Abstract
En betydande del av post-embryonal utveckling i bananflugan, Drosophila melanogaster, sker inom en uppsättning av säck-något liknande strukturer som kallas imaginal skivor. Dessa skivor ger upphov till en hög procentuell andel av vuxna strukturer som finns inom den vuxna flugan. Här beskriver vi ett protokoll som har optimerats för att återvinna dessa skivor och förbereda dem för analys med antikroppar, transkriptions reportrar och protein fällor. Detta förfarande är bäst lämpad för tunna vävnader såsom imaginal skivor, men kan lätt modifieras för användning med tjockare vävnader såsom larv hjärnan och vuxen äggstock. Den skriftliga protokoll och tillhörande video guidar läsaren / tittaren genom dissektion av tredje stadiet larver, fixering av vävnad, och behandling av imaginal skivor med antikroppar. Protokollet kan användas för att dissekera imaginal skivor från yngre första och andra instar larver samt. Fördelen med detta protokoll är att det är relativt kort och det har att varasv optimerad för höga bevara den dissekerade vävnaden kvaliteten. En annan fördel är att fixeringen förfarande som används fungerar bra med det överväldigande antalet antikroppar som känner igen Drosophila proteiner. Enligt vår erfarenhet finns det ett mycket litet antal känsliga antikroppar som inte fungerar bra med den här proceduren. I dessa situationer tycks botemedlet vara att använda en alternativ fixerings cocktail samtidigt fortsätta att följa de riktlinjer som vi har satt fram för dissektion steg och inkubationer antikroppar.
Introduction
I mer än ett århundrade bananflugan, Drosophila melanogaster, har varit ett ledande system för att studera utvecklingen, beteende och fysiologi. Utvecklingen i gylfen kan delas in i två faser: embryonala och post embryonala med mycket av den senare äger rum inom monolager epitel kallas imaginal skivor 1-3. Teckningar av imaginal skivor publicerades först i 1864 av August Weismann som en del av hans breda monografi om insekts utveckling 1. Dessa skivor börjar sin utveckling under fosterutvecklingen, är mönstrade under larvstadierna, överleva den massiva histolysis av de tidiga PUPP stadierna, och i slutändan leda till en hög andel av vuxna strukturer som finns inom vuxen flyga 1-14. Under larvutveckling varje skiva gör flera kritiska beslut om ödet, form och storlek. Inom de första och andra larv instars, är skivorna uppgift att anta en primär öde, establisHing områdesgränser, anta rätt form och generera det erforderliga antalet celler 15-16. Under tredje larv stadiet och tidig pre-puppstadium, de imaginal skivor fortsätter att dela sig och är mönstrade som celler antar deras kopplings öden 16.
Under tidiga historia Drosophila utvecklingsbiologi, har imaginal skivor studerade nästan uteslutande i samband med normal utveckling och i de begränsade fall där en förlust eller vinst-of-function mutant var lönsamt. Användningen av röntgenstrålar för att inducera mitotisk rekombination tillåts för dödliga mutationer som ska analyseras i cellkloner inom larver och vuxna vävnader. Detta förfarande har förbättrats genom införande av transgena metoder för att analysera förlusten och få-av-funktionsmutationer i båda larv och vuxna vävnader. Antalet antikroppar, transkriptions reportrar och protein fällor för att beskriva den molekylära landskap av vildtyp och mutant vävnader är också constoch art växer. Med hjälp av dessa molekylära markörer för att analysera förlusten och få-av-funktionen mutant cellkloner har gjort det allt möjligt för att få en realtids förståelse för hur muterade celler avviker från sina vilda kusiner typ under utveckling. För att korrekt dra nytta av dessa verktyg och reagens är det viktigt att ha höga beredningar av imaginal skivor som kan visas, fotograferade och analyserade kvalitet. Målet med detta manuskript är att ge ett optimerat protokoll för isolering och beredning av ögon antennal skivkomplex (Figur 1A). Den kan också med framgång användas för att isolera ett brett utbud av ytterligare skivor inklusive sådana som ger upphov till de vingar, halteres, T1-T3 ben och könsorganen (Figur 1B-E). Detta förfarande, med smärre modifikationer, använts för att isolera imaginal skivor från Drosophila för nästan åttio år.
