Summary
私たちは、端末赤血球生成の初期および後期段階を解剖インビトロマウス胎児肝臓赤芽球培養系を提示。このシステムは、異なる発生段階における特定の遺伝子の機能解析を容易にします。
Abstract
赤血球生成が急速に形成単位赤血球コロニー（CFU-ES）を分周して、その後、コミット赤血球バースト形成単位（BFU-ES）で始まる動的なプロセスを伴う。 CFU-ESの後、細胞を形態学的に認識され、一般的には、端末赤芽球と呼ばれる。端末赤血球生成の研究のための課題の一つは、時系列的に遺伝子の機能を分析するための実験的アプローチの欠如である。このプロトコルでは、端末赤血球形成の初期及び後期段階での遺伝子機能を決定するためのユニークな戦略を記載している。このシステムでは、マウス胎児肝臓TER119（成熟赤血球細胞マーカー）負の赤芽球を精製し、目的の遺伝子のcDNAや小さなヘアピンRNA（shRNAを）の外因性発現で形質導入。細胞は、外因性cDNAまたはshRNAを可能にしながら、12時間それらの前駆段階を維持するためにエリスロポエチン（EPO）以外の成長因子を含む培地で培養し、その後発現させた。外因性遺伝物質がすでに発現させながら、細胞は、細胞分化および増殖を誘導するために12時間後のEpo培地に変更した。このプロトコルは、端末赤血球生成の初期段階で遺伝子機能の解析を容易にします。後期端末赤血球形成を研究するために、細胞を直ちに形質導入後のEpo培地中で培養した。このように、細胞は、既に形質導入された遺伝物質を発現した端末赤血球形成の後期に分化させた。私たちは、端末赤血球生成のさまざまな段階での詳細な遺伝子機能を理解する助けとなるこの戦略の一般的な適用を推奨します。
Introduction
赤血球生成は、赤血球を成熟多能造血幹細胞の分化の過程である。この段階的なプロセスは、コミットされた赤血球バースト形成単位（BFU-ES）、急速に分裂赤血球コロニー形成単位（CFU-ES）、及び形態学的に認識可能な赤芽球1,2の形成を含む。 CFU-Eの前駆細胞からの端末赤血球生成は、シーケンシャルエリスロポエチン依存性および非依存性のステージ2,3を伴う。端末赤血球形成の初期段階では、エリスロポエチン（EPO）は、細胞表面上の受容体に結合し、細胞アポトーシスを防止し、迅速な細胞分裂および遺伝子発現1,4を促進する下流のシグナル伝達経路のシリーズを誘導する。端末赤血球生成の後期段階では、赤芽球は、高度に凝縮した核5の端子分裂停止、クロマチンおよび核の凝縮、および押出を受ける。
端末の理解赤血球生成が大幅にin vitroおよびin vivoで 6-9マウスモデルにおけるいくつかの使用の成功によるところが大きい、これ過去数十年で改善されています。これらのモデルの中でも、マウス胎児肝芽球のインビトロ培養中の細胞の精製、速い増殖および分化の容易さを含む多くの利点を提供し、人間の赤血球生成10,11に近い模倣。このシステムでは、マウス胎児肝臓からの赤血球前駆細胞の多数が容易にTER119の単一ステップ精製（成熟赤血球系細胞のマーカー）は、負の赤芽球を単離することができる。赤芽球の二日間の培養の間、これらの細胞の分化は、トランスフェリン受容体（CD71）の表面発現およびTER119抗原12に基づいて、フローサイトメトリー分析によってモニターすることができる。また、末端分化赤芽球の除核は、DNAメーカー（ヘキスト33342）によって検出することができる13。さらに、精製された前駆細胞は、遺伝的に赤血球生成11,13,14上の遺伝子発現の機能の機構研究を容易にする、目的の遺伝子のcDNAまたは小ヘアピンRNA（shRNAは）の外因性発現によって改変することができる。
