Summary
Nous présentons un système in vitro de culture de fœtus de souris des érythroblastes de foie qui dissèque les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Ce système facilite l'analyse fonctionnelle des gènes spécifiques à différents stades de développement.
Abstract
Érythropoïèse implique un processus dynamique qui commence avec des unités engagées en rafale érythroïde formant (BFU-Es) puis en divisant rapidement érythroïde unités formant colonie (UFC-Es). Après CFU-E, les cellules sont morphologiquement reconnaissable et généralement appelée érythroblastes terminaux. L'un des défis pour l'étude de l'érythropoïèse terminale est le manque d'approches expérimentales pour disséquer les fonctions des gènes d'une manière chronologique. Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie unique pour déterminer la fonction des gènes dans les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Dans ce système, la souris fœtale Ter119 du foie (marqueur des cellules érythroïdes matures) des érythroblastes négatifs ont été purifiés et transduites avec l'expression exogène d'ADNc ou de petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) pour les gènes d'intérêt. Les cellules ont ensuite été cultivées dans des facteurs de croissance de milieu contenant d'autres de l'érythropoïétine (Epo) pour maintenir leur stade de progéniteurs pendant 12 heures tout en laissant les ADNc exogène ou shRNAà exprimer. Les cellules ont été modifiées pour Epo milieu après 12 heures pour induire la différenciation et la prolifération cellulaire, tandis que les matériaux génétiques exogènes ont déjà été exprimés. Ce protocole facilite l'analyse des fonctions des gènes dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale. Pour étudier la fin de l'érythropoïèse terminale de stade, les cellules ont été immédiatement mises en culture dans un milieu Epo après transduction. De cette manière, les cellules ont été déjà différenciées à la fin du stade de l'érythropoïèse terminale lorsque les matériaux génétiques transduites ont été exprimés. Nous recommandons une application générale de cette stratégie qui aiderait à comprendre les fonctions des gènes détaillées à différents stades de l'érythropoïèse terminale.
Introduction
L'érythropoïèse est le processus de différenciation de cellules souches hématopoïétiques multipotentes à maturité érythrocytes. Ce processus par étapes comprend la formation d'unités engagées en rafale érythroïde formant (BFU-E), les unités formant des colonies érythroïdes à division rapide (CFU-Es), et morphologiquement reconnaissables érythroblastes 1,2. Érythropoïèse terminale à partir de cellules souches CFU-E implique séquentielle érythropoïétine-dépendantes et indépendantes étapes 2,3. Dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale, l'érythropoïétine (EPO) se lie à son récepteur sur la surface cellulaire et induit une série de voies de signalisation en aval qui empêchent l'apoptose cellulaire et favorisent la division cellulaire rapide et l'expression du gène 1,4. À la fin du stade de l'érythropoïèse terminale, érythroblastes subissent sortie de la cellule terminale du cycle, de la chromatine et de noyaux de condensation, et l'extrusion des noyaux fortement condensés 5.
Notre compréhension de la borneérythropoïèse s'est grandement améliorée au cours des dernières décennies, ce qui est dû en grande partie à l'utilisation réussie de plusieurs in vitro et dans des modèles murins in vivo 6-9. Parmi ces modèles, la culture in vitro de souris fœtale érythroblastes de foie fournit de nombreux avantages, y compris la facilité de purification des cellules, la prolifération et la différenciation rapide, et un synoptique plus proche de l'érythropoïèse 10,11 humain. Dans ce système, un grand nombre de cellules progénitrices érythroïdes à partir de foie fœtal de souris peuvent être facilement isolés par la purification en une seule étape de Ter119 (un marqueur pour les cellules érythroïdes matures) des érythroblastes négatifs. Au cours de la culture de deux jours des érythroblastes, la différenciation de ces cellules peut être surveillée par une analyse par cytométrie de flux sur la base de l'expression en surface du récepteur de la transferrine (CD71) et l'antigène de Ter119 12. En outre, des érythroblastes énucléation de différenciation terminale peut être détectée par un fabricant de l'ADN (Hoechst 33 342) 13. En outre, les progéniteurs purifiés peuvent être génétiquement modifiées par expression d'ADNc exogène ou de petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) pour les gènes d'intérêt, ce qui facilite les études mécanistiques des fonctions de l'expression du gène sur l'érythropoïèse 11,13,14.
