Abstract
שידור סינפטי הוא תהליך מהיר מאוד. פוטנציאל פעולה מונע זרם של Ca 2 + למסוף presynaptic, באמצעות ערוצי מתח מגודרת סידן (VGCCs) ממוקמים בפני קרום שחרור, הוא הטריגר לאיחוי שלפוחית ושחרור הנוירוטרנסמיטר. חיוני למהירות של העברת הסינפטית הוא תיאום המרחב ובזמן בין הגעתו של פוטנציאל הפעולה, VGCCs ומכונות שחרור הנוירוטרנסמיטר. היכולת להקליט ישירות Ca 2 + זרמים מעל פני שחרור הקרום של מסופי presynaptic פרט הכרחית להבנה מדויקת של מערכת היחסים בין Ca presynaptic 2 + ושחרור הנוירוטרנסמיטר. גישה לפרצוף שחרור קרום presynaptic להקלטת אלקטרו אינה זמינה ברוב ההכנות וCa presynaptic 2 + כניסה התאפיינה תוך שימוש בטכניקות הדמיה וmeasureme הנוכחי מקרוסקופיתNTS - טכניקות שאין לי החלטה זמנית מספיק כדי לדמיין כניסת Ca 2 +. האפיון של VGCCs ישירות במסופי presynaptic אחת לא היה אפשרי בסינפסות מרכזיות ועד כה הושג בהצלחה רק בסינפסה גביע הסוג של גנגליון ריסי חומוס ובcalyces חולדה. יש לנו לטפל בהצלחה בבעיה זו בסינפסה reticulospinal הענק של חוט השדרה צמד ים על ידי פיתוח הכנה בחריפות ניתקת של חוט השדרה שמניב האקסונים reticulospinal מבודדים עם מסופי presynaptic פונקציונליים נטולי מבני postsynaptic. אנו fluorescently יכולים לתייג ולזהות מסופי presynaptic פרט ולמקד אותם להקלטה. שימוש בתכשיר זה, יש לנו מאופיין VGCCs ישירות בפרצוף שחרורו של מסופי presynaptic בודדים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה גישות. Ca 2 + זרמים נרשמו ישירות בo קרום הפנים שחרורמסופי presynaptic פרט f, ההקלטה הראשונה מסוגו שבוצעו בסינפסות מרכזיות.
Introduction
שידור סינפטי הוא תהליך מאוד מהיר ומדויק. פלישת פוטנציאל פעולה של מסוף presynaptic מובילה לפתיחת VGCCs ממוקם בקרום הפנים שחרור, העלייה וכתוצאה מכך Ca presynaptic 2 + מתנהגת כמו ההדק לשחרור איחוי שלפוחית ומוליך עצבי 1. כל הצעדים האלה להתרחש בתוך מאות מיקרו 2, ולכן דורש צימוד המרחבית הדוק של VGCCs למכונות איחוי שלפוחית 3. Ca 2 + והנתיבים Presynaptic מתאפיינים בעיקר באמצעות הדמיה גישות באמצעות הצבעים הרגישים Ca 2 + 4. Ca 2 + מאגרי שילוב המווסתים Ca 2 + בתאי עצב presynaptic נעשה שימוש כדי לאפיין את מערכת היחסים בין סידן ועצבי 3 presynaptic בעקיפין. בנוסף, ויסות Ca 2 + הריכוז החופשי presynaptic ידי משחרר רפרוף Ca 2 + 5 או הקלטת macroscopiג Ca 2 + זרמים היו בשימוש בשילוב עם אמצעים של איחוי שלפוחית ו / או שחרור; כגון מדידות קיבול 6 או postsynaptic תגובות 2 להתייחס לאותה השאלה. עם זאת, המאפיין את Ca 2 + זרמים ישירות בפרצוף השחרור, הסעיף מיוחד של קרום presynaptic בי שלילת קוטביות קרום מתורגמת לCa 2 + זרמים מפעילות איחוי שלפוחית הסינפטית ושחרור הנוירוטרנסמיטר, הוא חלק בלתי נפרד מהשגת מידה מדויקת של Ca 2 + דרישה לאיחוי שלפוחית הסינפטית. בנוסף, היכולת לאפיין באופן ישיר 2 + זרמי Ca במסופי presynaptic בודדים, בשילוב עם מדידות בו זמנית מדויקות של איחוי שלפוחית ושחרור מאפשר הבהרה מדויקת של מערכת היחסים בין עיתוי מהלך פוטנציאל פעולת הזמן, Ca 2 + נוכחי presynaptic, איחוי שלפוחית ושחרור. גישה לקרום הפנים שחרוראינו זמין ברוב המכריע של מסופי presynaptic בשל סגירת פרד על ידי דנדריטים postsynaptic. חוסר נגישות זה היה מכשול עיקרי באפיון של VGCCs שכן הוא מונע מדידות ישירות של זרם במסופי presynaptic פרט. אפיון ישיר של 2 + זרמי presynaptic Ca במסופי presynaptic בודדים עד כה לא היה אפשרי בסינפסות מרכזיות והושג רק בשני מסופי presynaptic סוג calyceal; סינפסה גביע הסוג של calyces גנגליון ריסי חומוס 7-10 וחולדת 11,12. בכל מסופי presynaptic האחרים, כולל סינפסה reticulospinal הענק בחוט השדרה צמד ים 13, היעדר הגישה לקרום הפנים שחרור סינפטי יש חייבת השימוש בגישות עקיפות כגון ההדמיה Ca 2 + ללמוד Ca 2 + והנתיבים presynaptic.
