Abstract
Een aanzienlijk deel van de post-embryonale ontwikkeling in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, plaatsvindt binnen een set van sac-achtige structuren, genaamd imaginaire schijven. Deze schijven leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die worden gevonden in de volwassen vlieg. Hier een protocol dat is geoptimaliseerd om deze schijven te herstellen en hen voor te bereiden voor analyse met antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit valkuilen beschrijven we. Deze procedure is vooral geschikt voor dunne weefsels zoals imaginal schijven, maar kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met dikkere weefsels zoals de hersenen larven en volwassen eierstok. Het schriftelijk protocol en bijbehorende video zal de lezer / kijker te begeleiden bij de dissectie van derde instar larven, fixatie van het weefsel, en de behandeling van imaginaire schijven met antilichamen. Het protocol kan worden gebruikt om imaginal discs ontleden van larven jonger eerste en tweede instar ook. Het voordeel van dit protocol is dat het relatief kort en heeft zijnen geoptimaliseerd voor de hoge kwaliteit behoud van ontleed weefsel. Een ander voordeel is dat de fixatie procedure die wordt toegepast werkt goed met het overgrote aantal antilichamen dat Drosophila eiwitten herkennen. In onze ervaring, is er een zeer klein aantal gevoelige antilichamen die niet goed werken met deze procedure. In deze situaties, lijkt de oplossing te zijn om een alternatieve fixatie cocktail te gebruiken terwijl u de richtlijnen die wij hebben toegelicht voor de dissectie stappen en antilichaam incubatie volgen.
Introduction
Al meer dan een eeuw de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een van de beste systeem om de ontwikkeling, het gedrag en de fysiologie te bestuderen geweest. Ontwikkeling in de vlieg kan worden onderverdeeld in twee grote fasen: de embryonale en post-embryonale met veel van deze laatste hebben binnen monolaag epithelia genoemd imaginaire schijven 1-3. Tekeningen van imaginaire schijven werden voor het eerst gepubliceerd in 1864 door August Weismann, als onderdeel van zijn brede monografie over insecten ontwikkeling 1. Deze schijven beginnen hun ontwikkeling tijdens de embryogenese, worden gevormd tijdens de larvale stadia, overleef de massale histolysis van de vroege stadia popstadium en uiteindelijk leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die binnen de volwassen vliegen 1-14. Tijdens de ontwikkeling van de larven elke schijf maakt een aantal belangrijke beslissingen met betrekking tot het lot, vorm en grootte. Binnen de eerste en tweede larvale stadia, worden de schijven belast met de vaststelling van een primaire lot, establishing compartiment grenzen, de vaststelling van de juiste vorm en het genereren van de benodigde aantal cellen 15-16. Tijdens het derde larvale instar en vroege pre-popstadium, de imaginaire schijven blijven delen en zijn patroon als cellen hun terminal lot 16 vast te stellen.
Tijdens de vroege geschiedenis van Drosophila ontwikkelingsbiologie, werden imaginal schijven vrijwel uitsluitend onderzocht in het kader van de normale ontwikkeling en in de beperkte gevallen waarin een verlies of winst-of-function mutant levensvatbaar was. Het gebruik van X-stralen induceren mitotische recombinatie toegestaan letale mutaties in celklonen binnen de larven en volwassen weefsels te analyseren. Deze werkwijze is verbeterd door de introductie van transgene methoden verlies analyseren en gain-of-function mutaties in zowel larven en volwassen weefsels. Het aantal antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit vallen voor het beschrijven van de moleculaire landschap van wild-type en mutante weefsels is ook constantly groeien. Met deze moleculaire merkers verlies analyseren en gain-of-function mutante celklonen is het steeds mogelijk om een real-time begrijpen hoe mutantcellen afwijken van hun wildtype neven tijdens ontwikkeling krijgen. Om goed gebruik maken van deze instrumenten en reagentia is het essentieel om een hoge kwaliteit van de voorbereidingen imaginal schijven die kunnen worden bekeken, gefotografeerd en geanalyseerd hebben. Het doel van dit manuscript is een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en de voorbereiding van de eye-antennaal schijf complex (Figuur 1A) te verstrekken. Het kan ook met succes worden gebruikt om een groot aantal extra schijven zoals die welke tot de vleugels, halters, T1-T3 benen en genitaliën (Figuur 1B-E) te isoleren. Deze procedure, met kleine aanpassingen is gebruikt om imaginal discs isoleren van Drosophila bijna tachtig jaren.
