Abstract
Post-embriyonik meyve sineğinin gelişimi, Drosophila melanogaster önemli bir kısmı, hayali olarak adlandırılan diskler kese gibi yapıların bir dizi içinde yer alır. Bu diskler, yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açar. Burada bu diskleri kurtarmak ve antikorlar, transkripsiyon gazetecilere ve protein tuzakları ile analiz için onları hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu işlem en iyi hayali diskler gibi ince dokular için uygundur, ancak kolay gibi, larva ve yetişkin beyin yumurtalık kalın dokuları ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Yazılı bir protokol ve beraberindeki Video üçüncü larva, doku fiksasyonu ve antikorlar ile hayali diskler tedavisi diseksiyon ile okuyucu / izleyiciye rehberlik edecektir. Protokol da daha küçük olan, birinci ve ikinci instar larvalarından hayali diskleri incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün avantajı nispeten kısa olduğunu ve olması vardırdisseke doku yüksek kalite korunması için optimize tr. Diğer bir avantaj kullanıldığı sabitleme işlemi, Drosophila proteinleri tanıyan antikorların ezici sayı ile çalışır. Bizim tecrübelerimize göre, bu prosedürü ile iyi çalışmaz duyarlı antikorların çok küçük bir sayı vardır. Bu durumlarda, çare biz diseksiyon adımlar ve antikor inkübasyonlarının için belirlenen adres yönergeleri takip devam ederken alternatif bir sabitleme kokteyl kullanmak gibi görünüyor.
Introduction
Yüzyılı aşkın bir meyve sineği Drosophila melanogaster için, geliştirme, davranış ve fizyolojisini incelemek için önde gelen bir sistem olmuştur. Ikincisi alma yere kadar olan embriyonik ve post-embriyonik tek tabaka epitellerinden içinde hayali diskler 1-3 seslendi: sinek Kalkınma iki geniş aşamadan ayrılabilir. Hayali diskler çizimleri ilk böcek gelişimine 1 onun geniş monografi parçası olarak Ağustos Weismann tarafından 1864 yılında yayımlandı. Bu diskler 1-14 yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açan nihai olarak ilk pupa safhalarının yoğun doku çözülmesi hayatta ve larva aşamalarında desenli embriyojenez sırasında gelişme başlar. Larva gelişimi sırasında her bir disk kaderi, şekli ve büyüklüğü ile ilgili pek çok kritik kararlar alır. Birinci ve ikinci larva instars içinde, diskler, birincil kaderi benimseyerek establis görevliDoğru şekli alarak ve hücrelerin 15-16 arasında gerekli sayıda üretilmesi, bölme sınırları hing. Üçüncü larva ve erken pre-pupa aşamasında, hayali diskler bölünmeye devam ve hücreleri terminali kaderlerini 16 evlat gibi desenli.
Drosophila gelişimsel biyoloji erken tarih boyunca, hayali diskler normal gelişim bağlamında ve bir kazanç ya da kayıp fonksiyon-mutant canlı olduğu hangi sınırlı durumlarda neredeyse sadece çalışıldı. X-ışınlarının kullanımı ölümcül mutasyonlar izin mitotik rekombinasyon larva ve yetişkin dokularda hücre klonlarının analiz edilecek ikna etmek. Bu yöntem larva ve yetişkin dokularda hem de mutasyonlar kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-transgenik yöntemler giriş tarafından geliştirilmiştir. Vahşi tipli ve mutant Dokuların moleküller manzara tanımlamak için antikorlar, transkripsiyonel raportörler, ve protein tuzaklar sayısı da const 'tırantly büyüyen. Mutant hücre klonları kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-bu moleküler işaretlerini kullanarak giderek mümkün mutant hücreler gelişim sırasında, kendi vahşi tip kuzenleri sapan nasıl bir gerçek zamanlı anlayış kazanmak için yaptı. Doğru bu araçları ve reaktiflerin yararlanmak için bu inceledi fotoğraflandı ve analiz edilebilir hayali diskler yüksek kaliteli hazırlıklarını kritik öneme sahiptir. Bu yazının amacı göz antennal diski kompleksinin (Şekil 1A) 'nin izolasyonu ve hazırlanması için optimize edilmiş bir protokol sağlamaktır. Ayrıca, başarılı bir şekilde kanatlar, halteres, T1-T3 bacak ve cinsel organların (Şekil 1B-D) yol da dahil olmak üzere ek disklerin çok çeşitli izole etmek için kullanılabilir. Minör modifikasyonlarla bu prosedür, yaklaşık seksen yıldır Drosophila 'dan gelen hayali diskleri izole etmek için kullanılmıştır.
