Abstract
A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido. O potencial de ação dirigido influxo de Ca2 + para o terminal pré-sináptico, através de canais de cálcio dependentes da voltagem (VGCCs) localizados na membrana rosto lançamento, é o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores. Crucial para a rapidez da transmissão sináptica é a sincronia espacial e temporal entre a chegada do potencial de acção, e a maquinaria VGCCs a libertação de neurotransmissores. A capacidade de gravar diretamente de Ca2 + correntes da membrana rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais é imprescindível para uma compreensão precisa da relação entre pré-sináptica de Ca2 + e liberação de neurotransmissores. Acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica para a gravação eletrofisiológico ainda não está disponível na maioria das preparações e Ca 2 + entrada pré-sináptica tem sido caracterizada utilizando técnicas de imagem e MeasureMe atual macroscópicoNTS - técnicas que não têm resolução temporal suficiente para visualizar Ca2 + entrada. A caracterização de VGCCs diretamente nos terminais pré-sinápticos individuais não foi possível nas sinapses centrais e, até agora, foi alcançado com sucesso apenas no tipo cálice sinapse do gânglio ciliar e pinto em cálices de ratos. Temos abordado com sucesso este problema na sinapse reticuloespinhal gigante da lampreia medula espinhal através do desenvolvimento de uma preparação agudamente dissociada da medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de estruturas pós-sinápticos. Podemos fluorescently rotular e identificar terminais pré-sinápticos individuais e orientá-las para a gravação. Usando esta preparação, caracterizamos VGCCs diretamente para o rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais usando imunohistoquímica e eletrofisiologia abordagens. Ca2 + correntes foram registrados diretamente na membrana o rosto liberaçãoterminais pré-sinápticos individuais de f, o primeiro registo a ser realizada nas sinapses centrais.
Introduction
A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido e preciso. Ação potencial invasão do terminal pré-sináptico leva à abertura de VGCCs localizados na membrana rosto liberação, o aumento resultante na pré-sináptica de Ca2 + age como o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores 1. Todos estes passos ocorrem dentro de centenas de microsegundos 2, e, portanto, requerem acoplamento espacial de VGCCs apertado para a vesícula máquinas de fusão 3. Pré-sinápticos de Ca2 + fluxos têm sido caracterizadas principalmente por meio de imagens abordagens utilizando Ca2 + corantes sensíveis 4. Incorporando Ca2 tampões que modulam Ca2 + nos neurónios pré-sinápticos tem sido utilizado para caracterizar indirectamente a relação entre o cálcio pré-sináptico e a neurotransmissão 3. Além disso, a modulação da pré-sináptico livre concentração de Ca2 + por uncaging Ca2 + 5 ou gravação macroscopic correntes de Ca2 + têm sido utilizados em conjunção com medidas de fusão e / ou a libertação de vesículas; como medidas de capacitância 6 ou pós-sinápticos respostas 2 para abordar a mesma questão. No entanto, a caracterização de Ca2 + correntes directamente na face de libertação, a secção especializada da membrana pré-sináptica, onde a despolarização da membrana é convertida em Ca 2 + correntes provocando a fusão das vesículas sinápticas e a libertação de neurotransmissores, é essencial para se obter uma medida precisa do Ca2 requisito para a fusão das vesículas sinápticas. Além disso, a capacidade de caracterizar directamente as correntes de Ca2 + nos terminais pré-sinápticos individuais, acoplado com medições simultâneas precisos de fusão das vesículas e libertação permite uma elucidação preciso da relação de temporização entre o curso do tempo da acção potencial, pré-sináptico corrente 2 + Ca, fusão das vesículas e liberação. Acesso à membrana rosto liberaçãonão está disponível na maior parte dos terminais pré-sinápticos, devido a fechar por aposição dos dendritos pós-sinápticos. Esta inacessibilidade tem sido um grande obstáculo na caracterização de VGCCs uma vez que impede medidas diretas de corrente nos terminais pré-sinápticos individuais. Caracterização direta de pré-sinápticos Ca2 + correntes nos terminais pré-sinápticos individuais, até agora, não foi possível nas sinapses centrais e só foi alcançado em dois terminais pré-sinápticos do tipo coletor; cálice do tipo sinapse do pinto gânglio ciliar 7-10 e rato calyces 11,12. Em todos os outros terminais pré-sinápticos, incluindo a sinapse reticuloespinhal gigante na lampreia medula espinhal 13, a falta de acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica exigiu o uso de abordagens indiretas, tais como Ca2 + radiológico para o estudo pré-sinápticos de Ca2 + fluxos.
Figura 1 lampreia sinapse reticuloespinhal gigante. (A) Secção transversal da lampreia medula espinhal indicando orientação dorso-ventral. Axônios reticulospinais são marcadas com asterisco verde. (B) reconstrução 3-D da sinapse reticuloespinhal na lampreia medula espinhal mostrando axônio pré-sináptico reticuloespinhal fazendo numerosos en passant contatos (marcado por setas verdes) sobre o neurônio pós-sináptico 13. Terminais pré-sinápticos têm sido marcados com Alexa Fluor 488 conjugado com hidrazida faloidina (verde), enquanto que o neurónio pós-sináptico foi preenchido com Alexa Fluor 568 hidrazida (vermelho).
