Summary
我们提出了一个在体外小鼠胎肝红细胞培养系统剖析终端红细胞生成的早期和晚期阶段。这个系统有利于在不同的发育阶段特异性基因的功能分析。
Abstract
包括红细胞生成一个动态的过程，开始于随后迅速分裂红系集落形成单位（CFU-ES）致力于红爆形成单位（BFU-ES）。后CFU-ES，细胞形态识别，一般称为终端红细胞。其中一个终端红细胞的研究挑战是缺乏实验方法来剖析基因功能以时间的方式。在这个协议中，我们描述了一种独特的策略，以确定在终端红细胞生成的早期和晚期基因功能。在这个系统中，小鼠胎肝TER119（成熟红细胞细胞标记物）阴性红细胞中纯化和转导的cDNA或小发夹RNA（shRNA的）感兴趣的基因的外源表达。随后将细胞培养在含有培养基比红细胞生成素（EPO）等，以保持它们的祖细胞阶段为12小时，同时使外源的cDNA或shRNA的生长因子来表达。将细胞改变到促红细胞生成素培养基中12小时后，诱导细胞分化和增殖，而已经表达了外源遗传物质。这个协议有助于在终端红细胞生成的早期阶段的基因的功能分析。研究后期终端红细胞生成，细胞培养，立即在转导后生成素中。在这种方式中，细胞已分化到终端红细胞生成的后期时进行表达的转基因材料。我们建议使用此策略的普遍应用，这将有助于了解在终端红细胞生成的不同阶段，详细的基因功能。
Introduction
红血球生成是多能造血干细胞的成熟红细胞的分化过程。此分步处理包括类红细胞爆形成单位（BFU-ES），在快速分裂的红细胞集落形成单位（CFU-ES），及形态识别红细胞1,2的形成。由CFU-E祖细胞终端红细胞生成包括连续的促红细胞生成素依赖性和独立的阶段2,3。在终端红细胞生成的早期阶段，促红细胞生成素（EPO）结合到其细胞表面上的受体，并诱导一系列下游信号通路，防止细胞凋亡，促进细胞快速分裂和基因表达1,4。在终端红细胞生成的后期，有核红细胞进行终端细胞周期出口，染色质和核缩合，并挤出的高度浓缩的细胞核分 。
我们的终端的理解红细胞生成极大，在过去的几十年中，这主要是由于在体外成功地利用一些和体内小鼠模型6-9改善。在这些模型中， 在小鼠胚胎肝红细胞体外培养提供了许多优点，包括易于细胞纯化，快速增殖和分化，并更密切模仿人类红细胞生成10,11。在这个系统中，大量的从鼠胎肝红系祖细胞可以容易地由TER119的单步骤纯化（标记为成熟红细胞）阴性红细胞分离。中的红细胞的两天的培养，这些细胞的分化可以通过基于所述转铁蛋白受体（CD71）和TER119抗原12的表面表达的流式细胞术分析来监测。此外，晚期红细胞分化的眼球摘除可以用DNA制造商（赫斯特33342）被检测到13，此外，纯化的祖细胞可被转用的cDNA或小发夹RNA（shRNA的）感兴趣的基因，这有利于基因表达的功能的机理研究对红血球生成11,13,14的外源表达修饰。
在另一方面，快速的细胞生长速度可以是一把双刃剑，因为它很难在终端红细胞生成的不同阶段来描述基因功能。在大多数情况下，很难确定是否在终端红细胞生成的早期阶段的特定基因的功能，因为通过时间的cDNA或shRNA的表达，所述细胞已经通过了早期阶段。为了解决这个问题，我们开发了一个独特的系统剖析终端红细胞生成的早期和晚期阶段。对于终端红细胞生成的早期阶段，转基因TER119阴性红细胞培养在促红细胞生成素的培养基中，但含有干细胞因子（SCF），白细胞介素-6和FLT3配体以维持其祖的地位，并允许转导的cDNA和shRNA的表达13。将细胞改变到促红细胞生成素含培养基12小时后，诱导细胞增殖和分化。在这种方式中，当细胞开始分化，在转导的cDNA或shRNA的已经表达出来。对于终端红细胞生成后期，TER119负红细胞人转导后，立即含中Epo的培养。因此，可以分析在终端红细胞生成的后期所感兴趣的基因的功能。综上所述，本系统的广泛应用，将有助于终端红细胞生成的不同阶段解剖基因的功能。
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Protocol
在此协议中描述的实验是在按照规定由美国西北大学实验动物管理和使用委员会的指导方针和规定执行。
1，制备培养基
