Abstract
Synaptisk transmission er en ekstremt hurtig proces. Potentiel handling drevet tilstrømning af Ca 2 + ind i den præsynaptiske terminal, gennem spændingsafhængige calcium kanaler (VGCCs) placeret i frigivelsen ansigt membranen, er den udløsende faktor for vesikelfusion og neurotransmitterfrigivelse. Afgørende for den hurtige synaptisk transmission er den rumlige og tidsmæssige synkront mellem ankomsten af handling potentiale, VGCCs og neurotransmitterfrigivelsen maskineri. Evnen til at optage direkte Ca2 + strømme fra frigivelse ansigt membran af individuelle præsynaptiske terminaler er afgørende for en præcis forståelse af forholdet mellem præsynaptiske Ca 2 + og neurotransmitterfrigivelse. Adgang til den præsynaptiske frigivelse ansigt membran til elektrofysiologiske optagelse er ikke tilgængelig i de fleste præparater og præsynaptiske Ca 2 + post er blevet karakteriseret ved hjælp af billeddannende teknikker og makroskopisk strøm overvåNTS - teknikker, som ikke har tilstrækkelig tidsopløsning til at visualisere Ca 2 + post. Karakterisering af VGCCs direkte på enkelt præsynaptiske terminaler har ikke været muligt i det centrale synapser, og har hidtil været en succes kun opnås i bægeret-typen synapse af chick ciliære ganglion og rotte calyces. Vi har med succes behandlet dette problem i den gigantiske reticulospinal synapse af Lamprenen rygmarven ved at udvikle en akut dissocierede forberedelse af rygmarven, der giver isolerede reticulospinal axoner med funktionelle præsynaptiske terminaler blottet for postsynaptiske strukturer. Vi kan fluorescerende mærke og identificere individuelle præsynaptiske terminaler og målrette dem til optagelse. Ved hjælp af dette præparat, har vi karakteriseret VGCCs direkte ved frigivelse ansigt af individuelle præsynaptiske terminaler ved hjælp af immunhistokemi og elektrofysiologi tilgange. Ca 2 + strømme er blevet registreret direkte på udgivelsen ansigt membran of individuelle præsynaptiske terminaler, til den første af disse optagelse udføres på centrale synapser.
Introduction
Synaptisk transmission er en ekstremt hurtig og præcis proces. Virkningspotentiale invasion af den præsynaptiske terminal fører til åbning af VGCCs beliggende i frigivelsen ansigt membran, den deraf følgende stigning i præsynaptiske Ca 2 + fungerer som udløser vesikelfusion og neurotransmitterfrigivelse 1. Alle disse trin forekommer inden for hundreder af mikrosekunder 2, og derfor skal stramme rumlige kobling af VGCCs til vesikelfusion maskiner 3. Præsynaptiske Ca 2 + fluxe er primært karakteriseret ved billedteknik hjælp Ca 2 + følsomme farvestoffer 4. Omfattende Ca2 + buffere, der modulerer Ca2 + i præsynaptiske neuroner er blevet anvendt til indirekte at karakterisere forholdet mellem præsynaptisk calcium og neurotransmission 3. Hertil kommer, at modulere præsynaptiske frie Ca2 + koncentration ved uncaging Ca 2 + 5 eller optager macroscopic Ca 2 + strømme er blevet anvendt i forbindelse med foranstaltninger af vesikelfusion og / eller løsladelse; såsom kapacitansmålinger 6 eller postsynaptiske responser 2 at behandle det samme spørgsmål. Men karakterisere Ca2 + strømme direkte ved udgivelsen ansigt, faglig sektion i den præsynaptiske membran, hvor membran depolarisering oversættes til Ca2 + strømme udløser synaptisk vesikelfusion og neurotransmitterfrigivelse, er integreret for at opnå et præcist mål for Ca 2 + Kravet om synaptiske vesikel fusion. Desuden evnen direkte karakterisere Ca2 + strømme på individuelle præsynaptiske terminaler, kombineret med nøjagtige samtidige målinger af vesikelfusion og frigivelse tillader en præcis udredning af timingen forholdet mellem tidsforløbet af aktionspotentialet, præsynaptiske Ca2 + strøm, vesikelfusion og frigivelse. Adgang til frigivelse ansigt membraner ikke tilgængelig i de fleste af præsynaptiske terminaler grundet tæt anbringelsen af de postsynaptiske dendritter. Denne utilgængelighed har været en stor hindring i karakteriseringen af VGCCs idet den forhindrer direkte målinger af strøm på de enkelte præsynaptiske terminaler. Direkte karakterisering af præsynaptiske Ca 2 + strømme på de enkelte præsynaptiske terminaler, har hidtil ikke været muligt i det centrale synapser, og er kun blevet nået i to calyceal typen præsynaptiske terminaler; bæger-typen synapser af chick ciliære ganglion 7-10 og rotte calyces 11,12. I alle andre præsynaptiske terminaler, herunder den gigantiske reticulospinal synapse i Lamprenen rygmarven 13 har manglende adgang til den præsynaptiske frigivelse ansigt membran nødvendiggjort brug af indirekte metoder som Ca2 + imaging at studere præsynaptiske Ca 2 + flusmidler.