Lampreia gigantes axônios reticulospinais, localizado na região ventral da medula espinhal paralelo ao eixo Figura 1a rostral-caudal, forma múltipla en passant contatos sinápticos em neurônios doespinhal chifre ventral 14 Figura 1b 13. De célula inteira macroscópica Ca2 correntes foram registadas a partir de axônios reticulospinais na medula espinhal intacta 13,15. No entanto, tentativas anteriores para cegos medição directa de correntes de Ca 2 + em axónios reticulospinais na medula espinhal lampreia intacto usando ligado de células técnica de fixação de membranas 13, não têm tido sucesso, devido à falta de acesso à membrana cara de libertação pré-sináptica devido aos processos de pós-sinápticos opostas Figura 1b. A membrana de libertação cara tenha sido previamente tornado acessível pela remoção do neurónio pós-sináptico 11, perturbação mecânica da sinapse antes da gravação de 12 ou tratamento enzimático acoplado com dissociação mecânica 16. Dada a complexa organização da medula espinhal, que seria extremamente difícil identificar o neurônio pós-sináptico e recolhê-lo mecanicamente ou perturbar ªe sinapse. Por isso, decidimos usar o tratamento enzimático 17 seguido de dissociação mecânica.
Usando essa abordagem, temos desenvolvido uma preparação profundamente dissociada da lampreia medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados viáveis com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de quaisquer processos de pós-sinápticos, proporcionando assim o acesso irrestrito aos terminais pré-sinápticos individuais. Em conjunto com um microscópio invertido padrão e imagens de fluorescência, que nos permite identificar e alvejar terminais pré-sinápticos fluorescente identificados individualmente, com uma pipeta de patch que contém uma solução de gravação que isola as correntes de Ca2 + 4c figura e Figura 4d, para gravar utilizando célula- ligado técnica tensão-grampo. Ca2 + correntes foram registrados diretamente na membrana rosto liberação pré-sináptica de indivíduo terminais pré-sinápticos Figura 4f. Este é um significant avanço no campo da transmissão sináptica, uma vez que é o primeiro exemplo de gravação a ser realizada nas sinapses centrais.
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Protocol
1: Preparação de poli-D-lisina Hydrobromide
- Prepare 1 mg / ml de bromidrato de poli-D-lisina em tampão borato 0,1 M (pH 8,5).
- Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
Revestimento 2 Poli-lisina de Lamelas
Nota: Executar todas as etapas de limpeza e revestimento em uma câmara de fluxo laminar.
- Coloque lamelas em uma placa de Petri contendo 1 N de ácido clorídrico (HCl) durante 2 horas.
- Aspirar todo o HCl e enxágüe com 70% de etanol (EtOH) 2-3x.
- Deixar em EtOH a 70% durante 1 hora.
- Aspirar todo o etanol 70% e enxágüe com 100% EtOH 2-3x.
- Deixar em EtOH a 100% durante 2 horas. Aspirar todo o EtOH.
- Secar com papel de filtro e secar ao ar durante alguns segundos.
- Colocar N em 1 mg de solução de poli-lisina / / ml de S.
- Lavar lamelas dia seguinte com Millipore 4-5x água.
- Ar seco poli-lisina sobre lamelas de vidro revestidas em rolos de uma caixa de Petri limpa.
- Para immunohistochemistry, utilizar 35 × 10 mm tampas prato Petri. Prepare Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) alinhado pratos vertendo PDMS (elastómero e agente de cura de 10: 1, em peso) para o prato com uma espessura de 0,3 cm, e deixar solidificar a 30 ° CO / N. Uma vez que este se pôs, cortar dois centímetros por 1 centímetro talhado no PDMS. Limpar e revestir a inserção com poli-lisina, seguindo os mesmos passos como mencionado acima para lamelas.
- Armazenar poli-lisina lamelas revestidas e pratos cobertos para dentro da câmara de fluxo laminar, até à sua utilização (cerca de 2 semanas, mas obter melhores resultados através da preparação de adesivos, periodicamente a cada 3-4 dias).
- Prepare um bloco de PDMS, para fixar a medula espinhal no fatiador de tecido vibrando. Elastómero Mistura A e B de elastómero 1: 1 em peso. Verte-se uma placa de Petri de 100 x 15 mm e permite fixar O / N a 30 ° C. Corte um pedaço retangular do PMDS e cola-lo para a placa de base de corte com cola epóxi. Permitir que a cola para definir que fixa os PDMS no lugar e cortar várias seções finas na superfície para obter um apartamentosuperfície para fixar o tecido no.
