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Immunology and Infection

माउस भ्रूण जिगर संस्कृति के लिए सिस्टम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में लक्ष्य जीन कार्य काटना

Published: September 9, 2014 doi: 10.3791/51894
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Northwestern University

Summary

हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों dissects कि इन विट्रो माउस भ्रूण जिगर erythroblast संस्कृति प्रणाली मौजूद है. इस प्रणाली के विभिन्न विकास के चरणों में विशिष्ट जीन की कार्यात्मक विश्लेषण की सुविधा.

Abstract

एरिथ्रोपोएसिस तेजी इकाइयों के गठन erythroid कॉलोनी (CFU-ते) विभाजित करके पीछा प्रतिबद्ध एर्य्थ्रोइद फट बनाने इकाइयों (BFU-एस) के साथ शुरू होता है कि एक गतिशील प्रक्रिया शामिल है. CFU-एस के बाद, कोशिकाओं आकृति विज्ञान पहचानने और आम तौर पर टर्मिनल erythroblasts कहा जाता है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के अध्ययन के लिए चुनौतियों में से एक एक कालानुक्रमिक ढंग से जीन कार्यों काटना प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की कमी है. इस प्रोटोकॉल में, हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में जीन कार्यों का निर्धारण करने के लिए एक अद्वितीय रणनीति का वर्णन. इस प्रणाली में, माउस भ्रूण जिगर TER119 (परिपक्व erythroid सेल मार्कर) नकारात्मक erythroblasts शुद्ध थे और cDNAs या ब्याज की जीन के लिए छोटे बाल के लिये कांटा RNAs (shRNAs) के बहिर्जात अभिव्यक्ति के साथ transduced. कोशिकाओं बाद में बहिर्जात cDNAs या shRNAs की अनुमति है जबकि 12 घंटा के लिए उनके पूर्वज मंच बनाए रखने के लिए erythropoietin (ईपीओ) के अलावा अन्य मध्यम युक्त वृद्धि कारकों में सुसंस्कृत थेव्यक्त करने के लिए. कोशिकाओं बहिर्जात आनुवंशिक सामग्री पहले ही व्यक्त कर रहे थे, जबकि सेल भेदभाव और प्रसार के लिए प्रेरित करने के 12 घंटे के बाद ईपीओ मध्यम करने के लिए बदल गया. इस प्रोटोकॉल टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण में जीन के कार्यों का विश्लेषण की सुविधा. देर चरण टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं तुरंत पारगमन के बाद ईपीओ माध्यम में सुसंस्कृत थे. Transduced आनुवंशिक सामग्री व्यक्त किया गया है जब इस तरह, कोशिकाओं पहले ही टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण के लिए भेदभाव किया गया. हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में विस्तृत जीन कार्यों को समझने में मदद मिलेगी कि इस रणनीति का एक सामान्य आवेदन की सलाह देते हैं.

Introduction

एरिथ्रोपोएसिस एरिथ्रोसाइट्स परिपक्व करने के लिए multipotent hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव की प्रक्रिया है. इस stepwise प्रक्रिया प्रतिबद्ध एर्य्थ्रोइद फट बनाने इकाइयों (BFU-ते), तेजी से विभाजित एर्य्थ्रोइद कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU-ते), और आकृति विज्ञान पहचानने erythroblasts 1,2 के गठन शामिल है. CFU ई पूर्वज कोशिकाओं से टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस अनुक्रमिक erythropoietin निर्भर और स्वतंत्र चरणों 2,3 शामिल है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण में, एरिथ्रोपीटिन (ईपीओ) कोशिका की सतह पर अपने रिसेप्टर को बांधता है और सेल apoptosis को रोकने और तेजी से कोशिका विभाजन और जीन अभिव्यक्ति 1,4 बढ़ावा कि नीचे की ओर संकेत दे रास्ते की एक श्रृंखला को प्रेरित करता है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण में, erythroblasts अत्यधिक सघन नाभिक 5 के टर्मिनल सेल चक्र से बाहर निकलें, chromatin और नाभिक संघनन, और बाहर निकालना गुजरना.