それは、端末赤血球形成の異なる段階での遺伝子機能を特徴付けることは困難であるので、一方で、高速細胞増殖速度は、両刃の剣であることができる。ほとんどの場合、それは、cDNAまたはshRNAが発現した時点で以降の端末赤血球形成の初期段階における特定の遺伝子の機能は、細胞が既に初期段階に合格したかどうかを決定することは困難である。この問題を解決するために、私たちは、端末赤血球生成の初期および後期段階を詳細に分析するために独自のシステムを開発しました。端末赤血球形成の初期段階では、遺伝的に改変されTER119負赤芽球は、Epoを含まない培地中で培養したが、幹細胞因子（SCF）、IL-6およびFLT3を含むリガンドは、それらの前駆状態を維持し、数13に形質導入されたcDNAまたはshRNAを可能にする。細胞は、細胞の増殖および分化を誘導するために12時間後にEpoを含む培地に変更した。細胞が分化し始めたときにこのように、形質導入されたcDNAまたはshRNAは、既に発現した。端末赤血球生成の後期段階では、TER119負の赤芽球は、すぐに導入後エポ含む培地で培養した。従って、一つの端末赤血球形成の後期段階において、目的の遺伝子の機能を分析することができる。要約すると、本システムの広範な適用は、端末赤血球形成の異なる段階での遺伝子機能を分析に役立つだろう。
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Protocol
このプロトコルに記載される実験は、ノースウェスタン大学施設内動物管理使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に従って行った。
培養液の調製
- フィブロネクチン溶液を調製する。ヒトフィブロネクチン（1mg）を1バイアルに1mlの水を追加します。撹拌せずに30分間組織培養フード内の溶液のままにしておきます。 20μg/ mlの最終濃度を作るために、PBS 50mlに全液体を移し、静かによく混ぜる。プレートを被覆する前に、フィブロネクチン溶液は新鮮行う（下記参照）。
- エポ培地（SCF培地）50mlのを準備します。新鮮作ったとき、表1に列挙した成分を組み合わせる。培地を1ヶ月間4℃で保存することができる。
- エポ含む培地50mlを準備します。新鮮作ったとき、表2に列挙した成分を組み合わせる。培地を1ヶ月間4℃で保存することができる。 2フィブロネクチンコートプレート
- 6ウェルプレート（または12ウェルプレートの各ウェルに0.5 ml）を各ウェルに1 mlのフィブロネクチン溶液を添加する。 1時間の組織培養フード内でプレートにしておきます。
- 二回滅菌水でウェルを洗浄し、空気プレートを乾燥させます。
- プレートをラップし、4℃で低温室で保存してください。
- 総胎児肝細胞の調製
- 畝を生け贄に捧げるCO 2吸入と頸椎脱臼によってSE。消毒用70％エタノールで腹部をスプレーします。子宮を除去するために、はさみを解剖して、腹部を開きます。 1×PBS中で子宮を洗ってください。
- 組織培養フード、オートクレーブのツールを使用して無菌条件下で胎児を解剖し、1×PBS中で洗浄します。
- 胎児からの胎児の肝臓を解剖。別の鉗子で身体から離れ胎児肝臓（色はピンク）をゆっくりと引い1ピンセットで胎児のボディを持ってください。関連する線維性組織を除去するための鉗子で胎児の肝臓を清掃してください。 10％ウシ胎児血清を含む新鮮な1×PBS中にすべての胎児の肝臓を置きます。
- 機械的ピペッティングにより胎児の肝臓を混乱させる。
- 50mlの円錐チューブに40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。 5分間800×gで細胞をペレット化。
- FBSの上清を吸引し、10％1mlのPBSで細胞を再懸濁（約8 E13.5胎児肝臓）1mlあたり。
- TER119陰性赤芽球の精製
- 氷上で15分間、ラットのIgG（0.2 mg / ml）を用いて細胞をブロックする。
- 洗浄又は遠心分離せずに、細胞懸濁液（1μg/ ml）をビオチン化抗TER119抗体を加える。氷上で15分間インキュベートする。
- 5分間800×gで、10％FBS（1:10）と遠心分離機に1×PBS中で洗浄する。 10％FBSを含む1mlのPBSで細胞を再懸濁する。
- 磁性粒子とコンジュゲート75μlのストレプトアビジンを加え、氷上で10分間インキュベートする。
- PBSで10％FBSを含む2.5ミリリットルにボリュームを追加します。ボトムチューブラウンド5ミリリットルのポリプロピレンに細胞懸濁液を転送します。
- 磁気細胞選別装置内にチューブを挿入し、10分間インキュベートする。 TER119陽性細胞は、チューブの側面に付着する。アタッチされていないTER119負の赤芽球を懸濁液のままになります。
