Abstract
La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido. Potencial de acción impulsado afluencia de Ca 2 + en la terminal presináptica, a través de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCCs) localizados en la membrana cara liberación, es el detonante de la fusión de vesículas y la liberación de neurotransmisores. Crucial para la rapidez de la transmisión sináptica es la sincronía espacial y temporal entre la llegada del potencial de acción, VGCCs y la maquinaria liberación de neurotransmisores. La capacidad de grabar directamente Ca 2 + corrientes de la membrana cara liberación de terminales presinápticas individuales es imperativo para una comprensión precisa de la relación entre presináptica Ca 2 + y la liberación de neurotransmisores. El acceso a la membrana cara liberación presináptica de registro electrofisiológico no está disponible en la mayoría de las preparaciones y Ca 2 + entrada presináptica se ha caracterizado mediante técnicas de imagen y MeasureMe corriente macroscópicaNTS - técnicas que no tienen suficiente resolución temporal para visualizar la entrada de Ca 2 +. La caracterización de VGCCs directamente en las terminales presinápticas individuales no ha sido posible en las sinapsis centrales y hasta el momento se ha logrado con éxito sólo en el tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo y en los cálices de rata. Hemos abordado con éxito este problema en la sinapsis reticulospinal gigante de la lamprea de la médula espinal mediante el desarrollo de una preparación agudamente disociado de la médula espinal que produce axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de estructuras postsinápticas. Fluorescencia Podemos etiquetar e identificar las terminales presinápticas individuales y dirigirlos para la grabación. El uso de esta preparación, hemos caracterizado VGCCs directamente en la cara liberación de terminales presinápticas individuales utilizando enfoques de inmunohistoquímica y de electrofisiología. Ca 2 + corrientes se han registrado directamente en la cara de la membrana de liberación of terminales presinápticas individuales, la primera de grabación a ser llevadas a cabo en las sinapsis centrales.
Introduction
La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido y preciso. Acción potencial invasión de la terminal presináptica conduce a la apertura de VGCCs situados en la membrana cara liberación, el aumento resultante en presináptica Ca 2 + que actúa como el disparador para la fusión de vesículas y liberación de neurotransmisores 1. Todos estos pasos se dan dentro de cientos de microsegundos 2, y por lo tanto requieren de acoplamiento espacial estricto de VGCCs a la maquinaria de la fusión de vesículas 3. Presináptica Ca 2 + flujos se han caracterizado principalmente por medio de imágenes enfoques usando colorantes sensibles al Ca 2 + 4. La incorporación de Ca 2 + tampones que modulan Ca2 + en las neuronas presinápticas se ha utilizado para caracterizar indirectamente la relación entre el calcio y la neurotransmisión presináptica 3. Además, la modulación de la presináptica libre de Ca 2 + de concentración por uncaging Ca 2 + 5 o grabar macroscopic Ca 2 + corrientes se han usado en conjunción con medidas de la fusión de vesículas y / o liberación; tales como medidas de capacitancia 6 o postsináptica respuestas 2 para abordar la misma cuestión. Sin embargo, la caracterización de Ca 2 + corrientes directamente en la cara de la liberación, la sección especializada de la membrana presináptica, donde despolarización de la membrana se traduce en Ca 2 + corrientes desencadenan la fusión de vesículas sinápticas y la liberación de neurotransmisores, es esencial para obtener una medida precisa de la Ca 2 + requisito para la fusión de la vesícula sináptica. Además, la capacidad para caracterizar directamente Ca 2 + corrientes en los terminales presinápticos individuales, junto con mediciones simultáneas precisas de la fusión de vesículas y liberación permite una elucidación precisa de la relación de temporización entre el transcurso de tiempo del potencial de acción, presináptica Ca 2 + actual, la fusión de vesículas y la liberación. El acceso a la membrana de liberación carano está disponible en la mayoría de los terminales presinápticos debido a la estrecha aposición por las dendritas postsinápticas. Esta inaccesibilidad ha sido un obstáculo importante en la caracterización de VGCCs ya que impide las mediciones directas de la corriente en las terminales presinápticas individuales. Caracterización directa de presináptica Ca 2 + corrientes en las terminales presinápticas individuales hasta el momento no ha sido posible en las sinapsis centrales y sólo se ha logrado en dos terminales presinápticas tipo cálices; tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo de 7-10 y de rata cálices 11,12. En todos los otros terminales presinápticas incluyendo la sinapsis reticulospinal gigante en la lamprea de la médula espinal 13, la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica ha hecho necesario el uso de enfoques indirectos tales como Ca 2 + de imágenes para estudiar presináptica Ca 2 + flujos.
Figura sinapsis reticulospinal gigante. (A) Sección 1.-Lamprea de lamprea médula espinal que indica la orientación dorso-ventral. Reticuloespinal axones están marcados con el asterisco verde. (B) la reconstrucción 3-D de la sinapsis reticuloespinal en la lamprea de la médula espinal que muestra presináptica del axón reticuloespinal hacer numerosos contactos en passant (marcado por flechas verdes) en la neurona postsináptica 13. Terminales presinápticas han sido etiquetados con Alexa Fluor 488 hidrazida conjugado faloidina (verde), mientras que la neurona postsináptica se ha llenado con Alexa Fluor 568 hidrazida (rojo).