3. aguda dissociação da Lampreia Medular para produzir isolados reticulospinais Axons
- Anestesiar um ammoecoete ou adulto lampreia (Petromyzon marinus) com metanos tricaina (MS-222; 100 mg / L). Adicionar anestésico dentro da água, em um copo de plástico coberto por uma tampa, contendo a lampreia para ser sacrificado.
- Decapitar lampreia em frio (4 ° C) solução de Ringer com a seguinte composição (em mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 de CaCl2, 1,8 de MgCl2, 4 de HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) e remover o corpo músculos da parede para expor a superfície dorsal da espinal-medula.
- Remover meninge Primitiva a partir da superfície dorsal da medula espinal utilizando fórceps finos. Não retire ventral Primitiva meninx nesta fase.
- Corte medula espinhal em um centímetro peças longas.
- Fixar um pedaço da medula espinhal usando finas pinos de insetos, lado dorsal voltada para cima, em um PDMS forrado cortar pla base dete (ver 2.12) numa câmara de tecido de vibração fatiador contendo a solução de Ringer com gelo.
- Retirar uma secção central da coluna dorsal da espinal medula por corte ao longo do eixo rostro-caudal com a lâmina, deixando para trás secções da coluna dorsal intactas no rostral e caudal termina para servir como lida durante o processo de dissociação Figura 2a e a Figura 2b. Use configuração de velocidade mais lenta que permite cortar e uma configuração de profundidade que remove apenas a coluna dorsal deixando a coluna subjacente axônio reticuloespinhal Figura 2b sem danos.
- Incubar cortados pedaços da medula espinal, à TA, durante 45 minutos, em uma mistura de 1 mg / protease ml (Tipo XIV a partir do Streptomyces griseus) e 1 mg / ml de colagenase preparado (Tipo IA a partir de Clostridium histolyticum) em solução de Ringer (adaptado a partir de El Manira & Bussières , 1997 17).
- Pedaços da medula espinhal Pin tratado com enzimas que utilizam pinos finos em um PDMS forrado Petri Conta pratoining solução de Ringer frio (4 ° C).
- Remover ventral Primitiva meninx com uma pinça fina.
- Cortar extensões laterais da medula espinal, com uma lâmina de bisturi, no ponto médio da secção dorsal cortado deixando a coluna central do axónios reticulospinais intactas na medula espinhal A Figura 2d.
- Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lente.
- Coloque a lamela poli-lisina revestido (Figura 3a, parte superior, retângulo vermelho) na ranhura da câmara de gravação Figura 3 e aplique graxa de vácuo para todas as bordas (espaço entre os retângulos vermelhos e azuis na Figura 3a, a fim de facilitar um selo. Parafuso o top no lugar. Coloque a câmara na inserção no equipamento de gravação.
- Adicionar a solução de Ringer na câmara de gravação, utilizando uma pipeta Pasteur.
- Conecte o tubo de saída do frasco contendo solução anticongelante pressão para o tubo de entrada de dispositivo de resfriamento termoelétrico. Conecte o output tubagem do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico para a extremidade de entrada da camisa de arrefecimento externo e a extremidade de saída do reservatório para a Figura 3b.
- Coloque um pedaço de medula espinal de cada vez na câmara de gravação e separar cuidadosamente a medula espinhal mantê-la ao longo da lamela em todos os momentos, utilizando fórceps revestidos de Teflon, até axônios são isolados Figura 2e e na Figura 2f.
- Traga a temperatura da solução de gravação e 10 ° C, passando o pressurizado (gás de azoto é empurrado para dentro do frasco) de solução de anticongelante (por deslocamento), por intermédio do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico, através da camisa de arrefecimento exterior da câmara de gravação Figura 3b.
- Permitir axónios para se recuperar por 1 h após a dissociação, a 10 ° C.
Figura 3 Esquema de câmara para experimentos de eletrofisiologia gravação. Dimensões fornecidas são em polegadas. Retângulo vermelho mostrado no diagrama basepiece (a) indica o posicionamento da lamela no sulco lamela no basepiece. A região entre o rectângulo vermelho e azul, mostrado no diagrama basepiece (a) é o local onde está aplicado o lubrificante alto vácuo. (B) mostra a câmara de gravação montadas.
4. rotulagem e identificação dos terminais pré-sinápticos com FM 1-43
- Rotular terminais pré-sinápticos, incorporando FM 1-43 em vesicles durante sináptica exo-endocitose durante a alta K + despolarização. Perfundir preparação com 5 uM de FM 1-43 (em 5 ml de solução de Ringer contendo KCl 30 mM).
- Perfundir preparação com 1 mg / ml ADVASEP-7 (em 5 ml de solução de Ringer), para remover o excesso de corante FM) 18.
- Perfundir preparação, com a solução de Ringer durante 15 min à lavagem e qualquer corante Remant o ADVASEP.
- Imagem com 100 X lente de imersão em óleo (1,25 NA) num microscópio de fluorescência invertido, em conjunto com uma câmara CCD digital e software de aquisição de imagem micromanager, usando protocolos de imagem de fluorescência padrão.