En genler mu sırasında ifade edildiği gibi, yukarıda tarif edilengelişme ve dokuların çok sayıda aşamaları ltiple, bu hayvan Üçüncü dönem larva aşamasından önce ölür null mutantlar tüm göz olması etkilerini incelemek imkansızdır. Dört yöntemler, önemli ölçüde daha uysal retina gibi daha gelişmiş dokuların çalışma yaptık. Birinci bir başka vahşi tip doku 17-19 olan mutant hücre klonları jenere arasında Flippase (FLP) / Flippase rekombinasyonu hedeflemek (STT) yöntemidir. Bu durumda, mutasyona uğramış doku, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi bir görsel işaretin olmaması ile tanımlanır ve GFP mevcut olduğu çevre vahşi tip doku (Şekil 2B) mukayese edilebilir. İkinci bir transgen hücrelerinin 20 bir popülasyonunda ifade edildiği "Flp üzerinden" yöntemidir. Bu durumda, hücre klonları, GFP raportör yoksun çevresindeki yabani tip doku (Şekil GFP varlığı ile tanımlanan ve karşılaştırılmıştır2E). Üçüncü FLP / FRT mutant klon ve bdp-dışarı ekspresyon sistemleri 21 unsurlarını birleştiren bir Baskılanabilir Hücre Marker (MARCM) tekniği ile Mozaik Analizi'dir. Bu yöntem ile, bir transgen, aynı anda tek bir genetik lokus için mutant bir hücre popülasyonu içinde ifade edilebilir. Flp üzerinden klonları gibi, klonlar MARCM GFP varlığı ile tanımlanan ve GFP işaretleyici (Şekil 2F) yoksun çevreleyen vahşi tip doku ile karşılaştırılır. Ve son olarak, genler ve RNAi yapıları, GAL4 spesifik promotör-yapılarının kontrol altında hayali dokularda ifade edilebilir. Mutant veya aşırı ifadesi ya da klonlar desenler doğrudan bitişik vahşi tip dokuya göre olabilir çünkü Bu dört yöntem hayali diskleri okuyan ilgiyi artırmıştır. Bu prosedürde açıklanan gibi bir yöntem geliştirilmiştir ve böylece Drosophila yetişkin dokuların sonrası embriyo gelişimini çalışan araştırmacılar,Özellikle göz-antennal diskten türetilenler, analiz için yüksek kaliteli doku elde etmek mümkün olacaktır. Bireysel araştırmacılar küçük değişiklikler yapmış olsa da, bu prosedüre (biz burada açıklamak olan) çekirdek büyük ölçüde değişmeden kalmıştır. Yüksek kaliteli dokusu elde biz bu yazılı bir protokol ve beraberindeki görüntü değerli bir öğretim kaynağı olarak hizmet umuyoruz hayali disklerin çalışmaya kritik olduğundan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Larva 1. Hazırlık
- Diseksiyon tamponu ile, bir 35 mm Petri kabı doldurun.
- Petri kabındaki larva yerleştirin ve onları bir kaç dakika (kendi kendini temizleme adım) için etrafında yüzmek için izin verir.
- Bir silikon bazlı diseksiyon plaka üzerinde diseksiyon tampon bir havuza larva transferi. Bu havuz, levhanın bir kenarına olmalıdır. Diseksiyon levha, cam bir Petri kabı içinde dökülmüş ve sertleştirilmiş olan bir silikon çözelti oluşur.
- Bir pastör pipeti kullanılarak-, diseksiyon plaka ortasında tahlil tamponuna büyük bir havuz yerleştirin.
- 5. forseps kullanarak, diseksiyon tampon büyük havuza küçük havuzda tek temizlenmiş larva transferi.
Larva 2. Kaba Diseksiyon
- Larva diseksiyonu tampon büyük havuzun içinde hala ise forseps ile larva toka. Forseps ve diğer çift Anim tutmak için kullanılır ise forseps bir çift ağız kanca kapmak için kullanılmalıdırdiğerleri hala (1/3 vücut uzunlukta hafifçe larva kapmak).
- Hızla forseps ikinci çifti ile uzak vücudun geri kalanını çekerken ağız kanca yakın manikür içeren forseps çifti sakinleştirmeye tutun.
