Abstract
Una parte significativa di sviluppo post-embrionale nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, si svolge all'interno di un insieme di strutture sac-come chiamate dischi immaginali. Questi dischi danno luogo ad una elevata percentuale di strutture adulti che si trovano all'interno della mosca adulta. Qui si descrive un protocollo che è stato ottimizzato per recuperare questi dischi e li prepara per l'analisi con anticorpi, i giornalisti trascrizionali e trappole di proteine. Questa procedura è più adatto per tessuti sottili come dischi imaginali, ma può essere facilmente modificato per l'utilizzo con i tessuti più spessi come il cervello adulto e dell'ovaio larvale. Il protocollo scritto e video che accompagna guideranno il lettore / spettatore attraverso la dissezione di terza larve instar, la fissazione dei tessuti, e il trattamento di dischi immaginali con anticorpi. Il protocollo può essere utilizzato per analizzare i dischi immaginali dal più giovane primo e secondo instar larve pure. Il vantaggio di questo protocollo è che è relativamente breve e deve essereen ottimizzato per la conservazione di alta qualità del tessuto sezionato. Un altro vantaggio è che la procedura di fissazione che è impiegato funziona bene con il numero enorme di anticorpi che riconoscono le proteine di Drosophila. Nella nostra esperienza, vi è un numero molto piccolo di anticorpi sensibili che non funzionano bene con questa procedura. In queste situazioni, il rimedio sembra essere quello di utilizzare una fissazione cocktail alternativo, pur continuando a seguire le linee guida che ci siamo stabiliti per le fasi di dissezione ed incubazioni anticorpi.
Introduction
Per più di un secolo il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato un sistema di premier per studiare lo sviluppo, il comportamento e la fisiologia. Sviluppo in volo può essere diviso in due grandi fasi: embrionali e post-embrionali con gran parte quest'ultimo che si svolgono all'interno monostrato epiteli chiamati dischi immaginali 1-3. Disegni di dischi immaginali sono stati pubblicati nel 1864 da August Weismann, come parte della sua vasta monografia sullo sviluppo degli insetti 1. Questi dischi iniziano il loro sviluppo durante l'embriogenesi, vengono modellato durante gli stadi larvali, sopravvivere alla massiccia histolysis delle fasi pupa primi, e, infine, dare origine ad una elevata percentuale di strutture per adulti che si trovano dentro l'adulto volare 1-14. Durante lo sviluppo larvale ogni disco rende diverse decisioni critiche per quanto riguarda il destino, forma e dimensione. Entro i primi e secondi stadi larvali, i dischi hanno il compito di adozione di un destino primario, establishing confini vano, adottando la forma corretta e generando il numero richiesto di cellule 15-16. Durante il terzo stadio larvale e precoce fase di pre-pupa, i dischi immaginali continuano a dividersi e sono modellati come le cellule adottano i loro destini morsetto 16.
Durante la prima storia della Drosophila biologia dello sviluppo, dischi immaginali sono stati studiati quasi esclusivamente nel contesto dello sviluppo normale e nei casi limitati in cui una perdita o un mutante di guadagno-di-funzione era praticabile. L'uso di raggi X per indurre ricombinazione mitotica permesso di mutazioni letali da analizzare in cloni di cellule all'interno dei tessuti larvali e adulti. Questo metodo è stato migliorato con l'introduzione di metodi transgenici per analizzare perdita e guadagno-di-funzione mutazioni in entrambi i tessuti larvali e adulti. Il numero di anticorpi, giornalisti trascrizionali e trappole di proteine per descrivere il paesaggio molecolare di tipo selvatico e tessuti mutanti è anche constantly crescente. L'utilizzo di questi marcatori molecolari per analizzare perdita e guadagno-di-funzione di cloni di cellule mutanti ha reso sempre più possibile per ottenere in tempo reale comprensione di come le cellule mutanti deviano dalle loro tipo cugini selvatici durante lo sviluppo. Per sfruttare adeguatamente questi strumenti e reagenti è fondamentale disporre di preparazioni di alta qualità di dischi immaginali che possono essere visualizzati, fotografati e analizzati. L'obiettivo di questo manoscritto è fornire un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la preparazione del complesso disco-occhio antenne (Figura 1A). Può anche essere utilizzato con successo per isolare un'ampia varietà di dischi aggiuntivi compresi quelli che danno origine alle ali, bilancieri, gambe T1-T3 e genitali (Figura 1B-E). Questa procedura, con piccole modifiche, è stato utilizzato per isolare i dischi immaginali da Drosophila per quasi 80 anni.