Som beskrivits ovan, eftersom de flesta gener uttrycks under multiple stadier av utveckling och i en mångfald av vävnader, är det ofta omöjligt att studera effekterna att null mutanter har på hela ögat som djuret dör väl innan den tredje instar larvstadiet. Fyra metoder har gjort studier av mer utvecklade vävnader såsom näthinnan betydligt mer lätthanterlig. Den första är den Flippase (FLP) / Flippase Rekombination Target (FRT) metod för att generera muterade cellkloner i en annars vildtyp vävnad 17-19. I detta fall är den mutanta vävnad identifieras genom frånvaron av en visuell markör såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och kan jämföras med den omgivande vildtyp vävnad i vilken GFP är närvarande (figur 2D). Den andra är metoden "FLP-ut", i vilken en transgenen uttrycks i en population av celler 20. I detta fall är de cellkloner identifierades genom närvaron av GFP och jämfört med den omgivande vildtyp vävnad som saknar GFP reporter (Figur2E). Den tredje är den Mosaik analys med en undertryck Cell Marker (MARCM) teknik, som kombinerar element av FLP / FRT mutant klon och FLP-out expressionssystem 21. Med den här metoden en transgen kan uttryckas inom en population av celler som samtidigt mutant för en enskild genetiskt lokus. Liksom FLP-ut kloner, är marcm kloner identifierades genom närvaron av GFP och jämfört med den omgivande vildtyp vävnad som saknar den GFP-markör (Figur 2F). Och slutligen, kan de gener och RNAi konstruktioner uttryckas inom imaginal vävnad under kontroll av specifika promotor-GAL4 konstruktioner. Dessa fyra metoder har ökat intresset för att studera imaginal skivor sedan muterade eller överuttryck kloner eller mönster kan direkt jämföras med intilliggande vild vävnadstyp. Metoden som beskrivs i detta förfarande har utvecklats för att forskare som studerar den post-embryonal utveckling av vuxna vävnader i Drosophila,särskilt sådana som framställts från ögat-antennal skiva, kommer att kunna erhålla hög kvalitet vävnad för analys. Även om enskilda forskare har gjort smärre ändringar har kärnan i detta förfarande (som vi beskriver här) i stort sett oförändrad. Eftersom få högkvalitativ vävnad är avgörande för studiet av imaginal skivor vi hoppas denna skriftliga protokoll och tillhörande video kommer att fungera som en värdefull undervisningsresurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Larver
- Fyll en 35 mm petriskål med dissektion buffert.
- Placera larver i petriskål och tillåta dem att simma runt i några minuter (självrengörande steg).
- Överför larver till en pool av dissektion buffert på ett silikonbaserat dissektion plattan. Denna pool bör vara vid en kant av plattan. Den dissekering plattan består av en silikonlösning som har hällts och härdas i en glaspetriskål.
- Med hjälp av en pasteur-pipett, placera en större pool av dissektion buffert i mitten av dissektion plattan.
- Använda # 5 pincett, överföra en enda rengjord larv från den lilla poolen till större pool av dissektion buffert.
2 Grov Dissekering av larver
- Medan larven är fortfarande inom den stora poolen av dissektion buffert lås larven med pincett. En pincett bör användas för att ta tag i munnen krokar medan den andra pincett används för att hålla animal fortfarande (greppa larven försiktigt vid 1/3 kroppslängd).
- Håll stadig pincett innehåller nagelband nära munnen krokar samtidigt snabbt drar resten av kroppen bort med den andra pincett.
