بحضور GFP. يتم سرد كافة الأنماط الجينية الكشف عن البروتينات وضمن هذا الرقم. الأمامي إلى اليمين والظهرية متروك.
الرقم 3. مجمع العين الهوائي في الدماغ. وSCHالرسم ematic اليوم الأول المنتجات تشريح الخشنة. الأنسجة الوحيدة التي ينبغي أن تكون ثابتة هي السنانير الفم، وأقراص العين والدماغ الهوائي (في كثير من الأحيان سوف تبقى العقدة البطنية تعلق أيضا - لا يظهر). الأرجواني = الدماغ، أخضر = أقراص العين هوائي والبني = السنانير الفم. الأمامي إلى اليمين. إذا تشريح الساق، الجناح، haltere وأقراص التناسلية، لا يزال ينبغي أن ترفق بشرة الخارجية لليرقة لهذه الأنسجة. لا تقم بإزالة بشرة المغطي كما قد تفقد أقراص تخيلي خلال التحويلات اللاحقة من خلال مختلف الحلول الأجسام المضادة، ومنع غسل. يمكن إزالة الأنسجة الزائدة خلال الخطوات تشريح غرامة (4،1-4،2).
الرقم 4. موقف أقراص تخيلي داخل يرقة ذبابة الفاكهة. مخططالرسم التشنج الموقف النسبي للأقراص العين الهوائي، والساق، والجناح، haltere والتناسلية داخل يرقة الطور الثالث. هو لون القرص العين antennal باللون الأخضر، أقراص الساق هي باللون الأزرق، القرص الرسن في الأرجواني، القرص الجناح باللون البني / البرتقال والقرص الأعضاء التناسلية في البني الفاتح. الأمامي إلى اليمين.
| اسم الحل |
| 8٪ لامتصاص العرق |
| 0.2 M فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة |
| 0.2 M فوسفات الصوديوم Disbasic |
| 1 N هيدروكسيد الصوديوم |
| 10٪ تريتون |
| 0.1 M فوسفات الصوديوم العازلة (تشريح الاحتياطي) |
| 0.1 M فوسفات الصوديوم العازلة + 0.1٪ تريتون (غسل العازلة) |
| يسين العازلة |
| 2٪ لامتصاص العرق يسين-بريودات تثبيتي (حزب العمال التقدمي) |
| 10٪ مصل الماعز عادي |
الجدول 1: قائمة الحلول المطلوبة.
| 8٪ محلول المخزون لامتصاص العرق |
| إلى 50 مل قارورة مخروطي إضافة ما يلي: |
| 2.0 غرام بارافورمالدهيد |
| 23.0 مل من الماء المقطر |
| 4.0 قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم (من الماصة الزجاج باستور) |
| مزيج والحرارة على طبق من ضجة حتى يصل حل يغلي لطيف |
| السماح لتغلي برفق حتى يذوب تماما بارافورمالدهيد |
| وضع على الجليد حتى البرد (جعل الطازجة قبل كل تشريح) |
| 0.1 M الفوسفات العازلة (تشريح (P) الاحتياطي) |
| إلى أنبوب مخروطي 50 مل إضافة ما يلي: |
| 18.0 مل 0.2 M فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة |
| 7.0 مل 0.2 M فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة |
| 25.0 مل من الماء المقطر |
| تخزينها في 4 ° C (1 أسبوع الصلاحية) |
| 0.1 M فوسفات + مخزن منظفات (غسل (W) الاحتياطي) |
| إلى 50مل أنبوب مخروطي إضافة ما يلي: |
| 18.0 مل 0.2 M فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة |
| 7.0 مل 0.2 M فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة |
| 25.0 مل من الماء المقطر |
| 0.5 مل 10٪ تريتون |
| متجر في RT (1 أسبوع الصلاحية) |
| يسين (L) العازلة |
| إلى أنبوب مخروطي 50 مل إضافة ما يلي: |
| 0.4 ز يسين |
| 1.2 مل 0.2 M فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة |
| 8.0 مل تشريح (P) العازلة |
| 10.0 مل من الماء المقطر |
| يهز الحل حتى يذوب تماما يسين |
| وضع على الجليد حتى البرد (جعل الطازجة قبل كل تشريح) |
| 2٪ لامتصاص العرق - ليسين - بريودات (حزب العمال التقدمي) تثبيتي |