Figur 1. Lamprenen gigant reticulospinal synapser. (A) Tværsnit af lampret rygmarv indikerer dorso-ventrale orientering. Reticulospinal axoner er markeret med grøn asterix. (B), 3-D rekonstruktion af reticulospinal synapse i Lamprenen rygmarven viser præsynaptiske reticulospinal Axon gør mange en passant kontakter (markeret med grønne pile) på den postsynaptiske neuron 13. Præsynaptiske terminaler er blevet mærket med Alexa Fluor 488 hydrazid konjugeret phalloidin (grøn), mens den postsynaptiske neuron er blevet fyldt med Alexa Fluor 568 hydrazid (rød).
Lampret gigantiske reticulospinal axoner, der ligger i den ventrale region af rygmarven parallelt med rostral-caudale akse Figur 1a, formular multipel en passant synaptiske kontakter på neuroner ispinal ventrale horn 14 Figur 1b 13. Makroskopisk hel-celle Ca2 + strømme er blevet optaget fra reticulospinal axoner i den intakte rygmarv 13,15. Men tidligere blinde forsøg på direkte måling af Ca 2 + strømme i reticulospinal axoner i ubeskadiget lampret rygmarven ved hjælp af celle-attached patch-clamp-teknik har vist sig forgæves 13 på grund af manglende adgang til den præsynaptiske frigivelse ansigt membran på grund af de modstridende postsynaptiske processer Figur 1b. Frigivelsen flade membran er tidligere blevet gjort tilgængelig ved fjernelse af den postsynaptiske neuron 11, mekanisk forstyrrelse af synapsen før optagelse 12 eller enzymatisk behandling kombineret med mekanisk dissociering 16. I betragtning af den komplekse tilrettelæggelse af rygmarven, ville det være særdeles vanskeligt at identificere den postsynaptiske neuron og trække den mekanisk eller forstyrre the synapser. Derfor besluttede vi at bruge enzymatisk behandling 17 efterfulgt af mekanisk dissociation.
Ved hjælp af denne metode, har vi udviklet en akut dissocierede forberedelse af Lamprenen rygmarv, der giver levedygtige isolerede reticulospinal axoner med funktionelle præsynaptiske terminaler blottet for enhver postsynaptiske processer, hvilket giver ubegrænset adgang til individuelle præsynaptiske terminaler. I forbindelse med en standard omvendt mikroskop og fluorescens billeddannelse, det giver os mulighed for at identificere og målrette individuelle fluorescensmæssigt identificerede præsynaptiske terminaler med en patch pipette indeholder en optagelse løsning, der isolerer Ca 2 + strømme figur 4C og figur 4d, til optagelse via celle- fastgjort spændings-clamp-teknikken. Ca 2 + strømme er blevet registreret direkte på den præsynaptiske frigivelse ansigt membran af individuel præsynaptiske terminaler Figur 4f. Dette er en significant gennembrud inden for synaptisk transmission, da det er den første optagelse kan udføres på centrale synapser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af poly-D-lysinhydrobromid
- Klargør 1 mg / ml poly-D-lysin-hydrobromid i 0,1 M borat-buffer (pH 8,5).
- Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
2. Poly-lysin Overfladebehandling af Dækglas
Bemærk: Foretag alle rengøring og coating trin i en laminar strømning kammer.
- Placer dækglas i en petriskål indeholdende 1 N saltsyre (HCI) i 2 timer.
- Aspirér al HCI og skyl med 70% ethanol (EtOH) 2-3x.
- Efterlad i 70% EtOH i 1 time.
- Aspirér al 70% EtOH og skyl med 100% EtOH 2-3x.
- Efterlad i 100% EtOH i 2 timer. Aspirér al EtOH.
- Tørres med filtrerpapir og lufttørre i et par sekunder.
- Placer O / N i 1 mg / ml poly-lysin løsning.
- Skyl dækglas næste dag med millipore-vand 4-5x.
- Luft tør poly-lysin overtrukne dækglas på glas ruller i en ren petriskål.
- For immunohistochemistrå bruge 35 x 10 mm petriskål låg. Forbered Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) foret retter ved at hælde PDMS (elastomer og hærder 10: 1 efter vægt) i skålen til en tykkelse på 0,3 cm, og lad det indstillet til 30 ° CO / N. Når dette er indstillet, skæres en 2 cm med 1 cm indsat i PDMS. Ren og pels indsatte med poly-lysin følge de samme trin som nævnt ovenfor for dækglas.
- Opbevar poly-lysin coatede dækglas og retter dækket inde i laminar strømning kammeret, indtil brug (op til 2 uger, men opnå de bedste selvklæbende resultater ved at forberede regelmæssigt hver 3-4 dage).
- Forbered en PDMS blok, at pin rygmarven i vibrerende væv pålægsmaskine. Bland Elastomer A og Elastomer B 1: 1 efter vægt. Hæld i en 100 x 15 mm petriskål, og tillader at indstille O / N ved 30 ° C. Skær et rektangulært stykke af PMDS og lim det til udskæring bundplade bruger epoxy lim. Lad limen at indstille fastsættelse af PDMS på plads og skær flere tynde sektioner fra overfladen for at opnå en fladoverflade for at fastgøre væv på.