- När larven börjar slita sönder kommer du att känna en lätt release i spänning. Släpp larven från tången och möjliggöra "guts" av larven att spilla ut. Detta gör det möjligt för imaginal skivor för att stanna kvar i sin normala konformation och hindrar dem från att deformeras.
- Med en pincett tag i munnen krokar igen för att hålla den främre änden av larven på plats. Med hjälp av andra pincett bort den nedre 2/3 av larverna, inklusive de inre inälvor. Obs: ett komplex innehållande munnen krokar, ögon-antennal skivor, hjärnhalvorna, ventrala ganglion, spottkörtlar, några ben skivor, och den överliggande nagelband kommer att förbli.
- Med en pincett försiktigt bort överliggande nagelband, spottkörtlar, ben-skivor ochannan vävnad. Observera: Endast vävnad som bör förbli är munnen krokar, ögon antennal skivor, hjärnhalvorna, och ventrala ganglion (Figur 3).
- Upprepa steg 2.1-2.5 med ytterligare larver i 15-20 min. Obs: imaginal skivor som finns kvar i dissektion buffert för längre tid tenderar att brytas ned och i slutändan kommer att visas som mindre idealiska prover som ska fotograferas. Således, efter högst 20 min alla dissekerade vävnader bör överföras till PLP fixativ (se nedan).
3 Fixering och färgning av vävnad med antikroppar
- Med hjälp av en P-200 pipetman, överföra dissekerade vävnaderna till ett urglas innehåller kall Paraformaldehyden-lysin-Periodate (PLP) fixativ. Limit volym överförd dissektion buffert till 50 pl att minimera utspädning av PLP. Var noga med att skära spetsen med ett rakblad så att spetsen öppningen är tillräckligt stor för att rymma de dissekerade vävnaderna. Med hjälp av en pincett elleren volfram nål se till att de dissekerade vävnaderna helt under vatten för att korrekt fixering att inträffa. Inkubera dissekerade vävnader i kallt PLP fixativ i 45 min. Denna inkubation kan ske vid rumstemperatur utan att röra.
- Med hjälp av en P-200 pipetman, överföra dissekerade vävnaderna att tvätta buffert (RT) med en annan klippa gul spets i 45 min. Begränsar volym överföras PLP till 50 | il för att minimera utspädning av tvättbuffert. Obs: alla dissekerade vävnader ska vara helt under vattenytan.
- Överför 20-30 uppsättningar av dissekeras vävnaden till 1,5 ml mikrofugrör. Observera: om större antal uppseende antennal skiv komplexen kombineras inuti röret, finns det en möjlighet att den vävnad på botten av röret inte kommer att exponeras korrekt till antikropparna. För bästa resultat högst 20-30 ögon antennal skivkomplex bör finnas inom ett enda rör. Den dissekerade vävnaden kommer sedimentera till botten av mikrofugrör. Därför i efterföljande steg usyns en pipetman att ta bort och ersätta tvättbuffert, blockerande lösningen och antikroppar.
- Avlägsna tvättbuffert och ersätt med 100 pl blockeringslösning: 10% normalt getserum i tvättbuffert. Inkubera vid RT under försiktig rotation på en bordsskiva rotatorn för 10 min.
- Ta bort blockerande lösningen och ersätta med 100 pl primära antikroppar som har fått lämplig utspädd i 10% normalt getserum. Inkubera vid RT under försiktig rotation för 16 tim.
- Ta primära antikroppar och ersätta med 750 ul tvättbuffert. Placera rören på en nutator och tillåta att vicka vid RT under 10 min. Anmärkning: Den primära antikroppen kan sparas (förvaras vid 4 ° C) och återanvändas senare. Återanvändning av antikroppar flera gånger kan hjälpa till att minska icke-specifik bindning.
- Låt huvuden för att sjunka till botten av röret, sedan bort tvättbuffert och tillsätt 100 l av sekundära antikroppar som har fått lämplig utspädd i 10% normalt serum. Inkubera vid rumstemperatur med försiktig rotation för 2̵1; 4 tim.
