Summary
Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır.
Abstract
Eritropoez hızla birimleri oluşturan eritroid koloni (CFU-Es) bölünmesiyle ardından taahhüt eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es) ile başlayan dinamik bir süreç gerektirir. CFU-Es sonra hücreler morfolojik olarak algılanabilen ve genelde bağlantı eritroblastlarda olarak adlandırılır. Terminal eritropoezin çalışma için zorluklardan biri kronolojik bir şekilde gen fonksiyonlarını incelemek için deneysel yaklaşımların olmaması. Bu protokol, biz terminali eritropoezin erken ve geç evrelerinde gen fonksiyonlarını belirlemek için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Bu sistemde, bir fare fetal karaciğer Ter119 (olgun eritroid hücre işaretleme maddesi) negatif Eritroblastlar saflaştırılmış ve cDNA veya ilgi duyulan genler için küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile transduse. Hücreler, bundan sonra, eksojen cDNA veya shRNAs izin verirken 12 saat boyunca da projenitör sahne korumak Eritropoietin (EPO) dışındaki ortam ihtiva eden büyüme faktörleri kültürlendiifade etmek. Hücreler, egzojenez genetik malzeme, daha ifade edildi, hücre farklılaşmasını ve çoğalmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ortamına değiştirildi. Bu protokol, terminal eritropoezin erken evre gen fonksiyonlarının analizini kolaylaştırır. Geç aşama terminali eritrosit oluşumunu çalışmak için, hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. Transduse genetik malzeme olarak ifade edilmiştir, bu durumda, hücreler daha önce, terminal eritropoezi geç dönem için farklılaştırılmıştır. Biz terminali eritropoezin farklı aşamalarında detaylı gen fonksiyonlarını anlamak yardımcı olacak bu stratejinin genel bir uygulama önerilir.
Introduction
Eritrosit oluşumu, eritrositler olgunlaşması için multipotent hematopoetik kök hücrelerin farklılaşması işlemidir. Bu kademeli işlem, ilgili eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es), hızla bölünen eritroid koloni oluşturan birimler (CFU-Es) ve morfolojik olarak algılanabilen birçok eritroblast 1,2 oluşumunu kapsamaktadır. CFU-E projenitör hücrelerin Terminal eritropoezis sıralı eritropoietin bağımlı ve bağımsız aşamaları 2,3 içerir. Terminal eritropoezi erken aşamasında, eritropoetin (EPO), hücre yüzeyi üzerinde kendi reseptörüne bağlanan ve hücre apoptozu önlemez ve hızlı hücre bölünmesi ve gen ekspresyonunu teşvik 1,4 aşağı doğru sinyal yollarının bir dizi yol açar. Terminal eritropoezin geç evrede, Eritroblastlar derece yoğun çekirdeklerin 5 terminali hücre döngüsü çıkmak, kromatin ve çekirdek yoğunlaşmayı ve ekstrüzyon tabi.
Terminalin anlayışımızeritropoezis sayesinde büyük ölçüde in vitro birkaç başarılı kullanımı ve in vivo fare modellerinde 6-9 büyük ölçüde son birkaç on yıl içinde artmıştır. Bu modeller arasında, fare, fetal karaciğer eritroblast vitro kültür içinde hücre arıtma için hızlı çoğalma ve farklılaşma dahil olmak üzere birçok avantaj kolaylığı sağlar ve insan erythropoiesis 10,11 yakından taklit eder. Bu sistemde, fare fetal dokulardan eritroid progenitör hücrelerin çok sayıda kolay Ter119 tek aşamada arıtıldıktan (olgun eritroid hücreler için bir işaret) negatif eritroblast izole edilebilir. Eritroblast iki günlük kültür boyunca, bu, hücrelerin farklılaşması Transferin reseptörüne (CD71) ve Ter119 antijenin 12 yüzey ifadesine dayalı akış sitometrik analizi ile izlenebilir. Buna ek olarak, terminal farklılaşma eritroblast enükleasyonu 1 bir DNA makinesi (Hoechst 33342) tarafından tespit edilebilir3. Bundan başka, arıtılmış ataları genetik olarak cDNA veya erythropoiesis 11,13,14 gen ekspresyonunun fonksiyonlarının mekanistik çalışmalar kolaylaştırır ve ilgilenilen genler için, küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile modifiye edilebilir.