איור 1 צמד ים סינפסה reticulospinal הענק. (א) חתך של חוט השדרה צמד ים המצביע על הנטייה dorso- הגחון. האקסונים Reticulospinal מסומנים בכוכבית ירוקה. (ב) שיקום 3-D של סינפסה reticulospinal בחוט השדרה צמד ים מראה האקסון presynaptic reticulospinal עושה רב en קשר אגב (מסומנים בחצים ירוקים) אל הנוירון postsynaptic 13. מסופי Presynaptic סומנו בתווית עם אלקסה פלואוריד 488 hydrazide phalloidin מצומדות (ירוק), בזמן שהנוירון postsynaptic כבר מלא בhydrazide אלקסה פלואוריד 568 (אדום).
האקסונים reticulospinal ענק צמד ים, הממוקמים באזור הגחון של מקביל בחוט השדרה לאיור 1 א ציר מקורי, זנב, מרובה טופס en קשר אגב הסינפטי על תאי עצב שלקרן השדרה הגחון 14 איור 1b 13. כל תא מקרוסקופית זרמי Ca 2 + נרשמו מהאקסונים reticulospinal בחוט השדרה שלם 13,15. עם זאת, ניסיונות עיוורים קודמים במדידה ישירה של Ca 2 + זרמים באקסונים reticulospinal בכבל צמד ים שלם השדרה באמצעות טכניקת מהדק תיקון מצורף תא הוכיחו לא מוצלחים 13 בשל חוסר הגישה לקרום הפנים שחרור סינפטי בשל תהליכי postsynaptic מתנגדים איור 1b. פני שחרור הקרום נעשה בעבר נגיש על ידי ההסרה של הנוירון postsynaptic 11, ההפרעות מכאניות של סינפסה לפני הקלטת 12 או טיפול אנזימטי בשילוב עם ניתוק מכאני 16. בהתחשב בארגון המורכב של חוט השדרה, זה יהיה קשה מאוד להוכיח לזהות נוירון postsynaptic ולחזור בו באופן מכאני או להפריע הסינפסה דואר. לפיכך, החלטנו להשתמש בטיפול אנזימטי 17 אחרי ניתוק מכאני.
שימוש בגישה זו, פיתחנו הכנה בחריפות ניתקת של חוט השדרה צמד שמניב האקסונים reticulospinal מבודדים קיימא עם מסופי presynaptic פונקציונליים נטול כל תהליכי postsynaptic, ובכך לספק גישה חופשית למסופי presynaptic פרט. בשיתוף עם מיקרוסקופ רגיל הפוך ודימות פלואורסצנטי, זה מאפשר לנו לזהות ולמקד את מסופי presynaptic מזוהה fluorescently בודדים, עם טפטפת תיקון המכיל פתרון הקלטה שמבודד 4d איור 4C ואיור 2 + זרמי Ca, להקלטה באמצעות תאי ד' טכניקת מתח מהדק מצורף. Ca 2 + זרמים נרשמו ישירות בקרום הפנים שחרור presynaptic של 4F איור מסופי presynaptic פרט. זה significant פריצת הדרך בתחום של שידור סינפטי שכן הוא ההקלטה הראשונה מסוג זה בוצע בסינפסות מרכזיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת hydrobromide פולי-D-ליזין
- הכן hydrobromide פולי-D-ליזין 1 מ"ג / מ"ל במאגר M 0.1 borate (pH 8.5).
- Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
ציפוי 2 פולי-ליזין של Coverslips
הערה: בצע את כל שלבי הניקוי וציפוי בזרימה למינרית קאמרית.
- coverslips מקום בצלחת פטרי המכילה 1 חומצה הידרוכלורית N (HCl) לשעה 2.
- לשאוב את כל HCl ולשטוף עם אתנול 70% (EtOH) 2-3x.
- השאר בEtOH 70% עבור שעה 1.
- לשאוב את כל EtOH 70% ולשטוף עם 100% EtOH 2-3x.
- השאר ב100% EtOH לשעה 2. לשאוב את כל EtOH.
- כתם יבש עם נייר סינון וייבוש באוויר לכמה שניות.
- O מקום / N ב1 מ"ג פתרון poly-ליזין מ"ל /.
- יש לשטוף את coverslips למחרת עם 4-5x המים Millipore.
- פולי ליזין האוויר יבש מצופה coverslips על גלגלי זכוכית בצלחת פטרי נקייה.
- לimmunohistochemistry, להשתמש 35 x 10 מ"מ מכסים בצלחת פטרי. הכן sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) בשורה מנות על ידי שפיכת PDMS (אלסטומר וסוכן ריפוי 10: 1 לפי משקל) לתוך הצלחת לעובי של 0.3 סנטימטר ולאפשר להגדיר ב30 ° CO / N. ברגע שזה קבע, לחתוך 2 סנטימטר על 1 סנטימטר שהותקן בPDMS. נקי ומעיל משובץ עם פולי ליזין הבאים את אותם צעדים כאמור לעיל לcoverslips.
- coverslips החנות פולי ליזין המצופה ומנות מכוסות בתוך הזרימה למינרית החדר עד לשימוש (עד 2 שבועות, אבל להשיג תוצאות הדבק הטובות ביותר על ידי הכנה מעת לעת בכל 3-4 ימים).
- הכן בלוק PDMS, להצמיד את חוט השדרה במבצע הרקמות הרוטטת. מיקס אלסטומר ואלסטומר B 1: 1 לפי משקל. יוצקים לתוך צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ ותאפשר להגדיר O / N ב30 מעלות צלזיוס. חותכי פיסת PMDS מלבנית ולהדביק אותו לצלחת בסיס חיתוך באמצעות דבק אפוקסי. אפשר מדביק להגדיר תיקון PDMS במקום ופורסים חלקים דקים מרובים את פני השטח כדי להשיג שטוחמשטח להצמיד הרקמה ב.