3. Akut Dissociation af Lamprenen rygmarven til fremkommer isoleret Reticulospinal Axoner
- Bedøver en ammoecoete eller voksen lampret (Petromyzon marinus) med tricaine methansulfonat (MS-222, 100 mg / l). Tilføj bedøvelsesmiddel i vandet, i en plastik kop dækket af et låg, der indeholder lamprey skal ofres.
- Halshugge lamprey i kold (4 ° C) Ringers opløsning med følgende sammensætning (i mM): 130 NaCI, 2,1 KCI, 2,6 CaCl2, 1,8 MgCl2, 4 HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, osmolaritet 270 mOsm) og fjern organ væg muskler til at afsløre dorsale overflade af rygmarven.
- Fjern Meninx Primitiva fra den dorsale overflade af rygmarven ved hjælp af fine tænger. Fjern ikke ventrale Meninx Primitiva på dette stadium.
- Skær rygmarv i 1 cm lange stykker.
- Fastgør en rygmarv stykke ved hjælp af fine insekt ben, bryst opad, på en PDMS foret udskæring basen plate (se 2.12) i en vibrerende væv slicer kammer indeholdende iskold Ringers opløsning.
- Fjern en central del af den dorsale søjle af rygmarven ved skæring langs Rostro-caudale akse med bladet, efterlader intakte dorsale søjlesektioner på rostralt og caudale ender for at tjene som håndtag under dissociation proces figur 2a og figur 2b. Brug langsomste hastighed, der tillader udskæring og en dybde indstilling, der kun fjerner den dorsale kolonne forlader underliggende reticulospinal Axon kolonne ubeskadiget Figur 2b.
- Inkuber skiver rygmarv stykker ved stuetemperatur i 45 minutter i en blanding af 1 mg / ml protease (type XIV fra Streptomyces griseus) og 1 mg / ml kollagenase fremstilles (type IA fra Clostridium histolyticum) i Ringer-opløsning (tilpasset fra El Manira & Bussieres 1997 17).
- Pin enzymbehandlede rygmarv stykker med fine ben i en PDMS foret petriskål contalingen kold (4 ° C) Ringers opløsning.
- Fjern ventrale Meninx Primitiva med fine pincet.
- Skær laterale skrifter af rygmarven med en skalpel på midtpunktet af skiveskåret dorsale sektion forlader den centrale kolonne reticulospinal axoner intakte i rygmarven Figur 2d.
- Placer en dråbe immersionsolie på linsen.
- Placer poly-lysin coatede dækglas (figur 3a, øverste stykke, rød rektangel) i slidsen i optagelsen kammer Figur 3 og anvende vakuum fedt på alle kanter (plads mellem rød og blå rektangler i figur 3a, for at lette en sæl. Skrue toppen på plads. Placer kammer i indsatte på optagelsen riggen.
- Tilføj Ringers opløsning i optagelsen kammer ved hjælp af en Pasteur-pipette.
- Slut udstrømningen slangen af tryk flaske indeholdende frostvæske til termoelektriske køling enhed input slange. Tilslut output slanger af den termoelektriske køleindretning til indgangen ende af den ydre kølekappe og udgangsenden til reservoiret figur 3b.
- Anbring et stykke af rygmarven på et tidspunkt i optagelsen kammer og forsigtigt adskille rygmarven opretholde den langs dækglasset på alle tidspunkter under anvendelse af teflonbelagt pincet indtil axoner er isoleret Figur 2e og figur 2f.
- Bring optagelse opløsningens temperatur til 10 ° C ved at føre den under tryk (nitrogengas skubbes ind i flasken) frostvæske (ved fortrængning) via termoelektriske køleindretning, gennem den ydre kølekappe af optagelsen kammer 3b.
- Tillad axoner til at komme sig 1 time efter dissociering ved 10 ° C.
Figur 3. Skematisk af optagelsen kammer til elektrofysiologi eksperimenter. Dimensioner forudsat er i inches. Rød rektangel vist i basepiece diagram (a) angiver placeringen af dækglasset i dækglasset rille i basepiece. Området mellem det røde og blå rektangel, der er vist i basepiece diagram (a), hvor den høje vakuum fedt anvendes. (B) viser den samlede optagelse kammeret.
4. Mærkning og identifikation af Præsynaptiske Terminaler med FM 1-43
- Mærk præsynaptiske terminaler ved at indarbejde FM 1-43 i vesicles under synaptisk exo-endocytose i høj K + depolarisering. Perfundere præparat med 5 uM FM 1-43 (i 5 ml Ringers opløsning indeholdende 30 mM KCI).
- Perfundere præparat med 1 mg / ml Advasep-7 (i 5 ml Ringers opløsning) for at fjerne overskydende FM-farvestof) 18.
- Perfundere præparat med Ringers opløsning i 15 min til udvaskning enhver remant farvestof og Advasep.
