Abstract
Синаптической передачи является чрезвычайно быстрый процесс. Действие потенциал приводом приток Са 2 + в пресинаптических окончаний, через напряжения закрытого кальциевых каналов (VGCCs), расположенных в релизе лица мембраны, является триггером для слияния пузырьков и высвобождение нейромедиаторов. Решающее значение для быстроты синаптической передачи является пространственная и временная синхронизация между прибытием потенциала действия, VGCCs и высвобождение нейромедиатора машин. Возможность напрямую записывать Ca 2 + токи от выпуска номинальной мембраны отдельных пресинаптических окончаний необходимо для точного понимания взаимосвязи между пресинаптической Са 2 + и высвобождения нейромедиатора. Доступ к пресинаптической релиз лица мембраны для электрофизиологические записи не доступен в большинстве препаратов и пресинаптической Са 2 + запись была охарактеризована с помощью методов визуализации и макроскопического тока MeasureMeНТС - методы, которые не имеют достаточного временное разрешение для визуализации запись Ca 2 +. Характеристика VGCCs непосредственно на отдельных пресинаптических окончаний не удалось в центральных синапсах и до сих пор успешно достигнуто только в чашечки типа синапса куриного мерцательной ганглии и в крысиных чашечек. Мы успешно решили эту проблему в гигантском ретикулоспинальных синапса миноги спинного мозга, разработав остро диссоциированную подготовку спинного мозга, что дает отдельные ретикулоспинальных аксоны с функциональными пресинаптических окончаниях, лишенных постсинаптических структур. Мы можем флуоресцентно маркировать и идентифицировать отдельные пресинаптические терминалы и нацелить их для записи. Использование этого препарата, мы охарактеризовали VGCCs непосредственно на выпуск лице отдельных пресинаптических терминалов, использующих иммуногистохимии и электрофизиологии подходы. Ca 2 + токи были записаны непосредственно на выпуск лица мембраны OF отдельные пресинаптические терминалы, первый такой записи будет осуществляться в центральных синапсах.
Introduction
Синаптической передачи является чрезвычайно быстрый и точный процесс. Действие потенциал вторжение в пресинаптических окончаний приводит к открытию VGCCs расположенных в релиз лица мембраны, что привело к росту пресинаптической Са 2 +, действующей в качестве триггера для слияния пузырьков и высвобождение нейромедиаторов 1. Все эти шаги происходят в течение сотен микросекунд 2, и, следовательно, требуют жесткой пространственной сцепление VGCCs в слияния пузырьков машин 3. Пресинаптические Са 2 + потоки были, прежде всего, характеризуется через визуализации подходов с использованием Са 2 + чувствительные красители 4. Включение Са 2 + буферы, которые модулируют Са 2 + в пресинаптических нейронов был использован, чтобы косвенным образом характеризует соотношение между кальцием и пресинаптических нервных импульсов 3. Кроме того, модуляции пресинаптическое бесплатно Ca 2 + концентрации по uncaging Са 2 + 5 или записи macroscopiС Са 2 + токи были использованы в сочетании с мерами слияния пузырьков и / или высвобождения; такие как измерения емкости 6 или постсинаптические ответы 2 для решения тот же вопрос. Однако, характеризуя Ca 2 + токи непосредственно на выпуск лица, специализированный раздел пресинаптической мембраны, где деполяризация мембраны переводится в Са 2 + токи вызове синаптических везикул слияние и высвобождение нейромедиаторов, является неотъемлемой точно измерить в Са 2 + Требование синаптических пузырьков слияния. Кроме того, способность непосредственно характеризуют Ca2 + токи на отдельных пресинаптических окончаний, в сочетании с точной одновременных измерений слияния пузырьков и выпуска позволяет точным выяснение временной зависимости между временем ходе потенциала действия, пресинаптического Ca2 + тока, слияния пузырьков и релиз. Доступ к релиз лица мембраныне доступен в большинстве пресинаптических окончаний за счет близко друг к другу на постсинаптических дендритов. Это недоступность является одним из основных препятствий в характеристике VGCCs так как это предотвращает прямые измерения тока на отдельных пресинаптических окончаний. Прямая характеристика пресинаптических Ca 2 + токов в отдельных пресинаптических окончаний до сих пор не удалось в центральных синапсах и удалось осуществить только в двух пресинаптических окончаний calyceal типа; Чашечка типа синапса из куриных мерцательная ганглий 7-10 и крысы чашечек 11,12. Во всех других пресинаптических окончаний включая гигантского ретикулоспинальных синапса в миноги спинного мозга 13, отсутствие доступа к пресинаптической релиз лица мембраны потребовало использование непрямых подходов, таких как изображения Ca 2 + до изучения пресинаптические Ca 2 + потоков.