Axones gigantes reticulospinales lamprea, ubicadas en la región ventral de la médula espinal en paralelo a la rostral-caudal eje Figura 1a, la forma múltiple en passant contactos sinápticos en neuronas de laasta ventral de la médula 14 Figura 1b 13. De células enteras macroscópica Ca 2 + corrientes han sido registrados en los axones reticulospinales en la médula espinal intacta 13,15. Sin embargo, los intentos anteriores ciegos en la medición directa de Ca 2 + corrientes en los axones reticulospinales en la lamprea intacta la médula espinal usando técnica de patch clamp de células inscritos han tenido éxito 13 debido a la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica debido a los procesos postsinápticos opuestas la Figura 1b. La membrana cara liberación ha sido previamente hecho accesible por la eliminación de la neurona postsináptica 11, perturbación mecánica de la sinapsis antes de grabar 12 o el tratamiento enzimático junto con disociación mecánica 16. Dada la compleja organización de la médula espinal, que resultaría extremadamente difícil identificar la neurona postsináptica y retraer mecánicamente o perturbar ªe sinapsis. Por lo tanto, hemos decidido utilizar el tratamiento enzimático 17 seguido por disociación mecánica.
Con este enfoque, hemos desarrollado una preparación agudamente disociado de la lamprea de la médula espinal que produce viables axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de cualquier proceso de post-sinápticos, proporcionando así un acceso sin restricciones a las terminales presinápticas individuales. En conjunto con un microscopio invertido y estándar de imágenes de fluorescencia, que nos permite identificar y seleccionar los terminales presinápticos con fluorescencia identificado individuales, con una pipeta de parche que contiene una solución de grabación que aísla Ca 2 + corrientes 4c figura y la figura 4d, para la grabación con base celular técnica de fijación de voltaje adjunta. Ca 2 + corrientes se han registrado directamente en la membrana cara liberación presináptica de los terminales presinápticos individuo Figura 4f. Esta es una SIGNIFICAnt avance en el campo de la transmisión sináptica, ya que es la primera grabación que se llevó a cabo en las sinapsis centrales.
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Protocol
1. Preparación de poli-D-lisina bromhidrato
- Preparar bromhidrato de poli-D-lisina 1 mg / ml en tampón borato 0,1 M (pH 8,5).
- Alícuota y almacenar a -20 ° C.
Recubrimiento 2. poli-lisina de Cubreobjetos
Nota: Llevar a cabo todos los pasos de limpieza y revestimiento en una cámara de flujo laminar.
- Coloque los portaobjetos en una placa de Petri que contiene 1 N de ácido clorhídrico (HCl) durante 2 horas.
- Aspire todo el HCl y enjuague con un 70% de etanol (EtOH) 2-3 veces.
- Deja en EtOH al 70% durante 1 hora.
- Aspire todo el EtOH al 70% y enjuague con EtOH al 100% 2-3x.
- Deja en EtOH al 100% durante 2 horas. Aspirar todo EtOH.
- Secar con papel de filtro y secar al aire durante unos pocos segundos.
- Lugar O N en 1 mg solución poli-lisina / / ml.
- Enjuague cubreobjetos día siguiente con 4-5x agua Millipore.
- Aire seco poli-lisina recubierto cubreobjetos sobre rodillos de cristal en una placa de Petri limpia.
- Para immunohistochemistry, utilizar 35 x 10 mm de Petri tapas de los recipientes. Preparar Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) forrado platos vertiendo PDMS (elastómero y agente de curado de 10: 1 en peso) en el plato con un grosor de 0,3 cm y permita que se asiente en el 30 ° CO / N. Una vez que esto se ha puesto, cortar unos 2 cm por 1 cm emplazada en el PDMS. Limpiar y recubrir la inserción con poli-lisina siguiendo los mismos pasos como se mencionó anteriormente para cubreobjetos.
- Tienda cubreobjetos y platos recubiertos de poli-lisina cubiertos dentro de la cámara de flujo laminar hasta su uso (hasta 2 semanas, pero lograr mejores resultados mediante la preparación de adhesivos periódicamente cada 3-4 días).
- Preparar un bloque PDMS, al pin de la médula espinal en la máquina de cortar el tejido que vibra. Mix Elastómero A y B Elastómero 1: 1 en peso. Vierta la mezcla en un plato 100 x 15 mm de Petri y permita que se asiente O / N a 30 ° C. Corte un pedazo rectangular de los PMDS y péguelo en la placa base de corte utilizando pegamento epóxico. Deje que el pegamento se seque la fijación de los PDMS en lugar y cortar varias secciones delgadas de la superficie para obtener un pisosuperficie a la clavija del tejido en.