- Ta bort sekundära antikroppslösningar från vävnad och ersätta med 500 l av tvättbuffert. Låt vävnad för att sjunka till botten av röret.
- Med hjälp av en P-200 och ett snitt gul spets, överföra alla dissekerade vävnader till en pool av tvättbuffert som har placerats på dissekera skålen. Medan vidare med nästa steg av fina dissektion, kommer vävnaden inkubera i tvättbufferten. Detta bidrar till att avlägsna överskott sekundära antikroppar.
4 Fin Dissekering av Eye-Antenn Disc Anläggningar och Montering på diabilder
- Använd en pincett för att knäppa nagelbanden genom munnen krokar med den ventrala sidan av komplexet nedåt. Med en andra pincett bort de två hjärnlober genom att stänga den andra tången i utrymmet mellan hjärnan och ögat skivor (Figur 3, röd pil) och snabbt dra hjärnan ifrån munnen krokar.
- Samtidigt som man fortsätter att hålla fast munnen krokar, nypa bortvävnaden så nära som möjligt till anslutningen mellan antennal sektionen av ögon antennal skiva och munnen krokar (Figur 3, blå pil). Notera: ögat-antennal skivkomplex bör vara fria från all vävnad (Figur 1A). Fortsätt tills alla önskade vävnaden önskas som kan placeras på objektglas har dissekeras. Detta protokoll kan anpassas för att isolera vinge, haltere, ben och geni imaginal skivor (Figur 1B-E).
- Lägg till två små bitar av mjukpapper (storlek av täck) ca 3 i. Isär på dissekera skålen. Placera en glasskiva på skålen - bör de två bitar av mjukpapper vara under ändarna på bilden. Detta förhindrar att glid fastnar i silikonbasen dissekera skålen.
- Med användning av en P-20 med en oklippt spets, till 9 | il av en anti-blekmedlet till mitten av mikroskopobjektglas. Detta förhindrar blekning av vävnaden när den ses med fluorescerandeljus.
- Med samma uncut spetsen, samla alla ögon antennal skivor och lägg dem i droppe anti-blekningsreagens. Minimera mängden tvättbuffert som är överförda. Försök att begränsa mängden tvättbuffert till 10 | il eller mindre.
- Använd en pincett för att separera och sprida ut ögon-antennal skivor inom droppe anti-blekningsreagens. Låt skivorna inkubera i anti-blekningsreagens i flera minuter. Obs: skivor blir tydlig som vävnaden absorberar anti-blekningsreagens.
- Med hjälp av en fin pensel försiktigt sänka en täck mot provexemplaret. Detta förhindrar bildandet av luftbubblor.
- Store glider vid -20 ° C tills den ska visa ögon antennal eller andra imaginal skivor med ljus eller fluorescerande mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metod som beskrivs ovan tillförlitligt producerar högkvalitativt material för analys med in situ-prober, transkription reportrar, protein fällor och antikroppar. I figur 1 visar vi eye-antenn, genitala, vinge, haltere och ben skivor som rutin återvinns med denna metod. Dessa skivor har behandlats med en phalloidin-konjugerad fluorofor, som binder till F-aktin och därför beskriver varje cell. Om vävnaden har fastställts på rätt sätt då den morfogenetiska fåra i ögat skiva kanterna av koncentriska vävnad veck i de genitala, antennal och ben-skivor, och den dorsala-ventrala axeln för ving och haltere skivor kommer alla visas som skarpa kanter . Om en vävnad är ordentligt fast då antikroppar, fluorescerande proteiner och in situ sonder kommer också att avslöja skarpa mönster. Flera exempel visas i figur 2. De tre paneler visnings skivor som har färgats med olika antikroppar medan denundre tre paneler visar skivor där GFP används för att markera populationer av celler.
