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Biology

Génération de Published: October 31, 2014 doi: 10.3791/51934
Automatic Translation
1
1Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

Summary

Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l'hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage.

Abstract

Bactéries prototrophes poussent sur M-9 minimal sels du milieu supplémenté avec du glucose (milieu M-9), qui est utilisé comme source de carbone et d'énergie. Auxotrophes peuvent être générés en utilisant une transposome. La, Tn 5 transposome -derived disponible dans le commerce utilisé dans ce protocole consiste en un segment linéaire d'ADN contenant une origine de réplication de R6K γ, un gène de résistance à la kanamycine et deux extrémités séquence mosaïque, qui servent de sites de liaison de la transposase. Le transposome, à condition que un complexe de protéine ADN / transposase, est introduit par électroporation dans la souche prototrophe, Enterobacter sp. UEE, et lui-même intègre de façon aléatoire dans le génome de cet hôte. Les transformants sont étalés sur réplique Luria-Bertani des plaques de gélose contenant de la kanamycine (kan-LB) et sur des plaques de gélose M-9 contenant de la kanamycine moyennes (M-9-kan). Les transformants qui se développent sur des plaques LB-Kan, mais pas sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes. Génomique purifiéL'ADN d'un auxotrophe est partiellement digéré, ligaturé et transformé en un pir + Escherichia coli (E. coli) souche. L'origine de réplication du plasmide R6Ky permet de se répliquer dans E. pir + coli et des souches, le marqueur de résistance à la kanamycine pour la sélection permet de plasmide. Chaque transformant possède un nouveau plasmide contenant le transposon flanquée par la région chromosomique interrompue. Séquençage Sanger et le Local Alignment Search Tool base (BLAST) suggèrent une identité putatif du gène interrompu. Il ya trois avantages à utiliser cette stratégie de mutagenèse de transposome. Tout d'abord, il ne repose pas sur l'expression d'un gène de la transposase de l'hôte. En second lieu, la transposome est introduit dans l'hôte cible par électroporation, plutôt que par la conjugaison ou par transduction et est donc plus efficace. Troisièmement, l'origine de réplication R6Ky, il est facile d'identifier le g mutéène, qui est partiellement récupéré dans un plasmide recombinant. Cette technique peut être utilisée pour étudier les gènes impliqués dans d'autres caractéristiques de Enterobacter sp. UEE ou d'un plus grand nombre de souches bactériennes.

Introduction

Bactéries prototrophes poussent dans M-9 sels milieu minimal contenant du glucose (milieu M-9), la conversion du glucose à travers les voies du métabolisme central du carbone pour produire des précurseurs, tels que des acides aminés, des acides nucléiques et des vitamines, pour une biosynthèse. M-9, le milieu contient du chlorure d'ammonium comme source d'azote, du sodium et du phosphate de potassium comme source de phosphore et un tampon, le sulfate de magnésium en tant que source de soufre et du glucose comme source de carbone et d'énergie. Luria-Bertani (LB) est riche en acides aminés de tryptone et en vitamines et facteurs de croissance à partir de l'extrait de levure. Il favorise la croissance des auxotrophes qui ne peut pas synthétiser les acides aminés, les vitamines et d'autres facteurs de croissance nécessaires à la croissance sur le milieu M-9. Ainsi, prototrophes va croître dans LB et M-9 moyen, alors que auxotrophes vont grandir dans un milieu LB mais pas dans M-9 moyen. En introduisant des mutations dans une population de bactéries prototrophique et l'identification des gènes mutés qui causent des phénotypes auxotrophes, il est possible d'obtenir une meilleure compréhension du métabolisme dans une souche bactérienne.

