Abstract
חלק משמעותי מפיתוח שלאחר עוברי בזבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מתרחש בתוך מערכת של מבנים דמויים כיס נקראים דיסקים דמותי. תקליטורים אלה להצמיח אחוז גבוה של מבנים למבוגרים הנמצאים בתוך הזבוב הבוגר. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי כבר מותאם להתאושש הדיסקים הללו ולהכינם לניתוח עם נוגדנים, כתבי תעתיק ומלכודות חלבון. הליך זה הוא מתאים ביותר לרקמות דקות כמו דיסקים דמותי, אבל ניתן לשנות בקלות לשימוש עם רקמות עבות יותר כגון השחלה המוח ומבוגר זחל. הפרוטוקול נכתב והסרטון נלווה ידריכו את הקורא / צופה באמצעות הנתיחה של זחלים שלישיים instar, קיבעון של רקמה, וטיפול בדיסקים דמותי עם נוגדנים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי לנתח דיסקים דמותי מזחלי instar הראשון והשני צעירים יותר, כמו גם. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא קצר יחסית ויש לה להיותen מותאם במיוחד לשימור באיכות הגבוהה של הרקמה גזור. יתרון נוסף הוא שהליך הקיבעון שמועסק עובד היטב עם המספר העצום של נוגדנים המזהים חלבוני דרוזופילה. מניסיוננו, יש מספר קטן מאוד של נוגדנים רגישים שלא עובדים היטב עם הליך זה. במצבים אלה, התרופה נראית להשתמש קוקטייל קיבעון חלופי תוך המשך פעל בהתאם להנחיות שיש לנו, שנקבעו עבור צעדים לנתיחה וincubations נוגדן.
Introduction
במשך יותר ממאה שנת זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, הייתה מערכת מובילה ללימודי פיתוח, התנהגות ופיזיולוגיה. פיתוח בזבוב יכול להיות מחולק לשני שלבים עיקריים: עובריים ופוסט עובריים עם הרבה מקום הלקיחה האחרון בתוך epithelia monolayer נקראים דיסקים דמותי 1-3. ציורים של דיסקים דמותי פורסמו לראשונה בשנת 1864 עד אוגוסט וייסמן, כחלק ממונוגרפיה הרחבה שלו על פיתוח 1 חרקים. תקליטורים אלה להתחיל בפיתוחם במהלך עובר, הם בדוגמת בשלבי הזחל, לשרוד histolysis המסיבי של שלבי גלמים המוקדמים, וסופו של דבר לגרום לאחוז גבוה של מבנים למבוגרים הנמצאים בתוך המבוגר לטוס 1-14. במהלך התפתחות זחל כל דיסק עושה כמה החלטות קריטיות לגבי גורל, צורה וגודל. בתוך instars הזחל הראשון והשני, הדיסקים המוטל עם אימוץ גורל עיקרי, establisהינג גבולות תא, אימוץ הצורה הנכונה ויוצר את המספר הדרוש של תאי 15-16. במהלך instar הזחל השלישי והשלב טרום גלמים מוקדמים, הדיסקים דמותי ממשיכים להתחלק והם בדוגמת תאים לאמץ גורל המסוף שלהם 16.
במהלך ההיסטוריה המוקדמת של ביולוגיה התפתחותית דרוזופילה, דיסקים דמותי נחקרו כמעט באופן בלעדי בהקשר של התפתחות נורמלית ובמקרים המצומצמים שבו אובדן או מוטציה רווח של הפונקציה היה קיימא. השימוש בקרן רנטגן כדי לגרום רקומבינציה mitotic אפשרה למוטציות קטלניות להיות מנותחת בשיבוטי תאים בתוך רקמות זחל ומבוגרים. שיטה זו שופרה על ידי ההקדמה של שיטות מהונדסים לנתח אובדן ולהשיג של פונקצית מוטציות בשתי רקמות זחל ומבוגרים. מספר הנוגדנים, כתבי תעתיק ומלכודות חלבון לתיאור הנוף המולקולרי של סוג בר ורקמות מוטציה הוא גם constantly גובר. שימוש בסמנים מולקולריים אלה כדי לנתח אובדן ולהשיג של פונקצית שיבוטים תא שעבר מוטציה עשה את זה אפשרי יותר ויותר כדי להשיג הבנה של הדרך בה תאים שעברו מוטציה לסטות מבני דודים מהסוג הברים במהלך פיתוח בזמן אמת. כדי לנצל את הכלים וחומרים הכימיים הללו כראוי זה הוא קריטי ליש הכנות באיכות גבוהות של דיסקים דמותי שניתן לראות, צילמו וניתחו. המטרה של כתב יד זה היא לספק פרוטוקול מותאם במיוחד לבידוד והכנת המורכבת דיסק העיניים מחושים (איור 1 א). זה גם יכול לשמש בהצלחה לבודד מגוון רחב של דיסקים נוספים כוללים אלה שיוצרים כנפיים, הבוכניות, רגלי T1-T3 ואיברי המין (איור 1 ב-E). הליך זה, עם שינויים קלים, נעשה שימוש כדי לבודד דיסקים דמותי מדרוזופילה במשך כמעט שמונים שנה.