- 准备纤维连接蛋白的解决方案。加入1毫升水，以人纤连蛋白（1毫克）中的一个小瓶内。离开溶液在组织培养橱中30分钟而不搅拌。总的液体转移至50ml的PBS中，以20微克/毫升的最终浓度，并轻轻混匀。使涂覆的板（见下文）之前的纤连蛋白的溶液新鲜。
- 准备50毫升促红细胞生成素的培养基（SCF介质）。结合所列出的成分在表1中的介质可以被存储在4℃下1个月时发劲。
- 准备50毫升含有促红细胞生成素的培养基。结合所列出的成分在表2中的介质可以被存储在4℃下1个月时发劲。 2，纤维连接蛋白涂层板
- 加入1 ml纤连蛋白溶液到6孔板（或0.5毫升至12孔板的每孔）的每个孔中。离开该板在组织培养罩1小时。
- 冲洗孔中，用无菌水洗涤两次，并空气干燥该板。
- 包装板，并保存在寒冷的房间在4℃。
- 总胎肝细胞的制备
- 牺牲谅解备忘录SE的CO 2吸入和颈椎脱位。喷用70％乙醇消毒腹部。用解剖剪刀切除子宫打开腹部。洗1X PBS子宫。
- 解剖用组织培养罩和高压手段在无菌条件下将胎儿和洗1X PBS中。
- 从解剖胎儿胎儿的肝脏。握住胎儿的身体有一个镊子，轻轻一拉胎肝（粉红色）远离身体与另一个钳。用钳子清洁胎儿肝脏以除去相关的纤维化组织。将所有的胎儿肝脏到新鲜的1×PBS含有10％胎牛血清。
- 机械地上下吹打破坏胎肝。
- 过滤通过40微米的细胞过滤的细胞悬浮液置于50ml锥形管中。沉淀细胞，在800×g离心5分钟。
- 吸出上清液并将细胞重新悬浮于1ml PBS中，用10％的FBS（约8 E13.5胎肝每毫升）。
- 的TER119负红细胞的净化
- 方框在冰上将细胞用大鼠IgG（0.2毫克/毫升）15分钟。
- 未经洗涤或离心分离，生物素化的抗TER119抗体加入到细胞悬浮液（1微克/毫升）。孵育在冰上15分钟。
- 在1×PBS中，用10％的FBS（1:10）和离心机在800×g离心5分钟，洗净。重悬在1ml的PBS中，用10％FBS的细胞。
- 加入75微升链霉结合有磁性粒子和孵育10分钟在冰上。
- 的体积加入到2.5毫升的PBS含10％FBS。细胞悬液转移到5ml聚丙烯圆底试管中。
- 插入管插入的磁性细胞分选装置，并孵育10分钟。 TER119阳性细胞将附着在管的一侧。未附着的TER119阴性红细胞将保持在悬浮液中。
- 倒入细胞悬液到一个新的5毫升聚丙烯圆底试管。
- 重复步骤3.2.6和3.2.7，除去残留的TER119阳性细胞。
- 沉淀细胞，在800×g离心5分钟。抽吸掉上清液。重悬细胞于1ml PBS中含有10％FBS和计数活细胞用台盼蓝。
- 板式纯化TER119负胎儿肝细胞在3-5×10 5个/孔在包被12孔板纤连蛋白（如果使用一个不同的板调整细胞数）。
- 加入聚凝胺至10微克/毫升的最终浓度，以促进病毒转导。自旋感染细胞用慢病毒或逆转录病毒，编码的cDNA或shRNA，以800×g离心1-1.5小时，在37℃。
- 来测试基因功能的终端红细胞生成的早期阶段（ 图1中虚线）。“>
培养的转导的细胞中促红细胞生成素的培养基（SCF介质）12小时，以允许的转基因和维护祖状态的表达。 - 离心细胞，在800×g离心5分钟。吸出上清液。悬浮介质收容在一个12孔板的每个孔中的细胞在1ml生成素。
- 培养24或48小时后，收获细胞用于进一步分析。
- 测试基因功能的终端的红细胞生成（ 图1中的实线）的后期阶段。
- 文化的转立刻细胞生成素含有中。
- 培养24或48小时后，收获细胞用于进一步的分析。
- 清洗和悬浮细胞在1X PBS。收获的2×10 5细胞培养于流式细胞仪分析。
- 孵育将细胞与荧光标记的抗体20分钟，在室温下在黑暗中。为了测试分化，使用的APC标记的抗CD71和PE标记的抗TER119。为了测试去核，用Hoechst的33342染色，除了其他的抗体。
- 用1×PBS洗涤细胞。重悬含有1％FBS和碘化丙啶（PI）（1微克/毫升）进行染色的死细胞，并从分析中排除它们的细胞在0.5ml PBS中。
- 开展流动cytrometric分析。首先调整和补偿流式细胞仪的分析单色染色和未染色的对照细胞。
3，净化胎肝红细胞的