- Identifique os terminais pré-sinápticos marcados com fluorescência para direcionar para a gravação Figura 4c e 4d Figura.
5. Imunohistoquímica de isolados reticulospinais Axons
- Preencha prato inserção (seção Protocolo de 2.10.) Com bivalente-ion (Ca 2 + e Mg 2 +) livreSolução de Ringer.
- Fabricar pipetas de patch em uma micropipeta extrator P-87. Colocar uma pequena quantidade de cola de sutura numa extremidade de inserção da poli-lisina usando uma pipeta de remendo de 1,5 mm (diâmetro exterior de vidro) e de sucção (tubagem de silicone com um diâmetro interno de 0,89 milímetros com uma ponta de micropipeta ligada à extremidade de aspiração).
- Realizar dissociações utilizando o mesmo procedimento tal como mencionado na secção protocolo 3 Figura 2. Colocar uma extremidade da medula espinal em que a cola de sutura e pressionar suavemente com uma pinça para aderir fortemente à superfície. Colocar uma gota de cola de sutura na outra extremidade da inserção e alongar suavemente a medula espinal até axônios são dissociados e prender a extremidade livre da medula espinal, arrastando-o suavemente sobre a cola de sutura. Fixe no lugar pressionando suave para baixo com a pinça.
- Taxas bivalente libertar solução de Ringer com solução normal de Ringer por perfusão.
- Permitir que os axônios se recuperar por 20 min pós dissociation a 10 ° C.
- Fix axónios dissociados em 4% de paraformaldeído (PFA) {preparado de Tampão Fosfato Salino (PBS (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 a 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtre solução PFA antes da utilização através da passagem por um filtro de seringa de 0,2 uM.
- Lavar a PFA irrigando glicina 0,1 M (em PBS) durante 10 min.
- Incubar em 0,1% de Triton-X (em PBS) durante 10 min.
- Lavar irrigando PBS durante 20 min.
- Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 6 horas a 4 ° C.
- Adicionar em anticorpo primário para VGCC de interesse (diluição 1: 200 em PBS) e incuba-se durante 20 horas a 4 ° C.
- Lavar irrigando PBS durante 20 min.
- Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 10 min a 4 ° C.
- Adicionar em anticorpo secundário (1: 400 em PBS) e incuba-se escura durante 2 horas a 4 ° C.
- Lavar irrigando com PBS durante 20 min.
- Bloco com 1% de soro bovino Albumin (em PBS) durante 20 min.
- Adicionar em Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / ul concentração de trabalho; estoque preparadas em metanol a 200 Unidades / mL).
- Lavar irrigando com PBS durante 20 min.
- Imagem com lente de imersão em água 100X microscópio confocal.
6. eletrofisiológica Recording
- Fabricar pipetas de patch vidro alumino-silicato (resistência pipeta 2-5 mohms) em uma micropipeta extrator P-87. Projeto pipeta patch de tal forma que a ponta da pipeta engloba diâmetro inteiro terminal pré-sináptico.
- PDMS remendo pipetas revestimento por imersão a pipeta de adesivo sob 50-60 psi de pressão em PDMS 23 (juntar um tubo de silicone, 0,89 mm de diâmetro interno, ligada a um cilindro de gás de azoto, para a extremidade traseira da pipeta patch) e secam-se utilizando um calor arma. Como alternativa, o revestimento manualmente pipeta com PDMS, aplicando o revestimento o mais próximo da ponta quanto possível, sob um microscópio composto.
- Incêndio pipetas de patch polonês usando um microforge (um filamento de platina personalizado construído montada no palco de um microscópio composto).
- Identificar axônios isolados demonstrando terminais pré-sinápticos marcados por microscopia de fluorescência.
- Encha solução de gravação (concebido para isolar correntes de Ca 2 +, 10 mM de CaCl 2 ou 90 mM de BaCl2, como portador de carga, tamponada com HEPES, pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) para a pipeta de adesivo utilizando uma seringa.
- Insira remendo pipeta no suporte da pipeta e posição acima do banho usando um MP225 motorizada manipulador. Abaixe cuidadosamente a pipeta de patch para o banho e posição contra o rosto de um terminal pré-sináptico fluorescently identificado.
- Avança a pipeta remendo lentamente até que o contato é feito com a membrana. Neste ponto, conseguir uma vedação gigaohm por sucção boca suave através de um tubo colocado no suporte da pipeta.
- Para atingir os níveis extremamente baixos de ruído de fundo necessários para a gravação de um único canal de Ca2 + correntes, use um Axopatch 200B com um andar de entrada arrefecida para as gravações. Os dados da amostra em 20-50 kHz e filtrar por 5 kHz filtro de Bessel. Realizar aquisição de dados utilizando um Axograph X.
- Use um protocolo passo padrão, em incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar um pré-pulso no protocolo, o protocolo anterior passo, para assegurar activação máxima de canais de Ca 2 +. Incorporar uma mV etapa 10 vazamento no protocolo passo para pós-análise subtração das correntes de fuga.