Bu terminali eritropoezin farklı aşamalarında gen işlevleri tanımlamak zor olduğundan, diğer taraftan, hızlı hücre büyüme oranı iki ucu keskin kılıç olabilir. Çoğu durumda, bu cDNA'lar veya shRNAs ifade zaman terminalinde eritropoezi erken aşamasında belirli bir gen fonksiyonları, hücreler daha önce ilk aşamayı belirlemek zordur. Bu sorunu çözmek için, biz terminali eritropoezin erken ve geç evreleri incelemek için eşsiz bir sistem geliştirdi. Terminal eritropoezi erken bir aşaması için, genetik olarak tadil edilmiş Ter119 negatif Eritroblastlar EPO içermeyen ortam içeren ama kök hücre faktörü (SCF), IL-6 ve FLT3 kültürlendiligand kendi progenitör statüsünü korumak ve ifade 13 transdüse cDNA'lan veya shRNA izin vermek. Hücreler, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ihtiva eden ortam ile değiştirildi. Hücrelerin ayırt başladı Bu şekilde, transduse ya da cDNA'lar shRNAs daha önce ifade edildi. Terminal eritropoezi geç aşaması için, negatif Ter119 Eritroblastlar EPO transdüksiyon sonra hemen sıvı ihtiva eden kültürlenmiştir. Bu nedenle, bir terminal eritropoezi geç evrede, ilgi konusu genlerin fonksiyonlarının analiz edebilir. Özetle, bu sistemin geniş bir uygulama terminali eritropoezin farklı aşamalarında teşrih gen fonksiyonlarını yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan deneyler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
Kültür ortamına hazırlanması 1.
- Fibronektin çözeltisi hazırlayın. , Insan fibronestini (1 mg) ile bir şişe su 1 ml ilave edilir. Çalkalama olmaksızın 30 dakika boyunca doku kültürü kaputu çözeltisi bırakın. 20 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona yapmak için PBS, 50 ml toplam sıvı transferi ve yavaşça karıştırın. Plakası (aşağıya bakınız) kaplamadan önce fibronektin çözelti taze olun.
- Epo serbest ortamda (SCF orta) 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 1'de listelenen katkı maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- EPO ihtiva eden bir ortamda 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 2'de sıralanan terkip maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir. 2. Fibronektin Kaplı Plaka
- 6 çukurlu bir levha (ya da 12 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna 0.5 ml) her bir oyuğuna, 1 mi fibronektin solüsyonu ekleyin. 1 saat boyunca doku kültürü kaputu plaka bırakın.
- Iki kez steril su ile kuyu durulayın ve hava plaka kurulayın.
- Plaka sarın ve 4 ° C'de soğuk odada kaydedin.
- Toplam Fetal karaciğer hücrelerinin hazırlanması
- Mou KurbanCO 2 inhalasyon ve servikal dislokasyon ile se. Dezenfeksiyonu için% 70 etanol ile karın püskürtün. Rahim kaldırmak için diseksiyon makas ile karın açın. 1x PBS rahim yıkayın.
- Bir doku kültürü kaputu ve otoklavlanmıştır araçlarını kullanarak steril koşullar altında fetusa incelemek ve 1x PBS içinde yıkayın.
- Fetusundan fetal karaciğerleri teşrih. Yavaşça başka bir forseps ile vücuttan uzak fetal karaciğer (renkli pembe) çekin, bir forseps ile fetusun gövdesini tutun. Ilişkili fibrotik dokuların kaldırmak için forseps ile fetal karaciğer temizleyin. % 10 fetal sığır serumu içeren taze 1x PBS içine tüm cenin karaciğerleri yerleştirin.
- Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme fetal karaciğerleri bozabilir.
- 50 ml konik tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. 5 dakika boyunca 800 x g'de Pelet hücreleri.