Рис.1 миноги гигант ретикулоспинальных синапс. (А) Сечение миноги спинного мозга с указанием Dorso-вентральной ориентацию. Ретикулоспинальных аксоны выделены зеленым звездочкой. (Б) 3-D реконструкция ретикулоспинальных синапса в миноги спинного мозга, показывая пресинаптическое ретикулоспинальных аксон делает многочисленные мимоходом контактов (отмечены зелеными стрелками) на постсинаптического нейрона 13. Пресинаптические терминалы были помечены с Alexa Fluor 488 гидразида с сопряженными фаллоидином (зеленый), в то время как постсинаптического нейрона была заполнена Alexa Fluor 568 гидразида (красный).
Минога гигантские ретикулоспинальных аксоны, расположенные в брюшной области спинного мозга параллельно ростральной-каудальной оси рисунке 1a, образованию многочисленных мимоходом синаптических контактов на нейронахспинного вентральной рог 14 Рисунок 1б 13. Макроскопическая цельноклеточные Са 2 + токи были записаны с ретикулоспинальных аксонов в неповрежденной спинного мозга 13,15. Тем не менее, предыдущие слепые попытки прямого измерения Са 2 + токи в ретикулоспинальных аксонов в неповрежденной миноги спинного мозга с использованием методики патч зажим клеток-прилагается оказались безуспешными 13 в связи с отсутствием доступа к пресинаптической релиз лица мембраны вследствие противостоящих постсинаптических процессов Рисунок 1б. Высвобождение лицо мембраны были ранее доступны удалением постсинаптического нейрона 11, механическое возмущение синапсе перед записью 12 или ферментативной обработки в сочетании с механической диссоциации 16. Учитывая сложный организация спинного мозга, было бы оказаться чрезвычайно трудно определить постсинаптического нейрона и убрать его механически или возмутить гоэ синапс. Таким образом, мы решили использовать ферментативную обработку 17 с последующим механической диссоциации.
Используя этот подход, мы разработали остро диссоциированную подготовку миноги спинного мозга, что дает жизнеспособные изолированных ретикулоспинальных аксоны с функциональными пресинаптических окончаниях, лишенных любых постсинаптических процессов, тем самым обеспечивая неограниченный доступ к отдельным пресинаптических окончаний. В сочетании со стандартным перевернутый микроскоп и флуоресцентных изображений, это позволяет нам выявить и против отдельных флуоресцентно-определены пресинаптические терминалы, с помощью патча пипетки, содержащую раствор записи, который изолирует Ca 2 + токи Фиг.4С и рисунок 4d, для записи с помощью сотового прилагается метода фиксации. Са 2 + токи были записаны непосредственно на пресинаптической релиз лица мембраны индивидуального пресинаптических окончаний рисунке 4е. Это significaнт прорыв в области синаптической передачи, так как это первый такой записи будет осуществляться в центральных синапсах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Получение поли-D-лизина гидробромида
- Подготовка 1 мг / мл поли-D-лизина гидробромид в 0,1 М боратного буфера (рН 8,5).
- Алиготе и хранить при температуре -20 ° С.
2 Поли-лизин Покрытие покровные
Примечание: Выполняйте все чистящие и покрытий шаги в камере ламинарного потока.
- Место покровные в чашку Петри, содержащую 1N хлористоводородной кислотой (HCl) в течение 2 часов.
- Аспирируйте все HCl и промыть 70% этанола (этанол) 2-3x.
- Оставьте в 70% EtOH в течение 1 часа.
- Аспирируйте все 70% этанола и промыть 100% этанола 2-3x.
- Оставьте в 100% EtOH в течение 2 часов. Аспирируйте все этанола.
- Промокните насухо фильтровальной бумаги и высохнуть в течение нескольких секунд.
- Место O / N в концентрации 1 мг / мл поли-лизин раствор.
- Промыть покровные следующий день с Millipore воды 4-5x.
- Воздух сухой поли-лизин покрытием покровные стекла на роликах в чистую чашку Петри.
- Для immunohistochemistrу, использовать 35 х 10 мм чашки Петри крышками. Подготовка Sylgard (polydimethylsilioxane, ПДМС) вдоль блюда путем заливки PDMS (эластомер и отвердитель 10: 1 по весу) в чашку до толщины 0,3 см и позволяют устанавливать при 30 ° CO / N. Как только это установлено, вырезать 2 см на 1 см вставка в PDMS. Чистый и пальто вставка с полилизином используются те же шаги, как упоминалось выше для покровные.
- Храните поли-лизин покрытием покровные и блюда покрыты внутри камеры ламинарного потока до использования (до 2 недель, но достижения наилучших клейкие результаты по подготовке периодически раз в 3-4 дня).
- Подготовьте PDMS блок, к контакту спинной мозг в вибрирующей ткани слайсер. Смесь резина и резина B 1: 1 по весу. Налейте в 100 х 15 мм чашки Петри и позволяют установить O / N при 30 ° С. Отрежьте прямоугольный кусок из PMDS и приклейте ее к нарезки опорной плите с помощью эпоксидного клея. Разрешить клей для установки крепления PDMS в месте и нарезать несколько тонких срезов с поверхности, чтобы получить квартируповерхность, чтобы прикрепить ткань на.