Mutagenèse par transposon peut être utilisée pour identifier un grand nombre des gènes nécessaires à la croissance sur glucose en milieu M-9. Les transposons se insère au hasard dans le génome de l'hôte 2. En détectant les transformants de transposon sur des plaques de gélose LB et réplique les étalant sur des plaques de milieu M-9 de gélose, il est possible de cribler des mutants auxotrophes. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage de gène. Cette étude utilise un Tn 5 disponible dans le commerce -derived transposome qui est expédié à partir d'une solution d'un segment d'ADN du transposon linéaire en mélange avec de la protéine de transposase. Le segment d'ADN dépourvu d'un gène de transposase, mais qui contient un gène de résistance à la kanamycine, une origine de réplication de R6K et γ deux motifs en mosaïque qui sont des séquences d'ADN de la transposase de liaison à chaque extrémité du segment 3,4. Étant donné que la protéine de transposase est ajouté directement à l'ADN, le segment d'ADN seulest défini comme le transposon, et le complexe de protéine ADN / transposase est définie comme la transposome. Le transposome est transformé par électroporation 5 dans un hôte sensible à la kanamycine (Figure 1A). Les colonies qui croissent sur ​​des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine (LB-Kan) présentent des inserts de transposons (Figure 1b), et les répliques plaqué les transformants qui ne parviennent pas à se développer sur les M-9 des plaques d'agar de milieu contenant de la kanamycine (M-9-kan) sont auxotrophes (Figire 1C). L'ADN génomique à partir d'un mutant est purifié et digéré partiellement par la 4-base endonucléase de restriction de coupe, de FBu CI (figure 1D). L'ADN ligaturé est transformé dans une souche d'Escherichia coli (E. coli) qui contient le gène pir (Figure 1E). Ce gène permet à la nouvelle plasmide contenant le transposon et d'accompagnement hôte région chromosomique à se répliquer dans E. coli 6. Le gène de résistance à la kanamycine sert aussimarqueur éligible pour le nouveau plasmide. Finalement, le séquençage en utilisant des amorces complémentaires à chaque extrémité du transposon et Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse de la séquence 7,8 résultante sont utilisés pour déterminer l'identité des gènes interrompus.

Cette stratégie de mutagenèse transposome offre trois avantages 3. Tout d'abord, étant donné que la protéine de transposase est lié directement à la transposon, l'insertion ne dépend pas de l'expression du gène de la transposase dans l'hôte. Une fois que le transposon est incorporé dans le génome de l'hôte, la transposase est dégradée, ce qui empêche un mouvement supplémentaire du transposon. Cependant, le mouvement supplémentaire ne peut être évité si l'hôte possède une Tn 5 élément transpositionnel endogène. D'autre part, mise en place de la transposome par électroporation, il est possible de l'utiliser dans une grande variété d'hôtes. Elle élimine également la nécessité d'introduire le transposon par la conjugaison bactérienne ou par viinfection RAL. Les deux procédés nécessitent susceptibilité de l'hôte. En troisième lieu, l'insertion du gène de résistance à la kanamycine et l'origine de réplication de R6K γ dans la transposome rend plus facile d'identifier le gène interrompu. les régions de transposons interrompue peuvent être stockées sous forme de plasmides et séquences, ce qui élimine la nécessité d'utiliser la réaction en chaîne de la polymérase inverse (PCR) pour l'identification du gène.

Le protocole présenté dans cette vidéo décrit chaque étape de mutagenèse par transposon de Enterobacter sp. UEE 9 en utilisant un transposome de son introduction dans les cellules bactériennes à l'identification du gène putatif il interrompu. En plus des protocoles précédemment publiés 3,4,10, des méthodes détaillées pour l'utilisation des répliques à l'écran pour auxotrophes sont présentés. Cette technique de mutagénèse peut être utilisée pour l'étude d'autres phénotypes, tels que les antibiotiques et les résistances métalliques, dans différents types de bactéries, pour identification le nombre minimal de gènes nécessaires à la croissance dans des conditions de culture définies dans les études de la biologie synthétique, ou pour enseigner une composante de laboratoire de génétique ou d'un cours de physiologie microbienne.