Come descritto in precedenza, poiché la maggior parte dei geni sono espressi durante il multiple fasi di sviluppo e in una moltitudine di tessuti, è spesso impossibile studiare gli effetti che hanno sulla mutanti nulli l'intero occhio, come l'animale muore ben prima della fase larvale al terzo stadio. Quattro metodi hanno reso possibile lo studio dei tessuti più sviluppate, come la retina significativamente più trattabile. Il primo è il metodo flippase (FLP) / flippase Ricombinazione Target (FRT) di generare cloni di cellule mutanti all'interno di un tipo di tessuto altrimenti selvaggio 17-19. In questo caso il tessuto mutante è identificato dall'assenza di un marcatore visivo come proteina fluorescente verde (GFP) e può essere confrontato con il tipo selvatico tessuto circostante in cui GFP è presente (Figura 2D). Il secondo è il metodo "flp-out", in cui un transgene viene espresso in una popolazione di cellule 20. In questo caso i cloni cellulari sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvatico tessuto circostante che manca il reporter GFP (Figura2E). Il terzo è l'analisi Mosaico con un marcatore cellulare reprimibile (MARCM) tecnica, che combina elementi del clone mutante FLP / FRT e sistemi di espressione FLP-out 21. Con questo metodo un transgene può essere espressa all'interno di una popolazione di cellule che sono simultaneamente mutante per un locus genetico individuale. Come cloni FLP-out, cloni marcm sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvaggio circostante tessuto che manca il marcatore GFP (Figura 2F). E, infine, i geni ei costrutti RNAi possono essere espressi nei tessuti immaginari sotto il controllo di specifici costrutti promotore-GAL4. Questi quattro metodi hanno aumentato l'interesse per lo studio dei dischi immaginali dal cloni o modelli mutanti o over-espressione può essere direttamente confrontati con il tessuto adiacente wild type. Il metodo descritto in questa procedura è stata sviluppata in modo che i ricercatori che studiano lo sviluppo post-embrionale dei tessuti adulti in Drosophila,particolare di quelli derivati dal disco occhio-antenne, sarà in grado di ottenere tessuti di alta qualità per l'analisi. Anche se i singoli ricercatori hanno fatto lievi modifiche, il nucleo di questa procedura (che descriviamo qui) è rimasto sostanzialmente inalterato. Dal momento che l'ottenimento di tessuti di alta qualità è fondamentale per lo studio dei dischi immaginali Ci auguriamo che questo protocollo scritto e video che accompagna serviranno come risorsa didattica preziosa.
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Protocol
1 Preparazione di larve
- Riempire una capsula di Petri 35 millimetri con tampone dissezione.
- Porre larve in piastra di Petri e permettere loro di nuotare in giro per alcuni minuti (step-autopulente).
- Trasferimento larve ad un pool di buffer di dissezione su un piatto dissezione a base di silicone. Questa piscina deve essere di un bordo della piastra. La piastra dissezione costituita da una soluzione di silicone che è stato versato e indurito in una piastra di Petri di vetro.
- Usando una pipetta pasteur-, posizionare un grande pool di buffer di dissezione nel centro del piatto dissezione.
- Utilizzando # 5 pinze, trasferire un singolo larva pulita dalla piccola piscina al più grande pool di buffer di dissezione.
2 Coarse Dissezione di larve
- Mentre la larva è ancora all'interno della grande piscina di buffer di dissezione stringere la larva con le pinze. Un paio di pinze deve essere usato per afferrare i ganci bocca, mentre l'altra coppia di pinze è utilizzato per contenere la animaltri ancora (afferrare la larva dolcemente terzo lunghezza del corpo).
- Hold Steady la coppia di pinze contenenti la cuticola vicino i ganci bocca mentre rapidamente tirando il resto del corpo via con la seconda coppia di pinze.