3. aguda disociación de la lamprea de la médula espinal al rendimiento aislado axones reticuloespinal
- Anestesiar a un ammoecoete o adulto lamprea (Petromyzon marinus) con metanosulfonato tricaína (MS-222, 100 mg / L). Añadir anestésico en el agua, en un vaso de plástico cubierto por una tapa, que contiene la lamprea para ser sacrificado.
- Decapitar lamprea en frío (4 ° C) solución de Ringer de la siguiente composición (en mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 de dextrosa (pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) y retirar el cuerpo músculos de la pared para exponer la superficie dorsal de la médula espinal.
- Eliminar meninge primitiva de la superficie dorsal de la médula espinal utilizando unas pinzas finas. No retire primitiva meninge ventral en esta etapa.
- Cortar la médula espinal en trozos de 1 cm de largo.
- Pin un pedazo de la médula espinal con alfileres de insectos finas, frente a lado dorsal hacia arriba, sobre un PDMS forrado rebanar pla de baseTE (véase 2.12) en una cámara de la máquina de cortar tejido vibrante que contiene la solución de Ringer enfriada con hielo.
- Eliminar una sección central de la columna dorsal de la médula espinal por corte a lo largo del eje rostro-caudal con la hoja, dejando tras de secciones de columna dorsal intactos en el rostral y caudal termina para servir como asas durante el proceso de disociación Figura 2a y la Figura 2b. Use ajuste de velocidad más lenta que permite cortar y un ajuste de la profundidad que elimina sólo la columna de la dorsal dejando la columna subyacente axón reticulospinal Figura 2b sin daños.
- Incubar en rodajas piezas de la médula espinal a ta durante 45 min en un cóctel de 1 mg / ml de proteasa (Tipo XIV de Streptomyces griseus) y 1 mg / ml de colagenasa preparado (Tipo IA de Clostridium histolyticum) en solución de Ringer (adaptado de El Manira y Bussières , 1997 17).
- Piezas de la médula espinal tratados con enzimas Pin utilizando pasadores finos en una placa de Petri de PDMS se alinearon contanando frío (4 ° C) solución de Ringer.
- Retire primitiva meninge ventral con unas pinzas finas.
- Cortar secciones laterales de la médula espinal con una hoja de bisturí en el punto medio de la sección dorsal rodajas de salir de la columna central de los axones intactos reticulospinales en la médula espinal Figura 2d.
- Ponga una gota de aceite de inmersión en el objetivo.
- Coloque el cubreobjetos poli-lisina recubierto (Figura 3a, la pieza superior, un rectángulo rojo) en la ranura de la cámara de grabación de la figura 3 y aplicar grasa de vacío para todos los bordes (espacio entre los rectángulos rojos y azules en la Figura 3a, para facilitar un sello. Tornillo la parte superior en su lugar. Coloque la cámara en la inserción en el equipo de grabación.
- Añadir la solución de Ringer en la cámara de grabación usando una pipeta Pasteur.
- Conectar la tubería de salida de la botella de presión que contiene solución anticongelante a la tubería de entrada del dispositivo de refrigeración termoeléctrica. Conecte el caliut tubo del dispositivo de refrigeración termoeléctrica al extremo de entrada de la camisa de refrigeración exterior y el extremo de salida al depósito de la Figura 3b.
- Colocar una pieza de la médula espinal a la vez en la cámara de grabación y separar suavemente la médula espinal mantener a lo largo del cubreobjetos en todo momento utilizando fórceps recubiertos de teflón hasta que los axones están aislados Figura 2e y la figura 2f.
- Llevar la temperatura de la solución de grabación a 10 ° C haciendo pasar la (gas nitrógeno es empujado dentro de la botella) presurizado solución anticongelante (por el desplazamiento), a través del dispositivo de refrigeración termoeléctrica, a través de la camisa de refrigeración externa de la cámara de grabación de la figura 3b.
- Permitir que los axones se recuperen para el post disociación de 1 hora a 10 ° C.
Figura 3. esquemática de cámara para experimentos de electrofisiología grabación. Dimensiones proporcionadas están en pulgadas. Rectángulo rojo muestra en el diagrama basepiece (a) indica el posicionamiento de cubreobjetos en la ranura cubreobjetos en el basepiece. La región entre el rectángulo rojo y azul, que se muestra en el diagrama basepiece (a) es donde se aplica la grasa de alto vacío. (B) muestra la cámara de grabación montado.
4. etiquetado y la identificación de los terminales presinápticos con FM 1-43
- Etiquetar las terminales presinápticas, mediante la incorporación de FM 1-43 en vesicles durante sináptica exo-endocitosis durante la escuela K + despolarización. Perfundir preparación con 5 M FM 1-43 (en solución 5 ml de Ringer que contiene 30 mM KCl).
- Perfundir preparación con 1 mg / ml ADVASEP-7 (en solución de Ringer 5 ml) para eliminar el exceso de colorante FM) 18.
- Perfundir preparación con solución de Ringer durante 15 min al lavado por cualquier colorante Remant y la ADVASEP.