- ボトムチューブ新ラウンド5ミリリットルのポリプロピレンに細胞懸濁液を注ぐ。
- 繰り返し、残留TER119陽性細胞を除去するために3.2.6と3.2.7を繰り返します。
- 5分間800×gで細胞をペレット化。上清を吸引除去する。 10％FBSを含む1mlのPBSで細胞を再懸濁し、トリパンブルーで生細胞を数える。
- 3-5の精製TER119負の胎児肝細胞をプレー×10 5 /ウェルで12ウェルプレートをコーティングしたフィブロネクチン（異なるプレートを用いた場合に細胞数を調整する）である。
- ウイルス形質導入を容易にするためには10μg/ mlの最終濃度にポリブレンを加える。スピンは、37℃で1〜1.5時間、800×gで、cDNAまたはshRNAをコードするレンチウイルスまたはレトロウイルスで細胞を感染させる。
- 端末赤血球生成の初期段階での遺伝子の機能をテストするには（ 図1破線）。">
形質導入された遺伝子および前駆状態の維持の発現を可能にする12時間培養エポ培地で形質導入した細胞（SCF培地）。 - 5分間800×gで細胞を遠心。上清を吸引。 12ウェルプレートの各ウェルに培地を含有する1ミリリットルのEpo中で細胞を再懸濁する。
- 24または48時間培養後、さらなるアッセイのための細胞を採取する。
- 端末赤血球生成の後期段階でのテスト遺伝子機能（ 図1の実線）。
- 文化エポ含む培地中で、すぐに導入された細胞。
- 24または48時間培養後、さらなるアッセイのための細胞を採取する。
- 1×PBS中で細胞を洗浄し、再懸濁します。収穫フローサイトメトリー分析のために2×10 5個の培養細胞。
- 培養する暗所で室温で20分間フルオロフォア結合抗体を有する細胞。分化をテストするには、APC結合抗CD71およびPE結合抗TER119を使用しています。摘出をテストするには、他の抗体に加えて、ヘキスト33342染色を使用しています。
- 1×PBSで細胞を洗浄する。死細胞を染色し、分析から除外するために、1％FBSおよびヨウ化プロピジウム（PI）（1μg/ ml）を含む0.5 mlのPBS中に細胞を再懸濁。
- 流れcytrometric分析を実施する。フローサイトメーターの調整と補償のために最初に単一の色に染色し、染色していない対照細胞を分析します。
胎児肝臓赤芽球の精製
注：E13からE15時限妊娠マウス（C57BL / 6）に使用して胎児の肝臓。 E13.5肝臓はCFU-E前駆体の収量を最大にするために好ましい。時限妊娠マウスを得るためには、6〜8週齢の雄と雌のマウスは1ケージ（1つまたは2つの雌と通常1オス）に入れた。女性の膣のプラグは交尾が成功したかどうかを判断するために次の日の朝にチェックした。妊娠の最初の日は、プラグが検出された後の一日でした。
ウイルスコードするcDNAまたはshRNAで4形質導入
形質導入TER119陰性マウス胎児肝臓赤芽球の5。文化
フローサイトメトリー分析のために培養された胎児肝細胞の染色6。
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Representative Results
図1は、実験的な戦略の概要を説明します。プロトコルは、端末赤血球生成の初期および後期段階でのシグナル伝達分子の機能を標的とするための2つの独立した条件で構成されています。 TER119陰性胎児肝芽球は、E13.5マウス胎児から精製した。胎児肝臓赤血球系細胞の前および精製後のフローサイトメトリー分析により、精製が（ 図2Aおよび2B）効率的であったことを実証した。端末赤血球生成（ 図1の破線）の初期段階には、ウイルス形質導入後、細胞を12時間Epoを含まない培地（SCF培地）中で培養した。この期間に、細胞は形質導入された細胞で観察された有意なアポトーシス（GFP陽性）（ 図3）と最小限の分化（ 図2C）を示した。細胞は（EPO含有培地に移した後の図4を区別するために開始した直ちに形質導入（ 図1、実線及び図5）後のEpoを含む培地で培養した細胞と同様であった、強い>）。両方の方法でのEPOを含む培地で2日間培養の間、（CD71 低 TER119 低い ）赤血球前駆細胞の大部分は2日目（CD71 高 TER119 高い ）（ 図4Aおよび図上のトランスフェリン受容体の誘導（CD71）およびTER119を示した図5（a））。除核は、ヘキスト高 TER119 高い （赤芽球）によって観察されるように、2日目に発生したヘキスト低 TER119 高い （網状赤血球）（ 図4B及び図5B）。これは、EPO（実線）からすぐに細胞培養が細胞より分化と摘出のために比較的より効率的であったことは注目に値するSCF培地（破線）で培養された最初の。