.3 חריף דיסוציאציה של חוט השדרה צמד ים לתשואת האקסונים Reticulospinal מבודדים
- הרדימי צמד ים ammoecoete או מבוגר (מרינוס Petromyzon) עם methanesulphonate tricaine (MS-222; 100 מ"ג / ליטר). להוסיף חומר הרדמה אל תוך המים, בכוס פלסטיק המכוסה על ידי מכסה, המכיל את צמד ים צריך להקריב.
- לערוף צמד ים בקור (4 ° C) הפתרון של רינגר של הרכב הבא (במ"מ): גוף 130 NaCl, 2.1 KCl, 2.6 CaCl 2, 1.8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 דקסטרוז (pH 7.6, osmolarity 270 mOsm) ולהסיר קיר שרירים לחשוף פני השטח הגבי של חוט השדרה.
- הסר Primitiva meninx מהשטח הגבי של חוט השדרה באמצעות מלקחיים בסדר. אל תסיר Primitiva meninx הגחון בשלב זה.
- חותך את חוט השדרה ל1 סנטימטר חתיכות ארוכות.
- הצמד חתיכת חוט השדרה באמצעות סיכות חרקים קנס, צד גב כלפי מעלה, על PDMS מרופד חיתוך PLA בסיסte (ראה 2.12) בתא מבצעה רקמה רוטט המכיל הפתרון של רינגר קר כקרח.
- הסר קטע של הטור הגבי של חוט השדרה מרכזי על ידי חיתוך לאורך ציר rostro- זנב עם הלהב, והותיר אחריו חלקי טור הגבי שלמים על מקורי ואת הזנב מסתיים לשמש מטפל ב2b איור 2a תהליך הניתוק ואיור. השתמש בהגדרת מהירות האיטית ביותר המאפשרת חיתוך והגדרת עומק שמסירה רק את העמודה הגבי עוזב איור 2b ניזוק העמודה האקסון reticulospinal הבסיסי.
- דגירה חתיכות חוט השדרה פרוסה ב RT דקות 45 בקוקטייל של 1 מ"ג פרוטאז מ"ל / (סוג XIV מStreptomyces griseus) ו1 מ"ג / collagenase מ"ל מוכן (סוג IA מhistolyticum Clostridium) בפתרון של רינגר (מותאם מאל Manira & Bussières 1997 17).
- חתיכות חוט השדרה שטופל באנזים פין באמצעות סיכות קנס בPDMS מרופדות conta צלחת פטרי(4 ° C) ining הקר הפתרון של רינגר.
- הסר Primitiva meninx הגחון עם מלקחיים בסדר.
- לחתוך קטעים רוחביים של חוט השדרה עם להב סכין מנתחים בנקודת האמצע של הקטע הגבי הפרוס עוזב את הטור של אקסונים reticulospinal שלמים באיור 2 בעמוד השדרה המרכזי.
- מניחים ירידה של שמן טבילה על העדשה.
- מקום coverslip poly-ליזין המצופה (איור 3 א, פיסה עליונה, המלבן אדום) בחריץ של חדר הקלטת איור 3 ולמרוח משחה ואקום לכל הקצוות (חלל שבין מלבנים אדומים והכחולים באיור 3 א, כדי להקל על חותם. בורג העליון למקומו. מניחים את החדר בהבלעה במתקן ההקלטה.
- הוספת הפתרון של רינגר לתא ההקלטה באמצעות פיפטה פסטר.
- חבר את צינורות יצוא של בקבוק הלחץ המכיל נוזל לרדיאטור פתרון לצינורות הזנת מכשיר קירור תרמואלקטרי. חבר את outpצינורות ut של מכשיר קירור תרמואלקטרי לסוף הקלט של מעיל הקירור החיצוני וסופו של דבר התפוקה לאיור 3 ב מאגר.
- הנח חתיכת חוט השדרה אחד בכל פעם בחדר ההקלטה ועדינות להפריד את עמוד השדרה שמירה על זה לאורך coverslip בכל העת באמצעות מלקחיים מצופים טפלון עד האקסונים הם 2e איור מבודד ו2f איור.
- להביא את טמפרטורת פתרון הקלטה ל10 ° C על ידי העברה (גז חנקן נדחף לתוך בקבוק) בלחץ פתרון נוזל לרדיאטור (על ידי עקירה), באמצעות מכשיר קירור Thermoelectric, דרך מעיל הקירור החיצוני של איור 3 ב תא הקלטה.
- לאפשר האקסונים להתאושש להודעה ניתוק שעה 1 ב10 ° C.
מימדי איור 3 סכמטי של הקלטת תא לניסויי אלקטרופיזיולוגיה. הניתנים הם בסנטימטרים. מלבן אדום שמוצג בתרשים basepiece (א) מצביע על מיקום של coverslip בחריץ coverslip בbasepiece. האזור בין המלבן האדום וכחול, שמוצג בתרשים basepiece (א) המקום שבו השומן גבוה ואקום מיושם. (ב) מראה תא ההקלטה התאסף.
.4 סימון וזיהוי של מסופי Presynaptic עם FM 1-43
- תווית מסופי presynaptic, על ידי שילוב FM 1-43 לנesicles במהלך Exo-אנדוציטוזה הסינפטי במהלך גבוהה K + שלילת קוטביות. Perfuse הכנה עם 5 מיקרומטר FM 1-43 (ב 5 מ"ל הפתרון של רינגר המכיל 30 מ"מ KCl).
- Perfuse הכנה עם 1 מ"ג / מ"ל Advasep-7 (ב 5 מ"ל הפתרון של רינגר) כדי להסיר צבע FM העודף) 18.
- Perfuse הכנה עם הפתרון של רינגר ל15 דקות לכישלון כל צבע remant וAdvasep.
- תמונה עם עדשת 100 X טבילת שמן (NA 1.25) במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, בשיתוף עם מצלמת CCD דיגיטלית וMicromanager תוכנת רכישת תמונה, תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים דימות פלואורסצנטי.