Zoals hierboven beschreven, aangezien de meeste genen die tijdens multiple ontwikkelingsstadia en in een veelheid van weefsels, is het vaak onmogelijk om de effecten te onderzoeken die null-mutanten op het hele oog als het dier sterft ruim voor het derde instar larvale stadium. Vier methoden hebben de studie van de meer ontwikkelde weefsels gemaakt, zoals het netvlies significant meer handelbaar. De eerste is de methode flippase (FLP) / flippase Recombinatie Target (FRT) genereren mutante cel klonen in een overigens wildtype weefsel 17-19. In dit geval de mutant weefsel wordt geïdentificeerd door de afwezigheid van een markering zoals Green Fluorescent Protein (GFP) en kan worden vergeleken met de omringende wildtype weefsel waarin GFP aanwezig is (figuur 2D). De tweede is de "FLP-out" werkwijze waarbij een transgen tot expressie wordt gebracht in een populatie van cellen 20. In dit geval de cel klonen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP reporter mist (figuur2E). De derde is de Mosaic-analyse met een onderdrukbare Cell Marker (MARCM) techniek, die elementen van de FLP / FRT mutant kloon en FLP-out expressie systemen 21 combineert. Met deze methode een transgen kan worden uitgedrukt in een populatie van cellen die tegelijkertijd mutant voor individuele genetische locus. Like flp-out klonen worden MARCM klonen geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP merker (figuur 2F) mist. Tenslotte, de genen en RNAi constructen kunnen worden die binnen imaginaire weefsels onder controle van promotor-GAL4 constructen. Deze vier methoden hebben de belangstelling voor het bestuderen denkbeeldige schijven toegenomen sinds mutant en overexpressie klonen of direct kunnen worden vergeleken met aangrenzende wildtype weefsel. Werkwijze in deze procedure wordt beschreven is ontwikkeld om onderzoekers die de post-embryonale ontwikkeling van volwassen weefsels in Drosophila bestuderenname afkomstig uit de oog-antennaal disc, kunnen hoge kwaliteit weefsel te verkrijgen voor analyse. Hoewel individuele onderzoekers lichte wijzigingen hebben gemaakt, heeft de kern van deze procedure (die we hier beschrijven) grotendeels onveranderd gebleven. Na het behalen van hoge kwaliteit weefsel is van cruciaal belang voor de studie van de imaginaire schijven we hopen dat dit schriftelijk protocol en de bijbehorende video zal dienen als een waardevol leermiddel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van Larven
- Vul een 35 mm petrischaal met dissectie buffer.
- Plaats larven in petrischaal en hen in staat stellen om rond te zwemmen voor een paar minuten (zelfreinigende stap).
- Transfer larven tot een pool van dissectie buffer op basis van siliconen dissectie plaat. Dit zwembad moet aan de ene rand van de plaat. De dissectie plaat bestaat uit een siliconen oplossing werd gegoten en gehard in een glazen petrischaal.
- Met behulp van een pasteur-pipet, plaats een grotere groep dissectie buffer in het midden van de dissectie plaat.
- Met behulp van # 5 tang, de overdracht van een enkel gereinigd larve uit het kleine zwembad op de grotere pool van dissectie buffer.
2 Grof Dissectie van Larven
- Terwijl de larve is nog steeds binnen het grote zwembad van dissectie buffer omklemmen de larve met de tang. Een pincet worden gebruikt om de mond haken grijpen terwijl de andere tang wordt gebruikt om de anim houdenal nog (pak de larve zachtjes op 1/3 lichaamslengte).
- Houd stabiliseren de tang met de cuticula bij mondhaken snel trekken terwijl de rest van het lichaam veranderen met het tweede paar pincetten.
- Als de larve begint te scheuren je een lichte versie van de spanning voelen. Laat de larve van de tang en laat voor het "lef" van de larve te morsen. Dit zorgt voor de imaginaire schijven in hun normale conformatie te blijven en voorkomt dat ze worden vervormd.