टर्मिनल की हमारी समझएरिथ्रोपोएसिस बहुत कारण इन विट्रो में कई के सफल प्रयोग करने के लिए और इन विवो माउस मॉडल 6-9 में बड़े पैमाने पर है, जो पिछले कुछ दशकों में सुधार हुआ है. इन मॉडलों के बीच, माउस भ्रूण जिगर erythroblasts के इन विट्रो संस्कृति में सेल शुद्धि, तेजी से प्रसार और भेदभाव की आसानी सहित कई लाभ प्रदान करता है, और मानव एरिथ्रोपोएसिस 10,11 के लिए एक करीब नकल. इस प्रणाली में, माउस भ्रूण यकृत से एर्य्थ्रोइद पूर्वज कोशिकाओं की बड़ी संख्या आसानी से TER119 की भी कदम शुद्धि (परिपक्व erythroid कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) नकारात्मक erythroblasts द्वारा अलग किया जा सकता है. Erythroblasts की दो दिवसीय संस्कृति के दौरान, इन कोशिकाओं के भेदभाव transferrin रिसेप्टर (CD71) और TER119 प्रतिजन 12 की सतह अभिव्यक्ति पर आधारित एक प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा नजर रखी जा सकती है. इसके अलावा, टर्मिनली भेदभाव erythroblasts का स्पष्टीकरण 1 एक डीएनए निर्माता (Hoechst 33342) द्वारा पता लगाया जा सकता है3. इसके अलावा, शुद्ध progenitors आनुवंशिक रूप से cDNAs या एरिथ्रोपोएसिस 11,13,14 पर जीन अभिव्यक्ति के कार्यों की यंत्रवत पढ़ाई की सुविधा है, जो ब्याज की जीन, के लिए छोटे बाल के लिये कांटा RNAs (shRNAs) के बहिर्जात अभिव्यक्ति द्वारा संशोधित किया जा सकता है.

यह टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में जीन कार्यों को चिह्नित करने के लिए मुश्किल है क्योंकि दूसरी ओर, तेजी से कोशिकाओं की वृद्धि दर एक दोधारी तलवार हो सकता है. ज्यादातर मामलों में, यह cDNAs या shRNAs व्यक्त समय से जब से टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण में एक विशेष जीन कार्यों, कोशिकाओं पहले से ही प्रारंभिक चरण पारित निर्धारित करने के लिए मुश्किल है. इस समस्या को हल करने के लिए, हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों टुकड़े करने के लिए एक अनूठी प्रणाली विकसित की है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित TER119 नकारात्मक erythroblasts, ईपीओ मुक्त माध्यम लेकिन युक्त स्टेम सेल कारक (एससीएफ) में आईएल -6 और FLT3 सुसंस्कृत थेligand उनके पूर्वज स्थिति बनाए रखने और अभिव्यक्ति 13 transduced cDNAs या shRNA अनुमति देने के लिए. कोशिकाओं सेल प्रसार और भेदभाव को प्रेरित करने के 12 घंटे के बाद ईपीओ युक्त मध्यम करने के लिए बदल गया. कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर दिया है जब इस तरह,, transduced cDNAs या shRNAs पहले ही व्यक्त कर रहे थे. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण के लिए, TER119 नकारात्मक erythroblasts ईपीओ पारगमन के बाद तुरंत मध्यम युक्त में सुसंस्कृत थे. इसलिए, एक टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण में ब्याज की जीन के कार्यों का विश्लेषण कर सकते हैं. संक्षेप में, इस प्रणाली का एक व्यापक आवेदन टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में काटना जीन कार्यों में मदद मिलेगी.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

संस्कृति के माध्यम से 1 की तैयारी

  1. फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान तैयार है. मानव फ़ाइब्रोनेक्टिन (1 मिलीग्राम) की एक शीशी के लिए पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें. आंदोलन के बिना 30 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड में समाधान छोड़ दें. 20 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए पीबीएस के 50 एमएल के लिए कुल तरल स्थानांतरण और धीरे मिश्रण अच्छी तरह से. प्लेट (नीचे देखें) कोटिंग से पहले फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान ताजा बनाओ.
  2. ईपीओ मुक्त मध्यम (एससीएफ माध्यम) के 50 एमएल तैयार करें. ताजा कर दिया जब 1 टेबल में सूचीबद्ध सामग्री का मिश्रण. मध्यम 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  3. ईपीओ युक्त मध्यम की 50 मिलीलीटर की तैयारी. ताजा कर दिया जब 2 टेबल में सूचीबद्ध सामग्री का मिश्रण. मध्यम 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
    4. 2 fibronectin लेपित थाली

    1. 6 अच्छी तरह से थाली (या एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर) के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान जोड़ें. 1 घंटे के लिए टिशू कल्चर हुड में थाली छोड़ दें.
    2. दो बार बाँझ पानी के साथ कुओं कुल्ला और हवा थाली सूखी.
    3. प्लेट लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे कमरे में बचाने के लिए.