- לזהות מסופי presynaptic שכותרתו fluorescently למקד להקלטת איור 4C ו4d איור.
.5 אימונוהיסטוכימיה של האקסונים Reticulospinal מבודדים
- מלא הבלעה מנה (סעיף פרוטוקול 2.10.) עם דו ערכי יון (Ca 2 + וMg 2 +) חופשיהפתרון של רינגר.
- לפברק טפטפות תיקון בחולץ micropipette P-87. מניחים כמות קטנה של דבק תפר בקצה אחד של הבלעה פולי ליזין באמצעות פיפטה תיקון (זכוכית קוטר חיצונית 1.5 מ"מ) ויניקה (באמצעות צינורות סיליקון 0.89 מ"מ קוטר פנימי עם קצה micropipette המצורף בסוף היניקה).
- לבצע התנתקויות תוך שימוש באותו ההליך כאמור בסעיף פרוטוקול 3 איור 2. מניחים קצה אחד של חוט השדרה על דבק התפר ולחץ בעדינות עם מלקחיים כדי להדביק אותו בחריפות על פני השטח. מניחים עוד טיפה של דבק תפר בקצה השני של הבלעה ובעדינות למתוח את חוט השדרה עד האקסונים הם ניתקו ולדבוק סוף חוט השדרה בחינם על ידי גרירתו בעדינות על דבק התפר. לתקן במקום על ידי לחיצה עדינה עם המלקחיים.
- דו ערכי Exchange לשחרר הפתרון של רינגר עם הפתרון של רינגר הקבוע על ידי זלוף.
- לאפשר האקסונים להתאושש להודעה dissoc 20 דקותiation ב10 ° C.
- תקן את האקסונים ניתקו בparaformaldehyde 4% (PFA) {הכין בפוספט הצפת מלוח (PBS, (מ"מ) NaCl 137, KCl 2.7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, pH 7.4)} עבור 20 דקות. סנן פתרון PFA לפני שימוש על ידי עובר דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
- לשטוף את PFA ידי מרוסס 0.1 M גליצין (PBS) עבור 10 דקות.
- דגירה ב0.1% Triton-X (PBS) עבור 10 דקות.
- לשטוף ידי מרוסס PBS עבור 20 דקות.
- לחסום עם 5% חלב דל שומן (PBS) במשך 6 שעות ב 4 ° C..
- להוסיף בנוגדן ראשוני לVGCC של עניין (1: 200 דילול PBS) ודגירה של 20 שעות ב 4 ° C..
- לשטוף ידי מרוסס PBS עבור 20 דקות.
- לחסום עם 5% חלב דל שומן (PBS) עבור 10 דקות ב 4 ° C..
- להוסיף בנוגדנים משני (1: דילול 400 PBS) ו דגירה בחושך במשך שעה 2 ב 4 ° C..
- לשטוף ידי מרוסס עם PBS עבור 20 דקות.
- לחסום עם 1% הסרום albu שורדקות (PBS) עבור 20 דקות.
- להוסיף בphalloidin אלקסה פלואוריד 488 (5 יחידות / μl ריכוז עבודה; המניה הוכנה במתנול 200 יחידות / מ"ל).
- לשטוף ידי מרוסס עם PBS עבור 20 דקות.
- תמונה באמצעות עדשת טבילת 100X מים במיקרוסקופ confocal.
.6 אלקטרו הקלטה
- לפברק טפטפות זכוכית aluminosilicate תיקון (התנגדות פיפטה 2-5 MΩ) בחולץ micropipette P-87. פיפטה תיקון העיצוב כזה שקצה פיפטה מקיף קוטר מסוף presynaptic כולו.
- טפטפות תיקון מעיל PDMS על ידי טבילת פיפטה את התיקון בלחץ psi 50-60 לPDMS 23 (לצרף צינורות סיליקון, 0.89 מ"מ קוטר פנימי, מחוברים לבלון גז חנקן, לקצה האחורי של פיפטה התיקון) ולייבש באמצעות חום אקדח. לחלופין, באופן ידני מעיל פיפטה עם PDMS, יישום ציפוי קרוב לקצה אפשרי, תחת מיקרוסקופ מתחם.
- טפטפות תיקון פולני אש באמצעות MICRoforge (מצוידת לבמה של מיקרוסקופ מתחם נימה פלטינה נבנתה מותאם אישית).
- לזהות אקסונים מבודדים מדגימים מסופי presynaptic שכותרתו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- מלאו פתרון הקלטה (שנועד לבודד את Ca 2 + זרמים; 10 מ"מ CaCl 2 או 90 מ"מ BaCl 2 כמוביל מטען, HEPES נאגרו pH 7.6, osmolarity 270 mOsm) לתוך פיפטה התיקון באמצעות מזרק.
- הכנס פיפטה תיקון לבעל פיפטה ועמדה מעל האמבטיה באמצעות MP225 מניפולטור ממונע. בעדינות להוריד את פיפטה התיקון לאמבטיה והעמדה נגד פניו של מסוף presynaptic זיהה fluorescently.
- לקדם את פיפטה התיקון באיטיות עד ליצירת קשר הוא עשה עם הקרום. בשלב זה, להשיג חותם gigaohm על ידי יניקת פה עדינה דרך צינור המחובר לבעל פיפטה.