D'autre part, le taux de croissance de cellule rapide peut être une arme à double tranchant, car il est difficile de caractériser les fonctions des gènes à différents stades de l'érythropoïèse terminale. Dans la plupart des cas, il est difficile de déterminer si une des fonctions des gènes spécifiques à un stade précoce de l'érythropoïèse terminale depuis le temps des ADNc ou shRNA exprimés, les cellules ont déjà passé le stade précoce. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un système unique pour disséquer les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Pour le stade précoce de l'érythropoïèse terminale, Ter119 érythroblastes négatifs génétiquement modifiés ont été cultivées dans un milieu sans Epo mais contenant du facteur de cellules souches (SCF), l'IL-6 et FLT3ligand de maintenir leur statut de géniteur et laissez les ADNc transduites ou shRNA à l'expression 13. Les cellules ont été modifiées pour l'Epo contenant le milieu après 12 heures pour induire la prolifération et la différenciation cellulaire. De cette façon, lorsque les cellules ont commencé à se différencier, les ADNc ont été transduites ou shRNA déjà exprimé. Pour la phase tardive de l'érythropoïèse terminale, Ter119 érythroblastes négatives ont été cultivées dans un milieu contenant de l'Epo immédiatement après la transduction. Par conséquent, on peut analyser les fonctions des gènes d'intérêt dans la phase tardive de l'érythropoïèse terminale. En résumé, une large application de ce système aiderait les fonctions des gènes disséquer à différents stades de l'érythropoïèse terminale.
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Protocol
Les expériences décrites dans ce protocole ont été réalisées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université Northwestern institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.
1 Préparation du milieu de culture
- Préparer la solution de fibronectine. Ajouter 1 ml d'eau à une fiole de la fibronectine humaine (1 mg). Laissez solution dans la culture de tissus capot pendant 30 minutes sans agitation. Transférer le liquide total à 50 ml de PBS pour obtenir une concentration finale de 20 pg / ml et bien mélanger doucement. Rendre la solution de fibronectine frais avant le revêtement de la plaque (voir ci-dessous).
- Préparer 50 ml de milieu sans Epo (milieu SCF). Combinez les ingrédients énumérés dans le tableau 1. Le milieu peut être conservé à 4 ° C pendant 1 mois quand fait frais.
- Préparer 50 ml de milieu contenant de l'Epo. Combinez les ingrédients énumérés dans le tableau 2. Le milieu peut être conservé à 4 ° C pendant 1 mois quand fait frais. 2. fibronectine plaque recouverte
- Ajouter 1 ml de solution de fibronectine à chaque puits d'une plaque à 6 puits (ou 0,5 ml à chaque puits d'une plaque à 12 puits). Laisser la plaque dans la culture de tissus capot pendant 1 heure.
- Rincer les puits avec de l'eau stérile et sécher à l'air deux fois la plaque.
- Enveloppez la plaque et enregistrer dans la chambre froide à 4 ° C.
- Préparation des cellules de foie fœtal total
- Sacrifiez le mousoi par inhalation de CO 2 et la dislocation cervicale. Pulvériser l'abdomen avec de l'éthanol à 70% pour la désinfection. Ouvrez l'abdomen avec dissection des ciseaux pour enlever l'utérus. Laver l'utérus en 1x PBS.
- Disséquer les foetus dans des conditions stériles en utilisant une hotte de culture de tissus et des outils à l'autoclave et laver 1x PBS.
- Disséquer les foies fœtaux des fœtus. Maintenir le corps du fœtus avec une pince, tirez doucement sur le foie fœtal (de couleur rose) à partir du corps avec un autre pince. Nettoyer le foie fœtal avec une pince pour enlever les tissus fibrotiques associées. Placez tous les foies fœtaux en frais 1x PBS contenant 10% de sérum de veau fœtal.
- Perturber mécaniquement le foie du fœtus par aspiration et refoulement.
- On filtre la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um dans un tube conique de 50 ml. Pellet les cellules à 800 xg pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de PBS avec 10% de FBS (environ 8 E13.5 foies fœtauxpar ml).
- Purification de Ter119 érythroblastes négatifs
- Bloquer les cellules avec de l'IgG de rat (0,2 mg / ml) sur de la glace pendant 15 min.
- Sans lavage ou centrifugation, ajouter un anticorps biotinylé anti-Ter119 à la suspension de cellules (1 ug / ml). Incuber pendant 15 min sur la glace.
- Laver à 1x PBS avec 10% de FBS (1:10) et centrifuger à 800 g pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de PBS avec 10% de FBS.
- Ajouter 75 ul streptavidine conjuguée avec des particules magnétiques et incuber pendant 10 minutes sur la glace.
- Ajouter le volume à 2,5 ml avec du PBS contenant 10% de FBS. Transférer la suspension cellulaire dans un 5 ml polypropylene tubes fond rond.