- Quando la larva comincia a lacerare vi sentirete un leggero rilascio di tensione. Rilasciare la larva dalle pinze e consentire il "coraggio" della larva di fuoriuscire. Questo permette per i dischi immaginali a rimanere nella loro conformazione normale e impedisce loro di deformarsi.
- Con una coppia di pinze afferrare nuovamente i ganci bocca per tenere l'estremità anteriore della larva in posizione. Usando l'altra coppia di pinze rimuovere minore due terzi delle larve comprese le viscere interne. Nota: un complesso contenente i ganci bocca, i dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, gangliari ventrale, le ghiandole salivari, alcuni dischi gamba, e la cuticola sovrastante rimarranno.
- Con un paio di pinze rimuovere delicatamente la cuticola sovrastante, ghiandole salivari, dischi gamba ealtri tessuti. Nota: solo tessuto che deve rimanere è i ganci bocca, dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, e ganglio ventrale (Figura 3).
- Ripetere i passaggi 2,1-2,5 con larve supplementare per 15-20 minuti. Nota: i dischi immaginali che rimangono nel buffer di dissezione per lunghi periodi di tempo tendono a degradare e infine appariranno come meno di esemplari ideali per essere fotografati. Così, dopo un massimo di 20 minuti tutti i tessuti sezionati devono essere trasferiti al fissativo PLP (vedi sotto).
3 Fissazione e colorazione di tessuti con anticorpi
- Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti sezionati per un vetro da orologio contenente freddo paraformaldeide-lisina-periodato (PLP) fissativo. Limite volume di tampone dissezione trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione di PLP. Assicuratevi di tagliare la punta con una lama di rasoio in modo che l'apertura punta è grande abbastanza per ospitare i tessuti sezionati. Usando un paio di pinze oun ago di tungsteno assicura che i tessuti sezionati sono completamente immersi in ordine per il fissaggio adeguato a verificarsi. Incubare tessuti sezionati a freddo PLP fissativo per 45 min. Questo incubazione può avvenire a temperatura ambiente, senza agitazione.
- Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti dissezionati di tampone di lavaggio (RT) utilizzando un altro punta gialla tagliata per 45 min. Il volume Limite di PLP trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione del tampone di lavaggio. Nota: tutti i tessuti sezionati devono essere completamente sommerse.
- Trasferire 20-30 insiemi di tessuto sezionato a 1,5 ml provetta da microcentrifuga. Nota: se un numero maggiore di complessi dischi occhio-antenne vengono combinati all'interno del tubo, vi è la possibilità che il tessuto nella parte inferiore del tubo non sarà esposto correttamente agli anticorpi. Per ottenere risultati ottimali, non più di 20-30 complessi disco occhio-antenne dovrebbero essere presenti all'interno di un singolo tubo. Il tessuto sezionato si depositerà sul fondo della provetta per microcentrifuga. Pertanto, in successive fasi di uSE una Pipetman per rimuovere e sostituire il tampone di lavaggio, soluzione bloccante, e gli anticorpi.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e sostituirlo con 100 ml di soluzione bloccante: il 10% di siero normale di capra in tampone di lavaggio. Incubare a RT con rotazione delicata su un rotatore tavolo per 10 min.
- Rimuovere la soluzione di blocco e sostituirlo con 100 ml di anticorpi primari che sono stati opportunamente diluito in siero normale di capra al 10%. Incubare a RT con rotazione dolce per 16 ore.
- Rimuovere gli anticorpi primari e sostituirlo con 750 ml di tampone di lavaggio. Inserire provette su un nutator e lasciare nutate a temperatura ambiente per 10 min. Nota: L'anticorpo primario può essere salvato (conservare a 4 ° C) e riutilizzato in seguito. Riutilizzo anticorpi più volte può aiutare a ridurre legame non specifico.
- Consenti teste di depositarsi sul fondo della provetta, quindi rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 ml di anticorpi secondari che sono stati opportunamente diluiti in siero normale del 10%. Incubare a RT con rotazione delicato per 2̵1; 4 ore.
- Rimuovere soluzioni anticorpo secondario da tessuto e sostituirlo con 500 ml di tampone di lavaggio. Lasciare tessuto di depositarsi sul fondo della provetta.