- כדי להשיג את רמות הרעש נמוכות במיוחד רקע הנדרשות להקלטת ערוץ אחד 2 + זרמי Ca, להשתמשxopatch 200B עם headstage מקוררת להקלטות. נתונים לדוגמה ב20-50 קילוהרץ ומסנן באמצעות מסנן בסל 5 kHz. לבצע רכישת נתונים באמצעות X. Axograph
- השתמש בפרוטוקול צעד סטנדרטי, במרווחים של 10 mV כגירוי. לשלב טרום דופק בפרוטוקול, שקדמו לפרוטוקול הצעד, כדי להבטיח הפעלה מקסימלי של ערוצי 2 + Ca. לשלב צעד דליפת mV 10 לפרוטוקול הצעד לחיסור הודעה ניתוח של זרמי דליפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האקסונים זה תשואות פרוטוקול ניתוק בריאים ופונקציונליים מבודדים reticulospinal נטול 2f איור תחזיות postsynaptic, אך בכל זאת לשמור על מסופי presynaptic פונקציונליים מסוגלים 4c עורר שלפוחית הסינפטית Exo-ואנדוציטוזה איור ו4d איור. סעיפים של האזורים המבודדים של אקסונים reticulospinal ניתן לזהות באופן ברור תחת מיקרוסקופ אור שיהיה ברור של כל תהליכים עצביים אחרים המאפשרים גישה בלתי מוגבלת ל2f איור קרום האקסון reticulospinal. האקסונים לשמור על שלמות מבנית לאחר ניתוק. אקסונים מבודדים תוקנו בתצורת תא כולו ומלא בhydrazide אלקסה פלואוריד 488. הצבע המפוזר באופן אחיד בתוך האקסון ואין זליגת צבע נצפה מאיור 4 א האקסון.
"Width =" /ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg 500 "/>
איור 4 הקלטות נציג מהאקסון reticulospinal מבודד. (א) האקסון reticulospinal מבודד מלא בhydrazide אלקסה פלואוריד 488 עם טפטפת תיקון בתצורת תא כולו. עמדת פיפטה מסומנת בחץ לבן. (ב) אני. פוטנציאל פעולת נציג ירה בהאקסון reticulospinal מבודד. ii. פוטנציאל פעולת נציג ירה בהאקסון reticulospinal בחוט השדרה בשלמותה. חץ שחור מצביע על נקודת גירוי זמן. (ג) ו (ד) שתי תמונות של האקסון reticulospinal מבודד מראה תיוג punctate של מסופי presynaptic עם FM 1-43 ומיקוד של מסוף presynaptic בודד עם פיפטה תיקון להקלטת תיקון מצורף תא. חיצים ירוקים מסמנים מסופי presynaptic פרט תוך חץ לבן מסמן את פיפטה התיקון. (ה) המלח מבודד האקסון reticulospinal מראה indiscrהתאגדות iminate של FM 1-43 לאורך האקסון. 4F. דוגמא מייצגת מראה הקלטה של Ca 2 + זרמים מצורפים תא (10 מ"מ [Ca 2 +] חיצוני בפתרון ההקלטה בפיפטה התיקון) מpresynaptic קרום הפנים שחרור מפגין הפתיחה של Ca 2 + ערוצים מרובים. קו מוצק מסומן 0 מציין מצב סגור של ערוץ, ואילו קווים מקווקווים מציינים את פסגות גאוס לפתחי ערוץ.
אקסונים ניתקו בחריפות לשמור על תכונות חשמליות. פוטנציאל הממברנה במנוחה (RMP) ניתן למדוד על ידי impaling האקסון משויך עם microelectrode או על ידי תיקון האקסון בתצורת תא כולו במצב מהדק נוכחי. RMPs הדומה נרשם בשני השיטות, עם ממוצע של -57.94 ± 1.63 mV (n = 17 האקסונים). בנוסף, ניתק יכולים להיות מגורה האקסונים לירות פוטנציאל פעולת איור 4, עם כמובן צורה והזמן של פוטנציאל הפעולה להיות דומהלאחד ירה בהאקסון reticulospinal בחוט השדרה בשלמותה.
איחוי שלפוחית ומחזור להתמיד באקסונים ניתק. יכולים להיות מתויגים אשכולות שלפוחית מחזור עם צבע styryl FM 1-43 במהלך אשלגן גבוה (30 מ"מ KCl) גירוי 19. עם אישור צבע, תיוג punctate המובהק של מסופי presynaptic ניתן לצפות איור 4C ו4d איור, עם הפצה דומה לאקסונים reticulospinal בחוט השדרה שלם 13. צביעת FM 1-43 מספקת הבחנה ברורה בין האקסונים בריאים ולא בריאים כמו האקסונים לא בריאים להראות כניסה לצבוע FM ללא הבחנה בכל 4e איור האקסון. היכולת לזהות מסופי presynaptic פרט בבירור מאפשרת לנו למקד אותם עם טפטפת תיקון להקלטת איור 4C ו4d איור. ניצול יכולת זו, יש לנו נרשמו Ca 2 + זרמים ישירות ממ 'הפנים שחרורembrane של 4F איור מסופי presynaptic היחיד.
הכנת האקסון reticulospinal מבודדת בחריפות גם מציעה יתרונות ברורים בהשוואה לחוט השדרה שלם אימונוהיסטוכימיה של מסופי presynaptic יחידים. חוסר כל autofluorescence רקע והיעדר מכתים על מבנים או גליה postsynaptic מאפשרים זיהוי חד משמעי של תיוג נוגדן במסופי presynaptic מזוהה (איור 5 ב, ט). יחד עם סמן סינפטי כגון Alexa-488 phalloidin מצומדות (איור 5 א, ii) ו (איור 5 ב, ב), אשר התוויות אקטין presynaptic 20, לוקליזציה של תיוג immunohistochemical למסופי presynaptic ניתן להדגים באופן ברור (איור 5 א, iii). גישה זו נעשתה שימוש בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal לבצע אפיון immunohistochemical של תת VGCC השונים מראה tלוקליזציה ספציפית יורש ציור 5a מסופי presynaptic.