    भ्रूण जिगर Erythroblasts के 3 शोधन

    नोट: E15 के लिए E13 से उपयोग भ्रूण यकृत गर्भवती चूहों (C57BL / 6) समय पर. E13.5 यकृत CFU ई progenitors के उपज को अधिकतम करने के लिए पसंद कर रहे हैं. समय पर गर्भवती चूहों को प्राप्त करने के लिए, 6 से 8 सप्ताह पुराने नर और मादा चूहों एक पिंजरे (एक या दो महिलाओं के साथ आमतौर पर एक पुरुष) में रखा गया था. स्त्री योनि प्लग संभोग सफल रहा था, तो यह निर्धारित करने के लिए अगली सुबह जाँच की थी. प्लग पाया गया था के बाद गर्भ के पहले दिन दिन था.

    1. कुल भ्रूण जिगर की कोशिकाओं की तैयारी
      1. एमओयू बलिदानसीओ 2 साँस लेना और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से एसई. कीटाणुशोधन के लिए 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे. गर्भाशय निकालने के लिए कैंची विदारक साथ पेट खोलें. 1x पीबीएस में गर्भाशय धो लें.
      2. एक टिशू कल्चर हुड और autoclaved उपकरणों का उपयोग बाँझ परिस्थितियों में भ्रूण काटना और 1x पीबीएस में धो लो.
      3. भ्रूण से भ्रूण यकृत काटना. धीरे एक और संदंश के साथ शरीर से दूर भ्रूण जिगर (रंग में गुलाबी) पुल, एक संदंश के साथ भ्रूण के शरीर पकड़ो. जुड़े fibrotic ऊतकों को हटाने के लिए संदंश के साथ भ्रूण जिगर साफ करें. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त ताजा 1x पीबीएस में सभी भ्रूण यकृत रखें.
      4. यंत्रवत् ऊपर और नीचे pipetting द्वारा भ्रूण यकृत को बाधित.
      5. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर. 5 मिनट के लिए 800 XG पर गोली कोशिकाओं.
      6. FBS सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 10% के साथ 1 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं resuspend (लगभग 8 E13.5 भ्रूण यकृत) मिलीलीटर प्रति.
    2. TER119 नकारात्मक Erythroblasts का शोधन
      1. 15 मिनट के लिए बर्फ पर चूहा आईजीजी साथ कोशिकाओं (0.2 मिलीग्राम / एमएल) ब्लॉक.
      2. धोने या centrifuging बिना, सेल निलंबन (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए biotinylated विरोधी TER119 एंटीबॉडी जोड़ें. बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
      3. 5 मिनट के लिए 800 XG पर 10% FBS (1:10) और अपकेंद्रित्र के साथ 1x पीबीएस में धो लें. 10% FBS के साथ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend.
      4. जोड़ें 75 μl चुंबकीय कणों के साथ संयुग्मित और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते streptavidin.
      5. पीबीएस 10% FBS युक्त साथ 2.5 मिलीलीटर मात्रा में जोड़ें. नीचे ट्यूब दौर एक 5 मिलीलीटर polypropylene में सेल निलंबन स्थानांतरण.
      6. एक चुंबकीय सेल छँटाई तंत्र में ट्यूब डालें और 10 मिनट के लिए सेते हैं. TER119 सकारात्मक कोशिकाओं ट्यूब की ओर करने के लिए देते हैं जाएगा. स्वाधीन TER119 नकारात्मक erythroblasts निलंबन में रहेगा.
      7. नीचे ट्यूब दौर एक नया 5 एमएल polypropylene में सेल निलंबन डालो.
      8. दोहराएँ अवशिष्ट TER119 सकारात्मक कोशिकाओं को हटाने के लिए 3.2.6 और 3.2.7 कदम.
      9. 5 मिनट के लिए 800 XG पर गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate. 10% FBS युक्त 1 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend और Trypan ब्लू के साथ जीवित कोशिकाओं गिनती.