3 Острая Диссоциация Минога спинного мозга уступать Изоляты ретикулоспинальных аксонов
- Обезболить в ammoecoete или взрослых минога (Petromyzon Маринус) с Tricaine метансульфоната (MS-222; 100 мг / л). Добавить анестетика в воду, в пластмассовой чашке, покрытой крышкой, содержащий минога в жертву.
- Обезглавить минога в холодной (4 ° С) раствор Рингера следующего состава (в мм): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 декстрозы (рН 7,6, осмолярность 270 мОсм) и удалить тела настенные мышцы выставить спинной поверхности спинного мозга.
- Удалить Meninx Primitiva от спинной поверхности спинного мозга с использованием тонких щипцов. Не снимайте вентральной Meninx Primitiva на данном этапе.
- Вырезать спинного мозга в 1 см длинные куски.
- Закрепление спинного мозга кусок с использованием тонких насекомых булавками, спинной стороной вверх, на PDMS выстроились нарезки базовый плаТе (см 2,12) в вибрирующей ткани среза камеру, содержащую ледяной раствор Рингера.
- Снимите центральную секцию колонны спинной части спинного мозга, нарезая вдоль ростро-хвостовой оси с лезвием, оставляя позади неповрежденных сегментах колонн спинной на ростральнее и каудального концов в качестве ручки во время процесса диссоциации Рисунок 2а и рис 2b. Используйте медленный скоростной режим, который позволяет нарезки и глубина охвата, который удаляет только спинной колонки оставляя нижние ретикулоспинальных столбца аксонов повреждены Рисунок 2b.
- Выдержите нарезанные позвоночника кусочки мозга на КТ в течение 45 мин в коктейле 1 мг / мл протеазы (Тип XIV от Streptomyces пзеиз) и 1 мг / мл коллагеназы подготовленного (типа IA от Clostridium histolyticum) в растворе Рингера (взято из Эль Manira & Bussieres , 1997 17).
- Pin ферментов лечение позвоночника частей мозга с использованием тонких флажки в PDMS выстроились Петри Contaтка холодной (4 ° С) раствор Рингера.
- Удалить вентральной Meninx Primitiva с тонким пинцетом.
- Вырезать боковые участки спинного мозга с лезвием скальпеля в средней точке нарезанный спинной секции, оставляя центральную колонну ретикулоспинальных аксонов интактных в спинном мозге рисунке 2d.
- Поместите каплю иммерсионного масла на объективе.
- Поместите покрытием покровное поли-лизин (рисунок 3а, верхнюю часть, красный прямоугольник) в слот записи камеры рисунке 3 и применять вакуумную смазку на всех ребер (пространство между красными и синими прямоугольниками на рисунке 3а, чтобы облегчить печать. Винт верхняя на место. Поместите камеру на вставке на записи вышке.
- Добавить раствор Рингера в записывающую камеру с помощью пипетки Пастера.
- Подключите отток трубки бутылки давления, содержащей антифриз решение термоэлектрического ввода труб устройства охлаждения. Подключите OUTPут трубки термоэлектрического устройства охлаждения до входного конца к наружному кожуху охлаждения и выходной конец резервуара рисунке 3b.
- Поместите один кусок спинного мозга в то время, в записи камеры и осторожно отделить спинной мозг, поддерживая его вместе покровного стекла во все времена, используя щипцы с тефлоновым покрытием до аксоны не изолированы Рисунок 2е и рис 2F.
- Доведите температуру раствора записи до 10 ° С при пропускании под давлением газообразного азота (вставляется в бутылку) антифризом (по перемещению), с помощью термоэлектрического устройства охлаждения, с помощью внешней охлаждающей рубашке записи камеры рисунке 3b.
- Разрешить аксоны для восстановления в течение 1 ч после диссоциации при 10 ° С.
Рисунок 3 Схема записи камеру для электрофизиологических экспериментов. Размеры, предлагаемые в дюймах. Красный прямоугольник показан на basepiece диаграмме (а) указывает позиционирование покровного в покровного паз в basepiece. Область между красным и синим прямоугольником, как показано в схеме basepiece (а), где высокого вакуума смазка наносится. (Б) показывает собранный записи камеры.
4 Маркировка и идентификация пресинаптических окончаний с FM 1-43
- Этикетка пресинаптические терминалы, путем включения FM 1-43 в Vesicles во синаптической экзо-эндоцитоза в высокий K + деполяризации. Заливать подготовку с 5 мкМ FM 1-43 (в 5 мл раствора Рингера, содержащем 30 мМ KCl).
- Заливать подготовку с 1 мг / мл Advasep-7 (в 5 мл раствора Рингера) для удаления избытка FM краситель) 18.
- Заливать препарат с раствором Рингера в течение 15 мин, чтобы вымывания любой remant краситель и Advasep.