En av de mest påtagliga dragen i ögat-antennal skiva är morfogenetiska fåran (figur 1 A), vilket kan ses som en fördjupning inom mjukpapper kör längs ryggens-ventral axel 1, 22. Före den tredje larv stadiet alla celler i utvecklings ögat är omönstrad, odifferentierade och morfologiskt skilja från varandra. I början av den tredje larv stadiet initierar morphogenetic fåra vid den bakre kanten av ögonområdet och fortsätter anteriorly mot ögat / antennal gränsen 22. Som fåran fortskrider över ögat fältet havet av oordnade celler omvandlas till en ordnad uppsättning av regelbundet åtskilda enhets ögon eller ommatidia (Figur 1A) 22-23. Inför fåran en gen reglerande nätverk som innehåller Pax6 homolog Eyeless (Ey) kanaler cellermot ett öga öde (Figur 2A) 15. Den inledande och progression av fåran i sig är beroende av verksamheten i Hedgehog (Hh) och Decapentaplegic (DPP) signalvägar 24-29. Faktiskt en DPP-lacZ reporter återspeglar troget uttryck för DPP locus i fåran (figur 2B) 30-31. När celler ur fåran och börja anta deras kopplings öden, de uttrycker cellspecifika markörer såsom embryonala dödliga synstörning (elav), som kodar för ett pan-neuronal RNA-bindande protein (figur 2C) 32-34.
Figur 1 De imaginal skivor av Drosophila melanogaster. (
Figur 2 Klon och expressionsanalys i ögat imaginal skivan (A - F). Confocal bilder av ögat imaginal skivor. (A) Den Pax6 protein Eyeless (Ey) fördelas i stort sett före morfogenetisk fåra. (B) En DPP-lacZ transkriptions reporter svarar på Hh-signalering och uttrycks i morfogenetiska fåra. (C) Den pan-neuronal RNA-bindande protein elav distribueras i alla utvecklingsfotoreceptorer bakom morfogenetiska fåra. (D) Ett öga skiva med förlust av funktions kloner genererade av FLP / FRT-systemet. De kloner identifieras genom avsaknaden av GFP (E). Ett öga skiva med överuttryck kloner som genereras med FLP-out-system. Kloner är positivt märkta med GFP. (F) Ett öga skiva som innehåller marcm kloner. Liksom FLP-out-system, kan de marcm kloner identifieras genom närvaron av GFP. Alla upptäckta proteiner och genotyper listas i figuren. Främre är till höger och rygg är uppe.
Figur 3 Eye-antenn-hjärna komplex. A schEmatic ritning av den första dagen grova dissektion produkter. De enda vävnader som bör fastställas är munnen krokar, ögonantenn skivor och hjärna (ofta gånger den ventrala ganglion kommer sitta kvar även - visas inte). Lila = hjärna, grön = eye-antenn skivor, brun = munnen krokar. Främre är till höger. Om dissekera ben, vinge, haltere och genitala skivor ska den yttre nagelband av larven fortfarande är kvar dessa vävnader. Ta inte bort den överliggande nagelband som man kan förlora imaginal skivor under efterföljande överföringar genom olika antikroppar, blockera och tvättlösningar. Överskottet vävnad kan tas bort under de fina dissektion steg (4,1-4,2).
Figur 4 placering imaginal skivor inom Drosophila larv. Ett schematic ritning av den relativa positionen för ögon antenn, ben, vingar, haltere och genitala skivor inom ett tredje stadiet larv. Ögat-antennal skivan är färgad i grönt, benet skivor är i blått, är grimman skivan i lila, är vingen skivan i brun / orange och underlivet skivan är i ljusbrunt. Främre är till höger.
| Namn på lösning |
| 8% paraformaldehyd |
| 0,2 M natriumfosfat monobasiskt |
| 0,2 M natriumfosfat Disbasic |
| 1 N natriumhydroxid |
| 10% Triton |
| 0,1 M natriumfosfatbuffert (Dissection buffert) |
| 0,1 M natriumfosfatbuffert + 0,1% Triton (tvättbuffert) |
| Lysin Buffert |
| 2% paraformaldehyd-lysin-Periodate Fixative (PLP) |
| 10% normalt getserum |
Tabell 1: Förteckning över Nödvändiga lösningar.
