小鼠胎肝文化系统解剖靶基因功能的终端红细胞生成的早期和晚期

Summary

我们提出了一个在体外小鼠胎肝红细胞培养系统剖析终端红细胞生成的早期和晚期阶段。这个系统有利于在不同的发育阶段特异性基因的功能分析。

Abstract

包括红细胞生成一个动态的过程，开始于随后迅速分裂红系集落形成单位（CFU-ES）致力于红爆形成单位（BFU-ES）。后CFU-ES，细胞形态识别，一般称为终端红细胞。其中一个终端红细胞的研究挑战是缺乏实验方法来剖析基因功能以时间的方式。在这个协议中，我们描述了一种独特的策略，以确定在终端红细胞生成的早期和晚期基因功能。在这个系统中，小鼠胎肝TER119（成熟红细胞细胞标记物）阴性红细胞中纯化和转导的cDNA或小发夹RNA（shRNA的）感兴趣的基因的外源表达。随后将细胞培养在含有培养基比红细胞生成素（EPO）等，以保持它们的祖细胞阶段为12小时，同时使外源的cDNA或shRNA的生长因子来表达。将细胞改变到促红细胞生成素培养基中12小时后，诱导细胞分化和增殖，而已经表达了外源遗传物质。这个协议有助于在终端红细胞生成的早期阶段的基因的功能分析。研究后期终端红细胞生成，细胞培养，立即在转导后生成素中。在这种方式中，细胞已分化到终端红细胞生成的后期时进行表达的转基因材料。我们建议使用此策略的普遍应用，这将有助于了解在终端红细胞生成的不同阶段，详细的基因功能。

Introduction

红血球生成是多能造血干细胞的成熟红细胞的分化过程。此分步处理包括类红细胞爆形成单位（BFU-ES），在快速分裂的红细胞集落形成单位（CFU-ES），及形态识别红细胞^1,2的形成。由CFU-E祖细胞终端红细胞生成包括连续的促红细胞生成素依赖性和独立的阶段^2,3。在终端红细胞生成的早期阶段，促红细胞生成素（EPO）结合到其细胞表面上的受体，并诱导一系列下游信号通路，防止细胞凋亡，促进细胞快速分裂和基因表达^1,4。在终端红细胞生成的后期，有核红细胞进行终端细胞周期出口，染色质和核缩合，并挤出的高度浓缩的细胞核^分 。

我们的终端的理解红细胞生成极大，在过去的几十年中，这主要是由于在体外成功地利用一些和体内小鼠模型^6-9改善。在这些模型中， 在小鼠胚胎肝红细胞体外培养提供了许多优点，包括易于细胞纯化，快速增殖和分化，并更密切模仿人类红细胞生成^10,11。在这个系统中，大量的从鼠胎肝红系祖细胞可以容易地由TER119的单步骤纯化（标记为成熟红细胞）阴性红细胞分离。中的红细胞的两天的培养，这些细胞的分化可以通过基于所述转铁蛋白受体（CD71）和TER119抗原¹²的表面表达的流式细胞术分析来监测。此外，晚期红细胞分化的眼球摘除可以用DNA制造商（赫斯特33342）被检....

Protocol

在此协议中描述的实验是在按照规定由美国西北大学实验动物管理和使用委员会的指导方针和规定执行。

1，制备培养基

1. 准备纤维连接蛋白的解决方案。加入1毫升水，以人纤连蛋白（1毫克）中的一个小瓶内。离开溶液在组织培养橱中30分钟而不搅拌。总的液体转移至50ml的PBS中，以20微克/毫升的最终浓度，并轻轻混匀。使涂覆的板（见下文）之前的纤连蛋白的溶液新鲜。
2. 准备50毫升促红细胞生成素的培养基（SCF介质）。结合所列出的成分在表1中的介质可以被存储在4℃下1个月时发劲。
3. 准备50毫升含有促红细胞生成素的培养基。结合所列出的成分在表2中的介质可以被存储在4℃下1个月时发劲。

