Summary
Vi presenterer en in vitro mus fosterets lever erytroblast kultur system som dissekerer de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. Dette systemet forenkler funksjonell analyse av spesifikke gener i ulike utviklingsstadier.
Abstract
Erythropoiesis innebærer en dynamisk prosess som starter med engasjerte erythroid burst forming units (BFU-Es) etterfulgt av raskt delende erythroid kolonidannende enheter (CFU-Es). Etter CFU-Es, cellene er morfologisk gjenkjennelig og generelt betegnes terminal erytroblaster. En av utfordringene for studiet av terminal erythropoiesis er mangelen på eksperimentelle tilnærminger å dissekere genfunksjoner i en kronologisk måte. I denne protokollen, beskriver vi en unik strategi for å bestemme genfunksjoner i de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. I dette systemet, ble mus fosterets lever TER119 (moden erythroid celle markør) negative erytroblaster renset og omformet med eksogene uttrykk for cDNAs eller små hårnål RNA (shRNAs) for genene av interesse. Cellene ble deretter dyrket i medium inneholdende vekst andre enn erytropoietin (EPO) for å opprettholde sin stamcelle stadium i 12 timer samtidig som de eksogene cDNA eller shRNAs faktorerå uttrykke. Cellene ble endret til Epo medium etter 12 timer for å indusere celledifferensiering og proliferasjon mens de eksogene genetiske materialet allerede var uttrykt. Denne protokollen forenkler analyse av genfunksjoner i den tidlige fasen av terminal erythropoiesis. Å studere sent stadium terminal erythropoiesis ble cellene umiddelbart dyrket i Epo medium etter transduksjon. På denne måten ble cellene allerede er differensiert til sent stadium av terminal erytropoese når de transduserte genetiske materialer ble uttrykt. Vi anbefaler en allmenngjøring av denne strategien som ville bidra til å forstå detaljerte genet funksjoner i ulike stadier av terminal erythropoiesis.
Introduction
Erythropoiesis er prosessen med differensiering av multipotente blodkreft stamceller til modne erytrocytter. Dette trinnvis prosess inkluderer dannelsen av engasjerte erythroid burst forming units (BFU-ES), raskt dele erythroide kolonidannende enheter (CFU-ES), og morfologisk gjenkjennelige erytroblaster 1,2. Terminal erythropoiesis fra CFU-E stamceller innebærer sekvensiell erytropoietin-avhengige og uavhengige etapper 2,3. I det tidlige stadium av terminal erytropoese Erytropoietin (EPO) binder seg til sin reseptor på celleoverflaten, og induserer en serie av nedstrøms signalveier som hindrer celle apoptose og fremme hurtig celledelinger og genekspresjon 1,4. På slutten av fasen av terminal erythropoiesis, erytroblaster gjennomgå terminal cellesyklus exit, kromatin og nucleus kondens, og ekstrudering av de svært kondensert atomkjerner 5.
Vår forståelse av terminalerythropoiesis har blitt mye bedre de siste tiårene, noe som i stor grad skyldes vellykket bruk av flere in vitro og in vivo musemodeller 6-9. Blant disse modellene, in vitro kultur musefosterlever erytroblaster gir mange fordeler, inkludert den enkle celle rensing, rask spredning og differensiering, og en nærmere etterligner å menneskelige erythropoiesis 10,11. I dette system kan et stort antall erytroide progenitorceller mus føtale lever fra lett bli isolert ved den enkelt trinn rensing av TER119 (en markør for den modne erytroide celler) negative erytroblaster. I løpet av to-dagers kultur av erytroblaster, kan differensiering av disse cellene bli overvåket av en strømningscytometrisk analyse basert på overflaten ekspresjon av transferrin-reseptoren (CD71) og 12 TER119 antigen. I tillegg kan utskraping av de terminalt differensierings erytroblaster bli detektert av en DNA trakter (Hoechst 33342) 13.. Videre, de rensede stamceller kan bli genetisk modifisert ved eksogen ekspresjon av cDNA eller små hårnål RNA (shRNAs) for de gener som er av interesse, noe som letter den mekanistiske undersøkelser av funksjoner av genekspresjon på erytropoese 11,13,14.