- FBS, süpernatan aspire edin ve% 10 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri (yaklaşık 8 E 13.5 cenin karaciğeri) ml başına.
- Negatif Ter119 eritroblast saflaştırılması
- 15 dakika boyunca buz üzerinde sıçan IgG'si ile hücreleri (0.2 mg / ml) bloke eder.
- , Yıkama ya da santrifüj olmadan hücre süspansiyonu (1 ug / ml) biyotinile anti-Ter119 antikor ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 800 x g'de 10% FBS (1:10) ve santrifüj ile 1x PBS içinde yıkayın. % 10 FCS içeren 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- 75 ul ekle manyetik parçacıklar ile konjüge edilmiş ve buz üzerinde 10 dakika inkübe streptavidin.
- PBS% 10 FBS içeren 2.5 ml hacim ekleyin. Alt tüp yuvarlak 5 ml'lik polipropilen içine hücre süspansiyonu aktarın.
- Manyetik hücre sınıflandırma düzeneğinin içine takın ve tüp, 10 dakika için inkübe edilir. Ter119 pozitif hücreler, tüp yan ekleme. Serbest Ter119 negatif Eritroblastlar süspansiyon halinde kalır.
- Alt tüp yuvarlak yeni bir 5 ml'lik polipropilen içine hücre süspansiyonu dökün.
- Tekrar kalan Ter119 pozitif hücrelerini kaldırmak için 3.2.6 ve 3.2.7 adımları.
- 5 dakika boyunca 800 x g'de Pelet hücreleri. Süpernatant aspire. % 10 FBS içeren 1 ml PBS içerisinde yeniden süspanse edin ve hücreleri, tripan mavi ile canlı hücreleri sayın.
- 3-5 de saflaştırılmış Ter119 negatif cenin karaciğer hücreleri levhası X 10 5/12-gözlü plaka kaplanmış bir fibronektin (farklı plaka kullanılması durumunda, hücre sayısını ayarlamak) olarak.
- Viral iletimini kolaylaştırmak için 10 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Sıkma 37 ° C 1-1.5 saat boyunca 800 x g hızında, lentivirüsleri ya da retrovirüsler, kodlayan cDNA ya da shRNA ile hücreleri enfekte etmektedir.
- (Şekil 1 kesik çizgiler) terminali eritropoezin erken evrede gen fonksiyonlarını test etmek için.">
Kültür 12 saat boyunca EPO barındırmayan ortam (SCF ortam) olarak transduse edilmiş hücrelerin transduse genler ve progenitör bir durumun muhafazası ekspresyonunu sağlamak için. - 5 dakika boyunca 800 xg'de hücreleri santrifüj. Süpernatant aspire. 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna ortam içeren 1 ml Epo süspansiyon hücreleri.
- 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir.
- Terminal eritropoezde (Şekil 1 katı çizgiler) geç evrede Test gen fonksiyonları.
- Kültür EPO ihtiva eden bir ortam içinde hemen transduse hücreleri.
- 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir.
- Yıkayın ve 1x PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon. Hasat akım sitometri analizi için 2 x 10 5 kültür hücreleri.
- Inkübekaranlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca florofor konjuge antikor ile hücreler. Farklılaşmasını test etmek için APC konjuge anti-CD71 ve PE konjüge anti-Ter119 kullanın. Enükleasyonu test etmek için, diğer antikorlar yanı sıra, Hoechst 33342 boyası kullanın.
- 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreler ölü hücreleri boyamak ve analiz dışında tutmak için% 1 FBS ve propidyum iyodür (PI) (1 ug / ml) ihtiva eden 0.5 ml PBS içerisinde süspansiyon hücreleri.
- Davranış akış cytrometric analizi. Sitometresinin akışının ayarlanması ve tazminat için ilk tek renk lekeli ve lekesiz kontrolü hücreleri analiz.