| 8% Paraformaldehyd stamlösning |
| Till en 50 ml Erlenmeyer-kolv tillfoga följande: |
| 2,0 g paraformaldehyd |
| 23,0 ml destillerat vatten |
| 4,0 droppar 1 N natriumhydroxid (från ett glas pasteurpipett) |
| Blanda och värm på en omrörningsplatta tills lösningen når en mild koka |
| Låt försiktigt koka tills paraformaldehyd är helt upplöst |
| Placera på is tills kallt (göra färsk före varje dissektion) |
| 0,1 M fosfatbuffert (Dissection (P)-buffert) |
| Till en 50 ml koniskt rör lägga till följande: |
| 18,0 ml 0,2 M natriumfosfat dibasiskt |
| 7,0 ml 0,2 M natriumfosfat monobasiskt |
| 25,0 ml destillerat vatten |
| Förvara vid 4 ° C (en vecka hållbarhetstid) |
| 0,1 M Fosfat + detergentbuffert (Wash (W)-buffert) |
| Till en 50ml koniskt rör lägg till följande: |
| 18,0 ml 0,2 M natriumfosfat dibasiskt |
| 7,0 ml 0,2 M natriumfosfat monobasiskt |
| 25,0 ml destillerat vatten |
| 0,5 ml 10% Triton |
| Förvara vid RT (1 vecka hållbarhetstid) |
| Lysin (L) Buffert |
| Till en 50 ml koniskt rör lägga till följande: |
| 0,4 g Lysin |
| 1,2 ml 0,2 M natriumfosfat dibasisk |
| 8,0 ml Dissection (P) buffert |
| 10,0 ml destillerat vatten |
| Skaka lösningen tills lysin är helt upplöst |
| Placera på is tills kallt (göra färsk före varje dissektion) |
| 2% paraformaldehyd - Lysin - Periodate (PLP) fixativ |
| 0,1 g natriumperjodat |
| 15.0 ml lysin (L) buffert |
| 5,0 ml 8% paraformaldehyd |
| Skaka lösningen väl tills natriumperjodat är helt upplöst |
| Placera på is tills kallt (göra färsk före varje dissektion) |
Tabell 2: Recept för lösningar som krävs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om detta förfarande har till stor del fokuserat på isolering och efterföljande behandling av ögon antennal skivor är det mottagligt för att användas för att isolera och analysera vingen, haltere, ben och genitala skivor (Figur 4). Det enda som krävs ändring av protokollet för att isolera dessa skivor (i motsats till den ögon antennal skiva) är metoden för grova dissektion (§ 2 i protokollet). Den första bröstbenet (T1) paret hittas vid den främre av larven och kan återvinnas genom att följa protokollet för ögon antennal skivisolering. Men den andra bröstbenet (T2) skivor är fästa på nagelbanden. För att isolera dessa skivor en pincett bör användas för att hålla munnen krokar (såsom beskrivits ovan), medan en annan pincett bör användas för att knäppa den ventrala nagelband hos djuret (se till att knäppa larven omkring 1/3 från munnen krokar. Larven kan enkelt filé genom att riva den ventrala nagelbanden bort från resten av LARva. T2 benen sitter kvar på nagelbanden. Den tredje bröstkorg (T3) benet är fäst vingen och haltere skivor som en del av ett komplex, som i sig också är knuten till nagelbanden. Du kan välja att skilja skiv komplexa och T2 benen från nagelbanden i detta skede eller hålla nagelbanden-skivkomplex tillsammans under de efterföljande fixering / antikropp inkubationsstegen och isolera skivorna under den fina dissektion delen av förfarandet (avsnitt 4) . För att återhämta geni skivor, är det bäst att ta tag i larverna på midsection med en pincett och dra sedan den ventrala nagelbanden med den andra pincett startar vid mittsektionen och slutar vid den bakre änden av larven. Det rekommenderas att tång användas för att rensa bort alla främmande vävnad och sedan överföra bara underlivet skivan till fixeringslösning med hjälp av en P-200 pipetman och en gul spets vars ände har skurits med ett rakblad.