På den annen side, kan den raske celleveksthastighet være et tveegget sverd siden det er vanskelig å karakterisere genfunksjoner i forskjellige stadier av terminal erytropoese. I de fleste tilfeller er det vanskelig å bestemme om et bestemt gen Funksjonene i den tidlige fasen av terminal erytropoese siden av den tiden cDNA eller shRNAs uttrykt, cellene allerede passert tidlig stadium. For å løse dette problemet, har vi utviklet et unikt system for å dissekere de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. For den tidlige fasen av terminal erythropoiesis, genmodifiserte TER119 negative erytroblaster ble dyrket i Epo-free medium, men inneholder stamcellefaktor (SCF), IL-6 og FLT3ligand å opprettholde sin stamfar status og la transduserte cDNAs eller shRNA til uttrykk 13. Cellene ble endret til Epo holdige medium etter 12 timer for å indusere celleproliferasjon og differensiering. På denne måten, når cellene begynte å skille de transduserte cDNA eller shRNAs ble allerede uttrykt. For sent stadium av terminal erythropoiesis, TER119 negative erytroblaster ble dyrket i Epo inneholder medium umiddelbart etter transduksjon. Derfor kan man analysere funksjoner av gener av interesse i sent stadium av terminal erythropoiesis. Oppsummert, vil en bred anvendelse av dette systemet hjelpe dissekere genfunksjoner i forskjellige stadier av terminal erythropoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene som er beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med de retningslinjer og forskrifter fastsatt av Northwestern University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Utarbeidelse av Kultur Medium
- Forbered fibronectin løsning. Tilsett 1 ml vann til en ampulle med humant fibronektin (1 mg). La løsningen i vevskultur hette i 30 minutter uten omrøring. Overfør den samlede væske til 50 ml PBS for å lage en endelig konsentrasjon på 20 pg / ml og forsiktig bland godt. Gjør løsningen fibronektin friskt før belegging av platen (se nedenfor).
- Forbered 50 ml Epo fritt medium (SCF medium). Kombiner de oppførte bestanddeler i Tabell 1. Mediet kan lagres ved 4 ° C i 1 måned når fersk.
- Forbered 50 ml Epo holdig medium. Kombiner de oppførte bestanddeler i tabell 2. Mediet kan lagres ved 4 ° C i 1 måned når fersk. 2. Fibronektin belagt plate
- Tilsett 1 ml fibronektin-løsning til hver brønn av en 6-brønns plate (eller 0,5 ml i hver brønn av en 12 brønns plate). La platen i vevskultur hette i 1 time.
- Vask brønnene to ganger med sterilt vann og lufttørker plate.
- Pakk plate og lagre i kjølerommet ved 4 ° C.
- Utarbeidelse av Total Fetal leverceller
- Ofre mouSE av CO 2 innånding og halshugging. Spray magen med 70% etanol for desinfeksjon. Åpne buken med dissekere saks for å fjerne livmor. Vask livmoren i 1x PBS.
- Dissekere fostrene under sterile forhold ved hjelp av en vev kultur hette og autoklaveres verktøy og vask i 1x PBS.
- Dissekere fosterets lever fra fostre. Hold kroppen til fosteret med en pinsett, dra forsiktig fosterets lever (rosa i fargen) vekk fra kroppen med en annen tang. Rengjør fosterets lever med pinsett for å fjerne de tilknyttede fibrotic vev. Legg alle føtale lever i frisk 1x PBS inneholdende 10% føtalt bovint serum.
- Mekanisk forstyrre fosterets lever ved å pipettere opp og ned.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom et 40 mikrometer celle sil inn i en 50 ml konisk rør. Pelletere cellene ved 800 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1 ml PBS med 10% FBS (ca. 8 E13.5 føtal leverper ml).
- Rensing av TER119 Negative erytroblaster
- Blokker cellene med rotte-IgG (0,2 mg / ml) på is i 15 min.
- Uten vasking, eller sentrifugering, tilsett biotinylert anti-TER119 antistoff til cellesuspensjonen (1 pg / ml). Inkuber i 15 minutter på isen.
- Vask 1x i PBS med 10% FBS (1:10) og sentrifuger ved 800 xg i 5 min. Resuspender cellene i 1 ml PBS med 10% FBS.
- Legg 75 mL streptavidin konjugert med magnetiske partikler og inkuberes i 10 minutter på isen.