- Uso di un P-200 e una punta di giallo taglio, trasferire tutti i tessuti sezionati a un pool di tampone di lavaggio che è stato messo sul piatto dissezione. Mentre procedere con la fase successiva di dissezione bene, il tessuto sarà incubare al tampone di lavaggio. Questo aiuta a rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso.
4. fine dissezione di Eye-antenne Disc Complessi e Montaggio su diapositive
- Utilizzare un paio di pinze per stringere la cuticola dai ganci bocca con il lato ventrale del complesso rivolta verso il basso. Con una seconda coppia di pinze togliere le due lobi cerebrali chiudendo la seconda pinza nello spazio tra i dischi del cervello e degli occhi (Figura 3, freccia rossa) e rapidamente tirando il cervello lontano dai ganci bocca.
- Continuando a tenere su i ganci bocca, un pizzico fuoriil tessuto più vicino possibile al collegamento tra la sezione antenne del disco oculare antenne ed i ganci bocca (Figura 3, blu freccia). Nota: i complessi del disco occhio-antenne dovrebbero essere liberi di tutti i tessuti (Figura 1A). Continuare fino a quando tutto il tessuto desiderato desiderato che può essere posizionato su vetrini è stato sezionato. Questo protocollo può essere adattato per isolare ala, haltere, gamba e dischi immaginali genitali (Figura 1B-E).
- Aggiungere due piccoli pezzi di carta velina (dimensione del coprioggetto) circa 3. Parte sul piatto dissezione. Posizionare un vetrino sul piatto - i due pezzi di carta velina dovrebbero essere sotto le estremità del vetrino. Questo consentirà di evitare la diapositiva da attaccare alla base di silicone del piatto dissezione.
- Uso di un P-20 con una punta tagliata, aggiungere 9 ml di un agente anti-sbiancante al centro del vetrino per microscopio. Questo impedisce sbiancamento del tessuto se visto con fluorescenteluce.
- Utilizzando la stessa punta tagliata, raccogliere tutti i dischi degli occhi-antenne e aggiungerli alla goccia di reagente anti-imbianchimento. Ridurre al minimo la quantità di tampone di lavaggio che viene riportato. Cercare di limitare la quantità di tampone di lavaggio a 10 ml o meno.
- Utilizzare un paio di pinze per separare e diffondere i dischi occhio-antenne all'interno della goccia di reagente anti-imbianchimento. Lasciare i dischi di incubare in reagente anti-imbianchimento per alcuni minuti. Nota: i dischi girare chiaramente come il tessuto assorbe il reagente anti-imbianchimento.
- Utilizzando un pennello fine abbassare delicatamente un coprioggetto sul campione. Ciò impedisce la formazione di bolle d'aria.
- Conservare scivola a -20 ° C fino al momento di visualizzare i dischi immaginali eye-antennali o altri che utilizzano la luce o la microscopia a fluorescenza.
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Representative Results
Il metodo descritto in precedenza in modo affidabile produce materiale di alta qualità per l'analisi con sonde in situ, giornalisti trascrizionali, trappole di proteine e anticorpi. In figura 1 mostriamo dischi eye-antenna, genitali, ala, haltere e gambe che vengono regolarmente recuperati con questo metodo. Questi dischi sono stati trattati con un fluoroforo falloidina coniugato, che si lega alla F-actina e quindi delinea ogni cella. Se il tessuto è stato fissato correttamente allora il solco del disco morfogenetico dell'occhio, i bordi del tessuto concentrica pieghe nei dischi genitale, delle antenne e delle gambe, e l'asse dorso-ventrale dei dischi ala e haltere vengono indicate come spigoli taglienti . Se un tessuto è correttamente fissato quindi anticorpi, proteine fluorescenti e sonde in situ anche rivelare modelli taglienti. Diversi esempi sono mostrati nella Figura 2. I tre pannelli principali dischi di visualizzazione che sono state marcate con differenti anticorpi mentre l'tre pannelli inferiori mostrano dischi in cui GFP viene utilizzato per marcare popolazioni di cellule.
