Summary
Presentamos un ratón sistema de cultivo in vitro fetal eritroblasto hígado que disecciona las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Este sistema facilita el análisis funcional de genes específicos en diferentes etapas de desarrollo.
Abstract
La eritropoyesis implica un proceso dinámico que comienza con unidades de ráfaga eritroides comprometidos formación (BFU-Es), seguido de rápida división de colonias eritroides unidades (UFC-E). Después de CFU-E, las células son morfológicamente reconocibles y generalmente denominado eritroblastos terminales. Uno de los retos para el estudio de la eritropoyesis de terminal es la falta de enfoques experimentales para diseccionar las funciones de genes de manera cronológica. En este protocolo, se describe una estrategia única para determinar las funciones de genes en las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. En este sistema, el ratón TER119 hígado fetal (marcador de células eritroides maduro) eritroblastos negativos fueron purificados y transducidas con la expresión exógena de los ADNc o pequeños ARN de horquilla (shRNAs) para los genes de interés. Las células se cultivaron posteriormente en medio que contiene factores de crecimiento distintos de eritropoyetina (Epo) para mantener su etapa progenitor durante 12 horas al tiempo que permite los ADNc exógenos o shRNAsexpresar. Las células se cambiaron a medio Epo después de 12 horas para inducir la diferenciación celular y la proliferación, mientras que los materiales genéticos exógenos ya se expresaron. Este protocolo facilita el análisis de las funciones de genes en la etapa temprana de la eritropoyesis terminal. Para estudiar finales de la eritropoyesis terminal de etapa, las células se cultivaron inmediatamente en un medio de Epo después de la transducción. De esta manera, las células ya se diferenciaron a la etapa tardía de la eritropoyesis terminal cuando se expresaron los materiales genéticos transducidas. Se recomienda una aplicación general de esta estrategia que ayudaría a entender las funciones de genes detalladas en las diferentes etapas de la eritropoyesis terminal.
Introduction
La eritropoyesis es el proceso de diferenciación de células madre hematopoyéticas multipotentes a eritrocitos maduros. Este proceso por etapas incluye la formación de unidades de ráfaga eritroides comprometidos de formación (BFU-ES), las unidades que se dividen rápidamente eritroides formadoras de colonias (CFU-ES), y morfológicamente reconocibles eritroblastos 1,2. Eritropoyesis Terminal de células progenitoras CFU-E implica eritropoyetina dependiente secuencial etapas independientes y 2,3. En la etapa temprana de la eritropoyesis terminal, eritropoyetina (EPO) se une a su receptor en la superficie celular e induce una serie de vías de señalización corriente abajo que impiden la apoptosis celular y promueven divisiones celulares rápidas y expresión génica 1,4. En la etapa tardía de la eritropoyesis terminal, eritroblastos se someten a la salida del ciclo celular terminal, y la condensación de la cromatina núcleo, y la extrusión de los núcleos altamente condensados 5.
Nuestra comprensión de la terminaleritropoyesis ha mejorado mucho en las últimas décadas, que es en gran parte debido a la utilización con éxito de varios in vitro e in vivo en modelos de ratones de 6-9. Entre estos modelos, el cultivo in vitro de ratón fetal eritroblastos hígado proporciona muchas ventajas, incluyendo la facilidad de purificación celular, proliferación y diferenciación rápida, y un cerrador imitan a la eritropoyesis humana 10,11. En este sistema, un gran número de células progenitoras eritroides a partir de hígados fetales de ratón pueden ser fácilmente aislados por la purificación solo paso de TER119 (un marcador para las células eritroides maduras) eritroblastos negativos. Durante el cultivo de dos días de los eritroblastos, la diferenciación de estas células puede ser monitoreado por un análisis de citometría de flujo basado en la expresión de superficie de receptor de transferrina (CD71) y el antígeno de TER119 12. Además, la enucleación de los eritroblastos de diferenciación terminal puede ser detectada por un fabricante de ADN (Hoechst 33342) 13. Además, los progenitores purificados se pueden modificar genéticamente por la expresión exógena de ADNc o pequeños ARN de horquilla (shRNAs) para los genes de interés, lo que facilita los estudios mecanísticos de las funciones de la expresión génica en la eritropoyesis 11,13,14.