- Larva parçalıyorlar başlar zaman gerginlik hafif bir serbest hissedeceksiniz. Forseps larva bırakın ve dışarı dökmek için larva "cesaret" için izin verir. Bu, normal konformasyonda kalması için hayali diskler sağlar ve deforme edilmesini engeller.
- Forseps bir çift ile yerde larva ön ucunu tutmak için tekrar ağız kanca kavramak. Forseps kullanılarak diğer çift de dahil olmak üzere, iç bağırsakta larvaların 2/3 alt çıkarın. Not: ağız kancaları, göz antennal diskleri, beyin hemisfer, ventral ganglion, tükürük bezleri, bazı bacak diskler içeren karmaşık ve örten manikür kalacaktır.
- Forseps bir çift ile hafifçe örten manikür, tükürük bezleri, bacak diskleri ve kaldırmakdiğer doku. Not: Yalnızca ağız kancalar, göz antennal diskler, beyin hemisfer ise kalmalıdır doku ve ventral ganglion (Şekil 3).
- Tekrar 15-20 dakika için ek larva ile 2,1-2,5 adımları. Not: uzun süre için diseksiyon tampon kalır hayali diskler aşağılamak eğilimindedir ve sonuçta çektirmek için ideal bir numunelere göre daha az gibi görünecektir. Böylece, tüm kesilmiş dokuları PLP sabitleyici aktarılması gerekmektedir 20 dakika sonrasında en (aşağıya bakınız).
Antikorlar ile 3. Fiksasyon ve Doku Boyama
- P-200 Pipetman kullanarak, soğuk Paraformaldehit-Lizin-Periyodat (HUA) fiksatif içeren bir saat cam disseke dokuların aktarın. 50 ul transfer diseksiyon tampon sınırı hacmi PLP'nin seyreltme en aza indirmek için. Ucu açılma disseke dokuları barındıracak kadar büyük olduğunu böylece bir jilet ile ucu kesmek için emin olun. Bir çift forseps kullanılması veyatungsten iğne disseke dokuların tamamen doğru tespit gerçekleşmesi için batık emin olun. 45 dakika boyunca soğuk HUA sabitleyici disseke dokuları inkübe edin. Bu inkübasyon ajitasyon olmadan oda ısısında gerçekleşebilir.
- P-200 Pipetman kullanarak, 45 dakika boyunca bir kesim sarı ucu kullanılarak yıkama tamponu (RT) kesilmiş dokuları aktarın. 50 ul transfer PLP sınırı hacim yıkama tamponu ile seyreltme en aza indirir. Not: Tüm disseke dokuların tamamen sular altında olmalıdır.
- 1.5 ml mikrofuge'de tüp disseke doku 20-30 setleri aktarın. Not: Göz antennal disk kompleksleri daha çok sayıda boru içinde karıştırılması durumunda, borunun altındaki doku antikorlara uygun maruz kalmayacak bir olasılığı vardır. Optimal sonuçlar için fazla 20-30 göz antennal disk kompleksleri tek bir tüp içinde mevcut olmalıdır. Disseke doku mikrofuge'ye tüpün dibine çökecektir. Bu yüzden, daha sonraki adımlar uçıkarın ve yıkama tamponu engelleme çözeltisi ve antikor yerine bir Pipetman se.
- Yıkama tamponunu çıkarın ve bloklama çözeltisi 100 ul ile değiştirin: yıkama tamponu içinde% 10 normal keçi serumu. 10 dakika boyunca masa üstü bir karıştırıcı üzerine hafif bir döndürme ile oda sıcaklığında inkübe edin.
- Bloke çözeltisini çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal keçi serumu içinde seyreltilmiş olan birincil antikor 100 ul ile değiştirin. 16 saat süre ile hafif bir dönme ile oda sıcaklığında inkübe edin.
- Primer antikor çıkarın ve yıkama tamponu 750 ul ile değiştirin. Bir nutator tüpleri ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında nutate sağlar. Not: primer antikor (4 ° C'de mağaza) kaydedilir ve daha sonra yeniden kullanılabilir. Antikorlardır birden çok kez yeniden kullanma spesifik olmayan bağlanma azaltılmasında yardımcı olabilir.
- Kafaları, daha sonra borunun dibe yıkama tamponunu çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal serum içinde seyreltilmiş olan ikincil antikor, 100 ul ilave izin verin. Yumuşak devir için RT'de inkübe 2̵1, 4 sa.
- Dokudan ikincil antikor çözüm çıkarın ve yıkama tamponu ile 500 ul ile değiştirin. Doku tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin verin.