- Insérer le tube dans un appareil de tri cellulaire magnétique et incuber pendant 10 min. Ter119 cellules positives se fixeront sur le côté du tube. Les Ter119 seules érythroblastes négatifs resteront dans la suspension.
- Verser la suspension de cellules dans un nouveau 5 ml polypropylene tubes fond rond.
- Répétez les étapes 3.2.6 et 3.2.7 pour éliminer les cellules positives Ter119 résiduelle.
- Pellet les cellules à 800 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de PBS contenant 10% de FBS et compter les cellules vivantes avec du bleu Trypan.
- Plaque des cellules de foie foetal négatifs Ter119 purifiée à 3-5 x 10 5 / puits dans une plaque revêtue de fibronectine 12 puits (ajuster le nombre de cellules si vous utilisez une plaque différente).
- Ajouter polybrène à une concentration finale de 10 pg / ml pour faciliter la transduction virale. Spin infecter les cellules avec des lentivirus ou rétrovirus, ADNc codant ou shRNA, à 800 g pendant 1-1,5 heures à 37 ° C.
- Pour tester les fonctions des gènes dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale (Figure 1 pointillés).">
Culture des cellules transduites dans un milieu sans Epo (moyen SCF) pour 12 heures afin de permettre l'expression des gènes et de l'entretien de l'état progénitrices transduites. - Centrifuger les cellules à 800 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu contenant de l'Epo dans chaque puits d'une plaque à 12 puits.
- Après culture pendant 24 ou 48 heures, la récolte des cellules pour d'autres essais.
- fonctions des gènes de test à la fin du stade de l'érythropoïèse terminale (Figure 1 lignes pleines).
- Culture des cellules immédiatement à l'Epo milieu contenant une transduction.
- Après culture pendant 24 ou 48 heures, la récolte des cellules pour les autres essais.
- Lavez et remettre les cellules en PBS 1x. Récolte 2 x 10 5 cellules en culture pour l'analyse par cytométrie en flux.
- Incuberles cellules avec des anticorps conjugués à un fluorophore de 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Pour tester la différenciation, utilisez APC conjugué anti-CD71 et anti-PE Ter119 conjugué. Pour tester l'énucléation, utilisez Hoechst 33342 tache en plus des autres anticorps.
- Laver les cellules avec du PBS 1X. Remettre en suspension les cellules dans 0,5 ml de PBS contenant 1% de FBS et de l'iodure de propidium (PI) (1 pg / ml) pour colorer les cellules mortes et les exclure de l'analyse.
- Conduite flux d'analyse cytrometric. Analyser les cellules de contrôle de couleurs colorées et non colorées simples d'abord pour l'ajustement et la rémunération du cytomètre de flux.
3 Purification de foie fœtal érythroblastes
REMARQUE: Utilisez le foie du fœtus à partir de E13 à E15 chronométrés souris gravides (C57BL / 6). foies de E13.5 sont préférées pour optimiser le rendement de progéniteurs CFU-E. Pour obtenir des souris gravides chronométrés, 6 à 8 semaines les souris mâles et femelles ont été placées dans une cage (généralement un mâle avec une ou deux femelles). Bouchon vaginal femmes ont été vérifiés le lendemain matin afin de déterminer si l'accouplement a réussi. Le premier jour de la gestation était le jour après la prise a été trouvé.
4 transduction avec des virus ou ADNc codant shRNA
5. Culture des transduites Ter119 négatif souris foie fœtal érythroblastes
6. coloration des cellules cultivées foie fœtal pour l'analyse par cytométrie en flux
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Representative Results
La figure 1 présente les stratégies expérimentales. Le protocole est constitué de deux conditions indépendantes pour viser les fonctions des molécules de signalisation dans les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Ter119 négatifs érythroblastes de foie foetal ont été purifiés à partir de fœtus de souris E13.5. Analyse par cytométrie de flux de cellules érythroïdes fœtales du foie avant et après purification a montré que la purification a été efficace (Figures 2A et 2B). Pour le stade précoce de l'érythropoïèse terminale (Figure 1, lignes pointillées), après transduction virale, les cellules ont été cultivées dans un milieu sans Epo (moyen SCF) pendant 12 heures. Au cours de cette période, les cellules ont montré une différenciation minimale (figure 2C), sans apoptose significative observée dans les cellules transduites (GFP positif) (figure 3). Les cellules ont commencé à différencier après le transfert de l'Epo contenant du milieu (Figure 4 strong>), qui est similaire aux cellules cultivées dans un milieu contenant de l'Epo immédiatement après transduction (figure 1, lignes continues et Figure 5). Au cours de la culture de 2 jours dans de l'Epo contenant du milieu dans les deux méthodes, la plupart des cellules progénitrices érythroïdes (CD71 faible Ter119 bas) présentaient induction du récepteur de la transferrine (CD71) et Ter119 le jour 2 (CD71 haute Ter119 haut) (figure 4A et la figure 5A). Énucléation a eu lieu le jour 2, comme observé par Hoechst haute Ter119 élevés (érythroblastes) et Hoechst faible Ter119 élevés (réticulocytes) (figure 4B et la figure 5B). Il est à noter que les cellules immédiatement la culture dans l'Epo (ligne solide) a été relativement plus efficace pour la différenciation et l'énucléation de cellules cultivées d'abord dans le milieu SCF (ligne pointillée).