    वायरस तय सीडीएनए या shRNA साथ 4 पारगमन

    1. 3-5 पर शुद्ध TER119 नकारात्मक भ्रूण जिगर की कोशिकाओं प्लेट X 10 5 / अच्छी तरह से 12 अच्छी तरह से थाली में लिपटे एक फ़ाइब्रोनेक्टिन (एक अलग प्लेट का उपयोग अगर सेल नंबर समायोजित) में.
    2. वायरल पारगमन की सुविधा के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता polybrene जोड़ें. स्पिन 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-1.5 घंटे के लिए 800 XG पर, lentiviruses या रेट्रोवायरस, एन्कोडिंग सीडीएनए या shRNA के साथ कोशिकाओं को संक्रमित.

    Transduced TER119 नकारात्मक माउस भ्रूण जिगर Erythroblasts के 5 संस्कृति

    1. (चित्रा 1 लाइनें धराशायी) टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण में जीन कार्यों का परीक्षण किया.">
      1. संस्कृति 12 घंटे के लिए ईपीओ मुक्त मध्यम (एससीएफ माध्यम) में transduced कोशिकाओं transduced जीन और पूर्वज राज्य के रखरखाव की अभिव्यक्ति की अनुमति है.
      2. 5 मिनट के लिए 800 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला aspirate. एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में मध्यम युक्त 1 मिलीलीटर ईपीओ में कोशिकाओं Resuspend.
      3. 24 या 48 घंटे के लिए संस्कृति के बाद, आगे assays के लिए कोशिकाओं फसल.
    2. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस (चित्रा 1 ठोस लाइनों) की देर चरण में टेस्ट जीन कार्य करता है.
      1. संस्कृति ईपीओ युक्त मध्यम में तुरंत transduced कोशिकाओं.
      2. 24 या 48 घंटे के लिए संस्कृति के बाद, आगे assays के लिए कोशिकाओं फसल.

    प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए संवर्धित भ्रूण जिगर की कोशिकाओं के 6 धुंधला

    1. धोएं और 1x पीबीएस में कोशिकाओं resuspend. हार्वेस्ट प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए 2 एक्स 10 5 संवर्धित कोशिकाओं.
    2. सेतेअंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं. भेदभाव का परीक्षण करने के लिए, एपीसी संयुग्मित विरोधी CD71 और पीई संयुग्मित विरोधी TER119 का उपयोग करें. स्पष्टीकरण का परीक्षण करने के लिए, अन्य एंटीबॉडी के अलावा Hoechst 33342 दाग का उपयोग करें.
    3. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें. मृत कोशिकाओं दाग और विश्लेषण से उन्हें बाहर करने के लिए 1% FBS और propidium आयोडाइड (पीआई) (1 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त 0.5 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend.
    4. आचार प्रवाह cytrometric विश्लेषण. प्रवाह के समायोजन और मुआवजे के लिए पहला एकल रंग दाग और बेदाग नियंत्रण कोशिकाओं का विश्लेषण.