Por otra parte, la tasa de crecimiento celular rápido puede ser una espada de doble filo, ya que es difícil de caracterizar las funciones de genes en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal. En la mayoría de los casos, es difícil determinar si un funciones de genes específicos en la etapa temprana de la eritropoyesis desde el terminal en el momento en el ADNc o shRNAs expresaron, las células ya han pasado la etapa temprana. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un sistema único para diseccionar las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Para la etapa temprana de la eritropoyesis terminal, modificados genéticamente Ter119 eritroblastos negativos fueron cultivadas en medio libre de Epo-pero que contiene el factor de células madre (SCF), IL-6 y FLT3ligando para mantener su estado progenitor y deje los ADNc transducidas o shRNA de expresión 13. Las células se cambiaron a medio que contiene Epo después de 12 horas para inducir la proliferación y diferenciación celular. De esta manera, cuando las células empezaron a diferenciar, los ADNc fueron transducidas o shRNAs ya expresados. Para la etapa tardía de la eritropoyesis terminal, Ter119 eritroblastos negativos Epo fueron cultivadas en medio que contiene inmediatamente después de la transducción. Por lo tanto, se puede analizar las funciones de los genes de interés en la etapa tardía de la eritropoyesis terminal. En resumen, una amplia aplicación de este sistema ayudaría a las funciones de genes Dissect en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal.
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Protocol
Los experimentos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad Northwestern Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1 Preparación del Medio de Cultivo
- Prepare la solución de fibronectina. Añadir 1 ml de agua a un vial de fibronectina humana (1 mg). Deje la solución en la campana de cultivo de tejido durante 30 minutos sin agitación. Transferir el líquido total a 50 ml de PBS para hacer una concentración final de 20 mg / ml y mezclar suavemente también. Hacer la solución de fibronectina fresco antes de recubrir la placa (ver más abajo).
- Preparar 50 ml de medio libre de Epo (medio SCF). Combinar los ingredientes enumerados en la Tabla 1. El medio se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes cuando recién hecho.
- Preparar 50 ml de medio que contiene Epo. Combinar los ingredientes enumerados en la Tabla 2. El medio se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes cuando recién hecho. 2. fibronectina placa recubierta
- Añadir 1 ml de solución de fibronectina a cada pocillo de una placa de 6 pocillos (o 0,5 ml a cada pocillo de una placa de 12 pocillos). Deja la placa en la campana de cultivo de tejido durante 1 hora.
- Enjuague pozos con agua estéril dos veces y secar la placa.
- Envuelva la placa y guardar en la cámara frigorífica a 4 ° C.
- Preparación de las células totales de hígado fetal
- Sacrificar el mouse por inhalación de CO2 y dislocación cervical. Pulverizar el abdomen con etanol al 70% para la desinfección. Abra el abdomen con unas tijeras de disección para extraer el útero. Lave el útero en 1x PBS.
- Diseccionar los fetos en condiciones estériles utilizando una campana de cultivo de tejidos y herramientas tratados en autoclave y lavar en PBS 1x.
- Diseccionar los hígados fetales de los fetos. Sostenga el cuerpo del feto con una pinzas, tire suavemente el hígado fetal (de color rosa) lejos del cuerpo con otros fórceps. Limpiar el hígado fetal con las pinzas para quitar los tejidos fibróticos asociados. Coloque todos los hígados fetales en 1x PBS fresco que contenía suero bovino fetal al 10%.
- Mecánicamente interrumpir hígados fetales pipeteando arriba y abajo.
- Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 m en un tubo cónico de 50 ml. Sedimentar las células a 800 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de PBS con 10% de FBS (aproximadamente 8 E13.5 hígados fetalespor ml).
- Purificación de Ter119 Eritroblastos negativos
- Bloquear las células con IgG de rata (0,2 mg / ml) en hielo durante 15 min.
- Sin lavado o centrifugación, añadir anticuerpos anti-TER119 biotinilado a la suspensión celular (1 g / ml). Incubar durante 15 min en hielo.
- Lavar en 1x PBS con 10% de FBS (01:10) y se centrifuga a 800 xg durante 5 min. Resuspender las células en 1 ml de PBS con 10% de FBS.
- Añadir 75 l estreptavidina conjugada con partículas magnéticas y se incuba durante 10 minutos en hielo.
- Añadir el volumen a 2,5 ml con PBS que contenía 10% de FBS. Transferir la suspensión celular en un polipropileno de 5 ml ronda tubo inferior.