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Figure 1: Vue d'ensemble schématique de la stratégie expérimentale. Pointillée et les lignes pleines représentent les méthodes d'étude des molécules de signalisation dans les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale, respectivement.
Figure 2: Analyse des flux cytométrie de souris des cellules érythroïdes de foie foetal avant et après purification de Ter119 érythroblastes négatifs. (A) Total des cellules de foie foetal colorées avec Ter119 et CD71. Cellules négatives (B) purifiée Ter119 colorées avec Ter119 et CD71. (C) purifiées Ter119 cellules négatives après culture de 12 h dans un milieu SCF. Moyense cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Débit de l'analyse par cytométrie de l'apoptose après culture dans un milieu sans Epo (moyen SCF) pendant 12 heures. (AB) Les Ter119 érythroblastes négatifs ont été transduites avec des lentivirus de commande (A) ou de lentivirus codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) (B). Le pourcentage de cellules transduites GFP-positives a été présenté après 12 h de culture en milieu SCF. (CD) Analyse de l'apoptose dans la GFP négatif (C) et (D) à partir de cellules positives (B).
Figure 4 Débit analyse par cytométrie de différenciation et énucléation de l'erythrobla transductionsts cultivées dans un milieu SCF suivie par le milieu de l'Epo. (A) Dans la figure 3, les cellules GFP positives et négatives ont été bloqués pour l'analyse de la différenciation en utilisant CD71 et Ter119 après que les cellules ont été changées de milieu Epo et cultivées pendant une 48 heure supplémentaire. (B) Essai d'énucléation utilisant Hoechst et Ter119 du indiqué cellules après 48 heures dans le milieu de l'Epo.
Figure 5 Débit analyse par cytométrie de différenciation et de l'énucléation des érythroblastes transduites directement cultivées en milieu Epo. (A) Les cellules Ter119 négatifs ont été transduites avec lentivirus codant pour la GFP. Les cellules ont été immédiatement mises en culture dans un milieu Epo après transduction. Cellule d'analyse de la différenciation des cellules GFP positives et négatives a été effectuée en utilisant CD71 Ter119 et après 48 heures en culture. (B) Essai de énucléation deles cellules indiquées à l'aide de Hoechst et Ter119 après 48 heures de culture.
| Ingrédient | Quantité |
| IMDM | 41,385 ml |
| Sérum fœtal bovin (FBS, 15%) | 7,5 ml |
| b-mercaptoéthanol (10 -4 M) | 50 pi (10 -1 M stock en IMDM) |
| La pénicilline-streptomycine (1%) | 500 pl |
| Glutamine (2 mM) | 500 pl |
| Facteur de cellules souches (50 ng / ml) | 25 ul de 100 ng stock / ml |
| FLT3 ligand (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 pl de 50 ng stock / ml |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 pl de 100 ng stock / ml |
Tableau 1 Ingrédient fomoyen r SCF (de milieu sans Epo).