Detta förfarande är bäst för tissderingar av begränsad tjocklek såsom imaginal skivor och fungerar bäst om de antikroppar som används är av hög titer och specificitet. Det kan emellertid vara anpassad för att fungera bra med tjockare vävnader såsom vuxen äggstock, testikel och hjärna samt med låg titer antikroppar eller de som ger högre än önskat "bakgrund"-färgning. När man arbetar med tjockare vävnad, föreslås det att optimala resultat kan uppnås genom att helt enkelt öka koncentrationen av paraformaldehyd och / eller inkubering i PLP fixativ för längre tidsperioder. Eftersom korrekt fixering av dissekerade vävnaderna är avgörande för att lyckas med detta protokoll är det också föreslagits att effektiviteten ökar paraformaldehyden koncentration och / eller öka fixeringslängden bedömas med phalloidin (Figur 1). I synnerhet bör särskild uppmärksamhet ägnas åt "skärpa" cell konturer och andra fysiska landmärken i vävnaden (dvs morphogenetic fåra). Ett annat sätt att se till att din vävnad (speciellt tjockare prov) är fast på rätt sätt är att förbereda 8% paraformaldehyd och PLP lösningar färsk före varje dissekering. Och slutligen, kan ökas den övergripande kvaliteten på dissektion om vävnaden dissekeras under korta tidsperioder och vävnad överförs till fixativ så snart som möjligt. Det föreslås att dissekera en längre tid än 15-20 min. Analysera kortare löptider ökar kvaliteten på vävnaden bevarande.
Detta protokoll fungerar bra med ett brett utbud av antikroppar, men det är sant att vissa antikroppar inte fungerar bra med PLP fixativ. Ett ökänt exempel är antikropp som känner igen Rough (Ro) transkriptionsfaktor. Rough uttrycks i och krävs för att specificera en delmängd av att utveckla fotoreceptorer 35. Den anti-Ro-antikroppen fungerar bäst, inte med PLP, utan snarare med en RÖR - EGTA - MgSO 4 (PEM) miljarderUffer 36. På liknande sätt kan andra antikroppar fungerar bäst på vävnader som har varit inkuberade i ytterligare andra fixeringsmedel. Det föreslås att, om inte annat anges, bör PLP fixativ prövas först. Om misslyckade då processen att hitta en alternativ fixerings ska börja.
Ett vanligt problem att konfrontera är arbetskoncentration av antikroppen i fråga. Ofta kan du vara den första forskaren att använda en speciell antikropp för att detektera proteiner i vävnaden av intresse. Arbets koncentrationen kan avvika från vad som rapporterats för andra vävnader. Det föreslås att den rekommenderade koncentrationen prövas först. Ökning av koncentrationen av antikroppen om en signal inte kan ses. Å andra sidan, om den rekommenderade koncentrationen ger hög bakgrundsfärgning därefter utspädning av antikroppen bör prövas. Arbets koncentrationer bland antikroppar kan variera. Till exempel är den anti-Eyes Frånvarande (Eya) antikropp späddes 1: 5 medan den antiElav antikropp fungerar bra även vid en 1: 500 utspädning. Vissa antikroppar kan även spädas så långt ned som 1: 3,000. Dessutom denna procedur, som skrivet, fungerar bäst med hög specificitet antikroppar. Men som många har upplevt, kan vissa antikroppar binder ospecifikt till vävnaden och detta kan skapa en optimal bild. Denna situation kan ofta korrigeras genom inkubation den utspädda antikroppen med fasta embryon eller larv slaktkroppar innan de läggs till de fasta imaginal skivor. Beroende på graden av icke-specifik bakgrundsfärgning, kan önskad längd av "pre-absorption" varierar och måste utarbetas på försök. Det är också möjligt att öka signal / brusförhållandet genom att återanvända antikroppar flera gånger eller genom att utföra flera omgångar av pre-absorption.