- Billede med 100 x olie immersionslinse (NA 1.25) på et inverteret fluorescensmikroskop, i forbindelse med et digitalt CCD-kamera og billedoptagelse software micromanager ved anvendelse af standard fluorescens imaging protokoller.
- Identificer fluorescensmærkede præsynaptiske terminaler til at målrette til optagelse Figur 4c og 4d.
5. Immunohistokemi af isolerede Reticulospinal Axoner
- Fyld skålen indpresningsdybde (Protokol punkt 2.10.) Med divalent-ion (Ca2 + og Mg2 +) friRingers opløsning.
- Fabrikere patch pipetter i en P-87 mikropipette aftrækker. Placer en lille mængde af sutur lim på den ene ende af poly-lysin indsat ved hjælp af en patch-pipette (1,5 mm yderglas diameter) og sugning (ved hjælp af en siliconeslange 0,89 mm indvendig diameter med en mikropipettespids fastgjort til sugeenden).
- Udføre dissociationer bruger den samme fremgangsmåde som nævnt i protokol afsnit 3 Figur 2. Placer den ene ende af rygmarven på suturen lim og tryk forsigtigt med en pincet til at overholde det kraftigt til overfladen. Placer en anden dråbe sutur lim på den anden ende af det indsatte og forsigtigt strække rygmarven indtil axoner dissocieres og klæbe den frie rygmarv ende ved at trække det forsigtigt over suturen lim. Fix på plads ved forsigtig at trykke ned med pincet.
- Exchange divalente gratis Ringers opløsning med regelmæssige Ringers opløsning ved perfusion.
- Tillad axoner at inddrive i 20 min efter dissociation ved 10 ° C.
- Fix dissocierede axoner i 4% paraformaldehyd (PFA) {fremstillet i Phosphatbufferopløsning (PBS (mM) NaCI 137, KCI 2,7, Na 2 HPO 4 10 KH 2 PO4 1,8, pH 7,4)} i 20 minutter. Filter PFA opløsning før anvendelse ved passage gennem en 0,2 uM sprøjtefilter.
- Skyl PFA ved perfusion af 0,1 M glycin (i PBS) i 10 minutter.
- Inkuber i 0,1% Triton-X (i PBS) i 10 minutter.
- Vask ved perfusion PBS i 20 min.
- Bloker med 5% fedtfri mælk (i PBS) i 6 timer ved 4 ° C.
- Læg i primært antistof til VGCC af interesse (1: 200 fortynding i PBS) og inkuberes i 20 timer ved 4 ° C.
- Vask ved perfusion PBS i 20 min.
- Bloker med 5% fedtfri mælk (i PBS) i 10 minutter ved 4 ° C.
- Tilføj i sekundært antistof (1: 400 fortynding i PBS) og inkuberes i mørke i 2 timer ved 4 ° C.
- Vask ved perfusion med PBS i 20 minutter.
- Bloker med 1% bovint Albumin (i PBS) i 20 min.
- Tilføj i Alexa Fluor 488 phalloidin (5 enheder / ul arbejde koncentration, bestand fremstillet i methanol 200 Enheder / ml).
- Vask ved perfusion med PBS i 20 minutter.
- Billedet ved hjælp 100X vand nedsænkning linse på konfokal mikroskop.
6. Elektrofysiologisk Optagelse
- Fabrikere aluminosilikatglas patch pipetter (pipette modstand 2-5 MOhm) i en P-87 mikropipette aftrækker. Design patch-pipette, således at pipettespidsen omfatter hele præsynaptiske terminal diameter.
- PDMS frakke patch pipetter ved dypning patch-pipetten under 50-60 psi i PDMS 23 (vedhæfte en siliconeslange, 0,89 mm indvendig diameter, som er forbundet til en nitrogen gascylinder, til enden af patch-pipetten) og tørres ved hjælp af en varme pistol. Alternativt manuelt pels pipetten med PDMS anvende belægning så tæt på spidsen som muligt under et sammensat mikroskop.
- Fire polish patch pipetter hjælp af en MICRoforge (en specialbygget platinglødetråd monteres på den fase af et sammensat mikroskop).
- Identificer isolerede axoner demonstrerer mærkede præsynaptiske terminaler ved fluorescens mikroskopi.
- Fyld optagelse opløsning (designet til at isolere Ca2 + strømme, 10 mM CaCl2 eller 90 mM BaCl 2 som ladningsbærere, HEPES bufferopløsning pH 7,6, osmolaritet 270 mOsm) i patch-pipetten ved hjælp af en sprøjte.
- Sæt patch pipette ind i pipetten holderen og position over bad ved hjælp af en motoriseret manipulator MP225. Sænk forsigtigt plasteret pipette ind i badet og position mod ansigtet af en fluorescens identificeret præsynaptiske terminal.
- Advance patch pipette langsomt, indtil der er taget kontakt med membranen. På dette tidspunkt, for at opnå en gigaohm tætning ved forsigtig munden sugning gennem et rør fastgjort til pipetteholder.