- Imagen con 100 X lente de inmersión en aceite (NA 1,25) en un microscopio de fluorescencia invertido, en conjunción con una cámara CCD digital y la adquisición de imágenes micromanager software, utilizando protocolos de formación de imágenes de fluorescencia estándar.
- Identificar los terminales presinápticos marcados con fluorescencia para apuntar para la grabación de la figura 4c y 4d Figura.
5. inmunohistoquímica de aislados axones reticuloespinal
- Rellene inserción plato (sección Protocolo 2.10.) Con divalente-ion (Ca 2 + y Mg 2 +) libreSolución de Ringer.
- Fabrique pipetas de parche en un extractor micropipeta P-87. Colocar una pequeña cantidad de pegamento de sutura en un extremo de la inserción de poli-lisina utilizando una pipeta de parche (1,5 mm de vidrio de diámetro exterior) y de aspiración (usando un tubo de silicona 0,89 mm de diámetro interior con una punta de micropipeta unido al extremo de succión).
- Realizar disociaciones utilizando el mismo procedimiento que se menciona en la sección de protocolo 3 Figura 2. Coloque un extremo de la médula espinal en la cola de sutura y presione suavemente con unas pinzas para adherirse fuertemente a la superficie. Coloque otra gota de pegamento de sutura en el otro extremo de la inserción y estirar suavemente la médula espinal hasta que se disocian los axones y adherir el extremo libre de la médula espinal arrastrándolo suavemente sobre el pegamento de sutura. Fijar en su lugar por prensado suave hacia abajo con las pinzas.
- Divalente libre intercambio solución de Ringer con solución de Ringer normal por perfusión.
- Permitir que los axones se recuperen para el post dissoc 20 miniation a 10 ° C.
- Fijar los axones disociadas en 4% de paraformaldehído (PFA) {preparado en tampón fosfato salino (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtra solución de PFA antes de su uso mediante el paso a través de un filtro de jeringa de 0,2 mM.
- Lave la PFA perfundiendo glicina 0,1 M (en PBS) durante 10 min.
- Incubar en 0,1% de Triton-X (en PBS) durante 10 min.
- Lavar por perfusión PBS durante 20 min.
- Se bloquea con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 6 horas a 4 ° C.
- Añadir en el anticuerpo primario a VGCC de interés (dilución 1: 200 en PBS) y se incuba durante 20 horas a 4 ° C.
- Lavar por perfusión PBS durante 20 min.
- Bloquear con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 10 min a 4 ° C.
- Añadir en anticuerpo secundario (dilución 1: 400 en PBS) y se incuba en la oscuridad durante 2 horas a 4 ° C.
- Lavar por perfusión con PBS durante 20 min.
- Bloque con 1% de suero bovino Albumin (en PBS) durante 20 min.
- Añadir en Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / l concentración de trabajo; de stock preparada en metanol 200 Unidades / ml).
- Lavar por perfusión con PBS durante 20 min.
- Image usando lente de inmersión 100X agua en el microscopio confocal.
6. electrofisiológico de grabación
- Fabrique pipetas de parche de vidrio de aluminosilicato (resistencia pipeta 2-5 mW) en un extractor de micropipeta P-87. Diseño parche pipeta de tal manera que la punta de pipeta abarca toda diámetro terminal presináptica.
- PDMS pipetas de parche capa por inmersión de la pipeta de parche bajo presión de 50-60 psi en PDMS 23 (adjuntar un tubo de silicona, 0,89 mm de diámetro interior, conectado a un cilindro de gas nitrógeno, a la parte de atrás de la pipeta de parche) y secar usando un calor arma. Alternativamente, la capa manualmente la pipeta con PDMS, la aplicación de recubrimiento tan cerca de la punta como sea posible, bajo un microscopio compuesto.
- Fuego pipetas parche pulido utilizando un microforge (un filamento de platino a la medida montado sobre la platina de un microscopio compuesto).
- Identificar los axones aislados que demuestran terminales presinápticos marcados por microscopía de fluorescencia.
- Llenar solución de grabación (diseñado para aislar Ca 2 + corrientes; 10 mM CaCl 2 o 90 mM BaCl 2 como portador de carga, tamponada de HEPES pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) en el parche pipeta usando una jeringa.
- Inserte parche pipeta en el soporte de la pipeta y posición por encima del baño usando un manipulador motorizado MP225. Baje suavemente la pipeta parche en el baño y la posición contra la cara de un terminal presináptica fluorescente identificado.
- Avance el parche pipeta lentamente hasta que se haga contacto con la membrana. En este punto, lograr un sellado gigaohmio por succión la boca suave a través de un tubo conectado a la titular de la pipeta.
- Para alcanzar el fondo extremadamente bajos niveles de ruido requeridos para el registro de un solo canal de Ca 2 + corrientes, utilice una Axopatch 200B con un cabezal de la platina se enfrió durante las grabaciones. Datos de la muestra de 20 a 50 kHz y el filtro utilizando un filtro de Bessel 5 kHz. Llevar a cabo la adquisición de datos utilizando un AxoGraph X.