- P-200 ve bir kesme sarı ucu kullanarak, kesme tabağına yerleştirilmiş olan yıkama tamponu ile bir havuza tüm parçalara dokuları aktarın. Ince diseksiyon sonraki adıma geçmeden ederken, doku yıkama tamponunda inkübe olacak. Bu aşırı ikincil antikorlar kaldırmak için yardımcı olur.
4. Göz-Antennal Disk Kompleksleri Güzel Diseksiyon ve Slaytlar üzerine Montaj
- Aşağı bakacak kompleksinin ventral yüzü ile ağız kanca tarafından manikür kavrayabilirdim için forseps bir çift kullanın. Forseps ikinci bir çift göz ve beyin diskler arasındaki boşlukta (Şekil 3, kırmızı ok) ikinci forseps kapanış ve hızla ağzına kanca uzak beyin çekerek iki beyin lobu çıkarın.
- Ağız kanca tutunmaya devam ederken, çimdikgöz antennal diskin antennal bölümü ile ağız kanca (Şekil 3, mavi ok) arasındaki bağlantının mümkün olduğu kadar yakın bir doku. Not: göz antennal disk kompleksleri tüm doku (Şekil 1A) ücretsiz olmalıdır. Slaytlar üzerine yerleştirilebilir istenen istenen tüm doku disseke olmuştur kadar devam edin. Bu protokol, kanat, haltere, bacak ve genital hayali diskleri (Şekil 1B-D) izole etmek için adapte edilebilir.
- Kağıt mendil iki küçük parça (lamelleri boyut) yaklaşık 3 ekleyin. Ayrı diseksiyon çanak. Kabı üzerine bir cam slayt yerleştirin - ince kağıdın iki adet sürgünün uçları altında olmalıdır. Bu kesme çanak silikon tabanına yapışmasını slayt önleyecektir.
- Kesilmemiş bir ucu olan bir P-20 kullanılarak cam mikroskop slayt ortasına da bir ağartma karşıtı maddenin 9 ul ekleyin. Floresan ile bakıldığında bu dokunun ağartma önlerışık.
- Aynı kesilmemiş ucu kullanarak, tüm göz-antennal diskleri toplamak ve anti-ağartma reaktif damla ekleyebilirsiniz. Işlemine tabi tutulan, yıkama tampon miktarını en aza indirir. 10 ul veya daha az yıkama tampon miktarını sınırlamaya çalışın.
- Ayırmak ve anti-ağartma reaktif damla içindeki göz antennal diskleri yaymak için bir çift forseps kullanın. Diskler birçok dakika için ağartma karşıtı ayraç inkübe izin verin. Not: doku ağartma karşıtı ayraç emdiğinde diskler berrak dönecek.
- Ince bir fırça kullanarak hafifçe numune üzerine bir lamel indirin. Bu hava kabarcıklarının oluşumunu engeller.
- Mağaza ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak göz antennal veya başka bir hayali diskleri görüntülemek için hazır olana kadar -20 ° C'de kayar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Güvenilir bir şekilde yukarıda tarif edildiği gibi bir yöntem, in situ probları, transkripsiyonel raportörler, protein tuzakları ve antikorlarda analiz için yüksek kaliteli malzeme üretmektedir. Şekil 1 de rutin olarak bu yöntemle iyileşti göz anteni, genital, kanat, haltere ve bacak diskleri görüntüler. Bu diskler, F-aktine bağlanan ve bu nedenle de her bir hücreyi ortaya koyan bir falloidin-konjüge edilmiş fluorophore ile tedavi edilmiştir. Doku daha sonra düzgün bir göz diskin morfogenetik oluğunun saptanmış ise, eş doku kenarları genital, antennal ve bacak kıvrımları diskler ve kanat ve haltere disklerin dorsal-ventral ekseni, tüm olarak sivri kenarlara görünür . Bir doku düzgün sonra sabit ise antikorlar, floresan proteinleri ve yerinde sondalar da keskin desenleri ortaya çıkaracaktır. Çeşitli örnekler Şekil 2 'de gösterilmiştir. Sırasında farklı antikorlar ile boyanmış ilk üç panel ekranı disklerdüşük üç panel GFP hücrelerinin popülasyonunu işaretlemek için kullanılan sistemin bulunduğu diskleri göstermektedir.