כפי שתואר לעיל, שכן רוב הגנים באים לידי ביטוי במהלך multiple שלבי התפתחות ובמספר רב של רקמות, הוא לעתים קרובות בלתי אפשרי לחקור את ההשפעות שיש לי מוטציות null בכל עין כחיה מתה הרבה לפני שלב זחל instar השלישי. ארבע שיטות שעשו המחקר של רקמות מפותחות יותר כגון הרשתית באופן משמעותי יותר צייתן. הראשון הוא שיטת Flippase (FLP) / Flippase רקומבינציה היעד (FRT) של יצירת שיבוטים תא שעברו מוטציה בתוך רקמת סוג אחר פראית 17-19. במקרה זה רקמת המוטציה מזוהה על ידי היעדר סמן חזותי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויכולה להיות בהשוואה לרקמה הסובבת הפראית הסוג שבו GFP הוא הווה (איור 2 ד). השני הוא השיטה "FLP-out", שבי transgene באה לידי ביטוי באוכלוסייה של תאים 20. במקרה זה השיבוטים התא מזוהים על ידי הנוכחות של GFP והשוואה לרקמה הסובבת הסוג בר שחסרה את כתב GFP (איור2E). השלישי הוא ניתוח הפסיפס עם טכניקת סמן תא Repressible (MARCM), המשלבת אלמנטים של שיבוט המוטציה FLP / FRT ומערכות ביטוי FLP-out 21. בשיטה זו transgene יכול לבוא לידי ביטוי בתוך אוכלוסייה של תאים שנמצאים בו זמנית מוטציה למוקד גנטי בודד. כמו שיבוטים FLP-out, שיבוטים MARCM מזוהים על ידי הנוכחות של GFP והשוואה לרקמה מהסוג בר שמסביב שחסרה את סמן GFP (איור 2F). ולבסוף, ניתן לבטא את הגנים ומבני RNAi בתוך רקמות דמותי תחת שליטתו של בונה האמרגן-GAL4 ספציפי. ארבע שיטות אלה הגדילו את הריבית בלומד דיסקים דמותי מאז שיבוטים או דפוסי מוטציה או על ביטוי ניתן להשוות ישירות לרקמה מסוג בר סמוכה. השיטה המתוארת בהליך זה פותחה כך שחוקרים הלומדים את התפתחות פוסט העוברית של רקמות בוגרות בדרוזופילה,במיוחד אלה הנגזרים מדיסק העיניים מחושים, יוכל להשיג רקמה באיכות גבוהה לניתוח. למרות שחוקרים פרטיים שעשו שינויים קלים, הליבה של הליך זה (שבו אנו מתארים כאן) נותרה במידה רבה ללא שינוי. מאז קבלת רקמה באיכות גבוהה היא קריטית למחקר של הדיסקים דמותי אנו מקווים פרוטוקול זה נכתב וסרטון נלווה ישמשו כמשאב יקר ערך הוראה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת הזחלים
- למלא צלחת פטרי 35 מ"מ עם חיץ לנתיחה.
- מניחים זחלים בצלחת פטרי ולאפשר להם לשחות סביב לכמה דקות (שלב ניקוי עצמי).
- העבר את הזחלים לבריכה של חיץ לנתיחה על צלחת לנתיחה מבוססת סיליקון. בריכה זו צריכה להיות בקצה אחד של הצלחת. הצלחת לנתיחה כוללת פתרון סיליקון שכבר שפכו וקשוחים בתוך צלחת פטרי זכוכית.
- באמצעות פסטר-pipet, למקם בריכה גדולה יותר של חיץ לנתיחה באמצע הצלחת לנתיחה.
- באמצעות # 5 מלקחיים, להעביר זחל ניקה אחת מהברכה הקטנה לבריכה הגדולה יותר של חיץ לנתיחה.
.2 גס Dissection של זחלים
- בעוד הזחל הוא עדיין בתוך הבריכה הגדולה של חיץ נתיחה לאחוז את הזחל עם המלקחיים. זוג אחד של מלקחיים יש להשתמש כדי לתפוס את הפה הווים בעוד זוג המלקחיים האחר משמש להחזיק עניםאל עדיין (לתפוס את הזחל בעדינות ב1/3 אורך גוף).
- החזק לייצב את זוג מלקחיים המכילים את הציפורן ליד הפה הווים תוך משיכת מהירות שאר הגוף משם עם הזוג הנוסף של מלקחיים.