- Utilice un protocolo estándar para escaleras, en incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar un pre-pulso en el protocolo, el protocolo anterior etapa, para asegurar la activación máxima de los canales de Ca 2 +. Incorporar una mV paso 10 fugas en el protocolo de paso para un análisis posterior sustracción de corrientes de fuga.
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Representative Results
Esto produce la disociación de protocolo axones sanos y funcionales aisladas reticulospinal carentes de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo retener presináptica terminales funcionales capaces de vesícula sináptica evocada exo-y endocitosis Figura 4c y 4d Figura. Secciones de las regiones aisladas de los axones reticulospinal pueden ser claramente identificados con microscopía de luz para estar libre de cualquier otros procesos neuronales que permiten el acceso sin restricciones a la reticulospinal membrana del axón Figura 2f. Los axones conservan la integridad estructural después de la disociación. Axones aislados fueron parcheados en la configuración de célula completa y llenos de Alexa Fluor 488 hidrazida. El colorante distribuido uniformemente dentro del axón y no hay fugas de tinte se observa desde el axón Figura 4a.
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Figura 4. grabaciones representativas de un axón reticulospinal aislado. (A) axón reticuloespinal aislado lleno con Alexa Fluor 488 hidrazida con una pipeta de parche en la configuración de célula completa. Posición de la pipeta se indica con una flecha blanca. (B) i. Potencial de acción Representante disparado en un axón reticulospinal aislado. ii. Potencial de acción Representante encendido en un axón reticuloespinal en la médula espinal intacta. Negro flecha indica el punto de estimulación tiempo. (C) y (d) Dos imágenes de un axón reticuloespinal aislado que muestra etiquetado puntiforme de los terminales presinápticos con FM 1-43 y la orientación de un terminal presináptica individuo con pipeta de parche para la grabación de células de los parches adjunto. Las flechas verdes marcan las terminales presinápticas individuales mientras flecha blanca marca el parche pipeta. (E) Dead aislado axón reticulospinal mostrando indiscriminate incorporación de FM 1-43 en todo el axón. 4f. Ejemplo representativo que muestra la grabación de células-adjunto de Ca 2 + corrientes (10 mM [Ca 2 +] externa en la solución de grabación en el parche pipeta) de la membrana de la cara liberación presináptica que demuestra la apertura de múltiples canales de Ca2 +. Línea continua marcó 0 indica estado cerrado del canal, mientras que las líneas discontinuas indican los picos Gaussianos para aberturas de canal.
Axones aguda disociadas conservan propiedades eléctricas. Potencial de reposo de membrana (RMP) se puede medir por empalar el axón disociado con un microelectrodo o mediante un parche en el axón en la configuración de célula completa en el modo de abrazadera de corriente. RMP similares se registraron en ambos métodos, con una media de -57,94 ± 1,63 mV (n = 17 axones). Además, disociadas axones pueden ser estimulados para disparar potenciales de acción figura 4b, con el curso de la forma y el tiempo del potencial de acción es comparablea uno encendido en un axón reticuloespinal en la médula espinal intacta.
La fusión de vesículas y reciclaje persisten en los axones disociadas. Grupos de vesículas de reciclaje pueden ser etiquetados con el tinte estirilo FM 1-43 durante la escuela de potasio (30 mM KCl) estimulación 19. Al aclaramiento de tinte, etiquetado puntiforme distinta de los terminales presinápticos se puede observar la figura 4c y la figura 4d, con una distribución similar a los axones en el reticulospinales intacta la médula espinal 13. FM 1-43 tinción proporciona una clara distinción entre los axones saludables y no saludables como no saludables axones muestran la entrada de colorante FM indiscriminada en todo el axón Figura 4e. La capacidad de identificar claramente las terminales presinápticas individuales nos permite dirigirse a ellos con una pipeta de parche para la grabación de la figura 4c y 4d Figura. La utilización de esta capacidad, hemos registrado Ca 2 + corrientes directamente de la cara liberación membrane de terminales presinápticas única figura 4f.
La preparación axón reticuloespinal agudamente aislado también ofrece claras ventajas en comparación con la médula espinal intacta para inmunohistoquímica de las terminales presinápticas individuales. La falta de cualquier autofluorescencia de fondo y la ausencia de tinción en las estructuras postsinápticas o glía permite la identificación inequívoca de etiquetado de anticuerpos en los terminales presinápticos identificados (Figura 5b, i). Junto con un marcador presináptico como Alexa-488 conjugado phalloidin (Figura 5 bis, ii) y (Figura 5b, ii) que las etiquetas de actina presináptica 20, localización de marcaje inmunohistoquímico de las terminales presinápticas pueda demostrarse claramente (Figura 5a, iii). Este enfoque ha sido utilizado en conjunción con la microscopía confocal para llevar a cabo la caracterización inmunohistoquímica de los diferentes subtipos muestran VGCC theredero localización específica para presináptica terminales Figura 5a.