Una delle caratteristiche più sorprendenti del disco eye-antenne è il solco morfogenetico (Figura 1A), che può essere visto come un rientro all'interno del tessuto che corre lungo l'asse dorso-ventrale 1, 22. Prima del terzo stadio larvale tutte le cellule all'interno l'occhio in via di sviluppo sono nanostrutturata, indifferenziata, e morfologicamente indistinguibili l'una dall'altra. All'inizio del terzo stadio larvale solco morfogenetica inizia al margine posteriore del campo dell'occhio e progredisce anteriormente verso l'occhio / confine antenne 22. Come il solco progredisce attraverso il campo occhio il mare delle cellule disordinati si trasforma in un array ordinato di occhi unitari periodicamente distanziati o ommatidi (Figura 1A) 22-23. Ahead del solco di una rete di regolamentazione gene che include il Pax6 omologo Eyeless (Ey) canali celluleverso un destino occhio (Figura 2A) 15. L'iniziazione e la progressione del solco stesso è dipendente dalle attività della Hedgehog (Hh) e decapentaplegic (Dpp) vie di segnalazione 24-29. Infatti un reporter DPP-lacZ rispecchia fedelmente l'espressione del locus dpp entro il solco (Figura 2B) 30-31. Come le cellule escono dal solco e cominciano ad adottare i loro destini terminali, esprimono marcatori di cellule specifiche, come embrionali visione letale anormale (ELAV), che codifica per una proteina di legame RNA pan-neuronale (Figura 2C) 32-34.
Figura 1 I dischi immaginali di Drosophila melanogaster. (
Figura 2 Analisi clonale ed espressione del disco immaginale occhio (A - F). Immagini confocale di occhio dischi immaginali. (A) La proteina Pax6 Eyeless (Ey) è distribuito ampiamente in vista del solco morfogenetica. (B) A DPP-lacZ trascrizionale reporter risponde alla segnalazione di Hh e si esprime nel solco morfogenetica. (C) Il legame RNA proteina pan-neuronale Elav è distribuito in tutti i fotorecettori di sviluppo dietro il solco morfogenetica. (D) Un disco contenente occhio cloni perdita di funzione generati dal sistema FLP / FRT. I cloni sono identificati dalla mancanza di GFP (E). Un disco che contiene oltre eye-espressione cloni generati con il sistema FLP-out. I cloni sono positivamente contrassegnati con GFP. (F) Un disco contenente occhio cloni marcm. Come il sistema FLP-out, i cloni marcm possono essere identificate dalla presenza di GFP. Tutte le proteine e genotipi rilevati sono elencati all'interno della figura. Anteriore è a destra e dorsale è alto.
Figura 3 complesso Eye-antenna-cervello. A schdisegno ematico del primo giorno prodotti di dissezione grossolani. Gli unici tessuti che dovrebbero essere risolti sono i ganci bocca, dischi eye-antenna e il cervello (spesso volte il ganglio ventrale rimarrà attaccato così - non mostrati). Viola = cervello, = dischi eye-antenna verde, marrone = ganci bocca. Anteriore è a destra. Se dissezione gamba, ala, haltere e dischi genitali, la cuticola esterna della larva deve essere ancora attaccato a questi tessuti. Non rimuovere la cuticola sovrastante come si potrebbe perdere i dischi immaginali durante i successivi trasferimenti attraverso varie soluzioni di anticorpi, di blocco e di lavaggio. Il tessuto in eccesso può essere rimosso durante le fasi di dissezione sottili (4,1-4,2).
Figura 4 Posizione di dischi immaginali all'interno della larva di Drosophila. Uno schemadisegno tic della posizione relativa dei dischi eye-antenna, gamba, ala, haltere e genitali di un terzo stadio larva. Il disco eye-antenne è colorata in verde, i dischi gambe sono in blu, il disco capestro è in viola, il disco ala è in marrone / arancione e il disco genitale è in marrone chiaro. Anteriore è a destra.
| Nome della Soluzione |
| 8% Paraformaldeide |
| 0.2 M sodio fosfato monobasico |
| 0,2 M fosfato di sodio Disbasic |
| 1 N di idrossido di sodio |
| 10% Triton |
| 0.1 M Sodium Phosphate Buffer (Buffer Dissection) |
| 0.1 M sodio fosfato Tampone + 0,1% Triton (Wash Buffer) |
| Lisina Buffer |
| 2% paraformaldeide-lisina-periodato fissativo (PLP) |
| 10% Normal Goat Serum |
Tabella 1: Elenco delle soluzioni richieste.