Göz-antennal diskin en çarpıcı özelliklerinden biri, dorsal-ventral eksen 1, 22 boyunca çalışan doku içinde bir girinti olarak görülebilir morfojenetik karık (Şekil 1A), olduğunu. Tüm hücreleri üçüncü larva önce içinde Gelişmekte olan göz, desensiz farklılaşmamış ve birbirlerinden morfolojik olarak ayırt edilemez. Üçüncü larva başlangıcında morfogenetik karık göz alanının arka kenarı ile başlar ve göz / antennal sınırına 22 doğru öne doğru ilerler. Karık göz alanında genelinde ilerledikçe düzensiz hücrelerin deniz periyodik aralıklı birim veya gözlerin ommatidia (Şekil 1A) 22-23 sıralı bir diziye dönüşür. Ahead Pax6 benzerinin Gözsüzleri (Ey) içeren bir gen düzenleyici ağ Karık kanallar hücreleriBir göz kaderin (Şekil 2A) 15 doğru. Karık kendisi başlatılması ve ilerleme yolları 24-29 sinyal Hedgehog (Hh) ve Decapentaplegic (DPP) faaliyetlerine bağlıdır. Gerçekten de, bir DPP-LacZ haberci sadık oluktan (Şekil 2B) içinde 30-31 DPP lokusunun ekspresyonunu göstermektedir. Hücreler oluğunun çıkış terminali ve kaderlerini kabul başlar gibi, böyle bir pan-nöronal RNA bağlayıcı protein (Şekil 2C) kodlayan 32-34 embriyo ölümcül bulanık görme (ELAV), hücre spesifik markörleri ifade eder.
Şekil 1. Drosophila melanogaster hayali diskler. (
Göz hayali diskin Şekil 2. klonal ve ekspresyon analizi (A - F). Göz hayali diskler Konfokal görüntüler. (A) Pax6 proteini Gözsüzleri (Ey) geniş öncesinde morfogenetik Karık dağıtılır. (B) dpp-lacZ transkripsiyonel önce bildirilmiştirr Hh sinyal yanıt verir ve morfojenetik karık içinde ifade edilir. (C) ELAV morfojenetik karık arkasında tüm gelişmekte fotoreseptör dağıtılan pan-nöronal RNA bağlayıcı protein. (D) FLP / FRT sistemi tarafından üretilen zarar fonksiyon-klonları ihtiva eden bir göz diski. Klonlar, GFP (E) olmaması ile tanımlanır. FLP ölçme sistemi oluşturulacak aşırı ifadesi klonları ihtiva eden bir göz diski. Klonlar olumlu GFP ile işaretlenmiştir. (F) MARCM klonlan ihtiva eden bir göz diski. FLP çıkış sistemi gibi, klonlar MARCM GFP varlığı ile tespit edilebilir. Algılanan tüm proteinler ve genotipleri şekil içinde listelenir. Anterior sağ ve dorsal kadardır.
Şekil 3. Göz-anten-beyin kompleksi. A schİlk gün kaba diseksiyonu ürünlerin Ematic çizimi. Sabit olmalıdır, sadece dokuları, göz anten diskler ve beyin (- gösterilmeyen ventral ganglion de bağlı kalacaktır çoğu kez) ağız kancalar vardır. Mor = beyin, yeşil = göz anten diskler, kahverengi = ağız kanca. Anterior sağ etmektir. Bacak, kanat, haltere ve genital diskleri diseksiyon olursa, larva dış manikür yine de bu dokulara yapışık olmalıdır. Çeşitli antikor, blok ve yıkama çözümleri ile devamındaki transferlerin sırasında hayali diskleri kaybedebileceği gibi örten manikür çıkarmayın. Aşırı doku ince diseksiyon adımlarla (4,1-4,2) sırasında kaldırılabilir.
Şekil 4. Drosophila larva içindeki hayali diskler pozisyonu. Bir şemaÜçüncü evre larva içinde göz anten, bacak, kanat, haltere ve genital disklerin göreli konumunun tik çizimi. Göz-antennal disk yeşil renkli, bacak diskler mavi, yular disk mor olduğunda, kanat disk kahverengi / turuncu ve genital disk açık kahverengi olduğunu. Anterior sağ etmektir.
| Çözüm Adı |
| % 8 Paraformaldehit |
| 0,2 M Sodyum Fosfat Monobazik |
| 0.2 M sodyum fosfat Disbasic |
| 1 N sodyum hidroksit |
| % 10 Triton |
| 0.1 M sodyum fosfat tamponu (Tampon Diseksiyon) |
| 0.1 M sodyum fosfat tamponu +% 0.1 Triton (yıkama tamponu) |
| Lizin Tampon |
| % 2 para-formaldehid-Lizin-Periyodat Sabitleme (PLP) |
| % 10 normal keçi serumu |
Tablo 1: Gerekli Solutions listesi.