- כשהזחל מתחיל לקרוע לגזרים אתה תרגיש שחרור קל במתח. שחרר את הזחל מהמלקחיים ולאפשר ל" אומץ "של הזחל לשפוך החוצה. זה מאפשר לדיסקים דמותי להישאר בקונפורמציה הרגילה שלהם ומונע מהם להיות מעוות.
- עם זוג אחד של מלקחיים לתפוס את הפה הווים שוב להחזיק את הקצה הקדמי של הזחל במקום. באמצעות זוג מלקחיים האחר להסיר את תחתון 2/3 של הזחלים כוללים את האומץ הפנימי. הערה: מורכב המכילים את הפה הווים, דיסקי עיניים מחושים, אונות מוח, גנגליון הגחון, בלוטות הרוק, כמה דיסקי רגל, והציפורן שמעליה יישארו.
- עם זוג המלקחיים בעדינות להסיר ציפורן שמעליה, בלוטות רוק, דיסקי רגל ורקמות אחרות. הערה: רק רקמה שצריכה להישאר הוא הפה הווים, דיסקי עיניים מחושים, אונות מוח, וגנגליון הגחון (איור 3).
- חזור על שלבים 2.1-2.5 עם זחלים נוספים ל15-20 דקות. הערה: דיסקים דמותי שנותרו במאגר לנתיחה לתקופות זמן ארוכים יותר נוטים לבזות וסופו של דבר יופיעו כפחות מדגימות אידיאלי להצטלם. לפיכך, לאחר מקסימום של 20 דקות כל הרקמות גזורים יש להעביר למקבע PLP (ראה להלן).
3 קיבוע והכתמה של רקמות עם נוגדנים
- באמצעות pipetman P-200, להעביר את הרקמות גזורים לזכוכית שעון המכילה מקבע קר Paraformaldehyde-ליזין-periodate (PLP). מגבלת נפח של חיץ נתיחה הועבר ל50 μl כדי למזער דילול של PLP. הקפד לחתוך את הקצה בסכין גילוח כדי שפתיחת הקצה היא גדולה מספיק כדי להכיל את הרקמות גזורים. בעזרת זוג מלקחיים אומחט טונגסטן להבטיח שהרקמות גזורים שקועות לחלוטין במטרה לקיבוע נאות להתרחש. דגירה רקמות גזורים במקבע PLP קר 45 דקות. דגירה זה יכול להתרחש בRT ללא תסיסה.
- באמצעות pipetman P-200, להעביר את הרקמות גזורים לשטוף חיץ (RT) באמצעות עוד טיפ צהוב לחתוך ל45 דקות. מגבלת נפח של PLP הועבר ל50 μl כדי למזער דילול של המאגר לשטוף. הערה: כל הרקמות גזורים צריכה להיות שקועות לחלוטין.
- העבר 20-30 סטים של רקמה גזור ל1.5 מ"ל צינור microfuge. הערה: אם מספרים גדולים יותר של מתחמי דיסק עיניים מחושים משולבים בתוך הצינור, יש אפשרות שהרקמה בחלק התחתון של הצינור לא תהיה חשופה כראוי לנוגדנים. לקבלת תוצאות אופטימליות לא יותר מ 20-30 מתחמי דיסק עיניים מחושים צריכים להיות נוכחים בתוך צינור אחד. הרקמה גזור יישב לחלק התחתון של צינור microfuge. צעדים לכן, שבלאחר מכן use pipetman להסיר ולהחליף חיץ לשטוף, פתרון חסימה, ונוגדנים.
- הסר חיץ לשטוף ולהחליף עם של פתרון חסימת 100 μl: 10% עזים בסרום נורמלי בחיץ לשטוף. לדגור על RT עם סיבוב עדין על הכתף בראש טבלה ל10 דקות.
- הסר פתרון חסימה ולהחליף עם של נוגדנים עיקריים 100 μl כי כבר מדוללת כראוי ב10% עזים בסרום נורמלי. לדגור על RT עם סיבוב עדין ל16 שעות.
- הסר נוגדנים ראשוניים ולהחליף עם 750 μl של חיץ לשטוף. מניחים צינורות על nutator ולאפשר לnutate ב RT עבור 10 דקות. הערה: הנוגדן הראשוני ניתן לשמור (חנות ב 4 ° C), ושימוש חוזר מאוחר יותר. שימוש חוזר בנוגדנים מספר פעמים יכול לעזור בהפחתה מחייבת שאינו ספציפי.
- לאפשר ראשים ליישב לתחתית של התחתית, ולאחר מכן להסיר חיץ לשטוף ולהוסיף של נוגדנים משני שכבר מדולל כראוי ב10% בסרום נורמלי 100 μl. לדגור על RT עם סיבוב עדין ל2̵1; 4 שעות.