Vid beslut om vilka skivor som ska användas i publikationer och / eller presentationer, är det bäst att välja skivor som har orienterade med apikala sidan orienterade upp vårdavdelningar. Det är också bäst att använda skivor som inte är vikta. Detta gäller särskilt i ögat-antennal skiva. Den ventrala sidan av skivan tenderar att vika och tyvärr finns det inte mycket man kan göra för att förhindra att detta händer. En lösning är att dissekera yngre skivor eftersom dessa tenderar att lägga sig betydligt mindre. Ett annat alternativ är att bara dissekera ett stort antal skivor, tills du får en som är helt platt. Den övergripande formen på ögat-antennal skiva kan påverkas genom den hastighet med vilken larven slits sönder. Om man drar larven isär för snabbt hålet genom vilket hjärnan skivor komplexet passerar är liten och ögon antennal skiva kommer ut vikta och / eller sträckt. Det är bäst att dra långsamt tills larven börjar riva eftersom hålet kommer att bli större. Sedan kan du fortsätta att dra hjärnan-eye-antennal skivkomplex långsamt. Tänk på att du aldrig kan dra för långsamt. Observera också, att den hastighet med vilken man river vävnaden inte är en faktor i isolering av andra vävnader.
ve_content "> Livscykeln för Drosophila består av tre larv faser. Viktiga utvecklings evenemang äger rum under var och en av dessa faser, därför kan det vara viktigt att isolera vävnader inte bara från tredje larv instars (som är i fokus för detta förfarande) men också från både första och andra larver instars också. Med ett mindre undantag, kan detta förfarande användas, som skrivet, för att isolera andra stadiet skivor. Under fina dissektion delen av förfarandet (avsnitt 4) rekommenderas att skarp volfram tråd bör användas för att separera ögon antennal skiva från yttre vävnad som munnen krokar, hjärna och salivkörtlar. Volfram tråd kan också användas för att separera de T2 / T3 ben, vinge och haltere skivor från varandra och den överliggande nagelband . Det är rekommenderar att ena änden av volfram tråd (slutet som kommer att användas för att separera vävnader) vässas genom upphettning i ett kokande natriumnitrat bath Den andra änden kan infogas i ett stift vise;. thär gör att du kan hålla volfram tråd lättare. Tyvärr är det betydligt svårare att isolera intakta första stadiet skivor, därför rekommenderas att du placerar hela ögon antennal skiva / hjärna / mun krok komplex på bilden och täck med ett täckglas. Mängden dissekerade vävnad kan minimeras genom att använda en vass volfram tråd för att ta bort spottkörtlar och överliggande nagelband före montering skivan / hjärna / mun krok komplex till bilden. Det är relativt lätt att identifiera det första stadiet ögon antennal skiva när den fortfarande sitter hjärnan och munnen krokar (se figur 6A, D i Kumar och Moses, 2001) 37. De andra imaginal skivor kommer att behöva separeras från nagelbanden och placeras i en bild för visning.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Donald Ready och Kevin Moses för undervisning JPK original imaginal skivan dissektion förfarande. Vi tackar också Bonnie Weasner för genitala skivan i figur 1B och ögat skivan i figur 2A, Brandon Weasner för figur 3, den Bloomington Drosophila Stock Centrum för flyga fläckar och Utvecklingsstudier Hybridoma banken för antikroppar. CMS har fått stöd av ett stipendium från National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), Frank W. Putnam Research Fellowship, och Robert Briggs Research Fellowship. JPK stöds av ett bidrag från National Eye Institute (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