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図1実験戦略の概略図。破線と実線はそれぞれ、端末赤血球生成の初期および後期段階でのシグナル伝達分子を研究するための方法を表す。
マウス胎児肝臓赤血球細胞の図2のフローサイトメトリー解析TER119負赤芽球の精製前後の。 TER119およびCD71で染色した（A）総胎児肝細胞（B）精製TER119陰性細胞TER119とCD71で染色した。（C）精製TER119陰性細胞のSCF培地で12時間培養後。 プリーズEこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
12時間EPO-培地（SCF培地）中で培養後、アポトーシスの図3のフローサイトメトリー分析。 （AB）TER119負赤芽球は、緑色蛍光タンパク質（GFP）（B）をコードする対照レンチウイルス（A）またはレンチウイルスで形質導入した。 GFP陽性の形質導入された細胞の割合はSCF培地での培養の12時間後に発表された。（B）からのGFP陰性（C）におけるアポトーシスおよび陽性（D）の細胞（CD）分析。
形質導入erythroblaの分化および摘出の図4のフローサイトメトリー分析Epoの媒体続いSCF培地で培養STS。図3のように（A）は、GFP陰性および陽性細胞は、細胞が追加の48時間のEpo培地及び培養に変更した後のCD71およびTER119を使用して分化分析のためにゲートした。（B）除核アッセイはヘキストと示されたのTER119を用いてエポ培地で48時間後の細胞。
エポ培地で培養された形質導入を直接赤芽球の分化と脱核の図5のフローサイトメトリー分析。 （A）TER119陰性細胞は、GFPをコードするレンチウイルスを形質導入した。細胞は、直ちに形質導入後のEpo培地中で培養した。 GFP陰性および陽性細胞の細胞分化分析は、培養48時間後にCD71およびTER119を用いて行った。 （B）の除核アッセイ培養48時間後にヘキストとTER119を使用して示さ細胞。
| 原料 | 数量 |
| IMDM | 41.385ミリリットル |
| ウシ胎児血清（FBS、15％） | 7.5ミリリットル |
| B-メルカプトエタノール（10 -4 M） | 50μlの（IMDM中10 -1 Mストック） |
| ペニシリン - ストレプトマイシン（1％） | 500μlの |
| グルタミン（2 mM）を | 500μlの |
| 幹細胞因子（50 ng / mL）を | 100ng / mlのストックから25μlを |
| FLT3リガンド（FLT-3L）（30 ng / mL）を | 50ng / mlのストックから30μlの |
| IL-6（20 ng / mL）を | 100ng / mlのストックからの10μl |
表1成分FOR SCF培地（EPOを含まない培地）。
| 原料 | 数量 |
| IMDM | 36.3ミリリットル |
| FBS（15％） | 7.5ミリリットル |
| ウシ血清アルブミン（BSA、10％） | 5ミリリットル（IMDM中10％ストック） |
| インスリン（10 mg / ml）を | 4℃のストックからの50μl |
| ホロトランスフェリン（200 mg / ml）を | 200μlの（水中50 mg / mlの、-20℃のストック°） |
| B-メルカプトエタノール（10 -4 M） | 50μlの（IMDM中10 -1 Mストック） |
| ペニシリン - ストレプトマイシン（1％） | 500μlの |
| 2mMのグルタミン | 500μlの |
| エポ（2 U / ml）を | 33μlの（3,000 U / mlのストック） |
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Discussion