- Inserte el tubo en un aparato de clasificación de células magnéticas y se incuba durante 10 min. Ter119 células positivas se unirán al lado del tubo. Los eritroblastos negativos Ter119 unattached permanecerán en la suspensión.
- Verter la suspensión de células en un nuevo polipropileno de 5 ml ronda tubo inferior.
- Repetir los pasos 3.2.6 y 3.2.7 para eliminar las células positivas Ter119 residual.
- Sedimentar las células a 800 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de PBS que contenía 10% de FBS y contar células vivas con azul de tripano.
- Placa de las células hepáticas fetales negativos Ter119 purificada a 3-5 x 10 5 / pocillo en una fibronectina recubierto placa de 12 pocillos (ajustar el número de células si se utiliza una placa diferente).
- Añadir polibreno a una concentración final de 10 mg / ml para facilitar la transducción viral. Girar infectar las células con lentivirus o retrovirus, ADNc codificación o shRNA, a 800 xg durante 1-1,5 horas a 37 ° C.
- Para probar las funciones de genes en la etapa temprana de la eritropoyesis terminal (Figura 1 líneas discontinuas).">
Cultivar las células transducidas en medio libre de Epo (medio SCF) durante 12 horas para permitir la expresión de los genes y el mantenimiento del estado progenitor transducidas. - Centrifugar las células a 800 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de Epo que contenían medio en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
- Después del cultivo durante 24 o 48 horas, recoger las células para ensayos adicionales.
- Funciones de los genes de prueba en la etapa tardía de la eritropoyesis terminal (Figura 1 líneas continuas).
- Cultivar las células transducidas inmediatamente en Epo contiene medio.
- Después del cultivo durante 24 o 48 horas, recoger las células de los ensayos adicionales.
- Lavar y resuspender las células en 1x PBS. Cosecha 2 x 10 5 células cultivadas para el análisis de citometría de flujo.
- Incubarlas células con anticuerpos fluoróforo conjugado durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Para probar la diferenciación, utilizar APC conjugado anti-CD71 PE y anti-TER119 conjugado. Para probar la enucleación, usar Hoechst 33342 tinción además de los otros anticuerpos.
- Lavar las células con PBS 1x. Resuspender las células en 0,5 ml de PBS que contenía 1% de FBS y yoduro de propidio (PI) (1 mg / ml) para teñir las células muertas y excluirlos del análisis.
- Flujo de Conducta análisis cytrometric. Analice las células de control individuales de color teñido y sin teñir primero para el ajuste y compensación del citómetro de flujo.
3. Purificación del Hígado Fetal Eritroblastos
NOTA: Use el hígado fetal de E13 a E15 cronometrados ratones preñados (C57BL / 6). Se prefieren los hígados E13.5 para maximizar el rendimiento de CFU-E progenitores. Para obtener los ratones preñados cronometrados, de 6 a 8 semanas de edad ratones machos y hembras fueron colocados en una jaula (generalmente un macho con una o dos hembras). Se verificaron tapones vaginales hembra a la mañana siguiente para determinar si el apareamiento tuvo éxito. El primer día de la gestación fue el día después de que se encontró el enchufe.
4. transducción con virus cDNA de codificación o shRNA
5. Cultura de los transducidas Ter119 mouse Negativo fetales Eritroblastos Hígado
6. La tinción de las células cultivadas de hígado fetal para el análisis por citometría de flujo
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Representative Results
La figura 1 resume las estrategias experimentales. El protocolo consiste en dos condiciones independientes para dirigir las funciones de las moléculas de señalización en las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Ter119 eritroblastos fetales de hígado negativos fueron purificados de feto de ratón E13.5. Análisis de citometría de flujo de células eritroides fetales del hígado antes y después de la purificación demostraron que la purificación era eficiente (Figuras 2A y 2B). Para la etapa temprana de la eritropoyesis terminal (Figura 1, líneas de trazos), después de la transducción viral, las células se cultivaron en medio libre de Epo-(medio SCF) durante 12 horas. Durante este período, las células mostraron una mínima diferenciación (Figura 2C) sin la apoptosis significativa observada en las células transducidas (GFP positivo) (Figura 3). Las células empezaron a diferenciar después de la transferencia a la EPO que contiene medio (Figura 4 strong>), que fue similar a las células cultivadas en medio que contiene Epo inmediatamente después de la transducción (Figura 1, las líneas continuas y la Figura 5). Durante el cultivo 2 días en medio que contiene Epo en ambos métodos, la mayoría de las células progenitoras eritroides (CD71 bajo TER119 bajo) la inducción del receptor de transferrina (CD71) y TER119 en el día 2 (CD71 alta TER119 alto) (Figura 4A y la Figura exhibieron 5A). La enucleación se produjo el día 2, como se observa por Hoechst alta TER119 altas (eritroblastos) y Hoechst bajo Ter119 altas (reticulocitos) (Figura 4B y la Figura 5B). Es notable que las células de cultivo inmediatamente en Epo (línea continua) fue relativamente más eficiente para la diferenciación y la enucleación que las células se cultivaron primero en medio SCF (línea discontinua).