| % 8 Paraformaldehit stok çözeltisi, |
| 50 ml'lik bir Erlenmeyer şişeye ekleyin: |
| 2.0 g kadar paraformaldehid |
| Damıtılmış su, 23.0 mL |
| 1 N sodyum hidroksit damla 4.0 (cam bir pastör pipetiyle itibaren) |
| Çözeltiye, hafif bir kaynama noktasına ulaşıncaya kadar bir karıştırma plakası üzerinde karıştırılır ve ısı |
| Formaldehit tamamen çözülene kadar hafifçe kaynamaya bırakın |
| (Öncesinde her diseksiyon için taze yapmak), soğuk kadar buz koyun |
| 0.1 M fosfat tamponu (Diseksiyon (P) Tampon) |
| 50 ml konik tüp aşağıdakileri ekleyin: |
| 18.0 mi, 0.2 M sodyum fosfat dibazik |
| 7.0 mi, 0.2 M sodyum fosfat monobazik |
| 25.0 ml damıtık su |
| Mağaza, 4 ° C (1 haftalık raf ömrü) seviyesinde |
| 0.1 M Fosfat + Deterjan Tampon (Yıkama (W) Tampon) |
| Bir 50ml konik tüp aşağıdakileri ekleyin: |
| 18.0 mi, 0.2 M sodyum fosfat dibazik |
| 7.0 mi, 0.2 M sodyum fosfat monobazik |
| 25.0 ml damıtık su |
| 0.5 mL% 10 Triton |
| Oda sıcaklığında saklayın (1 hafta raf ömrü) |
| Lizin (L) Tampon |
| 50 ml konik tüp aşağıdakileri ekleyin: |
| 0.4 gr Lizin |
| 1.2 mi, 0.2 M sodyum fosfat dibazik |
| 8.0 mi Diseksiyon (P) Tampon |
| 10.0 ml damıtık su |
| Lisin tamamen eriyene kadar solüsyonu çalkalamak |
| (Öncesinde her diseksiyon için taze yapmak), soğuk kadar buz koyun |
| 2% Paraformaldehit - Lizin - Periyodat (HUA) fixative |
| 0.1 gr sodyum periodat |
| Lizin (L), tampon 15.0 mi |
| % 8 Paraformaldehit 5.0 mi |
| Sodyum periodat tamamen çözülene kadar iyice solüsyonu çalkalamak |
| (Öncesinde her diseksiyon için taze yapmak), soğuk kadar buz koyun |
Tablo 2: Gerekli Çözümleri için Tarifler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedür, büyük ölçüde izole edilmesi ve göz antennal diskler daha ilerideki muamelesi odaklanmış olmakla beraber, bu izole etmek ve kanat, haltere, bacak ve genital diskleri (Şekil 4) analiz etmek için kullanılan elverişlidir. (Göz antennal diske karşı), bu diskleri izole edilmesi için protokol tek gerekli modifikasyon kaba Diseksiyon (protokol, Bölüm 2) 'nin bir yöntemdir. İlk göğüs ayağı (T1), bir çift larva anterior bulunur ve göz antennal disk izolasyonu için protokol takip edilerek elde edilebilir. Ancak ikinci torakal bacak (T2) diskleri manikür bağlıdır. Forseps diğer bir çift hayvanın ventral kütikül toka için kullanılmalıdır (yukarıda tarif edildiği gibi) forseps bir çift ağız kanca tutmak için kullanılması gereken bu diskleri izole etmek için, (ikinci larva yaklaşık 1/3 toka emin olun Ağız kanca. larvası basitçe Lar geri kalanından ventral kütikül yırtılarak fileto edilebilirva. T2 bacaklar manikür bağlı kalacaktır. Üçüncü torasik (T3), aynı zamanda bacak kütikül bağlı kendisi bir kompleksin parçası olarak kanat ve haltere disklere takılır. Bu prosedürün ince diseksiyon kısmı sırasında diskleri bu aşamada üst deri üzerinden disk kompleksi ve T2 bacaklar ayrı ya da takip eden sabitleme / antikor İnkübasyon sırasında birlikte kütikül diskli kompleksi tutmak ve izole edilmesi için tercih edilebilir (bölüm 4) . Genital diskleri kurtarmak için, o forseps bir çift ile Midsection de larvaları tutup uzağa Midsection başlayan ve larva posterior sonunda biten forseps diğer çifti ile ventral manikür soymak için en iyisidir. Bu forseps uzaklıkta yabancı doku temizlemek ve daha sonra P-200 Pipetman olan ve ucu, bir tıraş bıçağı ile kesilmiş san bir ucunu kullanarak sabitleme çözeltisinin sadece genital diski aktarmak için kullanılması önerilir.