- Met een pincet grijpen weer de mond haken aan het vooreinde van de larve plaats houden. De andere paar pincetten verwijder de onderste 2/3 van de larven onder de binnenste ingewanden. Let op: een complex met de mond haken, de eye-antennal schijven, hersenhelften, ventrale ganglion, de speekselklieren, wat been schijven, en de bovenliggende opperhuid zal blijven.
- Met een pincet voorzichtig verwijderen bovenliggende opperhuid, speekselklieren, been schijven enander weefsel. Let op: alleen weefsel dat moet blijven is de mond haken, oog-antennale schijven, hersenhelften, en ventrale ganglion (Figuur 3).
- Herhaal stappen 2.1-2.5 met extra larven gedurende 15-20 minuten. Opmerking: denkbeeldige schijven die blijven dissectie buffer voor langere tijd meestal afneemt en uiteindelijk zal als minder dan ideaal specimens worden gefotografeerd. Aldus, na maximaal 20 minuten alle ontlede weefsels worden overgedragen aan de PLP fixatief (zie hieronder).
3 door fixatie en kleuring van weefsel met antilichamen
- Met behulp van een P-200 pipetman, de overdracht van de ontleed weefsels om een horloge glas met koud Paraformaldehyde-lysine-Periodaatoxidatie (PLP) fixatief. Beperk het volume van de overgedragen dissectie buffer om 50 pi tot verdunning van PLP minimaliseren. Zorg ervoor dat de punt snijden met een scheermesje zodat de tip opening is groot genoeg om de ontleed weefsels tegemoet. Met behulp van een pincet ofEen wolfraam naald toe dat de ontleed weefsel volledig ondergedompeld zodat goede fixatie optreedt. Incubeer ontleed weefsel in koude PLP fixatief 45 minuten. Deze incubatie kan plaatsvinden bij kamertemperatuur zonder roeren.
- Met behulp van een P-200 pipetman, de overdracht van de ontleed weefsels aan buffer te wassen (RT) met een andere gesneden gele punt voor 45 min. Beperk het volume van de overgedragen PLP 50 pi tot verwatering van de wasbuffer minimaliseren. Let op: alle ontleed weefsels moeten volledig worden ondergedompeld.
- Overdracht 20-30 sets van ontleed weefsel tot 1,5 ml microcentrifugebuis. Opmerking: Als grotere aantallen eye-antennaal disc complexen worden gecombineerd in de buis, is er een mogelijkheid dat het weefsel op de bodem van de buis niet correct worden blootgesteld aan de antilichamen. Voor optimale resultaten niet meer dan 20-30 eye-antennaal disc complexen moeten aanwezig zijn binnen een enkele buis. De ontleed weefsel naar de bodem van de microcentrifugebuis. Daarom, in opeenvolgende stappen use een pipetman te verwijderen en te vervangen wasbuffer, het blokkeren van oplossing, en antilichamen.
- Verwijder wasbuffer en vervangen door 100 pl blokkeeroplossing: 10% normaal geit serum in wasbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur met zachte rotatie op een tafelblad rotator gedurende 10 minuten.
- Verwijder het blokkeren oplossing en te vervangen door 100 ul van primaire antilichamen die adequaat werd verdund in 10% normaal geit serum. Incubeer bij kamertemperatuur onder zacht rotatie gedurende 16 uur.
- Verwijder primaire antilichamen en te vervangen door 750 ul wasbuffer. Plaats buisjes op een nutator en laat nutate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Opmerking: Het primaire antilichaam kan worden opgeslagen (opslag bij 4 ° C) en later hergebruikt. Hergebruik antilichamen meerdere keren kan helpen bij het verminderen van niet-specifieke binding.
- Laat hoofden naar de bodem van de buis, verwijder wasbuffer en voeg 100 pl secundaire antilichamen die adequaat werd verdund in 10% normaal serum. Incubeer bij RT met zachte rotatie voor 2̵1, 4 uur.
- Verwijder secundair antilichaam oplossingen van weefsel en vervangen door 500 ui wasbuffer. Laat weefsel naar de bodem van de buis.