ここでは、時系列的に、マウス胎児肝臓端末赤血球生成を分析する独自のシステムを提示する。異なる培養条件の適用を通じて、首尾よく初期および後期段階での端末赤血球生成を解剖した。これは、複数の機能を有する遺伝子のメカニズムを決定するために特に重要である。例えば、RacのGTPアーゼは、端末赤血球生成の各段階において重要な役割を果たしている。端末赤血球生成に影響を与える細胞の分化および増殖の初期段階でのRac GTPアーゼの阻害。一方、細胞分化、増殖、または生存13に影響を与えることなく、端末赤血球生成ブロック摘出の後期段階でのRac GTPアーゼの活性を阻害する。
このプロトコルのいくつかの重要なステップは、心に留めておくべきである。まず、E13.5マウス胎児肝臓TER119陰性細胞の精製のために好ましい。古い胚が使用されるが、proportiすることができます総胎児肝細胞の前駆細胞のうちに低くなります。第二に、機構は明らかではないが、それは、除核のために重要であるので、Epoを媒体に低エンドトキシンBSAを使用することが重要である。フィブロネクチンは、赤血球生成15のために重要であると報告されたが、第三には、フィブロネクチン被覆プレートの使用は任意であることがわかった。それは私たちのシステムでは、細胞の増殖、分化、または除核には影響しません。細胞は、免疫染色などの特定の用途のために重要であり得るプレートに付着するが、フィブロネクチンは有用であり得る。第四に、網状赤血球や後期赤芽球のわずかな割合は、形質導入された細胞で実施したGFPシグナルを失う可能性があります。代わりに、私たちは、形質導入細胞を追跡するためのマーカーとしてヒトCD4を使用しています。最後に、これまでの報告では、1日目11日に培養物からエリスロポエチンを除去することをお勧めします。細胞に有意な差は認められなかったので、私たちはそうすることは必要ではなかったことがわかったまたはエリスロポエチンの除去なしに分化、増殖、または摘出。逆に、媒体の変化が細胞消失を引き起こすことがある。
同じ戦略を用いて、最近の端末赤血球生成の異なる段階（チャオら 、未発表の結果）に新規な機能を果たしている30以上の遺伝子を発見しました。 RacのGTPアーゼと同様に、これらの遺伝子の多くは、端末赤血球生成の初期および後期段階の両方で二重の機能を果たしている。これは、端末赤血球産生におけるシグナル伝達経路が密接に相互接続されていることを示しています。改造アクチン細胞骨格と核の凝縮に関与する遺伝子は、端末赤血球生成を通じてこれらのシグナル伝達経路の重要な役割のために二重の機能を果たしている傾向があるものである。一方、ヘム合成および赤血球特異的な形質膜の生成などの経路に関与する遺伝子は、赤血球生成端子16,17の初期段階においてより制限する傾向がある。 THERもののeは、細胞株の形質導入、および長い半減期を有するタンパク質をノックダウンすることの難しさに比べて比較的低い感染効率としてこの実験戦略の一定の制限である、私たちは、遺伝子機能解剖の重要性を考えれば私達のシステムを使用するルーチンの方法を推奨端末赤血球生成の異なる段階にある。さらに、この実験戦略は、他の用途に使用することができる。例えば、SCF培地の培養条件を用いて、そのような自己再生または分化などの幹細胞特性の維持に関与する遺伝子を分析することができた。後期赤血球生成を分析するための方法を使用して、人はまた、オルガネラを除去するためのオートファジーに関与し得る遺伝子の機能を決定することができる。
広義には、この実験的な戦略は、巨核球や骨髄造血などの他の造血系の機能的な調査に適用することができます。これの成功のアプリケーションだtrategyはまた、血液細胞の異なる発達段階における特定の遺伝子の分子機構の隠れた側面を明らかにするであろう。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、NIH R00HL102154によってサポートされ、P智への血液学者賞のアメリカの社会ました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
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