- For at opnå de ekstremt lave baggrundsstøj, der kræves til optagelse enkelt kanal Ca 2 + strømme, skal du bruge et Axopatch 200B med en afkølet hovedtrin for optagelserne. Sample data på 20-50 kHz og filter ved hjælp af en 5 kHz Bessel-filter. Udføre dataopsamling ved hjælp af en Axograph X.
- Brug en standard skridt protokol, i intervaller på 10 mV som stimulans. Indarbejd en præ-puls i protokollen, forud for trin-protokollen, for at sikre maksimal aktivering af Ca 2 + kanaler. Indarbejde en 10 mV læk skridt ind i trin protokol til post-analyse subtraktion af læk strømme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne dissociation protokol udbytter sunde og funktionelle isolerede reticulospinal axoner blottet for postsynaptiske fremskrivninger Figur 2f, men som ikke desto mindre bevarer funktionelle præsynaptiske terminaler stand fremkaldte synaptisk vesikel exo-og endocytose Figur 4c og 4d. Dele af de isolerede regioner af reticulospinal axoner klart kan identificeres under lysmikroskopi at være fri for alle andre neuronale processer tillader ubegrænset adgang til reticulospinal Axon membran Figur 2f. Axoner bevarer strukturel integritet efter dissociering. Isolerede axoner blev lappet i hel-celle konfiguration og fyldt med Alexa Fluor 488 hydrazid. Farvestoffet ensartet fordelt inden Axon og ingen farvestoflækage blev observeret fra Axon Figur 4a.
/ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. Repræsentative optagelser fra en isoleret reticulospinal Axon. (A) Isoleret reticulospinal Axon fyldt med Alexa Fluor 488 hydrazid med en patch pipette i hele celle konfiguration. Pipette position indikeres med en hvid pil. (B) i. Repræsentant handling potentiale fyret i et isoleret reticulospinal Axon. ii. Repræsentant handling potentiale fyret i en reticulospinal Axon i ubeskadiget rygmarven. Sort pil angiver tidspunkt for stimulering. (C) og (d) To billeder af en isoleret reticulospinal Axon viser punktformig mærkning af præsynaptiske terminaler med FM 1-43 og målretning af en individuel præsynaptiske terminal med patch pipette til celle-vedhæftet patch optagelse. Grønne pile markerer individuelle præsynaptiske terminaler, mens hvid pil markerer patch pipette. (E) Dead isoleret reticulospinal Axon viser indiscriminate inkorporering af FM 1-43 hele Axon. 4f. Repræsentativt eksempel, der viser celle-attached optagelse af Ca 2 + strømme (10 mM [Ca 2 +] ekstern i optagelsen løsning i plasteret pipette) fra den præsynaptiske frigivelse ansigt membran demonstrerer åbning af flere Ca 2 + kanaler. Solid linie mærket 0 angiver lukket tilstand af kanal, mens stiplede linjer angiver Gauss toppe for kanal åbninger.
Akut dissocierede axoner bevarer elektriske egenskaber. Resting membranpotentiale (RMP) kan måles ved at spidde den adskilles axon med en mikroelektrode eller lappe Axon i helcelle konfiguration strømtangstilbehør tilstand. Lignende RMP registreres i begge metoder, med et gennemsnit på -57,94 ± 1,63 mV (n = 17 axoner). Endvidere dissocieres axoner kan stimuleres til at fyre virkningspotentialer Figur 4b, med formen og tidsforløbet af aktionspotentialet er sammenligneligtil en fyret i en reticulospinal Axon i ubeskadiget rygmarven.
Vesikelfusion og genbrug fortsætter i opdelte axoner. Genbrug vesikel klynger kan mærkes med styrylfarvestofoptagelse FM 1-43 i løbet af høj kalium (30 mM KCI) stimulering 19. Efter farvestof clearance, kan observeres distinkt punktformig mærkning af præsynaptiske terminaler Figur 4c og 4d, med en fordeling svarende til reticulospinal axoner i den intakte rygmarv 13. FM 1-43 farvning giver en klar sondring mellem sunde og usunde axoner som usunde axoner viser vilkårlige FM farvestof indgang hele Axon Figur 4e. Evnen til klart at identificere individuelle præsynaptiske terminaler giver os mulighed for at målrette dem med en patch pipette til optagelse Figur 4c og 4d. Ved hjælp af denne evne, har vi indspillet Ca2 + strømme direkte fra frigivelsen ansigt membrane enkelt præsynaptiske terminaler Figur 4f.
Den akut isolerede reticulospinal Axon forberedelse tilbyder også forskellige fordele i forhold til den intakte rygmarv til immunhistokemi af enkelte præsynaptiske terminaler. Manglen på baggrund autofluorescens og fraværet af pletter på postsynaptiske strukturer eller glia muliggør entydig identifikation af antistofmærkning på identificerede præsynaptiske terminaler (figur 5b, i). Kombineret med en præsynaptisk markør, såsom Alexa-488 konjugeret phalloidin (figur 5a, ii) og (figur 5b, ii), hvilke etiketter præsynaptiske actin 20, lokalisering af immunhistokemisk mærkning præsynaptiske terminaler klart kan bevises (figur 5a, iii). Denne fremgangsmåde har været anvendt i forbindelse med konfokal mikroskopi til at udføre immunohistokemiske karakterisering af de forskellige VGCC undertyper viser tarving specifik lokalisering til præsynaptiske terminaler figur 5a.