- Legg volumet til 2,5 ml med PBS inneholdende 10% FBS. Overfør cellesuspensjonen til en 5 ml polypropylen rundbunnet rør.
- Før røret inn i et magnetisk celle-sorteringsapparat og inkuberes i 10 min. TER119 positive celler vil feste seg til siden av røret. Den løse TER119 negative erytroblaster vil forbli i suspensjon.
- Hell cellesuspensjonen inn i en ny 5 ml polypropylen rundbunnet rør.
- Gjenta trinn 3.2.6 og 3.2.7 for å fjerne de gjenværende TER119 positive celler.
- Pelletere cellene ved 800 xg i 5 min. Aspirer av supernatanten. Resuspender cellene i 1 ml PBS inneholdende 10% FBS og telle levende celler med Trypan blå.
- Tallerken renset TER119 negative føtale leverceller på 3-5 x 10 5 / brønn i en fibronektin belagt 12-brønns plate (justere celle nummer hvis du bruker en annen plate).
- Legg polybren til en sluttkonsentrasjon på 10 mikrogram / ml for å lette viral transduksjon. Spin infisere cellene med eller lentivirus, retrovirus som koder cDNA eller shRNA, ved 800 xg i 1-1,5 timer ved 37 ° C.
- For å teste genfunksjoner i den tidlige fasen av terminal erytropoiese (Figur 1 stiplede linjer).">
Kultur de transduserte celler i Epo fritt medium (SCF medium) i 12 timer for å tillate ekspresjon av de transduserte gener og vedlikehold av progenitor tilstand. - Sentrifuger cellene ved 800 xg i 5 min. Aspirer supernatanten. Resuspender cellene i 1 ml Epo inneholdende medium i hver brønn av en 12-brønns plate.
- Etter at kulturen i 24 eller 48 timer, høste cellene for ytterligere analyser.
- Test genfunksjoner i sent stadium av erytropoese terminal (figur 1 med heltrukne linjer).
- Kultur transduced celler umiddelbart i Epo holdig medium.
- Etter kultur for 24 eller 48 timer, høste celler for de videre analyser.
- Vask og resuspender cellene i 1x PBS. Innhøsting 2 x 10 5 dyrkede celler for flowcytometrisk analyse.
- Inkubercellene med fluoroforen-konjugerte antistoffer til 20 min ved romtemperatur i mørke. For å teste differensiering, bruker APC konjugert anti-CD71 og PE-konjugert anti-TER119. For å teste enucleation, bruker Hoechst 33342 flekk i tillegg til de andre antistoffer.
- Vask cellene med 1x PBS. Resuspender cellene i 0,5 ml PBS inneholdende 1% FBS og propidium jodid (PI) (1 mikrogram / ml) for å farge døde celler og inkluderer dem fra analysen.
- Conduct flyt cytrometric analyse. Analyser ensfargede flekker og ufargede kontrollceller først for justering og erstatning av strømningscytometeret.
3. Rensing av føtale lever erytroblaster
MERK: Bruk fosterets lever fra E13 til E15 timet drektige mus (C57BL / 6). E13.5 lever er å foretrekke for å maksimere utbyttet av CFU-E stamfedre. For å oppnå de tidsbestemte gravide mus ble 6 til 8 uker gamle hann og hunn-mus plassert i en merd (vanligvis en eneste mann med en eller to hunner). Kvinnelige vaginal plugger ble sjekket neste morgen for å finne ut om parring var vellykket. Den første dagen av svangerskapet var dagen etter at pluggen ble funnet.