איור 5 Immunostaining של האקסון reticulospinal מבודד. (א) אפיון אימונוהיסטוכימיים של R-סוג תעלות סידן (CaV2.3) במסופי presynaptic פרט. אני. נוגדן ראשוני polyclonal שימש תווית epitope בלולאה תאית בין תחומים השני ושלישי של ערוץ R-סוג סידן (מארח - ארנב). נוגדנים משני היו 633 IgG hydrazide אלקסה פלואוריד העז מצומדות נגד הארנב. ii. מסופי Presynaptic זוהו על ידי תיוג 488 phalloidin אלקסה פלואוריד של אקטין presynaptic. iii. Colocalization בין תיוג R-סוג נוגדן (אדום) וAlexa-488 phalloidin (ירוק) מוצג בשכבה ממוזגת. (ב) אני. Preincubation של נוגדן תעלות סידן R-סוג אנטי עםאנטיגן שליטה לא יניב כל תיוג ספציפי של תעלות סידן. ii. תיוג 488 phalloidin אלקסה פלואוריד של מסופי presynaptic לאותו האקסון מראה תיוג punctate בדיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול הניתוק שלנו הוא משמעותי על ידי מניב האקסונים reticulospinal מבודדים נטולי 2f איור תחזיות postsynaptic, אך בכל זאת לשמור על 4d איור 4C מסופים ואיור presynaptic הפונקציונלי. היעדר תהליכי postsynaptic המנוגדים מסוף presynaptic מאפשר גישה ישירה להקלטת קרום הפנים שחרור סינפטי במסופי presynaptic יחידים, בעבר לא היה אפשרי בסינפסות מרכזיות והשיג הצלחה רק בשני מסופי presynaptic calyceal סוג; סינפסה גביע הסוג של calyces גנגליון ריסי חומוס 7-10 וחולדת 11,12. מסופים בודדים presynaptic, אשר ברמת micrographic האלקטרון הוכחו להציג אזורים פשוטים, אחד פעיל 21, ניתן לזהות על ידי אשכולות שלפוחית מחזור תיוג עם FM 1-43 וממוקד לאיור 4C הקלטה ו4d איור. Ca
המפתח להשגת האקסונים reticulospinal מבודדים עם מסופי presynaptic תפקודיים טמון בסדרה של מבקרצעדים עוקבים אל. רקמה מונעת ניתוק חריף של אקסונים הענק הממוקמים בעיקר באזור dorso-המדיאלי של איור 1 א חוט השדרה הייתה צורך להסיר ראשונה באיור 2a מבצעה רקמה רוטט. זה עושה את זה יותר קל לנתק באופן מכאני בעמוד השדרה תוך שימוש בכח אפשרי לפחות. החיתוך של העמודה הגב דורש הסרה המלאה של Primitiva meninx הגב שכן כל Primitiva meninx הגב שנותר היה לעכב את פעולת החיתוך של הלהב. אנו מוצאים שיציאה מPrimitiva meninx הגחון על חוט השדרה בעת החיתוך עוזרת לשמור על הצורה של חוט השדרה ומסייעת בחיתוך טוב יותר. שמירה על מתח בחוט השדרה במהלך תהליך החיתוך מונעת כל תנועה או מתנגשים לרוחב של הרקמה תחת הלהב שיפגע באקסונים. 1 סנטימטר ארוך חתיכות חוט השדרה מספקת אורך טוב לחיתוך כמו הרקמה יכולה להיות מתוחה ומרותקת שמירת מתח wחיתוך Hile. גורם קריטי נוסף כדי לפקח הוא העומק של הפרוסה; רדודה מדי הפרוסה מונעת הפרדה טובה של חוט השדרה ואילו נזקי הפרוסה עמוקים מדי האקסונים reticulospinal. עומק פרוסה טוב הוא אחד שבו הטור הגבי מוסר בעליל עוזב את טור reticulospinal הגחון ניזוק. העומק של הפרוסה יש ליעיד במהלך תהליך החיתוך נתון יש וריאציה בעובי חוט השדרה בין בעלי החיים. הסרת העמודה הגבי מתבצעת הטובה ביותר בחלק האמצעי של איור 2b חתיכת חוט השדרה כפי שהוא מאפשר למקורי unsliced וזנב מסתיים לשמש מטפל לתפוס את הרקמה במהלך 2e איור תהליך הניתוק.
לאחר הסרת העמודה הגב, טיפול בחתיכות חוט השדרה הפרוס בתערובת של collagenase (Collagenase סוג IA מClostridium histolyticum) ופרוטאז (פרוטאז סוג XIV מStreptomyces griseus) אנזימים (1 מ 'גר '/ מ"ל בפתרון של רינגר) עוזר לעכל את רקמת חיבור ומאפשר ניתוק עדין. עיכול 30-45 דקות ב RT הוא אידיאלי לניתוק. ניתוק האנזימטית שלם של חוט השדרה צמד ים בוצע בעבר עם טיפולים רציפים של collagenase (2 מ"ג / מ"ל, 30 דקות) ופרוטאז (2 מ"ג / מ"ל, 45 דקות) כדי לבודד תאי עצב בעמוד השדרה 17. טיפולים רציפים לעומת טיפול בקוקטייל של פרוטאז וcollagenase לא הניבו תוצאות טובות יותר במתנערים האקסונים reticulospinal. אנחנו גם ניסויים עם ריכוזים שונים של אנזימי דיסוציאציה. ריכוזי אנזים גבוהים יותר מאשר 2 מ"ג / מ"ל פעמים או עיכול ארוכות יותר מ45 דקות, הסתיימו בחוט השדרה מאבד את העקביות שלה והתנתקויות עניות. ריכוזי האנזים גבוהים יותר ותקופות טיפול ממושכות עשויים לסייע בניתוק של חוט השדרה שלם כאשר תשואות של נוירונים קטנים יותר נדרשות. האקסונים Reticulospinal, לעומת זאת, יש לי stru מורחבcture וטיפולים גדולים יותר מ45 דקות היו תוצאה הפוכים. שמירה על כמה מתח בחוט השדרה סייע התנתקויות טובות יותר.