Bu prosedür Tiss için uygundurgibi hayali diskler gibi sınırlı kalınlıkta eder ve en iyi çalışır kullanılan antikorlar yüksek titresi ve özgüllük ise. Bununla birlikte, bu yetişkin yumurtalık, testis, ve beyin gibi yanı sıra düşük titreli antikorların veya arzu edilen "arka plan" boyama daha yüksek verenlerden daha kalın dokuların ile çalışmak için adapte edilebilir. Kalın doku ile çalışırken, en iyi sonuçlar, sadece paraformaldehidin konsantrasyonunu artırmak için ve / veya daha uzun süre için PLP sabitleyici, inkübasyon yolu ile elde edilebilir olduğu düşünülmektedir. Kesilmiş dokuların uygun sabitleme bu protokol ile başarısı için çok önemlidir, çünkü bu da paraformaldehit konsantrasyonunu artırmak için ve / ya da tespit artan uzunlukta etkinliği falloidinle (Şekil 1) ile değerlendirildi önerilmektedir. Özellikle, yakın ilgi doku içinde hücre hatlarıyla ve diğer fiziksel yerlerinden "netlik" ödenmesi gerektiğini (yani, morphogenetic karık). Başka bir yol düzgün bir şekilde monte edilir sizin doku (özellikle kalın numuneleri)% 8 paraformaldehit önce ve her diseksiyon taze HUA çözümler hazırlamak olduğunu sağlamak. Doku kısa bir süre için disseke edilir ve doku kısa sürede fiksatif içine aktarılır Ve nihayet, eğer diseksiyon genel kalitesi artırılabilir. 15-20 dakika daha uzun süre diseksiyon önerilmektedir. Kısa süreler için diseksiyon doku koruma kalitesini artırır.
Bu protokol antikorların geniş bir yelpazede ile iyi çalışır, ancak bazı antikorlar PLP fiksatif ile iyi çalışmıyor doğrudur. Bir ünlü örnek Kaba (Ro) transkripsiyon faktörü tanır antikordur. Kaba içinde ifade edilir ve fotoreseptörleri 35 geliştirilmesi için bir alt kümesinin tarifnamede için gereklidir. Anti-Ro antikoru değil PLP'ye ile en iyi çalışır, ama yerine bir BORU ile - EGTA - MgSO 4 (PEM) buffer 36. Benzer şekilde, diğer antikorlar yine de diğer fiksatif içinde kuluçkaya yatırılmış dokuların en iyi çalışabilir. Bu aksi belirtilmedikçe, PLP fiksatif ilk yargılanması gerektiğini önerilmektedir. Başlaması gereken başka bir fiksatif bulma işlemi, daha sonra, başarısız olursa.
Karşı için genel bir sorunu, söz konusu antikorun çalışma konsantrasyonudur. Çoğu kez ilgi dokusunda proteinleri tespit etmek için belirli bir antikor kullanmak için ilk araştırmacı olabilir. Çalışma konsantrasyonu, diğer dokulara rapor ne deforme olabilir. Bu önerilen konsantrasyon ilk çalıştı önerilmektedir. Bir sinyal görülemez eğer antikorun konsantrasyonunu arttırmak. Tavsiye edilen yoğunlukta verirse Diğer yandan, daha sonra antikor seyreltilmesi yüksek bir arka plan boyama denenmelidir. Çalışma antikorlar arasında konsantrasyonları değişebilir. Bunun karşıtı ise 5: Örneğin, anti-Gözler Yok (Eya) antikoru 1 ile seyreltilmiştir: 500 oranında seyreltilmiş antikor ELAV 1 bile iyi çalışır. 3000: Bazı antikorlar bile kadarıyla aşağı 1 olarak seyreltilmiş olabilir. Ayrıca, bu prosedür, yazılı olarak, yüksek özgüllük antikorlar ile iyi çalışır. Birçok yaşamış Bununla birlikte, bazı antikorlar, dokuya spesifik olmayan bir şekilde bağlanan ve bu alt-optimal görüntü oluşturabilir. Bu durum, çoğu zaman, sabit hayali diskler ilave edilmeden önce, sabit embriyolar ya da larva karkas ile seyreltildi antikorun inkübe edilmesi ile düzeltilebilir. Spesifik olmayan arka plan boyaması seviyesine bağlı olarak, "ön emme" sahip olması gereken uzunluk olarak değişebilir ve bir deneme olarak çaba harcanması gerekir. Birkaç kez yeniden antikorlar kullanılarak ya da ön emilim birkaç tur yaparak sinyal / gürültü oranını arttırmak için de mümkündür.