4. Transduksjon med virus som koder cDNA eller shRNA
5. Kultur av transduserte TER119 Negativ Muse Fetal Lever erytroblaster
6. farging av Cultured Fetal leverceller for flowcytometrisk analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 skisserer de eksperimentelle strategier. Protokollen består av to selvstendige vilkår for målretting funksjonene til signalmolekyler i de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. TER119 negative føtale lever erytroblaster ble renset fra E13.5 mus fosteret. Flowcytometrisk analyse av føtale lever erytroide celler før og etter rensing viste at rensingen var effektiv (figurene 2A og 2B). For tidlig stadium av erytropoese terminalen (Figur 1, stiplede linjer), etter viral transduksjon, cellene ble dyrket i Epo-fritt medium (SCF medium) i 12 timer. I løpet av denne perioden ble cellene viste minimal differensiering (figur 2C) med ingen betydelig apoptose observeres i de transduserte celler (GFP positive) (figur 3). Cellene begynte å skille etter overføring til Epo-inneholdende medium (Figur 4 sterk>), som var lik de celler dyrket i Epo holdig medium umiddelbart etter transduksjon (Figur 1, heltrukne linjer, og figur 5). I løpet av 2 dagers kultur i Epo inneholder medium i begge metodene, de fleste av erythroid stamceller (CD71 lav TER119 lav) utstilt induksjon av transferrin reseptor (CD71) og TER119 på dag 2 (CD71 høy TER119 høy) (figur 4A og figur 5A). Enucleation skjedde på dag 2, som observert av Hoechst høy TER119 høy (erytroblaster) og Hoechst lav TER119 høy (retikulocytter) (Figur 4B og Figur 5B). Det er bemerkelsesverdig at cellene umiddelbart kultur i Epo (heltrukket linje) var forholdsvis mer effektiv for differensiering og enucleation enn celler dyrket først i SCF medium (stiplet linje).
gur 1 "fo: content-width =" 5in "width =" 500 "src =" / filer / Ftp_upload / 51894 / 51894fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk oversikt over den eksperimentelle strategi. Stiplet og heltrukne linjer representerer metoder for å studere signalmolekyler i de tidlige og sene stadier av terminal erytropoese hhv.
Figur 2. flowcytometrisk analyse av mus føtale lever erythroide cellene før og etter rensing av TER119 negative erytroblaster. (A) Totalt antall føtale leverceller farget med TER119 og CD71. (B) Renset TER119 negative celler farget med TER119 og CD71. (C) Purified TER119 negative celler etter 12 timers kultur i SCF medium. Please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. flowcytometrisk analyse av apoptose etter dyrkning i Epo-fritt medium (SCF medium) i 12 timer. (AB) De TER119 negative erytroblaster ble omformet med kontroll lentiviruses (A) eller lentiviruses koder grønt fluorescerende protein (GFP) (B). Prosentandelen av GFP positive transduserte celler ble presentert etter 12 hr av kultur i SCF medium. (CD) Analyse av apoptose i GFP negativ (C) og positive (D) celler fra (B).
Figur 4. flowcytometrisk analyse av differensiering og enucleation av transduced erythroblamx dyrket i SCF medium etterfulgt av Epo medium. (A) Som i figur 3, GFP negative og positive celler ble gated for differensiering analyse ved hjelp av CD71 og TER119 etter at cellene ble endret til Epo medium og dyrket i ytterligere 48 timer (B). Enucleation assay ved bruk av Hoechst og TER119 av den indikerte celler etter 48 timer i Epo medium.
Figur 5. flowcytometrisk analyse av differensiering og enucleation av de transduserte erytroblaster direkte dyrket i Epo medium. (A) TER119 negative celler ble omformet med lentiviruses koder GFP. Cellene ble umiddelbart dyrket i Epo medium etter transduksjon. Celledifferensiering analyse av GFP negative og positive celler ble utført ved hjelp av CD71 og TER119 etter 48 timer på kultur. (B) utskraping av assayde angitte celler ved hjelp av Hoechst og TER119 etter 48 timer på kultur.
| Ingrediens | Antall |
| IMDM | 41,385 ml |
| Føtalt bovint serum (FBS, 15%) | 7,5 ml |
| b-merkaptoetanol (10 -4 M) | 50 mL (10 -1 M lager i IMDM) |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | 500 mL |
| Glutamin (2 mM) | 500 mL |
| Stem Cell Factor (50 ng / ml) | 25 pl fra 100 ng / ml stock |
| FLT3 Ligand (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 ul fra 50 ng / ml stock |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 ul fra 100 ng / ml stock |
Tabell 1. Ingrediens for SCF medium (Epo fritt medium).