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Figura 1 Vista esquemática de la estrategia experimental. Guiones y líneas continuas representan los métodos para el estudio de moléculas de señalización en las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal, respectivamente.
Figura 2. análisis de citometría de flujo de ratón células eritroides fetales del hígado antes y después de la purificación de Ter119 eritroblastos negativos. (A) Total de células hepáticas fetales teñidos con TER119 y CD71. Células negativas (B) purificada Ter119 teñidas con TER119 y CD71. (C) purificadas Ter119 células negativas después de cultivo de 12 horas en medio SCF. Motivose Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. análisis de citometría de flujo de la apoptosis después del cultivo en un medio de Epo-libre (medio SCF) durante 12 horas. (Ab) Los eritroblastos Ter119 negativos fueron transducidas con lentivirus de control (A) o lentivirus que codifican proteína verde fluorescente (GFP) (B). El porcentaje de las células transducidas positivas GFP se presentó después de 12 h de cultivo en medio de SCF. (CD) Análisis de la apoptosis en GFP negativo (C) y las células positivas (D) a partir de (B).
Figura 4. análisis de citometría de flujo de la diferenciación y enucleación del erythrobla transducidassts cultivadas en medio SCF seguido por medio de Epo. (A) Como en la Figura 3, las células negativas y positivas GFP fueron cerrada para el análisis de la diferenciación utilizando CD71 y TER119 después de que las células se cambiaron a medio de Epo y se cultivaron durante una 48 h adicionales. (B) ensayo de enucleación utilizando Hoechst y TER119 del indicado células después de 48 horas en medio de Epo.
Figura 5. análisis de citometría de flujo de la diferenciación y la enucleación de los eritroblastos directamente transducidas cultivadas en medio Epo. (A) Las células negativas Ter119 fueron transducidas con lentivirus que codifican GFP. Las células se cultivaron en un medio de Epo inmediatamente después de la transducción. Se realizó el análisis de la célula diferenciación de células negativas y positivas GFP usando CD71 y TER119 después de 48 horas en la cultura. (B) Ensayo de enucleación delas celdas indicadas utilizando Hoechst y TER119 después de 48 horas en la cultura.
| Ingrediente | Cantidad |
| IMDM | 41.385 ml |
| El suero bovino fetal (FBS, 15%) | 7,5 ml |
| b-mercaptoetanol (10 -4 M) | 50 l (10 -1 M en IMDM) |
| Penicilina-estreptomicina (1%) | 500 l |
| La glutamina (2 mM) | 500 l |
| Factor de células madre (50 ng / ml) | 25 l de 100 ng de stock / ml |
| FLT3 ligando (FLT-3L) (30 ng / ml) | 30 l de 50 de stock ng / ml |
| IL-6 (20 ng / ml) | 10 l de 100 ng de stock / ml |
Tabla 1 Ingrediente fomedio r SCF (medio libre de Epo).