- Изображение с 100 X иммерсионным объектива (NA 1.25) на перевернутой флуоресцентного микроскопа, в сочетании с цифровой камеры CCD и захвата изображений программного обеспечения Микроменеджер, используя стандартные протоколы флуоресцентной томографии.
- Определить флуоресцентно меченных пресинаптические терминалы для целевых для записи Фиг.4С и рис 4d.
5 Иммуногистохимия изолированных ретикулоспинальных Аксоны
- Заполните блюдо вставку (Протокол раздел 2.10.) Двухвалентным-иона (Са 2 + и Mg 2 +) бесплатноРаствор Рингера.
- Изготовление патч пипетки в P-87 пипетки съемник. Поместите небольшое количество шовного клея на одном конце поли-лизин вставке с использованием пипетки патч (1,5 мм стекла наружный диаметр) и всасывание (с использованием силиконовой трубки 0,89 мм Внутренний диаметр с наконечником пипетки, прикрепленной к концу всасывающего).
- Провести диссоциации, используя ту же процедуру, как указано в разделе протокола 3 Рисунок 2. Поместите один конец спинного мозга на шовного клея и аккуратно нажмите щипцами придерживаться его сильно на поверхность. Поместите еще одну каплю шовного клея на другом конце вставке и осторожно растянуть позвоночник, пока аксоны не разобщены и придерживаться свободного спинного конец шнура, перетащив его мягко по шовного клея. Fix на месте нежный нажимая пинцетом.
- Обмен двухвалентного освободить раствор Рингера с раствором регулярного Рингера по перфузии.
- Разрешить аксоны восстановиться в течение 20 мин после dissocтельная при 10 ° С.
- Закрепить разложенных аксонов в 4% параформальдегида (PFA) {приготовленного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS, (мм) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4, 10 KH 2 PO 4 1,8, рН 7,4)} в течение 20 мин. Фильтр решение PFA перед использованием путем пропускания через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
- Промыть PFA путем перфузии 0,1 М глицин (в PBS) в течение 10 мин.
- Инкубировать в 0,1% Тритон-X (в PBS) в течение 10 мин.
- Промыть путем перфузии PBS в течение 20 мин.
- Блок 5% обезжиренного молока (в PBS) в течение 6 ч при 4 ° С.
- Добавить в первичных антител к VGCC интереса (разведение 1: 200 в ЗФР) и инкубировали в течение 20 ч при 4 ° С.
- Промыть путем перфузии PBS в течение 20 мин.
- Блок 5% обезжиренного молока (в PBS) в течение 10 мин при 4 ° С.
- Добавить в вторичным антителом (разведение 1: 400 в ЗФР) и инкубировали в темноте в течение 2 ч при 4 ° С.
- Промыть путем перфузии с PBS в течение 20 мин.
- Блок 1% бычьего сывороточного Альбумин (в PBS) в течение 20 мин.
- Добавить в Alexa Fluor 488 фаллоидином (5 ед / мкл рабочей концентрации; складе получают в метаноле 200 единиц / мл).
- Промыть путем перфузии с PBS в течение 20 мин.
- Изображение с помощью 100X погружения в воду объектив на конфокальной микроскопии.
6 электрофизиологические записи
- Изготовление алюмосиликатного стекла патч пипетки (пипетки сопротивления 2-5 МОм) в P-87 пипетки съемник. Дизайн патч пипетки таким образом, что пипетки охватывает весь диаметр пресинаптических окончаний.
- PDMS пальто патч пипетки погружением патч пипетки под 50-60 давлением пси в PDMS 23 (прикрепить силиконовые трубки, 0,89 мм внутренний диаметр, подключенный к газообразного азота цилиндра, к задней части патч-пипетки) и насухо тепло пистолет. С другой стороны, вручную пальто пипетки с PDMS, применяя покрытие как можно ближе к кончику, насколько это возможно, под сложным микроскопом.
- Своих ногтей патч пипетки с использованием MICRoforge (индивидуальному заказу платиновая нить установлен на сцену сложным микроскопом).
- Определить изолированные аксоны, демонстрирующие меченых пресинаптические терминалы с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Заполните решение для записи (для изоляции Ca 2 + токи 10 мМ CaCl 2 или 90 мм BaCl 2 в качестве носителя заряда, HEPES буфером рН 7,6, осмолярности 270 мОсм) в патч пипетки с помощью шприца.
- Вставьте патч пипетки в держатель пипетки и положение над ванной с помощью моторизованного манипулятора MP225. Аккуратно опустите патч пипетки в ванну и позиции против лице флуоресцентно определены пресинаптических окончаний.
- Авансовые патч пипетки медленно, пока контакт не сделан с мембраной. В этот момент достижения gigaohm уплотнение при осторожном всасывания через рот трубкой, прикрепленной к держателю пипетки.
- Для достижения чрезвычайно низкие уровни фоновых шумов, необходимые для записи одного канала Ca 2 + токи, использовать Axopatch 200B с охлаждаемым headstage для записей. Пример данных в 20-50 кГц и фильтр с использованием 5 кГц фильтр Бесселя. Провести сбор данных, используя Axograph X.