| 8% di soluzione paraformaldeide magazzino |
| Per una beuta da ml 50 aggiungere il seguente: |
| 2,0 g di paraformaldeide |
| 23,0 ml di acqua distillata |
| 4,0 gocce di idrossido di sodio 1 N (da una pipetta pasteur vetro) |
| Mescolare e calore su un piatto mescolare fino a quando la soluzione raggiunge lenta ebollizione |
| Lasciare bollire delicatamente fino paraformaldeide è completamente sciolto |
| Mettere in ghiaccio fino al freddo (fare fresco prima di ogni dissezione) |
| 0.1 M tampone fosfato (Dissection (P) Buffer) |
| Per un tubo conico da 50 ml aggiungere il seguente: |
| 18.0 ml 0,2 M fosfato di sodio bibasico |
| 7.0 ml 0.2 M sodio fosfato monobasico |
| 25,0 ml di acqua distillata |
| Conservare a 4 ° C (1 Settimana shelf life) |
| 0.1 M fosfato + Detergente Buffer (lavaggio (W) Buffer) |
| Per un 50tubo conico ml aggiungere il seguente: |
| 18.0 ml 0,2 M fosfato di sodio bibasico |
| 7.0 ml 0.2 M sodio fosfato monobasico |
| 25,0 ml di acqua distillata |
| 0,5 ml 10% Triton |
| Conservare a temperatura ambiente (1 Settimana shelf life) |
| Lisina (L) Buffer |
| Per un tubo conico da 50 ml aggiungere il seguente: |
| 0.4 g Lisina |
| 1,2 ml 0,2 M fosfato di sodio bibasico |
| 8.0 ml Dissection (P) Buffer |
| 10,0 ml di acqua distillata |
| Agitare la soluzione fino a quando la lisina è completamente sciolto |
| Mettere in ghiaccio fino al freddo (fare fresco prima di ogni dissezione) |
| 2% paraformaldeide - Lisina - periodato (PLP) fissativo |
| 0,1 g di sodio periodato |
| 15.0 ml di lisina (L) del buffer |
| 5,0 ml dell'8% paraformaldeide |
| Agitare bene fino a quando la soluzione periodato di sodio è completamente sciolto |
| Mettere in ghiaccio fino al freddo (fare fresco prima di ogni dissezione) |
Tabella 2: Ricette per soluzioni richieste.
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Discussion
Anche se questa procedura è in gran parte concentrata sulla isolamento e successivo trattamento di dischi occhio-antenne, è suscettibile di essere utilizzato per isolare e analizzare l'ala, haltere, gamba e dischi genitali (Figura 4). L'unica modifica necessaria del protocollo per isolare questi dischi (in contrasto con il disco occhio-antenne) è il metodo della dissezione grossolana (sezione 2 del protocollo). La prima tappa (T1) coppia toracica si trova alla anteriore della larva e può essere recuperato seguendo il protocollo per l'isolamento disco eye-antenne. Tuttavia la seconda tappa toracico (T2) i dischi sono attaccati alla cuticola. Per isolare questi dischi un paio di pinze deve essere utilizzato per contenere i ganci bocca (come descritto sopra), mentre un altro paio di pinze dovrebbe essere usato per stringere la cuticola ventrale dell'animale (assicurarsi di stringere la larva circa 1/3 dal ganci bocca. La larva può essere semplicemente Filetto strappando la cuticola ventrale lontano dal resto della larva. Le gambe T2 rimarranno attaccato alla cuticola. Il terzo toracico (T3) della gamba è collegato ai dischi ala e haltere come parte di un complesso, che si è anche collegato alla cuticola. È possibile scegliere di separare il complesso disco e le gambe T2 dalla cuticola in questa fase o mantenere il complesso cuticola-disco insieme durante le successive fissaggio / anticorpi fasi di incubazione e isolare i dischi durante la parte dissezione fini della procedura (sezione 4) . Per recuperare i dischi genitali, è meglio cogliere le larve in tronco con un paio di pinze e poi sbucciare la cuticola ventrale via con l'altra coppia di pinze con partenza dal tronco e termina alla fine posteriore della larva. Si consiglia di pinza essere utilizzati per eliminare tutto il tessuto estraneo e quindi trasferire solo il disco genitale alla soluzione fissativa con un P-200 Pipetman e una punta di giallo la cui fine è stato tagliato con una lama di rasoio.