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Representative Results

चित्रा 1 प्रयोगात्मक रणनीतियों की रूपरेखा. प्रोटोकॉल टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में संकेतन अणुओं के कार्यों को लक्षित के लिए दो स्वतंत्र शर्तों के होते हैं. TER119 नकारात्मक भ्रूण जिगर erythroblasts E13.5 माउस भ्रूण से शुद्ध किया गया. भ्रूण जिगर erythroid कोशिकाओं से पहले और शोधन के बाद का प्रवाह cytometric विश्लेषण शुद्धीकरण (आंकड़े 2A और 2 बी) कुशल था कि प्रदर्शन किया. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस (चित्रा 1, धराशायी लाइनों) के प्रारंभिक चरण के लिए, वायरल पारगमन के बाद, कोशिकाओं 12 घंटा के लिए ईपीओ मुक्त माध्यम (एससीएफ माध्यम) में सुसंस्कृत थे. इस अवधि के दौरान कोशिकाओं transduced कोशिकाओं में मनाया कोई महत्वपूर्ण apoptosis (GFP सकारात्मक) (चित्रा 3) के साथ कम से कम भेदभाव (चित्रा -2) दिखाया. कोशिकाओं (ईपीओ युक्त मध्यम करने के लिए स्थानांतरित करने के बाद चित्रा 4 अंतर करने के लिए शुरू कर दिया strong>), (चित्रा 1, ठोस लाइनों और चित्रा 5) ईपीओ पारगमन के बाद तुरंत मध्यम युक्त में संवर्धित कोशिकाओं के समान था. दोनों तरीकों में ईपीओ युक्त मध्यम में 2 दिन संस्कृति के दौरान, (CD71 कम TER119 कम) एर्य्थ्रोइद पूर्वज कोशिकाओं के सबसे दिन 2 (CD71 उच्च TER119 उच्च) (चित्रा -4 ए और चित्रा पर transferrin रिसेप्टर की प्रेरण (CD71) और TER119 का प्रदर्शन 5 ए). Hoechst उच्च TER119 उच्च (erythroblasts) और Hoechst कम TER119 उच्च (reticulocytes) (4B चित्रा और चित्रा 5 ब) द्वारा मनाया के रूप में स्पष्टीकरण, दिन 2 पर हुई. यह ईपीओ (ठोस लाइन) में तुरंत कोशिकाओं संस्कृति कोशिकाओं की तुलना में भेदभाव और स्पष्टीकरण के लिए अपेक्षाकृत अधिक कुशल था उल्लेखनीय है कि एस सी एफ मध्यम (धराशायी लाइन) में सभ्य पहले.

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चित्रा 1 प्रयोगात्मक रणनीति के योजनाबद्ध सिंहावलोकन. डैश्ड और ठोस लाइनों क्रमशः, टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में संकेतन अणुओं के अध्ययन के लिए तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 2
माउस का चित्रा 2 प्रवाह cytometric विश्लेषण भ्रूण जिगर erythroid कोशिकाओं से पहले और TER119 नकारात्मक erythroblasts की शुद्धि के बाद. (ए) TER119 और CD71 के साथ दाग कुल भ्रूण जिगर की कोशिकाओं. TER119 और CD71 के साथ दाग (बी) के शुद्ध TER119 नकारात्मक कोशिकाओं. (सी) शुद्ध TER119 एससीएफ माध्यम में 12 घंटा संस्कृति के बाद नकारात्मक कोशिकाओं. दलीलोंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
12 घंटे के लिए 3 चित्र फ्लो ईपीओ मुक्त माध्यम (एससीएफ माध्यम) में संस्कृति के बाद apoptosis के cytometric विश्लेषण. (अटल बिहारी) TER119 नकारात्मक erythroblasts हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) (बी) एन्कोडिंग नियंत्रण lentiviruses (ए) या ​​lentiviruses साथ transduced थे. GFP सकारात्मक transduced कोशिकाओं का प्रतिशत एससीएफ माध्यम में संस्कृति के 12 घंटे के बाद पेश किया गया. (बी) से GFP नकारात्मक (सी) में apoptosis और सकारात्मक (डी) कोशिकाओं की (सीडी) विश्लेषण.

चित्रा 4
Transduced erythrobla के भेदभाव और स्पष्टीकरण की चित्रा 4 प्रवाह cytometric विश्लेषणईपीओ मध्यम द्वारा पीछा एससीएफ माध्यम में सुसंस्कृत अनुसूचित जनजातियों. चित्रा 3 में (क), GFP नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं कोशिकाओं एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए ईपीओ मध्यम और सुसंस्कृत करने के लिए बदल गया बाद CD71 और TER119 का उपयोग भेदभाव विश्लेषण के लिए gated थे. (बी) के स्पष्टीकरण परख Hoechst और संकेत के TER119 का उपयोग ईपीओ माध्यम में 48 घंटे के बाद कोशिकाओं.

चित्रा 5
ईपीओ माध्यम में सीधे सुसंस्कृत transduced erythroblasts के भेदभाव और स्पष्टीकरण की चित्रा 5 प्रवाह cytometric विश्लेषण. (ए) TER119 नकारात्मक कोशिकाओं GFP एन्कोडिंग lentiviruses साथ transduced थे. कोशिकाओं तुरंत पारगमन के बाद ईपीओ माध्यम में सुसंस्कृत थे. GFP नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं के सेल भेदभाव विश्लेषण संस्कृति में 48 घंटे के बाद CD71 और TER119 उपयोग किया गया था. (बी) स्पष्टीकरण परखसंस्कृति में 48 घंटे के बाद Hoechst और TER119 का उपयोग कर संकेत दिया कोशिकाओं.