- Используйте стандартный шаг протокол, с шагом в 10 мВ, как стимул. Включить предварительный импульс в протоколе, предшествующий шаг протокол, чтобы обеспечить максимальную активацию каналов Ca 2 +. Включить в 10 мВ шаг просочиться в шаге протокола для пост-анализа вычитания утечки токов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это дает протокола диссоциации здоровые и функциональные изолированные ретикулоспинальных аксоны лишенные постсинаптической прогнозы рис 2F, но которые тем не менее сохраняют функциональные пресинаптические терминалы, способные вызвала синаптических пузырьков экзо-и эндоцитоза рисунке 4с и рис 4d. Разделы изолированных регионах ретикулоспинальных аксонов могут быть четко определены при световой микроскопии быть ясно из любых других нейронных процессов, позволяющих неограниченный доступ к ретикулоспинальных мембраны аксона рис 2F. Аксоны сохранить структурную целостность после диссоциации. Изолированные аксоны исправлена в конфигурации всей клеточной и наполнен Alexa Fluor 488 гидразида. Краситель равномерно распределены в пределах аксона и утечки не красителя наблюдалась от аксона рисунке 4a.
/ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рис.4 Типичные записи с изолированной ретикулоспинальных аксона. (А) изолированный ретикулоспинальных аксонов наполнены Alexa Fluor 488 гидразида с патч пипетки в конфигурации цельных клеток. Положение Внесите указывается с белой стрелкой. (Б) я. Представитель потенциал действия выстрелил в изолированной ретикулоспинальных аксона. II. Представитель потенциал действия выстрелил в ретикулоспинальных аксона в неповрежденной спинного мозга. Черная стрелка показывает временную точку стимуляции. (С) и (г) Два изображения изолированной ретикулоспинальных аксона показывая точечный маркировку пресинаптических окончаний с FM 1-43 и таргетирования индивидуального пресинаптических окончаний с патчем пипетки для записи патча клеток-прилагается. Зеленые стрелки пометить отдельные пресинаптические терминалы в то время как белая стрелка отмечает патч пипетки. (Е) Dead изолированы ретикулоспинальных аксона показывая indiscriminate включение FM 1-43 протяжении аксона. 4f. Представитель пример, показывающий клеток-прилагается запись Са 2 + токов (10 мм [Ca 2 +] Внешний в записи решения в патч пипетки) от пресинаптической релиз лица мембраны, демонстрирующего открытие нескольких Са 2 + каналов. Сплошная линия отмечены 0 указывает закрытое состояние канала, в то время как пунктирные линии показывают гауссовых пиков для отверстий каналов.
Остро диссоциированные аксоны сохраняют электрические свойства. Мембранный потенциал покоя (РМП) можно измерить с помощью пронзая в отрыве аксон с микроэлектрода или исправления аксон в конфигурации цельных клеток в текущем режиме зажим. Подобные ПУХ записываются в обоих методов, при среднем значении -57,94 ± 1,63 мВ (п = 17 аксонов). Кроме того, диссоциируют аксоны могут стимулироваться стрелять потенциалы действия Рисунок 4б, с формы и времени ходе потенциал действия сравнимоодному обжигали в ретикулоспинальных аксона в интактной спинного мозга.
Слияния пузырьков и переработка сохраняются в диссоциированных аксонов. Переработка пузырьков кластеры могут быть помечены с стирилового красителя FM 1-43 во время высокой калия (30 ммоль KCl) стимуляции 19. После оформления красителя, различны точечные маркировка пресинаптических окончаний можно наблюдать Фиг.4С и рис 4d, с распределением, подобным ретикулоспинальных аксонов в неповрежденной спинного мозга 13. FM 1-43 окрашивание обеспечивает четкое различие между здоровой и нездоровой аксонов как нездоровые аксоны показать запись неизбирательного FM красителя по всей аксона рисунке 4е. Способность четко определить индивидуальные пресинаптические терминалы позволяет нам охватить эти с патч пипетки для записи Фиг.4С и рис 4d. Используя эту способность, мы записали Ca 2 + токи непосредственно из выпуска номинальной мembrane из одной пресинаптических окончаний рисунке 4е.
Остро изолированы ретикулоспинальных препарат аксонов также предлагает различные преимущества по сравнению с интактной спинного мозга для иммуногистохимического анализа одиночных пресинаптических окончаний. Отсутствие флуоресценции фона и отсутствие окрашивания на постсинаптических структур и глии обеспечивает однозначной идентификации маркировки антител в определенных пресинаптических окончаний (рисунок 5b, I). В сочетании с пресинаптической маркером, таким как Alexa-488 сопряженного фаллоидином (Рисунок 5а, II) и (рис 5б, II), которая помечает пресинаптическое актин 20, локализацию иммуногистохимического маркировки на пресинаптических окончаний может быть четко продемонстрировано (Рисунок 5а, III). Этот подход был использован в сочетании с конфокальной микроскопии для выполнения иммуногистохимического характеристику различных подтипов VGCC, показывающие тнаследник конкретных локализации в пресинаптических окончаниях рисунке 5а.