Questa procedura è più adatto per tissUES di spessore limitato, quali i dischi immaginali e lavora meglio se gli anticorpi in uso sono di alto titolo e specificità. Tuttavia, può essere adattato a lavorare bene con i tessuti più spessi, come l'ovario adulto, testicolo, e il cervello così come con anticorpi di titolo bassi o quelli che danno maggiore di quanto desiderato "background" colorazione. Quando si lavora con i tessuti più spessi, si suggerisce che risultati ottimali si ottengono semplicemente aumentando la concentrazione di paraformaldeide e / o incubando nel fissativo PLP per periodi di tempo più lunghi. Dal momento che la corretta fissazione dei tessuti sezionati è essenziale per il successo con questo protocollo si è anche suggerito che l'efficienza di aumentare la concentrazione paraformaldeide e / o aumentando la lunghezza fissazione essere valutata con falloidina (Figura 1). In particolare, grande attenzione dovrebbe essere prestata alla "nitidezza" delle linee cellulari e altri punti di riferimento fisici all'interno del tessuto (ad esempio, il morphogsolco Enetic). Un altro modo per garantire che il vostro tessuto (in particolare i campioni più spessi) è fissato correttamente è quello di preparare la paraformaldeide dell'8% e soluzioni PLP fresco prima di ogni dissezione. Infine, la qualità complessiva della dissezione può essere aumentato se il tessuto è sezionato per brevi periodi di tempo e tessuto viene trasferito in fissativo appena possibile. Si consiglia di sezionare per non più di 15-20 minuti. Dissezione per le durate più brevi aumenta la qualità di conservazione dei tessuti.
Questo protocollo funziona bene con una vasta gamma di anticorpi, ma è vero che alcuni anticorpi non funzionano bene con il fissativo PLP. Un esempio famoso è l'anticorpo che riconosce il fattore di trascrizione approssimativa (Ro). Ruvido è espressa all'interno ed è necessario per la specifica di un sottoinsieme di sviluppare fotorecettori 35. L'anticorpo anti-Ro funziona meglio, non con PLP, ma piuttosto con un TUBI - EGTA - MgSO4 (PEM) bUffer 36. Allo stesso modo, altri anticorpi possono lavorare meglio sui tessuti che sono state incubate in ancora altri fissativi. Si suggerisce che, salvo diversa indicazione, il fissativo PLP dovrebbe essere provato prima. In caso di insuccesso, allora il processo di ricerca di un fissativo alternativo dovrebbe iniziare.
Un problema comune a confrontarsi è la concentrazione di lavoro dell'anticorpo in questione. Spesso si può essere il primo ricercatore ad utilizzare un anticorpo particolare per rilevare le proteine nel tessuto di interesse. La concentrazione di lavoro può deviare da ciò che è riportato per altri tessuti. Si suggerisce che la concentrazione raccomandata essere provato prima. Aumentare la concentrazione dell'anticorpo se un segnale non può essere visto. D'altra parte, se la concentrazione raccomandata dà colorazione con fondo elevato poi diluendo l'anticorpo dovrebbe essere processato. Le concentrazioni di lavoro tra anticorpi possono variare. Ad esempio, la contro-Eyes assente (Eya) anticorpo viene diluito 1: 5 mentre il antiAnticorpo Elav funziona bene anche a una diluizione 1: 500. Alcuni anticorpi possono anche essere diluiti più in basso 1: 3.000. Inoltre, questa procedura, come scritto, funziona meglio con gli anticorpi elevati di specificità. Tuttavia, come molti hanno sperimentato, alcuni anticorpi possono legare non specificamente per il tessuto e questo può creare un'immagine sub-ottimale. Questa situazione può essere spesso corretto incubazione l'anticorpo diluito con embrioni fissi o carcasse larvali prima di essere aggiunto ai dischi immaginali fisse. A seconda del livello di fondo non specifica colorazione, la lunghezza desiderata di "pre-assorbimento" può variare e dovrà essere elaborato in via sperimentale. È anche possibile aumentare il rapporto segnale / rumore riutilizzando anticorpi più volte o effettuando diversi cicli di pre-assorbimento.