Diskler yayınları ve / veya sunumlarda kullanılması gereken karar, o kadar odaklı apikal yüzü dönük olan diskleri seçmek en iyisidir koğuşları. Ayrıca katlanmış değil diskleri kullanmak en iyisidir. Bu göz antennal diskin geçerlidir. Diskin ventral yüzü kat eğilimi ve ne yazık ki, küçük bir Bunu önlemek için yapabilecekleri var. Bir çözüm, bu çok daha az kat eğilimi gibi genç diskleri incelemek için. Başka bir seçenek tamamen düz bir alana kadar sadece diskler çok sayıda teşrih etmektir. Göz antennal diskin genel şekli larva paramparça edildiği oranı ile etkilenebilir. Bir çok çabuk dışında beyin-disk kompleksi geçtiği delik larva çekerse küçük ve göz antennal disk dışarı katlanmış ve / veya gergin geliyor. Bu larva delik büyük olacaktır beri gözyaşı başlayana kadar yavaşça çekin en iyisidir. Sonra yavaş yavaş beyin-göz-antennal disk kompleksi çekmeye devam edebilirsiniz. Çok yavaş çekin asla unutmayın. Ayrıca doku gözyaşı hangi oranı diğer dokuların izolasyonu bir faktör olmadığını, unutmayın.
ve_content "> Drosophila yaşam döngüsü üç larva aşamadan oluşmaktadır. önemli gelişimsel olaylar böylece (bu prosedürün ana odak olan) sadece üçüncü larva instars dokuları izole etmek önemli olabilir, bu evrelerin her birinde sırasında gerçekleşecek aynı zamanda her ikisi de birinci ve ikinci Larva, bir küçük hariç olmak üzere, bu prosedür, ikinci instar diskler izole etmek için, yazılı olarak kullanılabilir. de instars. prosedürün ince diseksiyon kısmı (bölüm 4) sırasında sivri uçlu tungsten önerilir tel kanca ağız, beyin ve tükürük bezi gibi yabancı doku göz antennal diski ayırmak için kullanılır. tungsten tel birbirleriyle ve üstteki kütikül ikinci T2-T3 / bacak kanat ve haltere diskleri ayırmak için kullanılabilir . O tungsten telinin (dokuları ayırmak için kullanılacak olan uç) bir ucu, bir kaynama sodyum nitrat banyosunda ısıtılarak bilenmiş yapılması önerilir, diğer ucu bir pim mengene içine sokulabilir;. incidaha kolay bir tungsten tel tutmak sağlayacaktır olduğunu. Ne yazık ki, bu slaytta tüm göz-antennal disk / beyin / ağız kanca kompleksi yerleştirin ve bir lamel ile kaplayın ki, bu nedenle tavsiye edilir bozulmamış ilk evre diskleri izole etmek çok daha zordur. Disseke doku miktarı önceki slayt üzerine disk / beyin / ağız kanca kompleksi montaj kütiküllere tükürük bezlerini çıkarmak için keskin bir tungsten tel kullanılarak ve üstte minimize edilebilir. O hala beyin ve ağız kanca takılı olduğunda 37 (Şekil 6A, Kumar ve Musa, 2001 D) birinci evre göz antennal diski tespit etmek nispeten kolaydır. Diğer hayali diskler manikür ayrılır ve görüntüleme için bir lam üzerine yerleştirilir gerekecektir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz JPK orijinal hayali disk diseksiyonu işlemini öğretirken Donald hazır ve Kevin Musa'yı teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Şekil 1B genital disk ve Şekil 3 Şekil 2A Brandon Weasner, göz diski Bonnie Weasner ederiz, sinek lekelere Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve antikor Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası. CMS Sağlık (NIH) GCMS Eğitim Grant National Institutes (T32-GM007757), Frank W. Putnam Araştırma Bursu ve Robert Briggs Araştırma Bursu bir nakit tarafından desteklenmiştir. JPK Ulusal Göz Enstitüsü bir hibe ile desteklenen (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