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Representative Results
Isso gera protocolo dissociação saudáveis e funcionais axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter os terminais pré-sinápticos funcionais capazes de evocado vesículas sinápticas exo-e endocitose Figura 4c e 4d Figura. Secções das regiões isoladas dos axônios reticulospinais podem ser claramente identificados em microscópio de luz para estar livre de quaisquer outros processos neuronais que permitem o acesso irrestrito ao reticuloespinhal membrana do axônio Figura 2f. Os axônios manter a integridade estrutural após a dissociação. Isolados axônios foram remendado na configuração de célula inteira e preenchido com Alexa Fluor 488 hidrazida. O corante uniformemente distribuídos dentro do axônio e nenhum vazamento do corante foi verificada a partir do axônio figura 4a.
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Figura 4 gravações representativas de um axônio reticuloespinhal isolado. (A) axónio reticuloespinhal isolado preenchido com Alexa Fluor 488 hidrazida com uma pipeta de adesivo na configuração de célula inteira. Posição Pipeta é indicado com uma seta branca. (B) i. Potencial de ação Representante ateado fogo em um axônio reticuloespinhal isolado. ii. Potencial de ação Representante ateado fogo em um axônio reticuloespinhal na medula espinhal intacta. Seta preta indica o ponto de tempo de estimulação. (C) e (d) Duas imagens de um axônio reticuloespinhal isolado mostrando rotulagem pontuada de terminais pré-sinápticos com FM 1-43 e direcionamento de um terminal pré-sináptico indivíduo com pipeta patch para ligado à célula de gravação patch. Setas verdes marcar terminais pré-sinápticos individuais enquanto seta branca marca a pipeta patch. (E) inoperante isolada axônio reticuloespinhal mostrando indiscrincorporação iminate de FM 1-43 ao longo do axônio. 4f. Exemplo representativo mostrando gravação ligado à célula de correntes de Ca2 + (10 mM de [Ca2 +] externo na solução de gravação na pipeta patch) a partir da membrana pré-sináptica cara libertação demonstrando a abertura de múltiplos canais de Ca2 +. Linha sólida marcada 0 indica estado fechado de canal, enquanto que as linhas tracejadas indicam os picos de Gauss para aberturas de canal.
Axônios agudamente dissociadas reter propriedades elétricas. Potencial de repouso da membrana (PGR) pode ser medido por empalar o axônio desassociada com microeletrodos ou remendar o axônio em configuração de célula inteira no modo pinça de corrente. RMP similares são registrados em ambos os métodos, com uma média de -57,94 ± 1,63 mV (n = 17 axônios). Além disso, dissociado axônios podem ser estimuladas a disparar potenciais de ação Figura 4b, com o curso de forma e tempo do potencial de ação é comparávelpara uma cozida num axónio reticuloespinhal na medula espinhal intacta.
Fusão das vesículas e reciclagem persistem em axônios dissociados. Aglomerados de vesículas de reciclagem podem ser marcadas com o corante cstiril FM 1-43 durante a alta de potássio (KCl 30 mM) estimulação 19. Após a depuração corante, rotulagem ponteada distinta de terminais pré-sinápticos pode ser observado Figura 4c e figura 4d, com uma distribuição semelhante à axónios reticulospinais na medula espinhal intacta 13. FM 1-43 coloração proporciona uma distinção clara entre os axônios saudáveis e não saudáveis como axônios saudáveis mostram a entrada do corante FM indiscriminado ao longo do axônio Figura 4e. A capacidade de identificar claramente terminais pré-sinápticos individuais nos permite orientá-las com uma pipeta de patch para gravar Figura 4c e 4d Figura. Utilizando essa capacidade, temos registrado Ca2 + correntes diretamente do rosto liberação membrane de único terminais pré-sinápticos Figura 4f.
A preparação agudamente isolados axónio reticuloespinhal também oferece vantagens distintas em relação à medula espinal intacta para imuno-histoquímica de terminais pré-sinápticos individuais. A falta de qualquer fundo autofluorescência e ausência de manchas em estruturas de pós-sinápticos ou glia permite a identificação inequívoca de rotulagem anticorpo nos terminais pré-sinápticos identificados (Figura 5b, i). Juntamente com um marcador pré-sináptico, como Alexa-488 phalloidin conjugado (Figura 5a, ii) e (Figura 5b, ii), que rotula actina pré-sináptico 20, localização de imunohistoquímica para terminais pré-sinápticos pode ser claramente demonstrado (Figura 5a, iii). Esta abordagem tem sido usada em conjunção com microscopia confocal para realizar a caracterização imuno-histoquímica dos diferentes subtipos VGCC mostrando therdeiro localização específica de pré-sináptica terminais Figura 5a.