Figura 5. La inmunotinción de un axón reticuloespinal aislado. (A) la caracterización inmunohistoquímica de tipo R (Cav2.3) los canales de calcio en las terminales presinápticas individuales. i. Un anticuerpo primario policlonal se utilizó para etiquetar un epítopo en el bucle intracelular entre los dominios II y III del canal de calcio de tipo R (host - conejo). El anticuerpo secundario era Alexa Fluor 633 hidrazida conjugado de cabra anti-IgG de conejo. ii. Presináptica terminales identificados por Alexa Fluor 488 phalloidin etiquetado de actina presináptica. iii. Colocalización entre el etiquetado de tipo R anticuerpo (rojo) y Alexa-488 faloidina (verde) se muestra en una superposición fusionada. (B) i. La preincubación de anti-anticuerpo de tipo R de canales de calcio conantígeno de control no produce ningún etiquetado específico de los canales de calcio. ii. Alexa Fluor 488 faloidina etiquetado de los terminales presinápticos para la misma muestra axón etiquetado puntiforme discreta.
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Discussion
Nuestro protocolo de disociación es significativa al ceder axones reticulospinal aislados y fuera de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo conservan funcional presináptica terminales Figura 4c y 4d Figura. La ausencia de procesos de post-sinápticas se oponen a la terminal presináptica permite el acceso directo a la grabación de la membrana cara liberación presináptica en las terminales presinápticas individuales, antes no era posible en las sinapsis centrales y ha logrado con éxito en sólo dos terminales presinápticas de tipo cálices; tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo de 7-10 y de rata cálices 11,12. Los terminales presinápticos, que a nivel micrográfica electrónica se ha demostrado que presentan zonas activas simples, individuales 21, pueden ser identificados por grupos de vesículas de reciclaje etiquetado con FM 1-43 y dirigidos para la grabación de la figura 4c y 4d Figura. Ca
La clave para obtener los axones reticulospinales aislados con terminales presinápticas funcionales se encuentra en una serie de críticopasos secuenciales al. El tejido que impide la disociación aguda de los axones gigantes situadas principalmente en la región dorso-medial de la médula espinal Figura 1a tuvo que ser retirado por primera vez en una máquina de cortar el tejido que vibra Figura 2a. Esto hace que sea más fácil para disociar mecánicamente la médula espinal utilizando la fuerza menos posible. El corte de la columna dorsal requiere la eliminación completa de la meninge primitiva dorsal ya que cualquier restante meninge primitiva dorsal impediría la acción de corte de la cuchilla. Encontramos que salir de la meninge primitiva ventral sobre la médula espinal en el momento de corte ayuda a mantener la forma de la médula espinal y ayuda a un mejor corte. Mantener la tensión en la médula espinal durante el proceso de corte impide cualquier movimiento lateral o que incide del tejido debajo de la cuchilla que dañaría los axones. 1 cm de largo piezas de la médula espinal proporciona una buena longitud para cortar el tejido como se puede estirar y mantener la tensión inmovilizado wrebanar hile. Otro factor crítico para controlar es la profundidad de la rebanada; demasiado superficial una rebanada impide una buena separación de la médula espinal, mientras que demasiado profundos daños a los axones rebanada reticulospinal. Una buena profundidad rebanada es uno donde la columna dorsal se retira dejando visible la columna reticulospinal ventral sin daños. La profundidad de la rebanada tiene que ser calibrado durante el proceso de corte dado que hay variación en el espesor de la médula espinal entre los animales. La eliminación de la columna dorsal se realiza mejor en la sección media de la médula espinal pieza de la figura 2b ya que permite la unsliced rostral y caudal termina para servir como asas para agarrar el tejido durante el proceso de disociación Figura 2e.
Después de la retirada de la columna dorsal, el tratamiento de las piezas de la médula espinal en rodajas con una mezcla de colagenasa (colagenasa tipo IA de Clostridium histolyticum) y proteasa (Proteasa Tipo XIV de Streptomyces griseus) enzimas (1 mg / ml en solución de Ringer) ayuda a digerir el tejido conectivo y facilita una disociación suave. Una digestión 30-45 min a RT es ideal para la disociación. Disociación enzimática completa de la lamprea de la médula espinal se ha realizado previamente con tratamientos secuenciales de colagenasa (2 mg / ml, 30 min) y de la proteasa (2 mg / ml, 45 min) para aislar neuronas de la médula 17. Tratamientos secuenciales versus tratamiento con un cóctel de proteasa y la colagenasa no dió mejores resultados en disociar los axones reticulospinales. También experimentamos con diferentes concentraciones de las enzimas de disociación. Concentraciones de enzima superior a 2 mg / ml o tiempos de digestión de más de 45 min resultó en la médula espinal perder su consistencia y disociaciones pobres. Las concentraciones de enzima más altos y periodos de tratamiento prolongados pueden ayudar en la disociación completa de la médula espinal cuando se requieren rendimientos de las neuronas más pequeñas. Reticuloespinal axones, en contraste, tienen un estru extendidamagen y tratamientos de más de 45 min eran contraproducentes. Que conserva algo de tensión en la médula espinal ASISTIDO mejores disociaciones.