| 0.1 غرام الصوديوم بريودات |
| 15.0 مل من ليسين (L) العازلة |
| 5.0 مل من 8٪ لامتصاص العرق |
| يهز الحل جيدا حتى يذوب تماما بريودات الصوديوم |
| وضع على الجليد حتى البرد (جعل الطازجة قبل كل تشريح) |
الجدول 2: وصفات للحلول المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن هذا الإجراء قد ركزت بشكل كبير على العزلة ومعالجة لاحقة الأقراص العين antennal، فمن قابلة للتستخدم لعزل وتحليل الجناح، haltere والساق وأقراص التناسلية (الشكل 4). والتعديل الوحيد المطلوب من بروتوكول لعزل هذه الأقراص (على العكس من القرص العين antennal) هو طريقة تشريح الخشنة (القسم 2 من البروتوكول). تم العثور على أول الصدري الساق (T1) زوج في الجزء الأمامي من اليرقة ويمكن استرداد باتباع بروتوكول العين antennal القرص العزلة. ومع ذلك يتم إرفاق الساق الصدري الثانية (T2) أقراص للبشرة. لعزل هذه الأقراص يجب استخدام زوج من ملقط لعقد السنانير الفم (كما هو موضح أعلاه) بينما زوج آخر من ملقط ينبغي أن تستخدم لقفل بشرة البطنية من الحيوان (تأكد من قفل اليرقة حوالي 1/3 من الفم السنانير. يمكن ببساطة فيليه اليرقة من تمزيق إهاب بطني بعيدا عن بقية لارفا. سيبقى الساقين T2 تعلق على بشرة. يتم إرفاق الصدر الثالث (T3) الساق إلى أقراص الجناح وhaltere كجزء من مجمع، والتي تعلق نفسها أيضا للبشرة. يمكنك اختيار لفصل مجمع القرص والساقين T2 من بشرة في هذه المرحلة أو الاحتفاظ مجمع بشرة قرص معا أثناء التثبيت / الأجسام المضادة الخطوات اللاحقة الحضانة وعزل الأقراص أثناء الجزء تشريح غرامة من الإجراء (القسم 4) . لاستعادة الأقراص التناسلية، فمن الأفضل لفهم اليرقات في القسم الوسطي مع زوج واحد من ملقط ثم تقشر بشرة بطني بعيدا مع زوج آخر من ملقط بدءا من القسم الوسطي وتنتهي في نهاية الخلفي من يرقة. فمن المستحسن أن ملقط يمكن استخدامها لمسح بعيدا كل الأنسجة الغريبة وثم نقل القرص الأعضاء التناسلية فقط إلى حل تثبيتي باستخدام pipetman P-200 وتلميح الأصفر الذي تم قطع بشفرة حلاقة نهاية.
هذا الإجراء هو الانسب لTISSUES من سمك محدود مثل أقراص تخيلي ويعمل بشكل أفضل إذا كانت الأجسام المضادة المستخدمة هي من عيار عالية وخصوصية. ومع ذلك، فإنه يمكن تكييفها للعمل بشكل جيد مع الأنسجة سمكا مثل المبيض الكبار، الخصية والدماغ وكذلك مع الأجسام المضادة عيار منخفضة أو تلك التي تعطي أعلى من المطلوب "الخلفية" تلطيخ. عند العمل مع الأنسجة سمكا، يقترح أن أفضل النتائج يمكن الحصول عليها ببساطة عن طريق زيادة تركيز امتصاص العرق و / أو تفرخ في تثبيتي PLP لفترات أطول من الوقت. منذ التثبيت السليم للتشريح الأنسجة ضروري للنجاح مع هذا البروتوكول يقترح أيضا أن كفاءة زيادة تركيز امتصاص العرق و / أو زيادة طول التثبيت يتم تقييمها مع phalloidin (الشكل 1). على وجه الخصوص، ينبغي إيلاء اهتمام وثيق لل"الحدة" خلية من الخطوط العريضة والمعالم المادية الأخرى داخل الأنسجة (أي morphogثلم enetic). وهناك طريقة أخرى للتأكد من أن الأنسجة الخاصة بك (وخاصة عينات سمكا) هو ثابت بشكل صحيح هي إعداد بارافورمالدهيد 8٪ وحزب العمال التقدمي حلول جديدة قبل كل تشريح. وأخيرا، والجودة الشاملة للتشريح ويمكن زيادة إذا تم تشريح الأنسجة لفترات قصيرة من الوقت ويتم نقل الأنسجة في تثبيتي في أقرب وقت ممكن. يقترح أن تشريح مدة لا تزيد عن 15-20 دقيقة. تشريح لفترات أقصر يزيد من جودة حفظ الأنسجة.
هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع مجموعة واسعة من الأجسام المضادة، ولكن كان صحيحا أن بعض الأجسام المضادة لا تعمل بشكل جيد مع تثبيتي PLP. مثال واحد سيء السمعة هو الأجسام المضادة التي تعترف عامل النسخ الخام (رو). وأعرب الخام داخل ومطلوب من أجل تحديد مجموعة فرعية من تطوير خلايا مستقبلة للضوء 35. المضادة للرو الأجسام المضادة يعمل بشكل أفضل، وليس مع حزب العمال التقدمي، وإنما مع أنابيب - EGTA - MgSO 4 (بيم) بuffer 36. وبالمثل، قد الأجسام المضادة الأخرى تعمل بشكل أفضل على الأنسجة التي تم المحتضنة في مثبتات تزال الأخرى. يقترح أن، ما لم ينص على خلاف ذلك، يجب أن يحاكم تثبيتي PLP أولا. إذا لم تنجح ثم عملية إيجاد بديل تثبيتي ينبغي أن تبدأ.
قضية واحدة مشتركة لمواجهة هي تركيز العمل من الأجسام المضادة في السؤال. في كثير من الأحيان قد يكون الباحث الأول لاستخدام الأجسام المضادة خاصة للكشف عن البروتينات في الأنسجة اهتمامك. تركيز العمل يمكن أن تحيد عن ما يقال عن الأنسجة الأخرى. يقترح أن تركيز أوصى أن يحاكم أولا. زيادة تركيز الأجسام المضادة إذا لا يمكن رؤيتها إشارة. من ناحية أخرى، إذا كان يعطي تركيز أوصى عالية تلوين الخلفية ثم تمييع الأجسام المضادة يجب أن يحاكم. تركيزات العمل بين الأجسام المضادة يمكن أن تختلف. على سبيل المثال، يتم تخفيف المضادة للعيون غائب (EYA) الأجسام المضادة 1: 5 بينما المضادةالأجسام المضادة Elav يعمل بشكل جيد حتى في 1: 500 التخفيف. يمكن حتى أن تضعف بعض الأجسام المضادة لأعماق تصل إلى 1: 3،000. بالإضافة إلى ذلك، هذا الإجراء، كما هو مكتوب، يعمل بشكل أفضل مع الأجسام المضادة خصوصية عالية. لكن، وكما الكثيرون من ذوي الخبرة، يمكن لبعض الأجسام المضادة ربط غير الحكومية على وجه التحديد إلى الأنسجة وهذا يمكن خلق صورة دون المستوى الأمثل. ويمكن في كثير من الأحيان تصحيح هذا الوضع من خلال احتضان الضد المخفف الأجنة ثابتة أو جثث اليرقات قبل إضافتها إلى أقراص تخيلي الثابتة. وهذا يتوقف على مستوى تلوين الخلفية غير محددة، وطول المطلوب من "ما قبل امتصاص" يمكن أن تختلف وسيتعين عملت بها على أساس تجريبي. ومن الممكن أيضا لزيادة نسبة الإشارة / الضوضاء عن طريق إعادة استخدام الأجسام المضادة عدة مرات أو عن طريق إجراء عدة جولات من قبل الامتصاص.