Figura 5 Imunocoloração de um axônio reticuloespinhal isolado. (A) caracterização imuno-histoquímica de tipo R (CaV2.3) do canal de cálcio nos terminais pré-sinápticos individuais. i. Um anticorpo policlonal primário foi usado para marcar um epítopo na ansa intracelular entre os domínios II e III do canal de cálcio de tipo P (hospedeiro - coelho). O anticorpo secundário foi Alexa Fluor 633 conjugado com hidrazida de cabra anti-IgG de coelho. ii. Terminais pré-sinápticos identificados por Alexa Fluor 488 faloidina rotulagem de actina pré-sináptico. iii. Co-localização entre a rotulagem do tipo R anticorpo (vermelho) e Alexa-488 phalloidin (verde) mostrado em uma sobreposição resultante da fusão. (B) i. Pré-incubação de anti-tipo R anticorpo canal de cálcio comantigénio de controlo não produz qualquer rotulagem específica dos canais de cálcio. ii. Alexa Fluor 488 faloidina rotulagem dos terminais pré-sinápticos para a mesma axónio mostrando rotulagem ponteada discreta.
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Discussion
Nosso protocolo de dissociação é significativo por ceder axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter funcional pré-sináptica terminais Figura 4c e 4d Figura. A ausência de processos pós-sinápticos que se opõem ao terminal pré-sináptico permite o acesso a gravação direta para a membrana rosto liberação pré-sináptica nos terminais pré-sinápticos individuais, que não eram possíveis nas sinapses centrais e alcançado com êxito em apenas dois do tipo coletor terminais pré-sinápticos; cálice do tipo sinapse do pinto gânglio ciliar 7-10 e rato calyces 11,12. Terminais pré-sinápticos individual, que ao nível micrográfica de elétrons foram mostrados para apresentar únicas zonas simples, ativos 21, podem ser identificadas por conjuntos de vesículas de reciclagem marcação com FM 1-43 e orientada para a gravação Figura 4c e 4d Figura. Ca
A chave para a obtenção de axónios reticulospinais isolado com terminais pré-sinápticos funcional encontra-se em uma série de críticoal etapas seqüenciais. Tissue impedindo dissociação aguda dos axónios gigantes localizados principalmente na região dorso-medial da medula espinhal Figura 1a tinha de ser removido em primeiro lugar num cortador de tecidos de vibração Figura 2a. Isto faz com que seja mais fácil para dissociar mecanicamente a medula usando o menor força possível. O corte da coluna dorsal requer a remoção completa do Primitiva meninx dorsal já que qualquer restante Primitiva meninx dorsal impediria a ação de corte da lâmina. Descobrimos que, deixando o Primitiva meninge ventrais na medula espinal, no momento de corte ajuda a manter a forma da medula espinhal e auxilia na melhor corte. A manutenção de tensão na coluna vertebral durante o processo de corte evita qualquer movimento lateral ou impinging do tecido sob a lâmina que iria danificar os axónios. 1 cm de comprimento peças medulares fornece um bom comprimento para cortar como o tecido pode ser esticado e fixado para baixo, mantendo a tensão wnquanto corte. Outro factor é crítico para monitorizar a profundidade do corte; muito raso uma fatia impede uma boa separação da medula espinhal, enquanto a fatia danos muito profundos os axônios reticulospinais. Uma profundidade de corte é um bom onde a coluna dorsal é removida, deixando a coluna visivelmente reticuloespinhal ventral intacta. A profundidade do corte tem de ser medido durante o processo de corte dada há uma variação na espessura da medula espinal entre os animais. A remoção da coluna dorsal é melhor realizada na seção do meio da medula espinhal pedaço Figura 2b, uma vez que permite a rostral não fatiado e caudal termina a servir como alças para segurar o tecido durante o processo de dissociação Figura 2e.
Após a remoção da coluna dorsal, o tratamento das peças da medula espinhal em fatias com uma mistura de colagenase (colagenase de tipo IA de Clostridium histolyticum) e protease (Protease XIV Tipo de Streptomyces griseus) enzimas (1 mg / mL em solução de Ringer) ajuda a digerir o tecido conjuntivo e facilita a dissociação suave. Uma digestão de 30-45 minutos à temperatura ambiente é ideal para a dissociação. Dissociação enzimática completa da lampreia medula espinal tem sido anteriormente realizado com tratamentos sequenciais com colagenase (2 mg / ml, 30 min) e protease (2 mg / ml, 45 min) para isolar neurónios espinais 17. Tratamentos sequenciais comparação com o tratamento com um coquetel de protease e colagenase não deu melhores resultados em dissociar axônios reticulospinais. Também experimentou com diferentes concentrações das enzimas de dissociação. As concentrações de enzima superiores a 2 mg / ml ou de digestão vezes mais longos do que 45 minutos resultou na medula espinal a perder a sua coerência e dissociações pobres. As concentrações de enzima elevadas e tempos de tratamento prolongados podem auxiliar na dissociação completa da espinal-medula, quando são necessárias menores rendimentos de neurónios. Axónios reticulospinais, em contrapartida, tem uma stru estendidocture e tratamentos superiores a 45 min foram contraproducentes. Retenção de alguma tensão na medula espinhal ajudassem melhores dissociações.