- Met behulp van een P-200 en een cut gele tip breng dan ontleed weefsels in een pool wasbuffer die aan de dissectie schotel geplaatst. Terwijl gaan met de volgende stap van fijne dissectie zal het weefsel incuberen in de wasbuffer. Dit helpt om overmaat secundaire antilichamen te verwijderen.
4 Fine Dissectie van Eye-Antennaal Disc Complexen en montage op Slides
- Gebruik een pincet om de cuticula gesp door de mond haken met de ventrale zijde van het complex naar beneden. Met een tweede tang verwijder de twee hersenkwabben het sluiten van de tweede tang in de ruimte tussen de hersenen en de ogen discs (figuur 3, rode pijl) en snel trekken de hersenen verwijderd uit de mond haken.
- En tegelijkertijd vast te houden aan de mond haken, knijpenhet weefsel zo dicht mogelijk bij de verbinding tussen de antennaal gedeelte van de eye-antennaal disc en de mond haken (figuur 3, blauwe pijl). Let op: de eye-antennal disc complexen moet vrij zijn van alle weefsels (figuur 1A) zijn. Ga door tot alle gewenste weefsel gewenst dat op dia's kunnen worden geplaatst is ontleed. Dit protocol kan worden aangepast aan de vleugel, haltere, been en genitale verbeelding discs (Figuur 1B-E) isoleren.
- Voeg twee kleine stukjes vloeipapier (grootte van dekglaasjes) ongeveer 3 in. Elkaar op het ontleden schotel. Plaats een glasplaatje op de schotel - de twee stukken vloeipapier moet onder de uiteinden van de schuif. Dit voorkomt dat de glijbaan van het vasthouden aan de siliconen basis van het ontleden schotel.
- Met behulp van een P-20 met een geslepen punt, voeg 9 ul van een anti-bleekmiddel naar het midden van het microscoopglaasje. Dit voorkomt bleken van het weefsel wanneer bekeken met fluorescentelicht.
- Met behulp van dezelfde ongesneden tip, verzamel alle eye-antennal schijven en voeg ze toe aan de daling van de anti-blekingsreagens. Het minimaliseren van de hoeveelheid wasbuffer dat dan wordt uitgevoerd. Probeer de hoeveelheid wasbuffer beperken tot 10 gl of minder.
- Gebruik een pincet om te scheiden en spreiden de eye-antennal schijven binnen de druppel anti-blekingsreagens. Laat discs incuberen in anti-blekingsreagens enkele minuten. NB: Geen duidelijk zal blijken als het weefsel absorbeert de anti-blekingsreagens.
- Met een fijn penseel voorzichtig zakken een dekglaasje op het monster. Dit voorkomt de vorming van luchtbellen.
- WINKEL glijdt bij -20 ° C tot klaar voor het oog-antennaal of andere imaginaire discs met licht of fluorescentiemicroscopie bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methode die hiervoor betrouwbaar wordt beschreven produceert hoogwaardige materiaal voor analyse met in situ sondes, transcriptie verslaggevers, eiwit vallen en antilichamen. In figuur 1 geven we oog-antenne, genitale, vleugel, haltere en been schijven die routinematig worden hersteld met deze methode. Deze schijven werden behandeld met een falloïdine-geconjugeerd fluorofoor, dat bindt aan F-actine en derhalve schetst elke cel. Wanneer het weefsel is goed dan vastgestelde morfogenetische groef van het oog disc, de randen van de concentrische weefsel plooien in het genitale, antennaal en been schijven en de dorsale-ventrale as van de vleugel en haltere discs alle weergegeven als scherpe randen . Indien een weefsel goed dan vast antilichamen, fluorescerende eiwitten en in situ probes zal onthullen scherpe patronen. Enkele voorbeelden zijn weergegeven in figuur 2. De bovenste drie panelen elkaar schijven die zijn gekleurd met verschillende antilichamen terwijl deonderste drie panelen tonen discs waarbij GFP wordt gebruikt om populaties van cellen te markeren.