Figur 5. Immunofarvning af en isoleret reticulospinal Axon. (A) Immunhistokemisk karakterisering af R-type (CaV2.3) calcium kanal på de enkelte præsynaptiske terminaler. Jeg. Et polyklonalt primært antistof blev anvendt til at mærke en epitop i den intracellulære sløjfe mellem domænerne II og III af R-typen calciumkanal (vært - kanin). Sekundært antistof var Alexa Fluor 633 hydrazid konjugeret gede-anti-kanin-IgG. ii. Præsynaptiske terminaler identificeret af Alexa Fluor 488 phalloidin mærkning af præsynaptiske actin. iii. Colokalisering mellem F-typen antistofmærkning (rød) og Alexa-488 phalloidin (grøn) vises i et fusioneret overlay. (B) i. Præinkubation af anti R type calciumkanal antistof medkontrol-antigen giver ikke nogen specifik mærkning af calcium kanaler. ii. Alexa Fluor 488 phalloidin mærkning af præsynaptiske terminaler til samme Axon viser diskret punktformig mærkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores dissociation protokol er signifikant ved afgivelse isolerede reticulospinal axoner blottet for postsynaptiske fremskrivninger figur 2f, men som ikke desto mindre bevarer funktionel præsynaptiske terminaler Figur 4c og 4d. Fraværet af postsynaptiske processer modsatrettede den præsynaptiske terminal muliggør direkte optagelse adgang til den præsynaptiske frigivelse ansigt membran ved enkelt præsynaptiske terminaler, der tidligere ikke muligt i Mellemeuropa synapser og succes opnået i kun to calyceal-type præsynaptiske terminaler; bæger-typen synapser af chick ciliære ganglion 7-10 og rotte calyces 11,12. Individuelle præsynaptiske terminaler, som ved elektron mikrografisk plan, har vist sig at udgøre simpelt, fælles aktive zoner 21, kan identificeres ved genbrug mærkning vesikel klynger med FM 1-43 og målrettet til optagelse Figur 4c og 4d. Ca
Nøglen til at opnå isolerede reticulospinal axoner med funktionelle præsynaptiske terminaler ligger i en serie af kritikeral sekventielle trin. Tissue hæmmer akut dissociation af de gigantiske axoner beliggende hovedsagelig i dorso-mediale område af rygmarven Figur 1a havde først skal fjernes i et vibrerende væv pålægsmaskine figur 2a. Dette gør det lettere at mekanisk dissociere rygmarven ved hjælp af mindst mulig kraft. Udskæring af den dorsale kolonne kræver fuldstændig fjernelse af den dorsale Meninx Primitiva da enhver resterende dorsale Meninx Primitiva ville hindre skærende virkning af bladet. Vi finder, at de forlader den ventrale Meninx Primitiva på rygmarven ved udskæring bidrager til at opretholde formen af rygmarven og hjælper med bedre udskæring. Opretholdelse af spænding i rygmarven under udskæring proces forhindrer enhver sidebevægelse eller rammende af vævet under kniven, der ville skade axoner. 1 cm lange rygmarv stykker giver en god længde til udskæring som væv kan strækkes og holdt nede opretholde spænding while udskæring. En anden afgørende faktor for at overvåge, er dybden af skive; alt for overfladisk en skive forhindrer god adskillelse af rygmarven mens for dyb en skive skader reticulospinal axoner. En god skive dybde er en, hvor den dorsale kolonne fjernes synligt forlader ventrale reticulospinal kolonne ubeskadiget. Dybden af skive skal måles under udskæring proces gives der er variation i rygmarven tykkelse mellem dyr. Fjernelsen af den dorsale søjle udføres bedst i den midterste del af rygmarven stykke Figur 2b da det giver mulighed for unsliced rostralt og caudal ender til at fungere som håndtag til at gribe vævet under dissociation proces Figur 2e.
Efter fjernelse af den dorsale søjle, behandling af skiver rygmarv stykker med en blanding af kollagenase (collagenase type IA fra Clostridium histolyticum) og protease (Protease Type XIV fra Streptomyces griseus) enzymer (1 mg / ml i Ringers opløsning) hjælper fordøje bindevæv og letter en blidere dissociation. En 30-45 min fordøjelse ved RT er ideel til dissociation. Komplet enzymatisk dissociation af lamprey rygmarven er tidligere blevet udført med sekventielle behandlinger af collagenase (2 mg / ml, 30 min) og protease (2 mg / ml, 45 min) for at isolere spinale neuroner 17. Sekventielle behandlinger versus behandling med en cocktail af protease og collagenasen gav ikke bedre resultater adskille reticulospinal axoner. Vi har også eksperimenteret med forskellige koncentrationer af dissociation enzymer. Enzymkoncentrationer større end 2 mg / ml eller fordøjelsesproblemer gange længere end 45 min resulterede i rygmarven miste sin konsistens og fattige dissociationer. De højere enzymkoncentrationer og langvarig behandling perioder kan hjælpe i fuldstændig dissociation af rygmarven når udbyttet af mindre neuroner er påkrævet. Reticulospinal axoner derimod have en udvidet structure og behandlinger mere end 45 min var hensigten. Fastholdelse vis spænding i rygmarven Aided bedre dissociationer.