- הסר פתרונות נוגדנים משני מרקמות ולהחליף עם 500 μl של חיץ לשטוף. לאפשר לרקמות להתיישב לתחתית של התחתית.
- באמצעות P-200 וקצה צהוב לחתוך, להעביר את כל הרקמות גזורים לבריכה של חיץ לשטוף שהושם על הצלחת לנתח. בעוד שתמשיך לשלב הבא של נתיחה בסדר, רקמות דגירה בחיץ לשטוף. זה עוזר להסיר נוגדנים משני עודפים.
.4 פיין Dissection של Eye-מחושים דיסק מכלולים והרכבה על גבי שקופיות
- השתמש בזוג אחד של מלקחיים כדי לאחוז לציפורן על ידי ווי הפה עם צד הגחון של המתחם פונה כלפי מטה. עם זוג שני של מלקחיים להסיר את שתי אונות המוח על ידי סגירת המלקחיים השניה במרחב שבין דיסקי המוח והעין (איור 3, חץ אדום) ובמהירות משך את המוח מהפה הווים.
- בעוד המשך אחיזת ווי הפה, לצבוט אתהרקמה הקרובה ככל האפשר לחיבור בין סעיף המחושים של דיסק העין מחושים ופי הווים (איור 3, חץ כחול). הערה: מתחמי דיסק העיניים מחושים צריכים להיות חופשיים של כל הרקמות (איור 1 א). המשך עד שכל הרקמה הרצויה הרצויה שיכול להיות ממוקמת על גבי שקופיות כבר גזור. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לבודד את הכנף, הבוכניות, רגל ודיסקים באברי המין דמותי (איור 1 ב-E).
- הוסף שתי חתיכות קטנות של נייר טישו (גודל של coverslips) כ 3 ב. בנפרד על הצלחת לנתח. מניחים בשקופית זכוכית על הצלחת - שתי החתיכות של נייר טישו צריכה להיות תחת הקצוות של השקופית. זה ימנע את השקופית מלהידבק לבסיס סיליקון של המנה לנתח.
- באמצעות P-20 עם קצה חתוך, להוסיף 9 μl סוכן אנטי הלבנה לאמצע שקופית מיקרוסקופ הזכוכית. זה מונע הלבנה של הרקמה כאשר צפו עם ניאוןאור.
- השימוש באותו קצה חתוך, לאסוף את כל דיסקי העיניים מחושים ולהוסיף אותם לירידה של מגיב נגד הלבנה. למזער את הכמות של חיץ לשטוף שמתבצע מעל. נסה להגביל את הכמות של חיץ לשטוף ל10 μl או פחות.
- השתמש בזוג מלקחיים כדי להפריד ולהפיץ את דיסקי עיניים מחושים בתוך הטיפה של מגיב נגד הלבנה. לאפשר דיסקים כדי לדגור במגיבים נגד הלבנה למשך מספר דקות. הערה: דיסקים יהפכו ברורים כמו הרקמה סופגת מגיב נגד ההלבנה.
- באמצעות מכחול עדין בעדינות להוריד את coverslip לדגימה. זה מונע ההיווצרות של בועות אוויר.
- חנות מחליקה ב-20 ° C עד מוכן לצפייה בדיסקים דמותי עיניים מחושים או אחרים באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה שתוארה לעיל באופן מהימן מייצרת חומר באיכות גבוהה לניתוח עם בבדיקות באתר, כתבי תעתיק, מלכודות חלבון ונוגדנים. באיור 1 אנו מציגים דיסקי עין אנטנה, באברי המין, כנף, הבוכניות ורגל שהם התאוששו באופן שיגרתי בשיטה זו. טופלו בדיסקים אלה עם fluorophore phalloidin מצומדות-, אשר נקשר לF-אקטין ולכן מתאר כל תא. אם הרקמה תוקנה כראוי ואז תלם המוךפו"גנטי של דיסק העין, את הקצוות של הרקמה קונצנטריים מקפל בדיסקים באיברי המין, מחושים ורגליים, ואת הציר הגבי הגחון של דיסקי כנף והבוכניות יהיה מופיע כל קצוות חדים כ . אם רקמה קבועה כראוי אז נוגדנים, חלבוני ניאון ובבדיקות באתר גם לחשוף דפוסים חדים. כמה דוגמאות שמוצגים באיור 2. דיסקי התצוגה העליונים שלושה פנלים שכבר מוכתמים עם נוגדנים שונים תוךשלושה פנלים התחתונים מראים דיסקים שבי GFP משמש לסימון אוכלוסיות של תאים.