Een van de meest opvallende kenmerken van de oog-antennaal schijf de morfogenetische groef (figuur 1A), die kan worden gezien als een indrukking in het weefsel langs de dorsale-ventrale as 1, 22. Vóór het derde larvale instar alle cellen binnen de ontwikkeling van de ogen zijn effen, ongedifferentieerd, en morfologisch niet te onderscheiden van elkaar. Aan het begin van het derde larvale instar initieert de morfogenetische vore het achterste randgedeelte van het veld oog en vordert voren naar het oog / antennal rand 22. Zoals de voor vordert over het veld oog op de zee van wanordelijke cellen wordt omgezet in een geordende reeks van periodiek verdeelde eenheid ogen of ommatidia (Figuur 1A) 22-23. Vooruitlopend op de voor een gen regelgevend netwerk dat de Pax6 homoloog Eyeless (Ey) omvat kanalen cellennaar een eye lot (Figuur 2A) 15. De initiatie en progressie van de geul zelf is afhankelijk van de activiteiten van de Hedgehog (Hh) en Decapentaplegic (DPP) signaalwegen 24-29. Inderdaad een DPP-lacZ reporter getrouwe weergave van de expressie van het DPP locus in de groef (figuur 2B) 30-31. Als cellen de voor sluiten en beginnen hun terminal lot aannemen, express celspecifieke markers zoals embryonale letale abnormaal zicht (elav), die van pan-neuronale RNA bindend eiwit (Figuur 2C) 32-34 codeert.
Figuur 1 De denkbeeldige schijven Drosophila melanogaster. (
Figuur 2 Klonale en expressie analyse van het oog denkbeeldige schijf (A - F). Confocale beelden van het oog imaginaire schijven. (A) De Pax6 eiwit Eyeless (Ey) is in grote lijnen voor op de morfogenetische groef verdeeld. (B) A dpp-lacZ transcriptionele reporter reageert op Hh signalering en wordt uitgedrukt in de morfogenetische groef. (C) De pan-neuronale RNA bindend eiwit Elav wordt verspreid in alle ontwikkelingslanden fotoreceptoren achter de morfogenetische groef. (D) Een oog disc met verlies-van-functie klonen gegenereerd door de FLP / FRT-systeem. De klonen worden geïdentificeerd door het ontbreken van GFP (E). Een oog disc met over-expressie klonen gegenereerd met het FLP-out systeem. Klonen positief gemerkt met GFP. (F) Een oog disc met MARCM klonen. Net als het FLP-out-systeem, kan de MARCM klonen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP. Alle gedetecteerde eiwitten en genotypes zijn opgenomen in de figuur. Anterior is naar rechts en dorsale om is.
Figuur 3 Eye-antenne-hersenen complex. A schematic tekening van de eerste dag grove dissectie producten. Het enige weefsels die moeten worden vastgesteld zijn mond haken, eye-antenne discs en hersenen (Vaak de ventrale ganglion bevestigd blijven en - niet getoond). Paars = hersenen, groen = eye-antenne schijven, bruin = mond haken. Anterior is aan de rechterkant. Als ontleden been, vleugel, haltere en genitale schijven, de buitenste cuticula van de larve moet nog steeds worden aan deze weefsels bevestigd. Verwijder niet de bovenliggende opperhuid als je de denkbeeldige schijven zou kunnen verliezen tijdens de daaropvolgende overdracht door middel van verschillende antilichamen, blok en wassen oplossingen. Het overtollige weefsel kan tijdens de fijne dissectie stappen (4.1-4.2) worden verwijderd.
Figuur 4 Positie van imaginaire schijven binnen de Drosophila larven. Een schematic tekening van de relatieve positie van het oog-antenne, been, vleugel, haltere en genitale schijven in een derde instar larven. De eye-antennal schijf is gekleurd in het groen, het been schijven zijn in het blauw, de halter schijf in paars, de vleugel schijf is in bruin / oranje en de genitale schijf is in het licht bruin. Anterior is aan de rechterkant.
| Naam van Solution |
| 8% paraformaldehyde |
| 0,2 M monobasisch |
| 0,2 M natriumfosfaat Disbasic |
| 1 N natriumhydroxide |
| 10% Triton |
| 0,1 M natriumfosfaatbuffer (Dissection Buffer) |
| 0,1 M natriumfosfaatbuffer + 0,1% Triton (Wash Buffer) |
| Lysine Buffer |
| 2% paraformaldehyde-Lysine-Periodaatoxidatie fixatief (PLP) |
| 10% Normaal Geit Serum |
Tabel 1: Lijst van de Vereiste Solutions.