注意：使用从E13到E15胎肝定时妊娠小鼠（C57BL / 6）。 E13.5肝脏是首选，以最大限度地提高CFU-E祖细胞的产率。以获得定时怀孕小鼠，6〜8周龄的雄性和雌性小鼠放置在一个笼（通常是一个男性与一个或两个雌性）。第二天早晨女性阴道塞被检查，以确定是否交配是否成功。怀孕的第一天是当天被发现后插上。
4，转导与病毒编码基因或shRNA
转导TER119负鼠胎肝红细胞的5文化
6染色的培养胎肝细胞的流式细胞仪分析
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Representative Results
图1列出了实验策略。该协议包括两个独立的条件为靶向的信号分子的功能的终端红细胞生成的早期和晚期阶段。 TER119负胎肝红细胞从E13.5小鼠胚胎纯化。胎肝类红细胞前和纯化后的流式细胞术分析表明，纯化效率高（ 图2A和2B）。对于终端红细胞生成（ 图1中，虚线）的早期阶段，病毒转导后，将细胞在红细胞生成素的培养基（SCF介质）12小时进行培养。在此期间，该细胞表现出最小的分化（ 图2C），在转导的细胞中观察到无显著凋亡（GFP阳性）（ 图3）。细胞开始转移至含EPO的培养基后，以区分（ 图4中 强>），这类似于将细胞在含有立即介质转导后生成素培养（ 图1中，实线和图5）。在2天的培养中生成素含介质在两种方法中，大部分的红系祖细胞（CD71 低 TER119 低 ）显示出感应的转铁蛋白受体（CD71）和TER119，第2天（CD71 高 TER119 高 ）（ 图4A和图图5A）。去核发生在第2天，由Hoechst 高 TER119 高 （红细胞）和Hoechst的低 TER119 高 （网状细胞）（ 图4B和图5B），所观察到的。值得注意的是，细胞立即培养中生成素（实线）是用于分化和去核细胞相比相对更有效的培养的第一个中的SCF介质（虚线）。
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图1中的试验策略的示意图概述。虚线和实线表示的，学习的信号分子在终端红细胞生成的早期和晚期分别方法。
鼠标前和TER119负红细胞纯化后胎肝红系细胞图2流式细胞仪分析。 （A）染色的TER119和CD71总计胎儿肝细胞。沾上TER119和CD71（B）纯化的TER119阴性的细胞（C）纯化的TER119后在SCF培养基12小时培养阴性的细胞。 普莱斯E单击此处查看这个数字的放大版本。
图3流凋亡的培养后的红细胞生成素的培养基（SCF介质）流式细胞仪分析12小时。 （AB）的TER119阴性红细胞被转导的对照慢病毒（A）或慢病毒编码绿色荧光蛋白（GFP）（B）。将GFP阳性转导的细胞的百分比是12小时培养中的SCF介质之后提出的（CD）分析细胞凋亡的GFP阴性（C）和阳性（D）的细胞从（B）。
差异化的转erythrobla和眼球摘除图4流式细胞仪分析STS在SCF中后促红细胞生成素的培养基中培养。 （A）如在图3中，GFP阴性和阳性细胞进行门控，使用CD71和TER119后，将细胞改变成Epo的培养基和培养另外48小时，分化分析，（B）的去核测定用Hoechst的和所指示的TER119 48小时的促红细胞生成素中后的细胞。
差异化的转红细胞直接在培养中促红细胞生成素和去核的图5流式细胞仪分析。 （一）TER119阴性细胞转导慢病毒编码绿色荧光蛋白。细胞转导后，立即在培养介质中生成素。用CD71和TER119 48小时培养后进行了绿色荧光蛋白阴性和阳性细胞的细胞分化的分析。 （二）去核试验用赫斯特和TER119 48小时培养后，指示细胞。
| 成分 | 数量 |
| IMDM | 41.385毫升 |
| 胎牛血清（FBS，15％） | 7.5毫升 |
| B-巯基乙醇（10 -4 M） | 50μL（10 -1 1M贮存在IMDM） |
| 青霉素 - 链霉素（1％） | 500微升 |
| 谷氨酰胺（2毫米） | 500微升 |
| 干细胞因子（50毫微克/毫升） | 从100毫微克/毫升的库存25微升 |
| Flt3配体（FLT-3L）（30纳克/毫升） | 从50毫微克/毫升的库存30微升 |