אחד המאפיינים הבולטים ביותר של דיסק העין מחושים הוא תלם המוךפו"גנטי (איור 1 א), שניתן לראותו כזחה בתוך רקמה פועלת לאורך הציר הגבי הגחון 1, 22. לפני instar הזחל השלישי כל התאים בתוך עין הפיתוח היא יותר יופיע, לא מובחנת, ואין להבחין מורפולוגית זה מזה. בתחילת instar הזחל השלישי תלם המוךפו"גנטי יוזם בשוליים האחוריים של שדה עין ומתקדם anteriorly כיוון עין / גבול המחושים 22. כתלם מתקדם על פני שדה עין הים של תאים מסודרים הופך למערך מסודר של עיני יחידת רווח מעת לעת או האומטידיה (איור 1 א) 22-23. לקראת תלם רשת רגולציה גן הכוללת homolog Pax6 חסר העיניים (Ey) תאי ערוציםלקראת גורל העין (איור 2 א) 15. הייזום וההתקדמות של התלם עצמו הוא תלוי בפעילותם של הקיפוד (HH) וDecapentaplegic (DPP) מסלולי איתות 24-29. ואכן כתב DPP-lacZ ישקף נאמנה את הביטוי של מוקד DPP בתוך התלם (איור 2) 30-31. ככל שתאים לצאת מהתלם ולהתחיל לאמץ את גורל המסוף שלהם, הם מביעים סמני תא ספציפי כגון חזון עוברי קטלני חריג (elav), אשר מקודד חלבון מחבת עצבי RNA מחייב (איור 2 ג) 32-34.
איור 1 דיסקים דמותי של melanogaster דרוזופילה. (
איור 2 ניתוח משובט וביטוי של הדיסק דמותי עין (- F). תמונות Confocal של דיסקים דמותי עין. () חלבון Pax6 חסר עיניים (Ey) מופץ באופן נרחב לפני תלם המוךפו"גנטי. (ב) DPP-lacZ תעתיק reporter מגיב לאיתות Hh ובא לידי ביטוי בתוך תלם המוךפו"גנטי. חלבון RNA מחייב מחבת העצבית Elav מופץ בכל קולטני אור הפיתוח מאחורי תלם המוךפו"גנטי (C). דיסק העין מכיל שיבוטים אובדן של פונקציה שנוצרו על ידי מערכת FLP / FRT (ד '). השיבוטים מזוהים על ידי חוסר GFP (E). דיסק העין מכיל שיבוטים על ביטוי שנוצרו עם מערכת FLP-out. שיבוטים מסומנים באופן חיובי עם GFP. דיסק העין מכיל שיבוטים MARCM (F). כמו מערכת FLP-out, ניתן לזהות השיבוטים MARCM על ידי הנוכחות של GFP. כל החלבונים וגנוטיפים זוהו שמותיהם מופיעים בדמות. הקדמי הוא בצד הימין ועל הגב הוא עד.
.3 מורכב Eye-אנטנת מוח איור. SCHציור ematic של המוצרים לנתיחה גסות היום הראשון. הרקמות רק שצריך להיות קבועים הן הפה ווים, דיסקי העין אנטנה ומוח (לעתים קרובות פעמים גנגליון הגחון יישאר מחוברת גם כן - לא מוצג). סגול = מוח, = דיסקי העין אנטנה ירוקים, ווי חום = פה. הקדמי הוא בצד הימין. אם לנתח את רגל, כנף, הבוכניות ודיסקים באיברי המין, העור המת החיצוני של הזחל עדיין צריך להיות מחובר לרקמות אלה. אל תסיר את הציפורן שמעליה כפי שאתה עלול לאבד את הדיסקים דמותי במהלך ההעברות הבאות באמצעות פתרונות נוגדן, בלוק וכביסה שונים. הרקמה העודפת ניתן להסיר במהלך שלבי קנס דיסקציה (4.1-4.2).
איור 4 תפקיד של דיסקים דמותי בתוך זחל דרוזופילה. סכימהציור טיקים של המיקום היחסי של דיסקי עין אנטנה, רגל, זרוע, הבוכניות ואיברי מין בתוך זחל instar שלישי. דיסק העיניים מחושים הוא בצבע ירוק, דיסקי הרגל הם בכחול, דיסק הקולר הוא בצבע סגול, דיסק הכנף הוא בצבע חום / כתום והדיסק של איברי המין הוא בצבע החום בהיר. הקדמי הוא בצד הימין.
| שם פתרון |
| Paraformaldehyde 8% |
| 0.2 M סודיום פוספט monobasic |
| 0.2 M סודיום פוספט Disbasic |
| 1 N נתרן הידרוקסידי |
| 10% Triton |
| 0.1 M סודיום פוספט חוצץ (Buffer Dissection) |
| 0.1 M סודיום פוספט הצפת + 0.1% טריטון (הצפת לשטוף) |
| ליזין מאגר |
| 2% Paraformaldehyde-ליזין-periodate מקבע (PLP) |
| 10% רגיל עיזים סרום |
טבלת 1: רשימה של פתרונות הנדרשים.