Рисунок 5 Иммуноокрашивание изолированной ретикулоспинальных аксона. (А) Иммуногистохимический характеристика R-типа (CaV2.3) кальциевых каналов в отдельных пресинаптических окончаний. я. Поликлональное первичного антитела были использованы для обозначения эпитоп в внутриклеточной петле между доменами II и III канала кальция R-типа (хозяин - кролик). Вторичное антитело Alexa Fluor 633 гидразид конъюгированного козьего антитела против кроличьего IgG. II. Пресинаптические терминалы, выявленные Alexa Fluor 488 фаллоидином маркировки пресинаптической актина. III. Колокализации между антител маркировки R-типа (красный) и Алекса-488 фаллоидином (зеленый), показанной в объединенном наложения. (Б) я. Преинкубация анти R-типа кальциевых каналов антитела сконтрольного антигена не дает никаких конкретных маркировки кальциевых каналов. II. Alexa Fluor 488 фаллоидином маркировка пресинаптических окончаний для той же аксона показывая дискретный точечный маркировку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш протокол диссоциации Показательно, уступая изолированных ретикулоспинальных аксоны лишенные постсинаптической прогнозы рис 2F, но которые тем не менее сохраняют функциональную пресинаптическое терминалы Рисунок 4с и рисунок 4d. Отсутствие постсинаптических процессов противоположных пресинаптический терминал позволяет прямой доступ записи к пресинаптической релиз лица мембраны в отдельных пресинаптических окончаний, ранее не возможно в центральных синапсах и успешно достигнуты только в двух пресинаптических окончаний calyceal типа; Чашечка типа синапса из куриных мерцательная ганглий 7-10 и крысы чашечек 11,12. Индивидуальные пресинаптические терминалы, которые на уровне электронов микрографической были показаны представить простые, одиночные активные зоны 21, можно определить по утилизации маркировка пузырьков кластеров с FM 1-43 и направлены для записи рисунке 4с и рис 4d. Ca
Ключ к получению изолированных ретикулоспинальных аксоны с функциональными пресинаптических окончаний лежит в серии критикааль последовательные шаги. Ткань препятствуя острой диссоциации гигантских аксонов, расположенных главным образом в дорсомедиальной отделе спинного мозга рисунке 1а должны были быть удалены сначала в вибрирующей ткани среза рисунке 2а. Это облегчает механически отделить спинного мозга с использованием минимально возможное усилие. Нарезка из колонны спинного требуется полное удаление спинной мозговой оболочки Primitiva поскольку любой оставшийся спинной мозговой оболочки Primitiva препятствует режущее действие лезвия. Мы считаем, что оставляя вентральной Meninx Primitiva на спинной мозг в момент нарезки помогает поддерживать форму спинного мозга и помогает в лучшей нарезки. Поддержание напряжения в спинном мозге в процессе нарезки предотвращает боковое смещение падающего или ткани под лезвием, что бы повредить аксонов. 1 см в длину позвоночника частей мозга обеспечивает хорошую длину для нарезки как ткань может растягиваться и придавленный поддержания напряженности жотя нарезки. Другим важным фактором для мониторинга является глубина среза; слишком мелко кусочек предотвращает хорошее разделение спинного мозга пока тоже глубоких повреждений Нарежьте ретикулоспинальных аксонов. Хорошая глубина ломтик является одним где столбец спинной удаляется с явно оставляя вентральной ретикулоспинальных колонку повреждений. Глубина среза должна быть измерена во время процесса нарезки данной существуют различия в спинного мозга толщиной между животными. Удаление столбца спинной лучше всего проводить в средней части спинного мозга кусок рисунке 2b, так как позволяет для unsliced ростральнее и хвостовой концы в качестве ручки, чтобы понять ткани во время процесса диссоциации рис 2е.
После удаления столбца спинной, лечащего нарезанные позвоночника куски шнура смесью коллагеназы (коллагеназа типа IA от Clostridium histolyticum) и протеазы (протеазы Тип XIV от Streptomyces пзеиз) ферментов (1 мг / мл в растворе Рингера) помогает переваривать соединительную ткань и способствует более мягкий диссоциации. 30-45 мин пищеварения при комнатной температуре идеально подходит для диссоциации. Полное ферментативной диссоциации миноги спинного мозга ранее проводили с последующими обработками коллагеназы (2 мг / мл, 30 мин) и протеазы (2 мг / мл, 45 мин), чтобы изолировать нейронов спинного мозга 17. Последовательные процедуры против лечения с коктейлем протеазы и коллагеназы не дать лучшие результаты в диссоциации ретикулоспинальных аксоны. Мы также экспериментировали с различными концентрациями диссоциации ферментов. Концентрации ферментов выше, чем 2 мг / мл или пищеварения раз дольше, чем 45 мин привело к спинного мозга теряет свою консистенцию и плохие диссоциации. Более высокие концентрации фермента и длительные периоды лечения могут помочь в полной диссоциации спинного мозга, когда выходы мелких нейронов не требуется. Ретикулоспинальных аксоны, напротив, имеют расширенный STRUcture и лечения более 45 мин были контрпродуктивным. Сохраняя некоторую напряженность в спинном мозге автоматизированного лучшие диссоциации.