Fetal karaciğer eritroblast 3. saflaştırılması
NOT: E15 E13 dan Kullanım fetal ciğeri hamile fareler (C57BL / 6) zaman aşımına. E 13.5 karaciğerler CFU-E progenitörlerin verimini en üst düzeye çıkarmak için tercih edilmektedir. Gebe fareler zamanlı elde edilmesi için, 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler bir kafes (bir ya da iki kadın genellikle bir erkek) yerleştirilmiştir. Kadın vajinal fişler çiftleşme başarılı olup olmadığını belirlemek için ertesi sabah kontrol edildi. Fiş bulunduktan sonra gebeliğin ilk günü gündü.
Virüsler kodlayan cDNA ya da shRNA 4. İletimi
Kalıt aktarımlı Ter119 Negatif Fare fetal karaciğer eritroblast 5. Kültür
Akış Sitometrik Analizi Kültür Fetal Karaciğer Hücreleri 6. Boyama
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, deneysel stratejileri açıklamaktadır. Bu protokol, terminal eritropoezi erken ve geç aşamalarında sinyal molekülleri Hedef alma fonksiyonları için iki bağımsız koşulları oluşur. Ter119 negatif Fetal karaciğer Eritroblastlar E 13.5 fare fetüs saflaştırılmıştır. Fetal karaciğer eritrosit önce ve saflaştırma işleminden sonra, akış sitometrik analizi ile arıtma (Şekil 2A ve 2B) etkili olduğunu gösterdi. Terminal erythropoiesis (Şekil 1, kesik çizgiler) arasında erken bir aşaması için, viral transdüksiyon sonra, hücreler 12 saat boyunca EPO içermeyen ortamda (SCF ortamı) kültürlenmiştir. Bu süre içinde, hücreler transdüksiyona tâbi tutulmamış hücreler gözlemlenen anlamlı bir apoptoz (GFP pozitif) (Şekil 3) ile en az farklılaşmasını (Şekil 2C) göstermiştir. Hücreler (EPO-içeren ortama transfer edildikten sonra Şekil 4 ayırt başladı Güçlü>), (Şekil 1, düz çizgiler ve Şekil 5) EPO transdüksiyon sonra hemen ortamı içeren kültürlenmiş hücrelere benzer olan. Her iki yöntemde EPO ihtiva eden bir ortamda 2 gün boyunca kültürü, (CD71 düşük Ter119 düşük) eritroid progenitör hücrelerin çoğu gün 2 (CD71 yüksek Ter119 yüksek) (Şekil 4A ve Şekil üzerindeki transferin reseptörünün uyarılmasının (CD71) ve Ter119 sergiledi 5A). Hoechst yüksek Ter119 yüksek (Eritroblastlar) Hoechst düşük Ter119 yüksek (retikülosit) (Şekil 4B ve Şekil 5B) ile gözlendiği haliyle Enükleasyon, 2. günde meydana geldi. Bu Epo'nun (düz çizgi) hemen hücreler kültür hücrelerden daha farklılaşması ve enükleasyon nispeten daha etkili olduğu dikkat çekmektedir SCF ortamında (kesikli çizgi) kültüre ilk.
"" width = "500" src = "/ files / ftp_upload / 51894 / 51894fig1highres.jpg 5in />:" içerik-width = fo "? Güre 1
Şekil 1. Deney stratejisi şematik bakış. Kesik ve katı çizgiler sırasıyla Terminal eritropoezin erken ve geç dönemlerinde sinyal molekülleri incelemek için yöntemlerini temsil eder.
Farenin Şekil 2. flow sitometri analizleri, fetal karaciğer eritroid hücreler önce ve Ter119 olumsuz eritroblast arıtıldıktan sonra. (A), Ter119 ve CD71 ile lekelenmiş toplam fetal karaciğer hücreleri. Ter119 ve CD71 ile boyanmıştır (B) Temizlenmiş Ter119 negatif hücrelerin. (C) Saf Ter119 SCF bir ortam içinde 12 saat kültürden sonra negatif hücreleri. pleasE bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
12 saat boyunca Şekil 3. Akış EPO içermeyen ortam (SCF ortamda) olarak kültürden apoptosis sitometrik analizi. (AB) Ter119 negatif Eritroblastlar yeşil floresan protein (GFP), (B), kontrol kodlayan lentivirüsler (A) ya da lentivirüs ile transdüse edilmiştir. GFP pozitif kalıt aktarımlı hücrelerin yüzdesi TFA ortam içinde kültür 12 saat sonra belirlenmiştir. (B) GFP negatif (C) 'apoptoz ve pozitif (D) hücreleri (CD) testi.