संघटक मात्रा
IMDM 41.385 मिलीग्राम
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, 15%) 7.5 मिलीलीटर
B-mercaptoethanol (10 -4 एम) 50 μl (IMDM में 10 -1 एम स्टॉक)
पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) 500 μl
Glutamine (2 मिमी) 500 μl
सेल फैक्टर स्टेम (50 एनजी / एमएल) 100 एनजी / एमएल स्टॉक से 25 μl
FLT3 Ligand (फ्लाइट-3L) (30 एनजी / एमएल) 50 एनजी / एमएल स्टॉक से 30 μl
आईएल -6 (20 एनजी / एमएल) 100 एनजी / एमएल स्टॉक से 10 μl

तालिका 1 संघटक के लिएआर एस सी एफ मध्यम (ईपीओ मुक्त माध्यम).

संघटक मात्रा
IMDM 36.3 मिलीलीटर
FBS (15%) 7.5 मिलीलीटर
गोजातीय सीरम albumin (बीएसए, 10%) 5 मिलीलीटर (10% IMDM में स्टॉक)
इंसुलिन (10 मिलीग्राम / एमएल) 4 डिग्री सेल्सियस स्टॉक से 50 μl
Holo-transferrin (200 मिलीग्राम / एमएल) 200 μl (50 मिलीग्राम / पानी में मिलीलीटर, सी -20 स्टॉक °)
B-mercaptoethanol (10 -4 एम) 50 μl (IMDM में 10 -1 एम स्टॉक)
पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) 500 μl
2 मिमी Glutamine 500 μl
ईपीओ (2 यू / एमएल) 33 μl (3,000 यू / एमएल शेयर)

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Discussion

यहाँ हम कालक्रम के अनुसार माउस भ्रूण जिगर टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठी प्रणाली मौजूद है. अलग संस्कृति शर्तों के आवेदन के माध्यम से, हम सफलतापूर्वक जल्दी और देर चरणों में टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस विच्छेदित. यह कई कार्यों के साथ जीनों के तंत्र का निर्धारण करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, आरएसी GTPases टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस प्रभावों सेल भेदभाव और प्रसार के प्रारंभिक चरण में आरएसी GTPases का निषेध. दूसरी ओर, सेल भेदभाव, प्रसार, या अस्तित्व 13 को प्रभावित किए बिना टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस ब्लॉक स्पष्टीकरण की देर चरण में आरएसी GTPases की गतिविधि निषेध.

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम को ध्यान में रखा जाना चाहिए. सबसे पहले, E13.5 माउस भ्रूण यकृत TER119 नकारात्मक कोशिकाओं की शुद्धि के लिए पसंद कर रहे हैं. पुराने भ्रूण का इस्तेमाल किया लेकिन proporti किया जा सकता हैकुल भ्रूण जिगर की कोशिकाओं के बाहर progenitors के पर कम हो जाएगा. तंत्र स्पष्ट नहीं है, हालांकि दूसरा, यह, यह स्पष्टीकरण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि ईपीओ माध्यम में कम endotoxin बीएसए उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. फ़ाइब्रोनेक्टिन एरिथ्रोपोएसिस 15 के लिए महत्वपूर्ण होने की सूचना मिली थी, हालांकि तीसरा, हम फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित प्लेट का उपयोग वैकल्पिक था. यह हमारे सिस्टम में सेल प्रसार, भेदभाव, या स्पष्टीकरण को प्रभावित नहीं करता. कोशिकाओं immunostaining के रूप में कुछ अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है कि थाली करने के लिए संलग्न करने के लिए हालांकि, फ़ाइब्रोनेक्टिन उपयोगी हो सकता है. चौथा, reticulocytes या देर से मंच erythroblasts का एक छोटा सा प्रतिशत transduced कोशिकाओं के साथ किया गया था कि GFP संकेत खो सकते हैं. वैकल्पिक रूप से हम transduced कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक मार्कर के रूप में मानव सीडी 4 का उपयोग करें. अंत में, पिछली रिपोर्टों दिन 1 11 पर संस्कृति से erythropoietin को हटाने की सिफारिश की. सेल पर कोई महत्वपूर्ण अंतर था के बाद से हम ऐसा करना आवश्यक नहीं था कि पायासाथ या erythropoietin को हटाने के बिना भेदभाव, प्रसार, या स्पष्टीकरण. इसके विपरीत, मध्यम के परिवर्तन सेल हानि हो सकती है.