2，纤维连接蛋白涂层板

1. 加入1 ml纤连蛋白溶液到6孔板（或0.5毫升至12孔板的每孔）的每个孔中。离开该板在组织培养罩1小时。
2. 冲洗孔中，用无菌水洗涤两次，并空气干燥该板。
3. 包装板，并保存在寒冷的房间在4℃。

3，净化胎肝红细胞的

注意：使用从E13到E15胎肝定时妊娠小鼠（C57BL / 6）。 E13.5肝脏是首选，以最大限度地提高CFU-E祖细胞....

Results

图1列出了实验策略。该协议包括两个独立的条件为靶向的信号分子的功能的终端红细胞生成的早期和晚期阶段。 TER119负胎肝红细胞从E13.5小鼠胚胎纯化。胎肝类红细胞前和纯化后的流式细胞术分析表明，纯化效率高（ 图2A和2B）。对于终端红细胞生成（ 图1中，虚线）的早期阶段，病毒转导后，将细胞在红细胞生成素的培养基（SCF介质）12小时进行培养。在此期间，该细胞表现出最小的分化（ 图2C），在转导的细胞中观察到无显著凋亡（GFP阳性）（ 图3）。细胞开始转移至含EPO的培养基后，以区分（ 图4中 强>），这类似于将细胞在含有立即介质转导后生成素培养（ 图1中，实线和图5）。在2天的培养中生成素含介质在两种方法中，大部分的红系祖细胞（CD71 ^低 TER119 ^低 ）显示出感应的转铁蛋白受.......

Discussion

在这里，我们提出了一个独特的系统，按时间顺序分析小鼠胎肝终端红细胞生成。通过对不同培养条件下的应用，我们成功地解剖在早期和晚期终端红细胞生成。这是特别重要的，以确定基因与多种功能的机制。例如，外消旋GTP酶发挥终端红细胞生成的不同阶段起重要作用。 Rac的GTP酶在终端红细胞生成影响细胞分化和增殖的早期阶段抑制。在另一方面，抑制Rac的GTP酶的活性，在终端红细胞生成块去核的后期，而不影响细胞分化，增殖，或存活^13。

应牢记这一协议的几个重要步骤。首先，E13.5小鼠胎肝优选为TER119阴性细胞的纯化。较旧的胚胎可以使用，但在数比例在祖出总胎肝细胞的将是低的。其次，重要的是要使用低内毒素牛血清白蛋白中Epo的介质，因为它是为眼球摘除关键的，虽然其机理尚不清楚。第三，虽然纤连蛋白被报道为对红细胞生成¹⁵重要的是，我们发现，使用纤连蛋白包被的平板的是可选的。这不会影响我们的系统细胞的增殖，分化，或剜除术。然而，纤连蛋白可以是有用的细胞附着到这可能是对某些应用，如免疫重要的板。四，网织红细胞或晚期红细胞的一小部分可能会丢失进行的转导细胞GFP.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove 改良型 Dulbecco 培养基IMDM （IMDM）	Gibco	12440-053
胎牛血清 （FBS）	GEMINI 生物制品	700-102P
青霉素-链霉素溶液	Hyclone	SV30010	100x
L-谷氨酰胺	Hyclone	SH30034.01	200 mM
小鼠 FIT3 配体 （Flt-3L）	BD Biosciences	14-8001-80
小鼠重组白细胞介素-6 （IL-6）	GEMINI Bio-product	300-327P
纤连蛋白	BD Biosciences
牛血清白蛋白 （BSA）	STEMCELL TECH	9300	10% 库存 促
红细胞生成素 （Epo）	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml 库存
链霉亲和素颗粒加	BD Pharmingen	557812
EasySep 磁铁	STEMCELL TECH	18000
聚丙烯圆底管，5 ml	FALCON