| 8% paraformaldehyde voorraadoplossing |
| In een 50 ml erlenmeyer het volgende toevoegen: |
| 2,0 g paraformaldehyde |
| 23,0 ml gedestilleerd water |
| 4.0 druppels 1 N natriumhydroxide (Glas pasteur pipet) |
| Mix en warmte op een roerplaat tot oplossing van de kook bereikt |
| Laat zachtjes koken tot paraformaldehyde volledig is opgelost |
| Plaats op ijs tot koude (zorg verse voorafgaand aan elke dissectie) |
| 0,1 M fosfaatbuffer (Dissection (P) Buffer) |
| In een 50 ml conische buis voeg het volgende toe: |
| 18,0 ml 0,2 M dibasisch |
| 7,0 ml 0,2 M monobasisch |
| 25,0 ml gedestilleerd water |
| Bewaren bij 4 ° C (1 week houdbaar) |
| 0,1 M fosfaat + Wasmiddel Buffer (Wash (W) Buffer) |
| Naar een 50ml conische buis voeg het volgende toe: |
| 18,0 ml 0,2 M dibasisch |
| 7,0 ml 0,2 M monobasisch |
| 25,0 ml gedestilleerd water |
| 0,5 ml 10% Triton |
| Bewaren bij kamertemperatuur (1 week houdbaar) |
| Lysine (L) Buffer |
| In een 50 ml conische buis voeg het volgende toe: |
| 0,4 g Lysine |
| 1,2 ml 0,2 M dibasisch |
| 8,0 ml Dissection (P) Buffer |
| 10,0 ml gedestilleerd water |
| Schud oplossing totdat lysine volledig is opgelost |
| Plaats op ijs tot koude (zorg verse voorafgaand aan elke dissectie) |
| 2% paraformaldehyde - Lysine - Periodaatoxidatie (PLP) fixeermiddel |
| 0,1 g natriumperjodaat |
| 15,0 ml van Lysine (L) buffer |
| 5,0 ml 8% paraformaldehyde |
| Schud oplossing goed totdat natriumperiodaat volledig is opgelost |
| Plaats op ijs tot koude (zorg verse voorafgaand aan elke dissectie) |
Tabel 2: Recepten voor Required Solutions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel deze procedure is grotendeels gericht op de isolatie en daaropvolgende behandeling van oog-antennaal discs, het gemakkelijk kan worden gebruikt voor het isoleren en analyseren van de vleugel, haltere, been en genitale discs (figuur 4). De enige vereiste wijziging van het protocol voor het isoleren van deze schijven (in tegenstelling tot de eye-antennal disc) is de methode van grove dissectie (deel 2 van het protocol). De eerste thoracale been (T1) pair is te vinden op de voorste van de larve en kan worden hersteld door het volgen van het protocol voor eye-antennal isolatie schijf. Maar de tweede thoracale been (T2) schijven aan de cuticula bevestigd. Om deze schijven een tang worden gebruikt om de mond haken houden isoleren (zoals hierboven beschreven), terwijl andere tang worden gebruikt om de ventrale cuticula van het dier gesp (zorg ervoor dat de larve ongeveer 1/3 van de sluiting mondhaken. de larve kan eenvoudig worden fileren door scheuren van de ventrale cuticula van de rest van de larva. De T2 benen blijven zitten aan de cuticula. De derde thoracale (T3) poot wordt als onderdeel van een complex, die zelf ook aan de cuticula de vleugels haltere discs gevoegd. U kunt ervoor kiezen om de schijf te complex en de T2-benen van de cuticula de schijven tijdens de fijne dissectie deel van de procedure te scheiden in dit stadium of bij elkaar houden van de cuticula-disc complex tijdens de daaropvolgende vaststelling / antilichaam incubatie stappen en te isoleren (deel 4) . Voor herstellende genitale discs, is het het beste om de larven te grijpen op midsection met een pincet en pel de ventrale cuticula veranderen met het andere paar pincetten vanaf de buik en eindigt aan het achterste uiteinde van de larve. Aanbevolen wordt tang worden gebruikt ruimen alle vreemde weefsels en overzetten de genitale schijf naar de fixeeroplossing met een P-200 pipetman en gele punt waarvan het uiteinde is gesneden met een scheermesje.