Следующим важным шагом является сокращение боковые участки фермента, обработанных частей спинного мозга в средней точке нарезанного области, чтобы изолировать окончательный диссоциации силы в области, включающей ретикулоспинальных аксонов. Разрезы должны проходить от бокового края вентральной рога серого вещества к центральной вентромедиального колонке ретикулоспинальных аксонов оставляя их неповрежденную Фигура 2D. Резка боковые участки является координационным центром, на котором принудительного разделения спинного мозга будет происходить во время механической диссоциации и облегчает более гладкую разделение ткани. Устойчивый напряженность в спинном мозге требуется в процессе резания и может быть достигнуто путем растяжения и закрепления хвостового и ростральные концы спинного мозга кусок. Это предотвращает деформацию тканей под скальпелеми, как следствие повреждение аксонов.
Последним шагом в диссоциации применения механических напряжений и аккуратно растягивая ткань вдоль ростро-хвостовой оси рис 2е с помощью щипцов для захвата ткани. Этот этап выполняется более покровных покрытием поли-лизин, чтобы позволить адгезию отделенных аксонов для последующей записи. В целях достижения большей адгезией для длинных длительных ретикулоспинальных аксонов, мы использовали высокую молекулярную массу (> 300000) поли-D-лизин гидробромид, который обеспечивает большее количество точек крепления, чтобы покрыть покровные и Петри вставки. Поверхность с покрытием поли-лизина обеспечивает достаточное сцепление для спинной мозг заканчивается, и остро изолированные ретикулоспинальных аксоны. Щипцы покрытием Teflon обязаны сцепление спинной мозг, потому что он твердо стоит на регулярных нержавеющей стали щипцы, препятствующих диссоциации. Ткань должна быть растянута медленно и осторожно потянув аксоны из зрИнал шнур. Лучший способ получить аксоны поселиться является поддержание спинной мозг заканчивается по покровного стекла во все времена в процессе диссоциации, поддерживая давление вниз на ростральной и хвостового спинного мозга заканчивается пинцетом.
Аксоны лучше классифицировать как частично изолированы, так как некоторая часть остается внутри аксона при минимальном одном конце спинного мозга конце в зависимости от степени диссоциации. Изоляционные может быть осуществлено путем механического не разделяя два конца спинного мозга, пока аксонов полностью отделена от одного конца спинного мозга. В этом случае одна часть аксона остается внутри спинного мозга конце, из которого он выходит в то время как оставшаяся часть выделяют из спинного мозга интерьера. Терминал открытый конец аксонов запечатывает процессом мембраны Пересчет в зависимости от состояния здоровья аксона. Изоляционные также может быть выполнена таким образом, что аксоны выходят из спинного мозга, Bут хвостового и ростральные концы спинного мозга остаются подключенными с помощью изолированных ретикулоспинальных аксонов Рисунок 2e. На данный момент, мягко выпуская давление позволяет аксоны при растяжении, чтобы расслабиться и петли из уступая изолированных регионов аксонов лишенных постсинаптических прогнозов. Оба метода выхода диссоциации функциональных аксоны. Физиологической температуре в миногой 10 ° С и, следовательно, препарат оставляли для восстановления при 10 ° С в течение 1 ч, чтобы обеспечить аксоны для восстановления после острой диссоциации. Для Электрофизиологические записи, диссоциации проводили на покрытой покровным поли-лизин, вставленной в пользовательских камеры рисунке 3. Миногой спинной мозг были обычно поддерживают на уровне 10 ± 2 ° С путем перфузии раствор Рингера, предварительно охлажденного до 10 ° С при прохождении через термоэлектрического устройства охлаждения. Исключительно низкий фоновый шум необходим для решения одноканальный Ca Высокое К + (30 мМ КСl) используется для деполяризации аксоны (раздел 4.1), так что FM-краситель включены впузырьки во синаптической экзо-эндоцитоза. Трудно сохранить вставку микроэлектродом в изолированных аксонов в течение длительного времени, как малейшее смещение в положении аксона вызывает электрод отступать от аксона. Это затрудняет, чтобы стимулировать аксоны для длительного периода с использованием микроэлектрода. Большой диаметр аксона (20-50 мкм) делает его трудно, чтобы стимулировать использованием стимуляции вольфрамовым электродом. Следовательно высокой K + был использован для деполяризации аксонов. В пресинаптические терминалы в ретикулоспинальных аксонов имеют диаметр 1-2 мкм. Ca 2 + токи локализованы в релиз лица мембраны в пресинаптических окончаниях и поэтому важно, чтобы точно нацелены пресинаптического терминала. Следовательно, ключевым требованием для достижения этих записей является возможность манипулировать движение позиции патч пипетки с шагом мкм. Са 2 + токи в пресинаптический выпуска лица мембран были demonstratред в calyceal синапсов, чтобы