Det næste vigtige skridt er at skære de laterale skrifter af enzym-behandlede rygmarv stykker på midtpunktet af skiveskåret regionen til at isolere den endelige dissociation kraft til regionen omfatter reticulospinal axoner. Nedskæringerne skal strække sig fra den laterale kant af den ventrale horn grå sagen til den centrale Ventro-mediale kolonne reticulospinal axoner forlader dem ubeskadiget figur 2d. Skæring laterale skrifter giver et brændpunkt, hvor tvungen adskillelse af rygmarven vil forekomme under mekanisk dissociering og letter en jævn adskillelse af vævet. Vedvarende spændinger i rygmarven er nødvendig under opskæring, og som kan opnås ved at strække og pinning kaudale og rostralt ender af rygmarven stykke. Dette forhindrer væv deformation under skalpelbladetsog deraf følgende skader på axoner.
Det sidste trin i dissociationen anvender mekanisk spænding og forsigtigt strække væv langs Rostro-caudale akse Figur 2e ved hjælp af pincet til at gribe vævet. Dette trin udføres i løbet af polylysin-overtrukne dækglas for at tillade adhæsion af de separerede axoner til efterfølgende optagelse. For at opnå en større vedhæftning til de lange udvidede reticulospinal axoner har vi anvendt en høj molekylvægt (> 300.000) poly-D-lysin-hydrobromid, som giver større antal fastgørelsespunkter, at coate dækglas og petriskållåg Einsatzmellemværk. Poly-lysin coatede overflade giver tilstrækkelig vedhæftning til rygmarven slutter, og de akut isolerede reticulospinal axoner. Teflonbelagt pincet er forpligtet til at gribe fat i rygmarven, fordi det klæber fast til regelmæssige rustfrit stål pincet vanskeliggør dissociationer. Vævet må strækkes langsomt og forsigtigt at trække axoner ud af spnel ledning. Den bedste måde at få de axoner at slå sig ned er at opretholde rygmarven slutter langs dækglas på alle tidspunkter under den dissociation proces ved at opretholde presset nedad på rostral og caudale rygmarv slutter med pincet.
Axoner er bedst, delvis isoleret, da en del af Axon forbliver inde i mindst den ene ende af rygmarven ende, afhængigt af omfanget af dissociering. Isolering kan gennemføres ved mekanisk adskillelse af de to ender af rygmarven indtil axoner helt adskilt fra den ene ende af rygmarven. I dette tilfælde er en del af Axon forbliver inde i rygmarven ende, hvoraf det fremgår, mens den resterende del er isoleret ud af rygmarven interiør. Den terminale åbne ende af axoner forsegler op af en membran genforseglingsevne proces afhængigt sundhed Axon. Isolering kan også udføres således, at axoner opstå ud fra rygmarven but de caudale og rostralt ender af rygmarven forblive tilsluttet ved hjælp af de isolerede reticulospinal axoner Figur 2e. På dette tidspunkt, forsigtigt at trykket tillader axoner under spænding til at slappe af og loop ud gav isolerede regioner axoner blottet for postsynaptiske fremspring. Begge dissociation teknikker giver funktionelle axoner. Den fysiologiske temperatur for lampret er 10 ° C og dermed forberedelse får lov til at komme sig ved 10 ° C i 1 time for at tillade axoner at komme fra den akutte dissociation. Til elektrofysiologiske optagelser blev dissociation udført på en poly-lysin-coatede dækglas indsat i en brugerdefineret kammer Figur 3. Lamprenen rygmarv er generelt opretholdt ved 10 ± 2 ° C ved perfusion Ringers opløsning, forafkølet til 10 ° C ved at passere gennem en termoelektrisk køleenhed. Usædvanligt lavt baggrundsstøj er nødvendig for at løse enkelt kanal Ca Høj K + (30 mM KCI) anvendes til at depolarisere axoner (afsnit 4.1), således at FM-farvestoffet er inkorporeret ivesikler i synaptiske exo-endocytose. Det er svært at fastholde indsættelse af en mikroelektrode i isolerede axoner i længere perioder, da den mindste afdrift i Axon position bevirker elektroden at aftage fra Axon. Dette gør det vanskeligt at stimulere axoner til langvarig periode ved hjælp af en mikroelektrode. Den store Axon diameter (20-50 um) gør det vanskeligt at stimulere ved hjælp af en wolfram stimulering elektrode. Derfor høj K + blev anvendt til at depolarisere axoner. De præsynaptiske terminaler i reticulospinal axoner har en diameter på 1-2 um. Ca 2 + strømme er lokaliseret til frigivelse ansigt membran ved præsynaptiske terminaler, og det er derfor afgørende at præcist at målrette den præsynaptiske terminal. Derfor er et centralt krav for at opnå disse optagelser er i stand til at manipulere bevægelsen af patch-pipetten position i um trin. Ca2 + strømme på præsynaptiske frigivelse ansigt membraner er demonstrated i calyceal synapser at være meget lille i amplitude, mindre end 0,5 