השלב החשוב הבא הוא לחתוך את השטחים לרוחב של חתיכות חוט השדרה שטופל באנזים בנקודת האמצע של האזור הפרוס לבודד את כוח הניתוק הסופי לאזור המקיף את האקסונים reticulospinal. הקיצוצים צריכים להאריך מהקצה לרוחב של החומר אפור קרן הגחון לעמודת ventro-medial המרכזי של אקסונים reticulospinal משאירים אותם איור 2 שלא נפגעו. חיתוך קטעים לרוחב מספק נקודת מוקד שבו נאלצה הפרדה של חוט השדרה תתרחש במהלך ניתוק מכאני ומאפשרת הפרדה חלקה יותר של הרקמה. מתח שנגרם בחוט השדרה נדרש בתהליך החיתוך ויכול להיות מושגת על ידי מתיחה ומצמיד את קצות זנב והמקוריים של יצירת חוט השדרה. זה מונע עיוות רקמה תחת להב סכין המנתחיםוכתוצאה מכך לנזק לאקסונים.
השלב האחרון בניתוק מיישם מתח מכאני ובעדינות מתיחת הרקמה לאורך איור ציר rostro- זנב 2e באמצעות מלקחיים לאחיזת הרקמה. שלב זה מתבצע על coverslips המצופה פולי ליזין, כדי לאפשר הדבקה של האקסונים מופרדים להקלטה הבאה. על מנת להשיג הידבקות גדולה יותר עבור אקסונים reticulospinal מורחבים הארוכים, יש לנו להשתמש במשקל מולקולרי גבוה (> 300,000) פולי-D-ליזין hydrobromide, המספק מספר גדול יותר של נקודות חיבור, למעייל coverslips וריבועי צלחת פטרי. המשטח המצופה פולי ליזין מספק הידבקות מספיקה לחוט השדרה מסתיים ואקסונים reticulospinal המבודדים בחריפות. מלקחיים מצופים טפלון נדרשים אחיזה בחוט השדרה בגלל זה נדבק היטב למלקחי נירוסטה רגילים מונעים התנתקויות. הרקמה חייבת להיות מתוחה לאט ובעדינות מושכת את האקסונים מתוך spכבל INAL. הדרך הטובה ביותר לקבל את האקסונים להתיישב היא לשמור על חוט השדרה מסתיים לאורך coverslip הזכוכית בכל העת במהלך תהליך הניתוק על ידי שמירה על לחץ כלפי מטה על גבי חוט השדרה מקורי ואת הזנב מסתיים במלקחיים.
האקסונים מסווגים הטובים ביותר כמבודדים באופן חלקי שכן חלק החלק של האקסון נשאר בתוך בקצה אחד המינימום של סוף חוט השדרה בהתאם למידה של הניתוק. יכולים להתבצע על ידי בידודים מכניים מפריד בין שני הקצוות של חוט השדרה ועד לאקסונים נפרדים לחלוטין מקצה אחד של חוט השדרה. במקרה זה, חלק אחד של האקסון נותר בתוך סוף חוט השדרה שממנו עולה בעוד החלק הנותר מבודד מחוץ לעמוד השדרה הפנים. הסוף הפתוח המסוף של אקסונים חותם על ידי תהליך הודבק מכתבים מחדש קרום בהתאם לבריאותו של האקסון. יכולים גם להתבצע בידודים כך שהאקסונים לצאת החוצה מחוט השדרה, בut הזנב וקצוות מקורי של חוט השדרה להישאר מחובר באמצעות אקסונים reticulospinal המבודדים 2E איור. בשלב זה, בעדינות לשחרר את הלחץ מאפשר האקסונים תחת מתח להירגע ולולאה החוצה מניב אזורים מבודדים של אקסונים נטולי תחזיות postsynaptic. שני טכניקות הניתוק להניב האקסונים פונקציונליים. הטמפרטורה הפיזיולוגית לצמד הים היא 10 ° C, ולכן ההכנה מותרת להתאושש ב10 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר לאקסונים להתאושש מהניתוק החריף. עבור קלטות אלקטרו, הניתוק בוצע על coverslip המצופה פולי ליזין מוכנס לתוך איור קאמרי מותאם אישית 3. מיתרי השדרה צמד ים נשמרו בדרך כלל ב10 ± 2 מעלות צלזיוס במרוססת הפתרון של רינגר, precooled ל10 ° C על ידי עובר דרך מכשיר קירור תרמואלקטרי. יוצא דופן רעש רקע נמוך נדרש לפתרון ערוץ אחד Ca K גבוה + (30 מ"מ KCl) משמש לdepolarize אקסונים (סעיף 4.1), כך שצבע FM משולב בתוךשלפוחיות במהלך Exo-אנדוציטוזה הסינפטי. קשה לשמור על הכנסה של microelectrode באקסונים מבודדים לתקופות ממושכות כהיסחפות הקל שבקלים בעמדת האקסון גורמת אלקטרודה לסגת מהאקסון. זה עושה את זה קשה כדי לעורר את האקסונים לתקופה ממושכת באמצעות microelectrode. הקוטר הגדול האקסון (20-50 מיקרומטר) הופך אותו לקשה כדי לעורר באמצעות אלקטרודה גירוי טונגסטן. מכאן הגבוהה K + שימש לdepolarize אקסונים. יש לי מסופי presynaptic באקסונים reticulospinal קוטר של 1-2 מיקרומטר. Ca 2 + זרמים הם מקומיים לפרצוף שחרור הקרום במסופי presynaptic ולכן חיוני כדי למקד את מסוף presynaptic במדויק. לפיכך, דרישת מפתח להשגת ההקלטות הללו היא יכולת לתפעל את התנועה של עמדת פיפטה התיקון במיקרומטר במרווחים. Ca 2 + זרמים בקרומי פנים שחרור סינפטי כבר demonstratהעורך