Transdüksiyona erythrobla farklılaşma ve anükleasyon Şekil 4. Akım sitometri analiziEPO aracını takiben TFA ortamında kültürlenmiştir STS. Şekil 3'te olduğu gibi (A) GFP negatif ve pozitif hücreleri hücreler ek bir 48 saat boyunca ortam EPO ve kültüre edildikten sonra değiştirildi ve CD71 Ter119 kullanılarak diferansiyasyon analiz için geçitlendi. (B) tahlili Enükleasyon Hoechst ve belirtilen bir Ter119 kullanılarak EPO ortam içinde 48 saat sonra, hücreler.
Epo ortamda doğrudan kültüre Transdüksiyona eritroblast farklılaşma ve anükleasyon Şekil 5. Akım sitometri analizi. (A) GFP negatif hücrelerin Ter119 kodlayan lentivirüs ile transdüse edilmiştir. Hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. GFP negatif ve pozitif hücrelerin hücre farklılaşması analiz, kültür içinde 48 saat sonra CD71 ve Ter119 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (B) Enükleasyon deneyiKültür içerisinde 48 saat sonra, ticari olarak Hoechst'den Ter119 kullanılarak belirtilen hücreleri.
| Bileşen | Miktar |
| IMDM | 41,385 mi |
| Fetal sığır serumu (FBS,% 15) | 7.5 mi |
| B-merkaptoetanol (10 -4 M) | 50 ul (IMDM içinde 10 -1 M stok) |
| Penisilin-Streptomisin (% 1) | 500 ul |
| Glutamin (2 mM) | 500 ul |
| Kök hücre faktörü (50 ng / ml) | 100 ng / ml 'stoktan 25 ul |
| FLT3 ligandı (FLT-3 L) (30 ng / ml) | 50 ng / ml stok, 30 ul |
| , IL-6 (20 ng / ml) | 100 ng / ml stok, 10 ul |
Tablo 1. Madde for SCF orta (EPO ücretsiz orta).
| Bileşen | Miktar |
| IMDM | 36.3 mi |
| FBS (% 15) | 7.5 mi |
| Sığır Serum Albumin (BSA,% 10) | 5 ml (% 10 IMDM stoku) |
| İnsülin (10 mg / ml) | 4 ° C'de 50 ul stok |
| Holo-transferini (200 mg / ml) | 200 ul (50 mg / ml su içerisinde, -20 C ° stokta) |
| B-merkaptoetanol (10 -4 M) | 50 ul (IMDM içinde 10 -1 M stok) |
| Penisilin-Streptomisin (% 1) | 500 ul |
| 2 mM Glutamin | 500 ul |
| EPO (2 U / ml) | 33 ul (3.000 U / ml stok) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kronolojik fare fetal karaciğer terminali eritropoezi analiz etmek için eşsiz bir sistem sunuyoruz. Farklı kültür koşulları uygulama sayesinde, başarıyla erken ve geç evrelerinde terminal eritropoezi disseke. Bu çok işlevli genlerin mekanizmaların belirlenmesi özellikle önemlidir. Örneğin, Rac GTPazlar terminali eritropoezin farklı aşamalarında önemli rol oynar. Terminal eritropoezis etkiler, hücre farklılaşması ve çoğalması erken evrede Rac GTPases engellenmesi. Diğer yandan, hücre farklılaşmasını, proliferasyonunu, 13 veya hayatta kalmasını etkilemeden, terminal blokları eritropoiez enükleasyonu geç evrede rac GTPases aktivitesini inhibisyonu.