O próximo passo é importante para reduzir os intervalos laterais das peças da espinal medula tratadas com enzimas no ponto médio da região cortada para isolar a força de dissociação final para a região que engloba os axônios reticulospinais. Os cortes devem estender-se desde a borda lateral da substância cinzenta chifre ventral à coluna ventro-medial central da axônios reticulospinais deixando-Figura 2d sem danos. Cortar as extensões laterais fornece um ponto focal em que a separação da medula espinhal forçado ocorrerá durante dissociação mecânica e facilita uma separação suave do tecido. Tensão sustentada na medula espinhal é necessária durante o processo de corte e pode ser alcançado através de alongamento e fixando as extremidades caudal e rostral da parte da medula espinhal. Isto evita a deformação dos tecidos sob a lâmina de bisturie consequente lesão dos axônios.
O passo final é a aplicação de tensão de dissociação mecânica e alongamento suavemente o tecido ao longo do eixo rostro-caudal Figura 2e usando fórceps para agarrar o tecido. Esta etapa é executada através de lamelas revestidos poli-lisina para permitir a adesão dos axônios separados para gravação posterior. A fim de alcançar uma maior adesão para os longos axónios estendidos reticulospinais, usámos um elevado peso molecular (> 300.000)-poli-D lisina bromidrato, o que proporciona maior número de pontos de fixação, para o revestimento de lamelas e as inserções de placas de petri. A superfície revestida com poli-lisina proporciona uma aderência suficiente para a medula espinal e os axónios termina reticulospinais agudamente isolados. Teflon fórceps revestidos são obrigados a segurar a medula espinhal, porque ele adere firmemente a pinça de aço inoxidável regulares impedem dissociações. O tecido deve ser esticado lentamente e puxando os axônios para fora do spcabo inal. A melhor maneira de obter os axônios se estabelecer é a de manter a medula espinhal termina ao longo da lamela de vidro em todos os momentos durante o processo de dissociação, mantendo uma pressão descendente sobre a medula espinhal rostral e caudal termina com a pinça.
Os axónios são melhor classificados como parcialmente isolado, uma vez que parte do axónio permanece dentro de, no mínimo, uma extremidade do final da medula espinal de acordo com a medida da dissociação. No isolamento pode ser realizado por separação mecânica das duas extremidades da coluna vertebral, até os axónios completamente separadas de um lado da medula espinal. Neste caso, uma porção do axónio permanece no interior da extremidade da medula espinal a partir da qual emerge, enquanto a porção restante é isolado para fora do interior da medula espinal. A extremidade aberta terminal dos axónios veda-se por um processo de re-selagem da membrana, dependendo da saúde do axónio. No isolamento também pode ser realizado de tal modo que os axónios emergir a partir da medula espinal, but o caudal e rostral extremidades da medula espinhal permanecem ligados por meio dos axónios reticulospinais isolados Figura 2e. Neste ponto, liberando suavemente a pressão permite que os axônios sob tensão para relaxar e loop out produzindo regiões isoladas de axônios desprovidos de projeções pós-sinápticos. Ambas as técnicas de dissociação produzir axónios funcionais. A temperatura fisiológica para a lampreia é de 10 ° C e, portanto, a preparação é deixada a recuperar a 10 ° C durante 1 hora para permitir que os axónios para se recuperar a partir da dissociação aguda. Para registos electrofisiolicos, a dissociação foi realizada em uma lamela revestida com poli-lisina inserido num Figura câmara costume 3. Lampreia medulas espinhais foram geralmente mantidas a 10 ± 2 ° C por meio de perfusão a solução de Ringer, previamente arrefecido a 10 ° C por passagem através um dispositivo de resfriamento termoelétrico. Excepcionalmente baixo ruído de fundo é necessário para resolver um único canal Ca Alta K + (KCl 30 mM) é usado para despolarizar os axônios (seção 4.1), de modo que a tintura FM é incorporadavesículas durante a endocitose exo-sináptica. É difícil manter a inserção de um microeletrodos nos axônios isolados por períodos prolongados como o menor desvio em posição axônio faz com que o eletrodo a recuar a partir do axônio. Isto faz com que seja difícil para estimular os axónios em período prolongado utilizando um microeléctrodo. O grande diâmetro do axónio (20-50 um) faz com que seja difícil para estimular usando um eléctrodo de estimulação de tungsténio. Assim K + elevado foi usado para despolarizar os axónios. Os terminais pré-sinápticos dos axónios reticulospinais tem um diâmetro de 1-2 um. Ca2 + correntes são localizada na membrana rosto liberação nos terminais pré-sinápticos e é, portanto, crucial para atingir com precisão o terminal pré-sináptico. Assim, um requisito fundamental para alcançar essas gravações é ser capaz de manipular o movimento da posição remendo pipeta em incrementos m. Correntes de Ca 2 + em membranas de libertação pré-sináptica de face foram demonstred