Al momento di decidere quali dischi devono essere utilizzati in pubblicazioni e / o presentazioni, è meglio scegliere i dischi che sono stati orientati con la parte apicale orientato up reparti. E 'anche meglio di utilizzare dischi che non siano piegati. Ciò è particolarmente vero per il disco eye-antenne. Il lato ventrale del disco tende a piegare e, purtroppo, c'è poco si può fare per evitare che ciò accada. Una soluzione è quella di analizzare i dischi più piccoli in quanto questi tendono a piegare molto meno. Un'altra opzione è quella di sezionare solo un gran numero di dischi fino ad ottenere uno che è completamente piatto. La forma complessiva del disco occhio-antenne può essere influenzato dalla velocità con cui la larva è lacerato. Se si tira la larva a parte troppo in fretta il foro attraverso il quale il complesso cervello-disco passa è piccolo e il disco occhio-antenne esce piegato e / o allungato. E 'meglio tirare lentamente fino a quando la larva comincia a strappare dal momento che il foro sarà più grande. Poi si può continuare a tirare il complesso disco cervello-occhio-antenne lentamente. Tenete a mente che non si può mai tirare troppo lentamente. Si noti inoltre, che il tasso a cui strappare il tessuto non è un fattore di isolamento di altri tessuti.
ve_content "> Il ciclo di vita di Drosophila si compone di tre fasi larvali. eventi evolutivi importanti si svolgono durante ognuna di queste fasi, quindi può essere importante isolare i tessuti non solo da parte di terzi stadi larvali (che è l'obiettivo principale di questa procedura) ma anche da prima e seconda larvale stadi pure. Con una sola eccezione, questa procedura può essere utilizzata, come scritto, per isolare i dischi secondo instar. Durante la parte dissezione fini della procedura (sezione 4) si consiglia di tungsteno affilato filo dovrebbe essere utilizzata per separare il disco occhio-antenne dal tessuto estraneo come le ghiandole ganci a bocca, cervello e salivari. Il filo di tungsteno può anche essere utilizzato per separare i dischi T2 / T3 gamba, ala e haltere uno dall'altro e la cuticola sovrastante . Si raccomanda che un'estremità del filo di tungsteno (termine che verrà utilizzato per separare i tessuti) essere affilata mediante riscaldamento in un bagno di nitrato di sodio bollente L'altra estremità può essere inserito in una morsa perno;. thè vi permetterà di tenere il filo di tungsteno più facilmente. Purtroppo, è molto più difficile isolare i dischi intatti primo stadio, quindi si consiglia di posizionare l'intero complesso gancio del disco / cervello / bocca eye-antenne sul vetrino e coprire con un coprioggetto. La quantità di tessuto sezionato può essere minimizzato utilizzando un filo di tungsteno acuminati per rimuovere le ghiandole salivari e sovrastante cuticola prima di montare il gancio complesso disco / cervello / bocca sul vetrino. E 'relativamente facile identificare il primo disco eye-antenne instar quando è ancora attaccato ai ganci del cervello e la bocca (vedi Figura 6A, D di Kumar e Mosè, 2001) 37. Gli altri dischi imaginali dovranno essere separato dalla cuticola e posto su un vetrino per l'osservazione.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Donald Pronto e Kevin Mosè per l'insegnamento JPK la procedura di dissezione disco immaginale originale. Ringraziamo anche Bonnie Weasner per il disco genitale in Figura 1B e il disco occhio in Figura 2A, Brandon Weasner per la figura 3, il Bloomington Drosophila Stock Center per le macchie Fly e la Developmental Studies Ibridoma Banca per gli anticorpi. CMS è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), il Frank W. Putnam Research Fellowship, e Robert Briggs Research Fellowship. JPK è supportata da una sovvenzione da parte del National Eye Institute (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
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