El siguiente paso importante es cortar las extensiones laterales de las piezas de la médula espinal tratados con enzimas en el punto medio de la región en rodajas para aislar la fuerza de disociación final a la región que abarca los axones reticulospinales. Los cortes deben extenderse desde el borde lateral de la materia gris del cuerno ventral a la columna central ventro-medial de axones reticulospinales dejándolos sin daños Figura 2d. Cortar las extensiones laterales proporciona un punto focal en el que forzó la separación de la médula espinal se producirá durante disociación mecánica y facilita una separación más suave del tejido. Se requiere tensión sostenida en la médula espinal durante el proceso de corte y se puede lograr mediante el estiramiento y la fijación de los extremos caudal y rostral de la pieza de la médula espinal. Esto evita la deformación del tejido debajo de la hoja de bisturíy el consiguiente daño a los axones.
El paso final en la disociación es la aplicación de tensión mecánica y estirar suavemente el tejido a lo largo del eje rostro-caudal Figura 2e utilizando pinzas para agarrar el tejido. Este paso se realiza sobre cubreobjetos recubiertos de poli-lisina para permitir la adhesión de los axones separados para la grabación posterior. Con el fin de lograr una mayor adherencia para los largos axones reticulospinales extendidos, hemos utilizado un alto peso molecular (> 300.000) poli-D-lisina bromhidrato, que proporciona mayor número de puntos de fijación, para recubrir los cubreobjetos y inserciones placa de Petri. La superficie recubierta de poli-lisina proporciona una adherencia suficiente para la médula espinal termina y los axones reticulospinal sumamente aisladas. Fórceps recubiertos de teflón se requieren para agarrar la médula espinal porque se adhiere firmemente al fórceps de acero inoxidable regulares que obstaculizan disociaciones. El tejido debe estirarse lentamente y tirando suavemente de los axones de la spcable de inal. La mejor manera de obtener los axones para establecerse el mantenimiento de la médula espinal termina a lo largo del cubreobjetos de vidrio en todo momento durante el proceso de disociación mediante el mantenimiento de la presión hacia abajo sobre la médula espinal rostral y caudal termina con los fórceps.
Los axones se clasificarían mejor parcialmente aislado desde una cierta porción del axón permanece en el interior, como mínimo, un extremo del extremo de la médula espinal dependiendo de la extensión de la disociación. Los aislamientos pueden llevarse a cabo mediante la separación mecánica de los dos extremos de la médula espinal hasta los axones completamente separadas de un extremo de la médula espinal. En este caso, una porción del axón permanece dentro del extremo de la médula espinal de la cual emerge mientras que la porción restante está aislado de la médula espinal interior. El extremo abierto terminal de los axones sella mediante un proceso de resellado de la membrana dependiendo de la salud del axón. Los aislamientos también pueden llevarse a cabo de tal manera que los axones emergen de la médula espinal, but el caudal y rostral extremos de la médula espinal permanecer conectado por medio de los axones reticulospinales aislados Figura 2e. En este punto, liberando suavemente la presión permite que los axones bajo tensión para relajarse y salida de bucle produciendo regiones aisladas de los axones carentes de proyecciones postsinápticos. Ambas técnicas de disociación producen axones funcionales. La temperatura fisiológica para la lamprea es de 10 ° C y por lo tanto se permite la preparación de recuperar a 10 ° C durante 1 hora para permitir que los axones se recuperen de la disociación aguda. Para registros electrofisiológicos, la disociación se llevó a cabo en un cubreobjetos recubiertos de poli-lisina se inserta en una figura cámara personalizada 3. Lamprea médulas espinales han sido por lo general se mantiene a 10 ± 2 ° C por perfusión solución de Ringer, previamente enfriado a 10 ° C al pasar a través un dispositivo de enfriamiento termoeléctrico. Excepcionalmente se requiere bajo nivel de ruido de fondo para resolver un solo canal de Ca Alto K + (30 mM KCl) se utiliza para despolarizar los axones (sección 4.1), de modo que el tinte se incorpora en FMvesículas sinápticas durante exo-endocitosis. Es difícil retener la inserción de un microelectrodo en los axones aislados durante períodos prolongados como la más mínima desviación en la posición del axón hace que el electrodo a retroceder desde el axón. Esto hace que sea difícil para estimular los axones durante un periodo prolongado usando un microelectrodo. El diámetro del axón grande (20-50 micras) hace que sea difícil para estimular el uso de un electrodo de estimulación de tungsteno. Por lo tanto alta K + se utilizó para despolarizar los axones. Los terminales presinápticos en los axones reticulospinales tienen un diámetro de 1-2 micras. Ca 2 + corrientes se localizan en la membrana de la cara de liberación en las terminales presinápticas y es por lo tanto crucial para apuntar con precisión la terminal presináptica. Por lo tanto, un requisito clave para lograr estas grabaciones es ser capaz de manipular el movimiento de la posición de parche pipeta en incrementos de micras. Ca 2 + corrientes en membranas cara liberación presináptica se han