em sinapses de cálice de ser extremamente pequena em amplitude, inferior a 0,5 pA. Gravações de um único canal de Ca2 + correntes, portanto, exigem níveis extremamente baixos de ruído de fundo. Baixo ruído térmico foi conseguida com um amplificador Axopatch 200B e um andar de entrada arrefecida. Além disso, as fontes de ruído contaminantes necessitam de ser identificados e eliminados de forma sistemática. Pipetas patch foram fabricados, a partir de vidro de aluminossilicato para garantir baixo nível de ruído, desde o vidro tem extremamente baixas impurezas e alta resistividade. As pipetas foram criados de tal modo que o diâmetro da ponta da pipeta era maior do que o diâmetro do terminal pré-sináptico, assim abrangendo completamente o terminal pré-sináptico, as dimensões do qual pode ser claramente observado pela FM 1-43 rotulagem. Isso garantiu a gravação de toda a membrana rosto release. O ruído capacitivo foi reduzida por revestimento da pipeta com PDMS o mais próximo da ponta quanto possível. Os selos gigaohm em membranas terminal pré-sináptico não são estáveis por muito tempo porIODs e gravações duram, no máximo, 2 min. Isto faz com que as gravações extremamente difícil a obtenção de uma vez que a baixa taxa de sucesso requer um grande número de tentativas para a obtenção de gravações bem sucedidas. Soluções de gravação tem de ser concebido de modo que todas as outras correntes conhecidas na membrana do terminal pré-sináptico, como voltagem-Na + e canais de K + e Ca2 + -activated K + canais são bloqueados, permitindo a gravação de Ca2 + correntes. Existem algumas limitações para o uso superfície adesiva a poli-lisina com esta preparação. Uma delas é a incapacidade de se mover a localização física da câmara que contém a preparação porque quaisquer vibrações interrompido a preparação. Outra limitação da superfície do adesivo foi descoberto durante experimentos de imunohistoquímica, como as peças rostral e caudal final da medula espinhal perder aderência quando incubadas em paraformaldeído a 4%. Temos tentado coa adesivo alternativatings, como Cell-Tak e encontrou problemas semelhantes. A fim de resolver estes problemas, utilizou-se cola líquida sutura para fixar as pegas da medula espinhal. Os detalhes a respeito do uso da cola de sutura foram discutidos em um artigo anterior JoVE por Chen e Featherstone 22. Os conjuntos de cola em um ritmo mais lento em soluções sem íons bivalentes e aproveitamos que a propriedade e realizou as dissociações em solução de Ringer sem Ca 2 + e Mg 2 +. Este nós com um tempo adicional para a manipulação do tecido durante o processo de dissociação. Nós adoptou uma abordagem semelhante com Chen e Featherstone 22 usando pipetas de sucção remendo e boca através de um tubo ligado à pipeta patch para aplicar a cola sobre a área alvo específica sobre a superfície da dissociação antes de se realizar a dissociação (Protocolo secção 5.2). As dissociações foram realizados como descrito anteriormente, com a única diferença sendo que o c espinalextremidades ord foram afixados durante o processo de dissociação, arrastando levemente a extremidade do punho sobre a cola previamente colocado (Protocolo secção 5.3). Uma vez que a dissociação foi completada, o ião divalente livre solução de Ringer foi trocada por solução de Ringer contendo Ca 2 + e Mg 2 + iões por perfusão e a preparação foi deixada a recuperar a 10 ° C durante 20-30 minutos em uma placa de arrefecimento termoeléctrico antes prosseguir para as etapas subseqüentes de imuno-histoquímica. A implicação fundamental desta técnica é a compreensão precisa do Ca2 + requisito para a libertação de neurotransmissores, o que não foi completamente resolvido, apesar de décadas de investigação. Um aumento transitório da pré-sináptica [Ca 2 +] foi estabelecida como sendo crucial para desencadear a liberação em todas as sinapses. No entanto, continua a faltar o consenso sobre o número de canais de Ca 2 +, que contribuem para o Ca2 + domínio gating RELEASE. Medição simultânea de correntes de Ca2 + e medidas de capacitância na membrana rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais daria uma resposta inequívoca a esta questão. Além disso, permitiria a elucidação da relação de temporização entre a pré-sináptica a entrada de Ca2 + e de vesícula de fusão, permitindo que uma medida precisa do atraso sináptica. A acessibilidade irrestrita à membrana rosto liberação nos terminais pré-sinápticos individuais fornece a capacidade de aplicar um número de diferentes abordagens experimentais para estudar vários componentes do processo de liberação de neurotransmissores. Exemplos de tais abordagens incluem imagem vesícula única usando pontos quânticos para estudar a fusão das vesículas sinápticas. Eventos de fusão da vesícula também pode ser caracterizada diretamente nos terminais pré-sinápticos medindo mudanças de capacitância de membrana que fundamentam eventos de fusão da vesícula.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
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