Deze procedure is het meest geschikt voor tissues van beperkte dikte zoals imaginal schijven en werkt het beste als de antilichamen worden gebruikt zijn van hoge titer en specificiteit. Het kan echter worden aangepast voor gebruik met dikkere weefsels zoals de volwassen ovarium, testis en hersenen alsook met lage titer antilichamen of met hogere dan gewenst "achtergrond" kleuring geven. Bij het werken met dikkere weefsels, wordt voorgesteld dat optimale resultaten kunnen worden verkregen door het verhogen van de concentratie van paraformaldehyde en / of incuberen in de PLP fixatief langere tijd. Aangezien goede fixatie van ontleed weefsel is essentieel voor succes met dit protocol wordt ook voorgesteld dat de efficiëntie van het paraformaldehyde toenemende concentratie en / of het vergroten van de fixatie lengte worden geslagen phalloidin (figuur 1). In het bijzonder moet veel aandacht aan de 'scherpte' van de cel contouren en andere fysieke monumenten worden betaald in het weefsel (dat wil zeggen, de morphogGenetic groef). Een andere manier om ervoor te zorgen dat uw weefsel (vooral dikkere samples) correct is bevestigd is aan de 8% paraformaldehyde en PLP oplossingen verse voorafgaand aan elke dissectie bereiden. Tenslotte, de algehele kwaliteit van de ontleding kan worden verhoogd als weefsel wordt ontleed voor korte periodes als weefsel wordt zo snel mogelijk overgebracht in fixeermiddel. Er wordt gesuggereerd dat het ontleden van niet langer dan 15-20 minuten. Ontleden voor kortere looptijden verhoogt de kwaliteit van het weefsel behouden.
Dit protocol werkt goed met een uitgebreide lijst van antilichamen, maar het is waar dat sommige antilichamen niet goed met het PLP fixeermiddel. Een bekend voorbeeld is het antilichaam dat de Rough (Ro) transcriptiefactor herkent. Rough uitgedrukt zijn in en vereist voor de specificatie van een subset van ontwikkeling fotoreceptoren 35. De anti-Ro antilichaam werkt het beste, niet met PLP, maar eerder met een BUIZEN - EGTA - MgSO4 (PEM) bUffer 36. Evenzo kunnen andere antilichamen beste werken met weefsels die zijn geïncubeerd in nog andere fixeermiddelen. Er wordt gesuggereerd dat, tenzij anders vermeld, de PLP fixatief moet eerst geprobeerd. Lukt dit niet dan is het proces van het vinden van een alternatief fixatief moet beginnen.
Een veel voorkomend probleem confronteren de werking concentratie van het antilichaam in kwestie. Vaak kan de eerste onderzoeker een bepaald antilichaam om eiwitten in de weefsels van belang. De werkconcentratie afwijken van hetgeen gerapporteerd voor andere weefsels. Er wordt gesuggereerd dat de aanbevolen concentratie eerst worden geprobeerd. Verhoog de concentratie van het antilichaam als het signaal niet zichtbaar. Aan de andere kant, als de aanbevolen concentratie geeft hoge achtergrondkleuring vervolgens verdunnen van het antilichaam worden geprobeerd. Werken concentraties tussen antilichamen kunnen variëren. Bijvoorbeeld, is de anti-Eyes Afwezig (Eya) antilichaam verdund 1: 5, terwijl de anti-Elav antilichaam werkt goed, zelfs bij een 1: 500 verdunning. 3000: sommige antilichamen kan zelfs zo ver naar beneden als 1 worden verdund. Bovendien, deze procedure, zoals geschreven, werkt het beste met een hoge specificiteit van antilichamen. Zoals velen hebben ervaren sommige antilichamen niet-specifiek binden aan het weefsel en dit beeld kan een suboptimaal maken. Deze situatie kan vaak worden verbeterd door het incuberen van het verdunde antilichaam met vaste embryo's of larven karkassen alvorens te worden toegevoegd aan de vaste imaginaire schijven. Afhankelijk van het niveau van de niet-specifieke kleuring van de ondergrond, kan de vereiste lengte van de "pre-absorptie" variëren en zal moeten worden uitgewerkt op proef. Het is ook mogelijk om de signaal / ruisverhouding door hergebruik van antilichamen herhaaldelijk of door het uitvoeren van meerdere rondes van pre-absorptie verhogen.