Bu protokolde birkaç önemli adımlar akılda tutulmalıdır. İlk olarak, bir fare E 13.5 fetal karaciğer Ter119 negatif hücrelerin saflaştırılması için tercih edilir. Eski embriyolar kullanılır ama proporti olabilirTotal fetal karaciğer hücrelerinin üzerinden progenitörlerinin düşük olacaktır. Mekanizma açık değildir, ancak İkinci olarak, bu, bu enükleasyonu için kritik olduğu EPO ortamda düşük endotoksin BSA kullanılması önemlidir. Fibronektin eritropoezde 15 için önemli olduğu bildirilmiştir, ancak Üçüncüsü, biz fibronektin kaplı plakanın kullanımı isteğe bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Bizim sistemi içinde hücre çoğalmasını, farklılaşmasını veya enükleasyonu etkilemez. Hücreler, imüno gibi belirli uygulamalar için de önemli olabilir plakasına bağlamak için Ancak, fibronektin yararlı olabilir. Dördüncü, retikülositlerde veya geç evre eritroblast küçük bir yüzdesi dönüştürülmüş hücreler ile gerçekleştirildi GFP sinyalini kaybedebilirsiniz. Veya biz transduced hücreleri izlemek için bir belirteç olarak insan CD4 kullanın. Son olarak, önceki raporlar günde 1 11 kültüründen eritropoietin çıkarılmasını tavsiye etti. Hücre üzerinde anlamlı bir fark yoktu çünkü biz bunu yapmak gerekli değildi bulunduveya eritropoietin kaldırılması olmadan farklılaşma, çoğalma, ya da enükleasyon. Aksine, ortam değişikliği, hücre kaybına neden olabilir.
Aynı strateji kullanarak, son zamanlarda, terminal eritropoezi farklı aşamalarında (Zhao ve ark., Yayınlanmamış sonuçlar) içinde yeni işlevleri oyun 30'dan fazla gen keşfedilmiştir. Rac GTPases gibi, bu genlerin pek çok terminal eritropoezin hem erken ve geç evrelerinde ikili işlevleri oyun. Bu terminal eritropoiezde sinyal yolları yakından birbirine olduğunu gösterir. Remodeling aktin hücre iskeleti ve nükleer yoğunlaşma ile ilgili genler terminali eritropoezde boyunca bu sinyal yollarının kritik rolleri nedeniyle ikili işlevleri oyun eğiliminde olanlardır. Diğer taraftan, böyle bir hema sentezi ve eritroid spesifik plazma zarının üretimi gibi yollar ile ilgili genler, terminal eritropoiezde 16,17 erken aşamasında daha kısıtlı olması eğilimindedir. Ther rağmenE böyle nispeten düşük enfeksiyon hücre hatlarının iletimi karşılaştırıldığında verimlilik ve uzun yarılanma ömrü ile proteinleri aşağı vurma güçlüğü gibi bu deneysel stratejinin bazı sınırlamalar vardır, biz gen fonksiyonlarını diseksiyon önem verilen bizim sistemini kullanmak için rutin bir uygulama tavsiye Terminal eritropoezin farklı aşamalarında. Buna ek olarak, bu deneysel strateji başka uygulamalarda da kullanılabilir. Örneğin SCF kültür ortamı koşulları kullanılarak, örneğin kendini yenileme ya da farklılaşma gibi kök hücre özelliklerinin korunmasının katılan genler analiz edilebilir. Geç aşama eritrosit analiz etmek için kullanılan yöntem kullanılarak, bir de organel uzaklaştırılması için Otofaji dahil edilebilir genlerin işlevini belirlemek de mümkündür.
Genel olarak, bu deneysel strateji ve bu megakaryopoiesis miyelopoezle gibi diğer hematopoetik sistemlerin fonksiyonel soruşturma uygulanabilir. Bu s başarılı uygulamatrategy aynı zamanda kan hücrelerinin farklı gelişim aşamalarında spesifik genlerin moleküler mekanizmaların gizli tarafını ortaya çıkaracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R00HL102154 tarafından desteklenen ve P Ji Hematoloji bilim adamı ödülü bir Amerikan Derneği oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100x |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J.