| IL-6（20毫微克/毫升） | 从100毫微克/毫升的库存10微升 |
表1成分FOřSCF介质（促红细胞生成素的培养基）。
| 成分 | 数量 |
| IMDM | 36.3毫升 |
| FBS（15％） | 7.5毫升 |
| 牛血清白蛋白（BSA，10％） | 加入5ml（10％的股票在IMDM） |
| 胰岛素（10毫克/毫升） | 从4℃股市50微升 |
| 全息转铁蛋白（200毫克/毫升） | 200微升（-20 50毫克/毫升的水，℃，股吧） |
| B-巯基乙醇（10 -4 M） | 50μL（10 -1 1M贮存在IMDM） |
| 青霉素 - 链霉素（1％） | 500微升 |
| 2mM谷氨酰胺 | 500微升 |
| 促红细胞生成素（2单位/毫升） | 33微升（3000 U / ml的股票） |
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Discussion
在这里，我们提出了一个独特的系统，按时间顺序分析小鼠胎肝终端红细胞生成。通过对不同培养条件下的应用，我们成功地解剖在早期和晚期终端红细胞生成。这是特别重要的，以确定基因与多种功能的机制。例如，外消旋GTP酶发挥终端红细胞生成的不同阶段起重要作用。 Rac的GTP酶在终端红细胞生成影响细胞分化和增殖的早期阶段抑制。在另一方面，抑制Rac的GTP酶的活性，在终端红细胞生成块去核的后期，而不影响细胞分化，增殖，或存活13。
应牢记这一协议的几个重要步骤。首先，E13.5小鼠胎肝优选为TER119阴性细胞的纯化。较旧的胚胎可以使用，但在数比例在祖出总胎肝细胞的将是低的。其次，重要的是要使用低内毒素牛血清白蛋白中Epo的介质，因为它是为眼球摘除关键的，虽然其机理尚不清楚。第三，虽然纤连蛋白被报道为对红细胞生成15重要的是，我们发现，使用纤连蛋白包被的平板的是可选的。这不会影响我们的系统细胞的增殖，分化，或剜除术。然而，纤连蛋白可以是有用的细胞附着到这可能是对某些应用，如免疫重要的板。四，网织红细胞或晚期红细胞的一小部分可能会丢失进行的转导细胞GFP信号。另外，我们用人类的CD4作为标记来追踪转导的细胞。最后，以前的报告中建议去除红细胞生成素从培养第1天11，我们发现，这是没有必要这么做，因为有对细胞无显著差异分化，增殖，或眼球摘除或不拆促红细胞生成素。与此相反，介质的变化可能会导致细胞损失。
使用同样的策略，我们最近发现超过30个基因发挥新的功能在终端红细胞生成的不同阶段（Zhao 等人 ，未发表结果）。像Rac的GTP酶，在终端红细胞生成的早期和晚期阶段许多这些基因发挥双重功能。这表明，在终端红细胞生成信号通路密切相连。参与肌动蛋白细胞骨架重构和核固缩基因是那些倾向于玩，由于这些信号通路在整个终端红细胞的重要作用双重功能。另一方面，卷入通路如血红素合成和产生的红细胞特异性细胞膜基因往往更加受限于终端红细胞生成16,17的早期阶段。尽管疗法e为这个实验策略的某些限制，例如相对低的感染效率相比的细胞系转导，并撞倒蛋白具有长半衰期的困难，我们建议常规的做法是使用我们的系统中给定的解剖基因功能的重要性在终端红细胞生成的不同阶段。此外，本试验策略也可用于其它应用。例如，使用SCF培养基的培养条件下，参与的干细胞特性，例如自我更新或分化的维持该基因可以被分析。使用该方法，用于分析晚期红细胞生成，人们也可以决定基因可以参与自噬用于除去细胞器的功能。
广义地说，本实验策略可以应用到其它造血系统如megakaryopoiesis和骨髓细胞生成的功能研究。成功应用，这款Strategy也揭示了在血细胞的不同发育阶段特异性基因的分子机制的潜在副作用。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生研究院R00HL102154支持，以及血液学学者奖的美国社会为P吉。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
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