| 8% פתרון מניות Paraformaldehyde |
| לבקבוק Erlenmeyer 50 מ"ל להוסיף את הדברים הבאים: |
| paraformaldehyde 2.0 גרם |
| 23.0 מ"ל של מים מזוקקים |
| 4.0 טיפות של נתרן הידרוקסידי 1 N (מpipet פסטר זכוכית) |
| מערבבים ומחממים על צלחת ומערבבים עד שהפתרון מגיע רתיחה עדינה |
| מרתיח על אש עד שהוא נמס לגמרי paraformaldehyde |
| מניחים על קרח עד קר (לעשות טרי לפני כל נתיחה) |
| 0.1 M פוספט חוצץ (Dissection (P) Buffer) |
| לצינור חרוטי 50 מ"ל להוסיף את הדברים הבאים: |
| dibasic 18.0 מ"ל 0.2 M סודיום פוספט |
| monobasic 7.0 מ"ל 0.2 M סודיום פוספט |
| 25.0 מ"ל מים מזוקקים |
| חנות ב 4 ° C (חיי מדף שבוע 1) |
| 0.1 M פוספט + דטרגנט חוצץ (Wash (W) Buffer) |
| ל50צינור חרוטי מ"ל להוסיף את הדברים הבאים: |
| dibasic 18.0 מ"ל 0.2 M סודיום פוספט |
| monobasic 7.0 מ"ל 0.2 M סודיום פוספט |
| 25.0 מ"ל מים מזוקקים |
| 0.5 מ"ל 10% Triton |
| חנות ב RT (1 שבוע חיי מדף) |
| ליזין (L) מאגר |
| לצינור חרוטי 50 מ"ל להוסיף את הדברים הבאים: |
| ליזין 0.4 גרם |
| dibasic 1.2 מ"ל 0.2 M סודיום פוספט |
| 8.0 מ"ל Dissection (P) חוצץ |
| 10.0 מ"ל מים מזוקקים |
| לנער פתרון עד ליזין הוא נמס לגמרי |
| מניחים על קרח עד קר (לעשות טרי לפני כל נתיחה) |
| Paraformaldehyde 2% - ליזין - periodate מקבע (PLP) |
| 0.1 גרם נתרן periodate |
| 15.0 מ"ל של ליזין חיץ (L) |
| 5.0 מ"ל של Paraformaldehyde 8% |
| לנער פתרון טוב עד periodate נתרן הוא נמס לגמרי |
| מניחים על קרח עד קר (לעשות טרי לפני כל נתיחה) |
טבלה 2: מתכונים לפתרונות נדרשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שהליך זה במידה רבה התמקד בבידוד והטיפול הבא של דיסקי עיניים מחושים, זה ניתן לשימוש כדי לבודד ולנתח את הכנף, הבוכניות, הרגל ודיסקים באברי המין (איור 4). השינוי הנדרש היחיד של הפרוטוקול לבידוד הדיסקים הללו (בניגוד לדיסק העיניים מחושים) הוא השיטה של נתיחה גסה (סעיף 2 לפרוטוקול). רגל הזוג הראשון של בית החזה (T1) נמצא בקדמי של הזחל וניתן לשחזר על ידי ביצוע הפרוטוקול לבידוד דיסק עיניים מחושים. עם זאת הדיסקים שני רגל חזה (T2) מחוברים לציפורן. כדי לבודד את הדיסקים האלה זוג המלקחיים יש להשתמש כדי להחזיק את הפה הווים (כמתואר לעיל) ואילו יש להשתמש זוג נוסף של מלקחיים לאחוז ציפורן הגחון של בעלי החיים (הקפד לאחוז את הזחל על 1/3 מ ווי פה. הזחל יכולים להיות פשוט פילה על ידי קריעה לציפורן הגחון משאר LARva. רגלי T2 יישארו צמודות לציפורן. החזה השלישי ברגל (T3) מחוברת לדיסקי כנף והבוכניות כחלק ממכלול, שהיא עצמה גם מצורף לציפורן. אתה יכול לבחור כדי להפריד מורכב דיסק ורגלי T2 מהציפורן בשלב זה או לשמור מורכב ציפורן הדיסק יחד במהלך הקיבעון / שלבי הדגירה נוגדן שלאחר מכן ולבודד את הדיסקים במהלך חלק נתיחת הקנס של ההליך (סעיף 4) . לשחזור דיסקים באיברי מין, דרך טובה ביותר הוא לתפוס את הזחלים בבטן עם זוג אחד של מלקחיים ולאחר מכן לקלף את העור המת הגחון משם עם זוג המלקחיים מתחילים בבטן ומסתיימים בקצה האחורי של הזחל האחר. מומלץ מלקחיים לשמש כדי לסלק את כל הרקמה הזר ולאחר מכן להעביר רק את הדיסק באברי המין לפתרון מקבע באמצעות pipetman P-200 וקצה צהוב הסוף שנחתך בסכין גילוח.