| Ingrediens | Antall |
| IMDM | 36,3 ml |
| FBS (15%) | 7,5 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA, 10%) | 5 ml (10% aksjer i IMDM) |
| Insulin (10 mg / ml) | 50 mikroliter fra 4 ° C lager |
| Holo-transferrin (200 mg / ml) | 200 ul (50 mg / ml i vann, 20 ° C lager) |
| b-merkaptoetanol (10 -4 M) | 50 mL (10 -1 M lager i IMDM) |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | 500 mL |
| 2 mM Glutamin | 500 mL |
| Epo (2 U / ml) | 33 mL (3000 U / ml lager) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi et unikt system for å kronologisk analysere mus fosterets lever terminal erythropoiesis. Gjennom anvendelse av ulike oppdrettsbetingelser, vi lykkes dissekert terminal erythropoiesis i tidlige og sene stadier. Dette er spesielt viktig for å bestemme mekanismene for gener med flere funksjoner. For eksempel Rac GTPases spiller viktige roller i ulike stadier av terminal erythropoiesis. Hemming av Rac GTPases i den tidlige fasen av terminal erytropoiese påvirkninger celledifferensiering og spredning. På den annen side, hemmingen av aktiviteten Rac GTPases i sent stadium av terminal erytropoiese blokker enucleation uten å påvirke celle differensiering, proliferasjon eller overlevelse 13.
Flere viktige skritt i denne protokollen bør holdes i bakhodet. Først blir E13.5 musefosterlever foretrukket for rensingen av TER119 negative celler. Eldre embryoer kan brukes, men det proportipå av forfedrene Av det totale føtale leverceller vil være lav. For det andre er det viktig å bruke lave endotoksin BSA i Epo medium, siden det er avgjørende for utskraping, men mekanismen er ikke klart. Tredje, selv om fibronektin ble rapportert å være viktig for erythropoiesis 15, fant vi at bruk av fibronektin belagt plate var valgfritt. Det påvirker ikke celledeling, differensiering, eller enucleation i vårt system. Imidlertid kan fibronektin være nyttig for cellene å feste til platen som kan være viktig for enkelte applikasjoner som farging. Fjerde, kan en liten prosentandel av retikulocytter eller sent stadium erytroblaster miste GFP signal som ble gjennomført med transduced celler. Alternativt kan vi bruke menneskelige CD4 som en markør for å spore transduserte celler. Endelig tidligere rapporter anbefales fjerning av erytropoietin fra kulturen på dag 1 11. Vi fant at det ikke var nødvendig å gjøre dette, siden det ikke var noen signifikant forskjell på celledifferensiering, proliferasjon eller enucleation med eller uten fjerning av erytropoietin. Tvert imot, kan endring av medium forårsake celletap.
Ved bruk av samme strategi, vi nylig oppdaget mer enn 30 gener som spiller nye funksjoner i ulike stadier av terminal erytropoiese (Zhao et al., Upubliserte resultater). Som Rac GTPases, mange av disse genene spiller doble funksjoner i både tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. Dette indikerer at signalveier i terminal erythropoiesis er tett sammenvevd. Gener involvert i aktin cytoskjelettet ombygging og atom kondensasjon er de som har en tendens til å spille to funksjoner på grunn av de kritiske roller av disse signalveier gjennom terminal erytropoese. På den annen side, gener som er involvert i banene som heme syntese og generering av erythroid spesifikke plasmamembranen har en tendens til å være mer begrenset i det tidlige stadium av terminal erytropoese 16,17. Selv there er visse begrensninger i denne eksperimentelle strategi, for eksempel relativt lav infeksjon effektivitet sammenlignet med transduksjon av cellelinjer, og vanskelighetene med å banke ned proteiner med lang halveringstid, anbefaler vi en rutine praksis å bruke vårt system gitt betydningen av dissekere genfunksjoner i forskjellige stadier av terminal erytropoese. I tillegg kan denne eksperimentelle strategi også brukes til andre formål. For eksempel bruke SCF medium kultur tilstand, gener som er involvert i vedlikehold av stamcelleegenskaper som selvfornyelse eller differensiering kunne analyseres. Ved hjelp av fremgangsmåten for å analysere sent stadium erytropoese, kunne man også fastslå funksjon av gener som kan være involvert i autophagy for fjerning av organeller.
Generelt kan denne eksperimentelle strategi anvendes på den funksjonelle undersøkelse av andre hematopoetiske systemer som megakaryopoese og myelopoiesis. Vellykket anvendelse av denne strategy vil også avsløre den skjulte side av de molekylære mekanismer av spesifikke gener i forskjellige utviklingsstadier av blodceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH R00HL102154, og en American Society of Hematology lærd prisen til P Ji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J.