| Ingrediente | Cantidad |
| IMDM | 36,3 ml |
| FBS (15%) | 7,5 ml |
| Albúmina de suero bovino (BSA, 10%) | 5 ml (10% de valores en IMDM) |
| La insulina (10 mg / ml) | 50 l de 4 ° C de stock |
| Holo-transferrina (200 mg / ml) | 200 l (50 mg / ml en agua, -20 ° C de stock) |
| b-mercaptoetanol (10 -4 M) | 50 l (10 -1 M en IMDM) |
| Penicilina-estreptomicina (1%) | 500 l |
| 2 mM de glutamina | 500 l |
| EPO (2 U / ml) | 33 l (3.000 U / ml de stock) |
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Discussion
Aquí presentamos un sistema único para analizar cronológicamente ratón fetal eritropoyesis terminal de hígado. A través de la aplicación de diferentes condiciones de cultivo, disecado éxito eritropoyesis terminal en fases tempranas y tardías. Esto es particularmente importante para determinar los mecanismos de genes con múltiples funciones. Por ejemplo, GTPasas Rac juegan papeles importantes en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal. La inhibición de Rac GTPasas en la etapa temprana de la diferenciación celular influencias de la eritropoyesis terminales y la proliferación. Por otro lado, la inhibición de la actividad de Rac GTPasas en la etapa tardía de terminal de bloques de la eritropoyesis enucleación sin afectar la diferenciación celular, la proliferación o la supervivencia 13.
Varios pasos importantes en este protocolo deben tenerse en cuenta. En primer lugar, se prefieren ratón E13.5 hígados fetales para la purificación de Ter119 células negativas. Embriones de más edad pueden ser usados pero el proportiel de los progenitores fuera de las células de hígado fetal total será baja. Segundo, es importante utilizar bajo BSA endotoxina en medio Epo ya que es crítico para la enucleación, aunque el mecanismo no está claro. En tercer lugar, aunque la fibronectina se informó a ser importante para la eritropoyesis 15, se encontró que el uso de la placa recubierta de fibronectina era opcional. No afecta a la proliferación celular, la diferenciación, o enucleación en nuestro sistema. Sin embargo, la fibronectina puede ser útil para que las células se adhieren a la placa que podría ser importante para ciertas aplicaciones tales como la inmunotinción. En cuarto lugar, un pequeño porcentaje de reticulocitos o eritroblastos etapa tardía puede perder la señal de GFP que se llevó con las células transducidas. Alternativamente usamos CD4 humano como marcador para el seguimiento de las células transducidas. Por último, los informes anteriores recomendaron la eliminación de la eritropoyetina de la cultura en el día 1 11. Descubrimos que no era necesario hacerlo, ya que no hubo diferencia significativa en la celdadiferenciación, proliferación, o enucleación con o sin eliminación de la eritropoyetina. Por el contrario, el cambio de medio puede causar la pérdida de células.
Utilizando la misma estrategia, recientemente hemos descubierto más de 30 genes que desempeñan funciones novedosas en diferentes etapas de la eritropoyesis de terminal (Zhao et al., Resultados no publicados). Como Rac GTPasas, muchos de estos genes desempeñan una doble función, tanto en etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Esto indica que las vías de señalización en la eritropoyesis terminal son estrechamente interconectados. Los genes implicados en la remodelación del citoesqueleto de actina y la condensación nuclear son aquellos que tienden a desempeñar funciones duales debido a los papeles críticos de estas vías de señalización a través de la eritropoyesis terminal. Por otra parte, los genes implicados en las vías tales como la síntesis de hemo y generación de membrana plasmática eritroide específica tienden a ser más restringido en la etapa temprana de la eritropoyesis terminal de 16,17. Aunque there ciertas limitaciones de esta estrategia experimental, como relativamente baja eficiencia de infección en comparación con la transducción de líneas celulares, y la dificultad de derribar las proteínas con vida media larga, se recomienda una práctica de rutina para utilizar nuestro sistema dada la importancia de la disección de las funciones de genes en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal. Además, esta estrategia experimental también se puede utilizar para otras aplicaciones. Por ejemplo, utilizando la condición de SCF medio de cultivo, los genes que están involucrados en el mantenimiento de propiedades de células madre tales como la auto-renovación o diferenciación podrían ser analizados. Usando el método para el análisis de la eritropoyesis etapa tardía, también se podría determinar la función de genes que podrían estar implicados en la autofagia para la eliminación de los orgánulos.
En términos generales, esta estrategia experimental se puede aplicar a la investigación funcional de otros sistemas hematopoyéticos tales como megacariopoyesis y mielopoyesis. La aplicación exitosa de este sSTRATEGIA también revelaría el lado oculto de los mecanismos moleculares de genes específicos en diferentes etapas de desarrollo de células sanguíneas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el NIH R00HL102154, y la Sociedad Americana de Hematología premio académico a P Ji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J.