הליך זה הוא מתאים ביותר עבור Tissues של עובי מוגבל כגון דיסקים דמותי ועובד הכי טוב אם הנוגדנים שבשימוש גבוה כייל וספציפיות. עם זאת, זה יכול להיות מותאם לעבודה גם עם רקמות עבות יותר כגון השחלה הבוגרת, אשכים, ומוח, כמו גם עם נוגדני כייל נמוכים או אלה שנותנים גבוהים יותר מאשר צביעה "רקע" רצויה. כאשר עובד עם רקמות עבות יותר, הוא הציע כי ניתן להשיג תוצאות אופטימליות, פשוט על ידי הגדלת הריכוז של paraformaldehyde ו / או דוגרים במקבע PLP לתקופות זמן ארוכים יותר. מאז הקיבוע נכון של רקמות גזורים הוא חיוני להצלחה עם פרוטוקול זה הוא גם הציע כי היעילות של הגדלת ריכוז paraformaldehyde ו / או להגדיל את אורך הקיבעון תוערך עם phalloidin (איור 1). בפרט, תשומת לב צריך להיות משולם על "החדות" של קווי המתאר תא וציונים דרך פיזית אחרת בתוך הרקמה (כלומר, morphogתלם enetic). דרך נוספת להבטיח שהרקמה שלך (במיוחד דגימות עבות יותר) הוא קבוע כראוי היא להכין paraformaldehyde 8% ופתרונות PLP טריים לפני כל נתיחה. ולבסוף, את האיכות הכוללת של הנתיחה ניתן להגדיל אם רקמה היא גזור לתקופות קצרות של זמן והרקמה מועברת לתוך מקבע בהקדם האפשרי. הוא הציע כי לנתח לא יותר מ15-20 דקות. ביתור לתקופות קצרות יותר מגביר את האיכות של שימור רקמות.
פרוטוקול זה עובד היטב עם מגוון רחב של נוגדנים, אבל זה נכון שחלק מהנוגדנים לא עובדים היטב עם מקבע PLP. דוגמא ידועה לשמצה אחד היא הנוגדן שמזהה את גורם השעתוק גס (Ro). מחוספס בא לידי הביטוי בתוך ודרוש למפרט של קבוצת משנה של פיתוח קולטני אור 35. אנטי Ro הנוגדן עובד הכי טוב, לא עם PLP, אלא עם צינורות - EGTA - MgSO 4 (PEM) בuffer 36. באופן דומה, נוגדנים אחרים עשויים לעבוד הכי טובים על רקמות שכבר מודגרות בfixatives עדיין אחר. הוא הציע כי, אלא אם כן צוין אחרת, מקבע PLP יש לנסות ראשון. אם לא מוצלח אז את התהליך של מציאת מקבע חלופי צריכים להתחיל.
בעיה נפוצה אחת להתמודד היא ריכוז העבודה של הנוגדן בשאלה. פעמים רבות אתה יכול להיות החוקר הראשון שהשתמש בנוגדן מסוים כדי לזהות חלבונים ברקמת עניין שלך. ריכוז העבודה יכול לסטות ממה שדיווח לרקמות אחרות. הוא הציע כי הריכוז המומלץ להיות ניסה ראשון. להגדיל את הריכוז של הנוגדנים אם אות לא ניתן לראות. מצד השני, אם את הריכוז המומלץ נותן מכתים רקע גבוה אז לדלל את הנוגדן צריך להיות ניסה. ריכוזי עבודה בין נוגדנים יכולים להשתנות. לדוגמא, בהעדר הנוגדנים נגד עיניים (Eya) מדולל 1: 5 ואילו אנטינוגדן Elav עובד היטב גם בדילול 1: 500. נוגדנים חלקם אפילו יכולים להיות מדוללים והגיע עד 1: 3,000. בנוסף, הליך זה, כפי שנכתב, עובד הכי טוב עם נוגדנים סגוליות גבוהים. עם זאת, כפי שהרבים חוו, כמה נוגדנים יכולים להיקשר שאינו ספציפי לרקמה וזה יכול ליצור תמונה לא אופטימלית. מצב זה יכול להיות לעתים קרובות תוקן על ידי דוגרים הנוגדן המדולל עם עוברים קבועים או פגרי זחל לפני להתווסף לדיסקים דמותי הקבועים. בהתאם לרמה של מכתים רקע שאינו ספציפי, האורך הנדרש של "טרום קליטה" יכול להשתנות ויצטרך להיות עבד החוצה על בסיס ניסיון. אפשר גם להגדיל את יחס אות / רעש על ידי נוגדנים באמצעות מחדש מספר פעמים או על ידי ביצוע כמה סיבובים של טרום קליטה.