एक ही रणनीति का प्रयोग, हमने हाल ही में टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों (झाओ एट अल., अप्रकाशित परिणाम) में उपन्यास कार्यों खेलना है कि 30 से अधिक जीन की खोज की. आरएसी GTPases की तरह, इन जीनों के कई टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के दोनों जल्दी और देर चरणों में दोहरी कार्यों खेलते हैं. इस टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस में संकेत दे रास्ते बारीकी से जुड़े रहते हैं कि इंगित करता है. Remodeling actin cytoskeleton और परमाणु संक्षेपण में शामिल जीनों टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस भर में इन संकेत दे रास्ते की महत्वपूर्ण भूमिका के कारण दोहरी कार्यों खेलने के लिए करते हैं कि उन हैं. दूसरी ओर, इस तरह के हीम संश्लेषण और एर्य्थ्रोइद विशिष्ट प्लाज्मा झिल्ली की पीढ़ी के रूप में रास्ते में शामिल जीनों टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस 16,17 के शुरुआती चरण में अधिक प्रतिबंधित हो जाते हैं. वहाँ हालांकिई ऐसी अपेक्षाकृत कम संक्रमण सेल लाइनों के पारगमन की तुलना में दक्षता, और लंबे समय से आधा जीवन के साथ प्रोटीन नीचे दस्तक करने की कठिनाई के रूप में इस प्रयोगात्मक रणनीति की कुछ सीमाएं हैं, हम जीन कार्यों विदारक के महत्व को देखते हुए हमारे सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक नियमित अभ्यास की सिफारिश टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में. इसके अलावा, इस प्रयोगात्मक रणनीति भी अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एससीएफ मध्यम संस्कृति हालत का उपयोग, ऐसे आत्म नवीकरण या भेदभाव के रूप में स्टेम सेल संपत्तियों के रखरखाव में शामिल कर रहे हैं कि जीन का विश्लेषण किया जा सकता है. देर चरण एरिथ्रोपोएसिस विश्लेषण करने के लिए विधि का प्रयोग, एक भी organelles को हटाने के लिए भोजी में शामिल किया जा सकता है कि जीन के समारोह का निर्धारण कर सकता है.

मोटे तौर पर, इस प्रयोगात्मक रणनीति ऐसी megakaryopoiesis और myelopoiesis के रूप में अन्य hematopoietic प्रणाली के कार्यात्मक जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है. इस एस के सफल आवेदनtrategy भी रक्त कोशिकाओं के विभिन्न विकास के चरणों में विशिष्ट जीन की आणविक तंत्र की छिपी ओर प्रकट होता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस अध्ययन एनआईएच R00HL102154 द्वारा समर्थित है, और पी जी को रुधिर विद्वान पुरस्कार के एक अमेरिकी समाज था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) Gibco 12440-053
Fetal bovine serum (FBS) GEMINI Bio-product 700-102P
Penicillin-Streptomycin solution Hyclone SV30010 100x
L-Glutamine Hyclone SH30034.01 200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) BD Biosciences  14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)  GEMINI Bio-product 300-327P
Fibronectin BD Biosciences  354008
Bovine Serum Albumin (BSA) STEMCELL TECH 9300 10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo) PROCRIT NOC 59676-303-00 3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus BD Pharmingen 557812
EasySep Magnet STEMCELL TECH 18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml FALCON 352063

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 91 एरिथ्रोपोएसिस सेल संस्कृति erythroblast भेदभाव erythropoietin भ्रूण जिगर स्पष्टीकरण
माउस भ्रूण जिगर संस्कृति के लिए सिस्टम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में लक्ष्य जीन कार्य काटना
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Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P.… More

Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P. Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis. J. Vis. Exp. (91), e51894, doi:10.3791/51894 (2014).

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