demonstrated en las sinapsis caliciales a ser extremadamente pequeña en amplitud, a menos de 0,5 pA. Las grabaciones de canales individuales de Ca 2 + corrientes, por lo tanto requieren de fondo extremadamente bajos niveles de ruido. Ruido térmico de baja se logró con un amplificador Axopatch 200B y un cabezal de la platina enfriado. Por otra parte, las fuentes contaminantes de ruido deben ser identificados y eliminados sistemáticamente. Parche pipetas fueron fabricados, a partir de vidrio de aluminosilicato para asegurar bajo nivel de ruido ya que el vidrio tiene impurezas extremadamente bajos y alta resistividad. Las pipetas fueron creadas de manera que el diámetro de la punta de la pipeta era más grande que el diámetro de la terminal presináptica de este modo abarca completamente la terminal presináptica, cuyas dimensiones pueden ser claramente observados por FM 1-43 etiquetado. Esto aseguró la grabación de toda la membrana cara liberación. El ruido capacitivo se redujo mediante el recubrimiento de la pipeta con PDMS tan cerca de la punta como sea posible. Los sellos gigaohmio en membranas terminales presinápticas no son estables por mucho tiempo porIODs y grabaciones suelen durar un máximo de 2 min. Esto hace que las grabaciones extremadamente difícil de obtener ya que la baja tasa de éxito requiere un gran número de intentos de obtener grabaciones de éxito. Soluciones de grabación tienen que ser diseñados de manera que todas las demás corrientes conocidos en la membrana presináptica, tales como Na + dependientes de voltaje y canales de K + y Ca 2 + K + activado por los canales están bloqueados, lo que permite la grabación de Ca 2 + corrientes. Hay algunas limitaciones para el uso de la superficie adhesiva de poli lisina con esta preparación. Una es la incapacidad para mover la ubicación física de la cámara que contiene el preparado, ya las vibraciones interrumpidas la preparación. Otra limitación de la superficie adhesiva se descubrió durante los experimentos de inmunohistoquímica, como las piezas de extremo rostral y caudal de la médula espinal pierden adherencia cuando se incubaron en 4% de paraformaldehído. Hemos tratado coa adhesivo alternativoTings como Cell-Tak y se encontró con problemas similares. Con el fin de resolver estos problemas, se utilizó pegamento líquido de sutura para fijar las asas de la médula espinal. Los detalles con respecto al uso de la cola de sutura han sido discutidos en un artículo anterior JoVe por Chen y Featherstone 22. Los conjuntos de pegamento a un ritmo más lento en soluciones sin iones divalentes y nos aprovechamos de esa propiedad y llevaron a cabo las disociaciones en solución de Ringer sin Ca 2 + y Mg 2 +. Esto nos proporcionó un tiempo adicional para la manipulación del tejido durante el proceso de disociación. Hemos adoptado un enfoque similar al de Chen y Featherstone 22 utilizando pipetas de parche y la boca de succión a través de un tubo conectado a la pipeta de parche para aplicar el pegamento en el área de destino específico en la superficie de disociación antes de realizar la disociación (sección Protocolo 5.2). Las disociaciones se realizaron como se ha descrito anteriormente, con la única diferencia de que el c médulaord extremos fueron fijados durante el proceso de disociación arrastrando suavemente el extremo del mango sobre el pegamento colocado previamente (sección Protocolo 5.3). Una vez que se completó la disociación, el ion divalente libre de solución de Ringer se cambió por solución de Ringer que contiene Ca 2 + y Mg 2 + iones por perfusión y la preparación se dejaron recuperar a 10 ° C durante 20-30 min en una placa de refrigeración termoeléctrica antes de proceder a los pasos posteriores de inmunohistoquímica. La implicación clave de esta técnica es una comprensión precisa de la Ca 2 + requisito para la liberación de neurotransmisores, que no ha sido completamente resuelto a pesar de décadas de investigación. Un aumento transitorio en presináptica [Ca 2 +] se ha establecido como cruciales para desencadenar la liberación de todas las sinapsis. Sin embargo, todavía no existe un consenso sobre el número de canales de Ca 2 + que contribuyen a la Ca 2 + dominio gating RELEAse. Medición simultánea de las corrientes de Ca 2 + y medidas de capacitancia de la membrana cara liberación de terminales presinápticas individuales daría una respuesta inequívoca a esta pregunta. Además, permitiría a la elucidación de la relación de temporización entre la entrada y la fusión de la vesícula presináptica Ca 2 +, lo que permite una medida precisa de retardo sináptica. La accesibilidad sin restricciones a la cara de la membrana de liberación en las terminales presinápticas individuales proporciona la capacidad de aplicar un número de diferentes enfoques experimentales para estudiar diversos componentes del proceso de liberación del neurotransmisor. Ejemplos de tales enfoques incluyen único de formación de imágenes de la vesícula utilizando puntos cuánticos para estudiar la fusión de la vesícula sináptica. Eventos de fusión de vesículas también pueden caracterizarse directamente en las terminales presinápticas mediante la medición de cambios de capacitancia de membrana que subyacen a los eventos de fusión de vesículas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
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