כאשר מחליטים על שיש להשתמש בתקליטורים בפרסומים ו / או מצגות, עדיף לבחור דיסקים שכבר בכיוון עם צד פסגת אוריינטציה עד מחלקות. היא גם הטובה ביותר כדי להשתמש בתקליטורים שאינם מקופלים. זה נכון במיוחד של דיסק העין מחושים. בצד הגחון של דיסק נוטה להתקפל, ולמרבה הצער, יש מעט שאפשר לעשות כדי למנוע את זה מלקרות. פתרון אחד הוא לנתח דיסקים צעירים כמו אלה נוטים להתקפל הרבה פחות. אפשרות נוספת היא פשוט לנתח מספר גדול של דיסקים עד שאתה מקבל אחד כי הוא שטוח לחלוטין. הצורה הכללית של דיסק העין מחושים יכולה להיות מושפעת על ידי הקצב שבו הזחל נקרע לגזרים. אם אחד מושך את הזחל לגזרים מהר מדי לחור שדרכו מורכב מוח הדיסק עובר הוא קטן ודיסק העיניים מחושים יוצא מקופל ו / או מתוח. עדיף למשוך באיטיות עד הזחל מתחיל לקרוע מאז החור יהיה גדול יותר. אז אתה יכול להמשיך למשוך מורכב דיסק מוח העין מחושים לאט. יש לזכור כי אתה אף פעם לא יכול למשוך לאט מדי. כמו כן שים לב, שהקצב שבו אתה לקרוע את הרקמה אינו מהווה גורם בבידוד של רקמות אחרות.
ve_content "> מחזור החיים של דרוזופילה מורכב משלושה שלבי זחל. אירועים התפתחותיים חשובים יתקיימו במהלך כל אחד מהשלבים האלה, ובכך שהוא עשוי להיות חשוב לבודד את רקמות ולא רק מinstars זחל השלישי (המהווה את המוקד העיקרי של הליך זה) אלא גם משני הזחל הראשון והשני instars גם כן. עם יוצא מן הכלל אחד קטין, ניתן להשתמש בם בהליך זה, כפי שנכתב, לבודד דיסקי instar שני. במהלך חלק נתיחת הקנס של ההליך (סעיף 4) מומלץ שטונגסטן החד יש להשתמש בחוט כדי להפריד את דיסק העיניים מחושים מרקמות זרות כמו בלוטות פה ווים, המוח ורוק. גם חוט טונגסטן יכול לשמש כדי להפריד את דיסקי רגל T2 / T3, אגף והבוכניות אחד מהשני והציפורן שמעליה . הוא ממליץ שקצה אחד של חוט טונגסטן (הסוף שישמש להפרדת רקמות) להיות מחודד על ידי חימום באמבטית נתרן חנקה רותחת הקצה השני יכול להיות מוכנס לתוך מלחציים סיכה;. ההוא יאפשר לך להחזיק את חוט טונגסטן בקלות רבה יותר. לרוע המזל, זה הרבה יותר קשה לבודד את דיסקי instar הראשונים בשלמותה, ולכן מומלץ כי אתה מציב את המכלול כולו קרס דיסק / מוח / פה העיניים מחושים בשקופית ולכסות עם coverslip. כמות הרקמה גזור ניתן למזער באמצעות חוט טונגסטן חד כדי להסיר את בלוטות רוק ומעל לציפורן לפני ההרכבה מורכבת וו דיסק / מוח / פה לשקופית. זה יחסית קל לזהות את דיסק עיניים מחושים instar הראשון כאשר הוא עדיין מחובר לקרסי המוח ופה (ראה איור 6 א ', ד' של קומאר ומשה, 2001) 37. הדיסקים דמותי האחרים יצטרכו להיות מופרדים מהציפורן והניחו בשקופית לצפייה.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לדונלד מוכן וקווין משה להוראת JPK הליך נתיחת דיסק דמותי המקורי. אנו מודים גם לבונים Weasner לדיסק באברי המין באיור 1 ואת דיסק עין באיור 2 א, ברנדון Weasner לאיור 3, מרכז Bloomington דרוזופילה המלאי לכתמי זבוב ובנק Hybridoma התפתחותית לימודים לנוגדנים. CMS כבר נתמך על ידי מלגה מהמכון הלאומי לבריאות (NIH) GCMS הדרכת גרנט (T32-GM007757), פרנק וו Putnam מלגת המחקר, ורוברט בריגס מלגת המחקר. JPK נתמך על ידי מענק מהעין הלאומית (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