عند البت في الأقراص التي يجب أن تستخدم في المنشورات و / أو العروض، فمن الأفضل لاختيار الأقراص التي تم المنحى مع الجانب قمي الموجهة تصل العنابر. كما أنه من الأفضل استخدام الأقراص التي لم يتم مطوية. هذا صحيح بشكل خاص من القرص العين antennal هذا. الجانب البطني من القرص يميل إلى أضعاف وللأسف، هناك القليل واحد يمكن القيام به لمنع هذا من الحدوث. حل واحد هو لتشريح أقراص الأصغر سنا حيث أن هذه تميل إلى أضعاف أقل بكثير. وثمة خيار آخر هو مجرد تشريح أعداد كبيرة من أقراص حتى تحصل واحد هو أن مسطح تماما. الشكل العام للقرص العين antennal يمكن أن تتأثر المعدل الذي تمزق اليرقة بعيدا. إذا كان أحد تسحب اليرقة بعيدا بسرعة كبيرة جدا الحفرة التي يمر مجمع الدماغ قرص صغير ويأتي القرص العين antennal من مطوية و / أو امتدت. فمن الأفضل لسحب ببطء حتى تبدأ اليرقة المسيل للدموع منذ حفرة ستكون أكبر. ثم يمكنك الاستمرار في سحب مجمع القرص الدماغ العين antennal ببطء. نضع في اعتبارنا ان كنت لا يمكن أبدا أن سحب ببطء شديد. نلاحظ أيضا، أن المعدل الذي كنت تمزق الأنسجة ليس عاملا في عزل الأنسجة الأخرى.
ve_content "> دورة حياة ذبابة الفاكهة تتكون من ثلاث مراحل اليرقات. الأحداث تنموية هامة تتم خلال كل واحدة من هذه المراحل، وبالتالي قد يكون من المهم لعزل الأنسجة وليس فقط من الأعمار اليرقية الثالثة (والذي هو المحور الرئيسي لهذا الإجراء) ولكن أيضا من كل من اليرقات الأولى والثانية الأعمار أيضا. مع استثناء واحد بسيط، ويمكن استخدام هذا الإجراء، كما هو مكتوب، لعزل الأقراص الطور الثاني. خلال تشريح جزء جيد من الإجراء (القسم 4) فمن المستحسن أن التنغستن حاد يجب استخدام سلك لفصل القرص العين antennal من الأنسجة الغريبة مثل الغدد الفم السنانير والدماغ واللعابية. ويمكن أيضا أن سلك التنغستن أن تستخدم لفصل أقراص T2 / T3 الساق والجناح وhaltere عن بعضها البعض وبشرة المغطي ، وهو يوصي بأن واحدة من نهاية سلك التنغستن (النهاية التي سيتم استخدامها لفصل الأنسجة) يمكن صقلها عن طريق التسخين في الغليان حمام نترات الصوديوم يمكن إدراج الطرف الآخر إلى العكس دبوس؛ عشرهو سيسمح لك لعقد السلك التنغستن بسهولة أكبر. للأسف، هو إلى حد كبير أكثر صعوبة لعزل سليمة أقراص الطور الاولى، ولذلك فمن المستحسن أن قمت بوضع كامل القرص / الدماغ / الفم مجمع هوك العين antennal على الشريحة، وتغطي مع ساترة. كمية الأنسجة تشريح يمكن التقليل باستخدام سلك التنغستن حادة لإزالة الغدد اللعابية والمغطي بشرة قبل تركيب مجمع هوك القرص / الدماغ / الفم على الشريحة. فمن السهل نسبيا تحديد أول الطور العين antennal القرص عندما لا تزال تعلق على الدماغ والفم السنانير (انظر الشكل 6A، D من كومار وموسى، 2001) 37. فإن أقراص تخيلي أخرى لا بد من فصلها عن بشرة وتوضع على شريحة للعرض.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر دونالد جاهز وكيفن موسى لتعليم JPK وتخيلي إجراء تشريح القرص الأصلي. كما نشكر بوني Weasner للقرص الأعضاء التناسلية في الشكل 1B والقرص العين في الشكل 2A، براندون Weasner عن الشكل 3، ومركز بلومينغتون الأسهم ذبابة الفاكهة ذبابة عن البقع والضفة الدراسات التنموية ورم هجين عن الأجسام المضادة. وقد تم دعم CMS بواسطة راتبا من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) GCMS التدريب المنحة (T32-GM007757)، وجورج بوتنام زمالة أبحاث فرانك، وزمالة أبحاث روبرت بريجز. ويدعم JPK من خلال منحة من المعهد الوطني للعيون (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