быть чрезвычайно мала по амплитуде, менее 0,5 мкА. Одноканальные записи Са 2 + токи, следовательно, требуют чрезвычайно низкий уровень шума фона. Низкий тепловой шум был достигнут с усилителя Axopatch 200В и охлажденной headstage. Кроме того, загрязняющие источники шума необходимо систематически выявлять и устранять. Патч пипетки были сфабрикованы, от алюмосиликатного стекла для обеспечения низкий уровень шума, так как стекло имеет крайне низкие примесей и высоким удельным сопротивлением. Пипетки были созданы таким образом, что диаметр пипетки была больше, чем диаметр пресинаптических окончаний, таким образом, полностью охватывающей пресинаптического терминал, размеры которых могут быть четко наблюдали FM 1-43 маркировки. Это обеспечивается запись из всего выпуска номинальной мембраны. Емкостной шум был уменьшен путем нанесения пипетку с PDMS как можно ближе к кончику, насколько это возможно. В gigaohm уплотнения в пресинаптических терминалов мембран не являются стабильными в течение длительного перIODS и записи обычно длятся максимум 2 мин. Это делает записи чрезвычайно трудно получить, так как низкий уровень успеха требует большое количество попыток получить хорошей записи. Запись решения должны быть сконструированы таким образом, что все другие известные токи в пресинаптической терминальной мембраной, такие как напряжения закрытого Na + и K + каналов и Са 2 + -активированную K + каналы блокируются, что позволяет запись Са 2 + токов. Есть некоторые ограничения на использование поли-лизин клейкую поверхность с этого препарата. Одним из них является неспособность двигаться физическое местоположение камеры, содержащей препарат, потому что любые колебания нарушается подготовку. Другим ограничением клейкой поверхности были обнаружены в ходе экспериментов иммуногистохимических, как ростральные и хвостовой спинного мозга концевые детали теряют адгезию при инкубации в 4% параформальдегида. Мы постарались альтернативный клея, пропавшихTings такие как Cell-Tak и столкнулся с подобными проблемами. Для того чтобы решить эти проблемы, мы использовали жидкое шовный клей, чтобы прикрепить спинного ручки шнура. Специфика относительно использования шовного клея были обсуждены в предыдущей статье Юпитер Чэнь и Featherstone 22. Наборы клей более медленными темпами в растворах без двухвалентных ионов и мы воспользовались этим имуществом и проведены диссоциации в растворе Рингера без Са 2 + и Mg 2 +. Это дает нам дополнительное время для манипуляций с ткани в процессе диссоциации. Мы приняли аналогичный подход к Чен и Featherstone 22 использовании патч-пипеток и всасывание рот через трубопровод, подключенный к патч-пипетки применять клей на конкретной целевой области на поверхности диссоциации до выполнения диссоциации (Протокол раздел 5.2). В диссоциации проводили, как описано ранее, с той лишь разницей, что спинной сORD концы были прикреплены в процессе диссоциации, осторожно перемещая конец ручки над ранее размещенных клея (Протокол разделе 5.3). После того, как было завершено диссоциации, двухвалентный ион свободный раствор Рингера был обменен на раствор Рингера, содержащий Са 2 + и Mg 2 + ионов перфузии и подготовки было разрешено восстановление при 10 ° С в течение 20-30 мин на пластины термоэлектрического охлаждения до перейти к последующих стадий иммуногистохимии. Ключ Смысл этого метода является точное понимание в Са 2 + требованием высвобождения нейромедиатора, который не был полностью решен, несмотря на десятилетия исследований. Временное увеличение пресинаптического [Ca 2 +] была создана в качестве исключительно важное значение для запуска релиз во всех синапсах. Тем не менее, консенсус до сих пор отсутствует на количество каналов Ca 2 +, которые способствуют Ca домена 2+ литниковой releaсебе. Одновременное измерение Ca 2 + токов и измерения емкости на выпуск лица мембраны отдельных пресинаптических окончаний даст однозначный ответ на этот вопрос. Кроме того, это позволило бы выяснение временной зависимости между пресинаптической Ca 2+ входа и слияния пузырьков, что позволяет точно измерить синаптической задержки. Неограниченный доступность до выпуска номинальной мембраны в отдельных пресинаптических окончаний обеспечивает возможность применять ряд экспериментальных подходов к изучению различных компонентов нейромедиатора процесса выпуска. Примерами таких подходов включают одну пузырьков визуализации с использованием квантовых точек для изучения синаптических пузырьков слияние. События слияния пузырьков также может быть непосредственно характеризуется в пресинаптических окончаниях путем измерения изменений мембраны емкости, которые лежат события слияния пузырьков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S.
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V.
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K.
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