pA. Single-optagelser af Ca 2 + strømme derfor kræver ekstremt lave baggrund støjniveau. Lav termisk støj blev opnået med en Axopatch 200B forstærker og en afkølet hovedtrin. Desuden skal systematisk identificeres og elimineres forurenende kilder til støj. Patch pipetter blev fremstillet fra aluminosilikatglas at sikre lav støj, da glasset har ekstremt lave urenheder og høj modstand. Pipetterne blev skabt, således at pipettespidsen diameter var større end diameteren af den præsynaptiske terminal derved helt omfatter den præsynaptiske terminal kan dimensioner tydeligt ses af FM 1-43 mærkning. Dette sikrede optagelse fra hele meddelelsen ansigt membran. Den kapacitive støj blev reduceret ved at overtrække pipetten med PDMS så tæt på spidsen som muligt. De gigaohm sæler på præsynaptiske terminale membraner er ikke stabil i lang priods og optagelser typisk højst vare 2 min. Dette gør optagelserne yderst vanskeligt at opnå, da den lave succesrate nødvendiggør et stort antal forsøg på at opnå vellykkede optagelser. Optagelse løsninger skal udformes således, at alle andre kendte strømme i den præsynaptiske terminal membran såsom spændingsstyrede Na + og K +-kanaler og Ca2 + -activated K +-kanaler er blokeret, som muliggør optagelse af Ca2 + strømme. Der er nogle begrænsninger ved anvendelse af polylysin-klæbende overflade med dette præparat. Den ene er den manglende evne til at flytte den fysiske placering af kammeret indeholdende præparatet, da vibrationer forstyrret præparatet. En anden begrænsning af den klæbende overflade blev afsløret ved immunhistokemi eksperimenter, som rostralt og caudale rygmarv endestykker mister adhæsion, når de inkuberes i 4% paraformaldehyd. Vi har forsøgt alternativ klæbemiddel coaTings såsom celle-Tak og stødte lignende spørgsmål. For at løse disse problemer, vi brugte flydende sutur lim til at anbringe rygmarv håndtag. De nærmere vedrørende anvendelsen af suturen lim er blevet drøftet i en tidligere JOVE artikel af Chen og Featherstone 22. Limen sæt langsommere i opløsninger uden divalente ioner og vi tog fordel af denne og foretaget de dissociationer i Ringers opløsning uden Ca2 + og Mg2 +. Dette gav os med yderligere tid til manipulation af væv under dissociation proces. Vi vedtog en lignende tilgang til Chen og Featherstone 22 ved hjælp af patch pipetter og mund sug gennem en slange forbundet til patch-pipetten til at anvende lim på det specifikke målområdet på dissociation overflade før udførelse af dissociation (Protokol afsnit 5.2). De dissociationer blev udført som tidligere beskrevet, med den eneste forskel er, at spinal cORD ender blev anbragt under dissociation proces ved forsigtigt at trække i håndtaget ende over den tidligere placeret lim (Protokol afsnit 5.3). Når dissociation blev afsluttet, den divalente ion-fri Ringer opløsning blev udvekslet til Ringers opløsning indeholdende Ca 2 + og Mg 2 +-ioner efter perfusion og præparatet fik lov til at komme sig ved 10 ° C i 20-30 minutter på et termoelektrisk afkøling plade før videre til efterfølgende trin i immunhistokemi. Det centrale implikation af denne teknik er en præcis forståelse af Ca 2 + kravet om neurotransmitterfrigivelse, som ikke er helt løst på trods af årtiers forskning. En forbigående stigning i præsynaptiske [Ca 2 +] er blevet etableret som værende afgørende for at udløse frigivelse i alle synapser. Dog er konsensus stadig mangler på antallet af Ca 2 + kanaler, som bidrager til Ca 2 + domæne gating matese. Samtidig måling af Ca 2 + strømme og kapacitans målinger på frigivelsen ansigt membran af individuelle præsynaptiske terminaler ville give et entydigt svar på dette spørgsmål. Desuden vil det gøre det muligt opklaringen af timingen forholdet mellem præsynaptiske Ca 2 + indrejse og vesikelfusion, der muliggør en præcis måling af synaptisk forsinkelse. Ubegrænset adgang til frigivelse ansigt membranen på de enkelte præsynaptiske terminaler giver mulighed for at anvende en række forskellige eksperimentelle metoder til at studere forskellige komponenter i neurotransmitterfrigivelse proces. Eksempler på sådanne tilgange omfatter enkelt vesikel billeddannelse ved hjælp kvantepunkter at studere synaptiske vesikel fusion. Vesikelfusion begivenheder kan også være direkte kendetegnet ved præsynaptiske terminaler ved måling membran kapacitans ændringer, der ligger til grund for vesikelfusion begivenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S.
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V.
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K.
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