בסינפסות calyceal להיות קטן מאוד במשרעת, פחות מ0.5 הרשות הפלסטינית. מכאן הקלטות ערוץ אחד של Ca 2 + זרמים דורשים רמות רעש רקע נמוכות ביותר. רעש תרמי נמוך הושג עם מגבר Axopatch 200B וheadstage מקוררת. יתר על כן, מקורות זיהום רעש צריכים להיות מזוהים באופן שיטתי וחיסלו. טפטפות התיקון היו מפוברקת, מזכוכית aluminosilicate כדי להבטיח רעש נמוך שכן יש זכוכית זיהומים נמוכים ביותר והתנגדות גבוהה. טפטפות נוצרו כך שקוטר קצה פיפטה היה גדול יותר מאשר הקוטר של מסוף presynaptic וכך מקיף את מסוף presynaptic לחלוטין, שממדיה ניתן להבחין בבירור על ידי תיוג FM 1-43. זה הבטיח הקלטה מכל קרום הפנים שחרור. רעש קיבולי הופחת על ידי ציפוי פיפטה עם PDMS הקרוב לקצה ככל האפשר. חותמות gigaohm בקרומי מסוף presynaptic אינן יציבים לכל אורךiods וההקלטות האחרונות בדרך כלל למקסימום של 2 דקות. זה הופך את ההקלטות מאוד קשים להשיג שכן שיעור ההצלחה הנמוך מחייב מספר גדול של ניסיונות להשיג הקלטות מוצלחות. פתרונות הקלטה צריכים להיות מתוכננים כך שכל זרמים האחרים הידועים בקרום מסוף presynaptic כגון מתח מגודרת Na + K + וערוצים וCa 2 + K -activated + ערוצים חסומים, המאפשרים הקלטה של Ca 2 + זרמים. ישנן מספר מגבלות לשימוש במשטח הדביק פולי ליזין עם הכנה זו. אחת מהן הוא חוסר היכולת להזיז את המיקום הפיזי של החדר המכיל את ההכנה כי כל תנודות שיבשו את ההכנה. מגבלה נוספת של פני השטח דבקים נחשפה במהלך ניסויי אימונוהיסטוכימיה, כחתיכות סוף חוט השדרה מקורי ואת הזנב לאבד את ההידבקות כאשר הודגרו בparaformaldehyde 4%. יש לנו ניסינו coa דבק החלופיTings כגון Cell-Tak ונתקל בבעיות דומות. על מנת לפתור את הבעיות הללו, היינו דבק תפר הנוזל להדביק את ידיות חוט השדרה. הפרטים בנוגע לשימוש בדבק התפר נידונו במאמר יופיטר קודם על ידי חן ו22 פת'רסטון. סטי הדבק בקצב איטי יותר בפתרונות ללא יונים דו ערכיים ואנו ניצלנו רכוש ושבצעו את ההתנתקויות בפתרון של רינגר ללא Ca 2 + וMg 2 +. זה סיפק לנו זמן נוסף למניפולציה של הרקמה בתהליך הניתוק. אנחנו אימצנו גישה דומה לחן ו22 פת'רסטון באמצעות טפטפות תיקון ופה יניקה דרך צינור המחובר לפיפטה התיקון ליישם את הדבק על אזור היעד הספציפי על פני השטח דיסוציאציה קודם לביצוע הניתוק (סעיף פרוטוקול 5.2). ההתנתקויות בוצעו כמתואר לעיל, עם ההבדל היחיד הוא שג השדרהקצות ORD הוצמדו במהלך תהליך הניתוק בעדינות על ידי גרירת קצה ידית על הדבק העמיד בעבר (סעיף פרוטוקול 5.3). ברגע הניתוק הושלם, היון דו הערכי חופשי הפתרון של רינגר הוחלף הפתרון של רינגר המכיל Ca 2 + וMg יונים 2 + על ידי זלוף וההכנה היה מותר להתאושש ב10 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות על צלחת קירור ותרמית לפני שתמשיך לשלבים הבאים של אימונוהיסטוכימיה. המשמעות המרכזית של שיטה זו היא הבנה מדויקת של דרישת Ca 2 + לשחרור הנוירוטרנסמיטר, שלא נפתר לחלוטין, למרות עשרות שנים של מחקר. עלייה חולפת בpresynaptic [Ca 2 +] כבר נקבע כחיוני למפעיל שחרור בכל סינפסות. עם זאת, קונסנסוס הוא עדיין חסר במספר הערוצים 2 + Ca שתורם לrelea gating 2 + תחום Case. מדידה בו זמנית של זרמי Ca 2 + ומדידות קיבול בפרצוף שחרור הקרום של מסופי presynaptic פרט תניב תשובה חד משמעית לשאלה זו. יתר על כן, זה יאפשר הבהרה של מערכת היחסים העיתוי בין היתוך הכניסה ושלפוחית 2 + Ca presynaptic, המאפשר למידה מדויקת של עיכוב הסינפטי. נגישות בלתי מוגבלת לפרצוף שחרור הקרום במסופי presynaptic פרט מספקת את היכולת ליישם מספר גישות ניסיוניות שונות ללמוד רכיבים שונים של תהליך שחרור הנוירוטרנסמיטר. דוגמאות לגישות אלו כוללות הדמיה שלפוחית אחת באמצעות נקודות קוונטיות ללמוד איחוי שלפוחית הסינפטית. אירועי איחוי שלפוחית גם יכולים להיות מאופיינים באופן ישיר במסופי presynaptic על ידי מדידת שינויי קיבול קרום העומדים בבסיס אירועי איחוי שלפוחית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S.
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V.
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K.
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