Bij de beslissing over welke schijven moet worden gebruikt in publicaties en / of presentaties, is het het beste om schijven die zijn gericht aan de apicale zijde georiënteerd up kiezen wards. Het is ook best om schijven die niet zijn gevouwen gebruiken. Dit geldt met name voor de eye-antennal schijf. De ventrale zijde van de schijf heeft de neiging op te vouwen en helaas, er is weinig men kan doen om dit te voorkomen. Een oplossing is om jongere schijven ontleden als deze hebben de neiging om veel minder te vouwen. Een andere optie is om gewoon te ontleden grote aantallen schijven totdat je er een krijgt die is volledig vlak. De algemene vorm van het oog-antennaal disc kan worden beïnvloed door de snelheid waarmee de larve wordt verscheurd. Als men trekt de larve elkaar te snel het gat waardoorheen de hersenen-disc complex geeft is klein en het oog-antennaal disk wordt gevouwen en / of gestrekt. Het beste is om langzaam uit totdat de larve begint te scheuren aangezien het gat groter wordt. Waarna je verder naar de hersenen-eye-antennal schijf complexe trek. Houd in gedachten dat je nooit kunt trekken te langzaam. Merk ook op, dat de snelheid waarmee je het weefsel scheuren is geen factor in het isolement van andere weefsels.
ve_content "> De levenscyclus van Drosophila bestaat uit drie larvale stadia. Belangrijke ontwikkelingsstoornissen evenementen plaatsvinden tijdens elk van deze fasen, dus kan het belangrijk zijn om de weefsels niet alleen uit derde larvale stadia isoleren (dat is de belangrijkste focus van deze procedure) maar ook uit zowel de eerste en tweede larvale stadia ook. Met een kleine uitzondering, kan deze procedure worden toegepast, zoals geschreven, naar de tweede instar schijven isoleren. Tijdens de fijne dissectie deel van de procedure (hoofdstuk 4) is het aanbevolen dat scherpe wolfraam draad moet worden gebruikt om het oog-antennaal disc geen vreemde weefsel scheiden zoals de mond haken, hersenen en speekselklieren. de wolfraam draad kan ook worden gebruikt om de T2 / T3 been vleugels haltere schijven van elkaar en de bovenliggende cuticula scheiden . Het is aanbevolen dat een uiteinde van de wolfraam draad (het einde dat wordt gebruikt om weefsels te scheiden) geslepen worden door verwarmen in een kokend bad natriumnitraat Het andere uiteinde kan in een pin bankschroef worden ingevoegd. this zal u toelaten om de wolfraam draad gemakkelijker vast te houden. Helaas, het is aanzienlijk moeilijker om intacte eerste instar schijven isoleren, daarom is het aanbevolen dat u het hele oog-antennal disc / hersenen / mond haak complex te plaatsen op de glijbaan en dek af met een dekglaasje. De hoeveelheid ontleed weefsel kan worden geminimaliseerd door een scherpe wolfraamdraad de speekselklieren te verwijderen en bovenliggende cuticula vóór de montage van de schijf / hersenen / mond haak complex op de dia. Het is relatief eenvoudig om de eerste instar eye-antennaal disc identificeren wanneer het nog aan de hersenen en mond haken (zie figuur 6A, D van Kumar en Moses, 2001) 37. De andere imaginaire schijven zal moeten worden gescheiden van de cuticula en geplaatst op een dia te bekijken.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Donald Ready en Kevin Mozes bedanken voor het onderwijzen van JPK de originele imaginale schijf dissectie procedure. We danken ook Bonnie Weasner voor de genitale schijf in Figuur 1B en het oog schijf in figuur 2A, Brandon Weasner voor Figuur 3, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly vlekken en de Developmental Studies Hybridoma Bank voor antilichamen. CMS is ondersteund door een toelage van de National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), de Frank W. Putnam Research Fellowship, en de Robert Briggs Research Fellowship. JPK wordt ondersteund door een subsidie van de National Eye Institute (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