| Ingrédient | Quantité |
| IMDM | 36,3 ml |
| FBS (15%) | 7,5 ml |
| Albumine de sérum bovin (BSA, 10%) | 5 ml (10% actions dans IMDM) |
| L'insuline (10 mg / ml) | 50 pi de 4 ° C stocks |
| Holo-transferrine (200 mg / ml) | 200 pi (50 mg / ml dans l'eau, 20 ° C stock) |
| b-mercaptoéthanol (10 -4 M) | 50 pi (10 -1 M stock en IMDM) |
| La pénicilline-streptomycine (1%) | 500 pl |
| 2 mM de glutamine | 500 pl |
| Epo (2 U / ml) | 33 pi (3 000 U / ml stock) |
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Discussion
Nous présentons ici un système unique d'analyser chronologiquement fœtus de souris érythropoïèse terminale du foie. Grâce à l'application de différentes conditions de culture, nous avons disséqué avec succès l'érythropoïèse terminale en début et en fin. Ceci est particulièrement important pour déterminer les mécanismes de gènes ayant des fonctions multiples. Par exemple, GTPases Rac jouent un rôle important dans les différentes étapes de l'érythropoïèse terminale. L'inhibition de GTPases Rac dans le stade précoce de la différenciation des influences de l'érythropoïèse terminale et la prolifération cellulaire. D'autre part, l'inhibition de l'activité des GTPases Rac à la fin du stade de la borne blocs de l'érythropoïèse énucléation sans affecter la différenciation cellulaire, la prolifération, la survie ou 13.
Plusieurs étapes importantes dans ce protocole doivent être gardés à l'esprit. Tout d'abord, les foies fœtaux de souris E13.5 sont préférés pour la purification de cellules négatives Ter119. Embryons âgés peuvent être utilisés, mais la proportisur des progéniteurs sur les cellules de foie foetal totale sera faible. Deuxièmement, il est important d'utiliser faible BSA d'endotoxines en milieu Epo, car il est essentiel pour l'énucléation, bien que le mécanisme n'est pas clair. Troisièmement, bien que la fibronectine a été signalé comme étant importante pour l'érythropoïèse 15, nous avons trouvé que l'utilisation de la fibronectine plaque revêtue est facultative. Elle n'affecte pas la prolifération cellulaire, la différenciation ou l'énucléation dans notre système. Cependant, la fibronectine peut être utile pour les cellules de se fixer à la plaque qui pourraient être importantes pour certaines applications telles que l'immunomarquage. Quatrièmement, un petit pourcentage de réticulocytes ou érythroblastes à un stade avancé peut perdre le signal de la GFP qui a été réalisée avec les cellules transduites. Sinon, nous utilisons CD4 humaine comme un marqueur pour suivre les cellules transduites. Enfin, les rapports précédents ont recommandé le retrait de l'érythropoïétine de la culture le jour 1 11. Nous avons constaté que ce n'était pas nécessaire de le faire car il n'y avait pas de différence significative sur la celluledifférenciation, la prolifération, ou énucléation avec ou sans suppression de l'érythropoïétine. Au contraire, le changement de milieu peut provoquer une perte de cellule.
En utilisant la même stratégie, nous avons récemment découvert plus de 30 gènes qui jouent de nouvelles fonctions dans les différentes étapes de l'érythropoïèse terminale (Zhao et al., Résultats non publiés). Comme GTPases Rac, beaucoup de ces gènes jouent deux fonctions à des stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Cela indique que les voies de signalisation dans l'érythropoïèse terminale sont étroitement liés. Les gènes impliqués dans le remodelage du cytosquelette d'actine et la condensation nucléaire sont celles qui ont tendance à jouer deux fonctions en raison des rôles essentiels de ces voies de signalisation dans l'ensemble de l'érythropoïèse terminale. D'autre part, les gènes impliqués dans les voies telles que la synthèse de l'hème et de la génération de membrane plasmique spécifique de la lignée érythrocytaire ont tendance à être plus restreint dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale 16,17. Bien there sont certaines limites de cette stratégie expérimentale, comme un rendement relativement faible d'infection par rapport à la transduction de lignées cellulaires, et la difficulté de faire tomber des protéines ayant une longue demi-vie, nous recommandons une pratique courante d'utiliser notre système compte tenu de l'importance de disséquer les fonctions des gènes à différents stades de l'érythropoïèse terminale. De plus, cette stratégie expérimentale peut également être utilisé pour d'autres applications. Par exemple, en utilisant la condition milieu de culture SCF, les gènes qui sont impliqués dans le maintien de propriétés de cellules souches telles que l'auto-renouvellement ou la différenciation ont pu être analysés. Utilisation de la méthode d'analyse de l'érythropoïèse de stade tardif, on peut également déterminer la fonction de gènes qui pourraient être impliqués dans autophagy pour l'élimination des organites.
De façon générale, cette stratégie expérimentale peut être appliquée à la fonction de recherche d'autres systèmes tels que mégacaryopoïèse hématopoïétiques et la myélopoïèse. L'application réussie de ce stratégie serait également révéler la face cachée des mécanismes moléculaires de gènes spécifiques dans les différents stades de développement des cellules sanguines.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le NIH R00HL102154, et un American Society of Hematology prix de savant à P Ji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
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