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Protocol

1. L'électroporation de cellules compétentes 5,11

  1. Diluer une culture O / N LB de Enterobacter sp. UEE 20.1 dans 50 ml de milieu LB frais et croître avec secousses à 120 tpm et 30 ° C jusqu'à une DO (600 nm) entre 0,4 et 0,6. Eventuellement, d'autres souches bactériennes se développer à leur température optimale de croissance.
  2. Refroidir les cellules sur de la glace pendant 5 min et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min.
  3. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 50 ml d'eau glacée stérile et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min. Répétez cette étape.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un volume d'eau glacée égal au volume du culot cellulaire. Pour le stockage à long terme, laver les cellules avec 10 ml de glace froide 10% (v / v) de glycérol, remettre en suspension dans un volume de granulés égal de glace froid 10% (v / v) de glycérol, conserver à -80 ° C, et le dégel sur la glace avant l'électroporation.
  5. Ajouter 0,5 pi de la transposome à 40 pi decellules. La solution de transposome disponible dans le commerce est fourni à une concentration d'ADN de 0,33 ug / ul. Bien 0,33 mg est recommandée, 0,165 pg d'ADN est suffisante.
  6. Placer le mélange cellules / transposome dans un froid de glace, 0,2 mm, cuvette d'électroporation et appuyez sur le mélange au fond de la cuvette. Choquer les cellules à 25 pF, 200 Ω, et 2,5 kV. Pour veiller à ce que les cellules restent refroidis, rangez les cuvettes d'électroporation dans un congélateur à -20 ° C avant utilisation.
  7. Immédiatement, ajouter 960 ul de filtre stérilisés super bouillon optimale avec la répression catabolique (SOC) moyen. Mélanger par pipetage de haut en bas et de transférer les cellules à 1,5 ml d'un tube de microcentrifugation stérile.
    NOTE: Les cellules commencent à mourir après le choc, mais le sel dans le milieu SOC leur permet de récupérer. Pour économiser, il est nécessaire d'ajouter transposome ou de choquer les cellules témoins négatifs. Il suffit d'ajouter 960 ul de milieu SOC stérile à elle.
  8. Incuber les cellules à 30 ° C fou de 45 à 60 min sous agitation à 120 tours par minute. Ceci permet d'obtenir le temps de transposome à recombiner avec le génome de l'hôte et pour les cellules à exprimer la résistance à la kanamycine.
  9. Étaler 100 pi de cellules sur une plaque de gélose LB-kan et incuber la plaque O / N à 30 ° C. Stocker le mélange de transformation restant dans le réfrigérateur à 4 ° C. Étaler montants supplémentaires à une date ultérieure jusqu'à 2 semaines après l'électroporation initial si nécessaire.

2. Maillage des transformants

  1. Bande d'une grille sur le couvercle d'une boîte de 100 x 15 mm de Pétri vide. Copier une grille de "A Short Course en bactérienne génétique" 12.
  2. Tracez une ligne sur le fond d'une plaque de gélose LB-kan. Utilisez un petit morceau de ruban adhésif pour l'ancrer sur le couvercle en grille pour que la grille est visible à travers l'agar-agar. Assurez-vous que la ligne sur la base de la plaque soit aligné avec le haut, au centre de la grille. L'ancrage de la plaque avec du ruban adhésif empêche de glisser, permettant même maillage. La ligne facilite l'identification de la colonie, après des répliques.
  3. Choisissez un seul transformant avec un cure-dent stérile et repérer dans le centre d'un carré de la grille. Il suffit de toucher la colonie et l'endroit. Ne pas creuser le cure-dent dans la gélose. Pour éviter de contaminer la plaque, gérer le cure-dent à une seule extrémité.
  4. Découvrir un autre transformant dans une case adjacente comme dans l'étape 2.3. Lorsque la plaque est pleine, incuber O / N à 30 ° C. Ceci est la plaque de maître.

3. des répliques pour déterminer le phénotype Auxotrophe 12

  1. Pour chaque plaque qui ont été quadrillées, faire une pile de trois nouvelles plaques d'agar numérotés de un à trois: un pour LB-kan, deux M-9-kan et trois pour LB-kan. Sécher les plaques à l'envers, O / N à 37 ° C avant utilisation.
  2. Tracez une ligne sur le dessus de chaque plaque comme dans l'étape 2.2.
  3. Essuyez l'outil réplique de placage avec 70% d'éthanol, placer un carré de velours stérile sur le dessus de la réplique de placageol et serrer le carré de velours vers le bas. Mains sont pleines de microbes, même après les avoir lavées. Empêcher l'introduction de contamination par les microbes manipulation du carré de velours par son bord.
  4. Alignez la ligne sur la plaque de maître avec une ligne tracée sur la fixation et placez la plaque sur le dessus du carré de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque à la place de velours. Veillez à ne pas salir les bactéries. Retirer la plaque de maître de la place du velours.
  5. Alignez la ligne tracée sur la plaque numéro un avec la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la place du velours à la plaque. Retirer la plaque numéro un.
  6. Jeter le carré de velours dans un bécher d'eau et placer un carré de velours propre, stérile sur l'outil réplique de placage à l'étape 3.3. Cette étape évite la sur-inoculation qui provoque la croissance de la percée et des résultats faussement positifs.
  7. Aligner laligne sur plaque numéro un avec la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la nouvelle place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque numéro un à la place de velours. Retirer la plaque numéro un.
  8. Alignez la ligne tracée sur la plaque numéro deux, la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la place du velours à la plaque numéro deux. Retirer la plaque numéro deux.
  9. Répétez l'étape 3.8 pour plaque numéro trois. La troisième plaque est une commande pour un transfert complet de la plaque maîtresse pour les deux autres plaques. Jeter le carré de velours dans un bécher d'eau. Pour réutiliser les carrés de velours, l'autoclave le bécher contenant les carrés de velours contaminés, les laver, les sécher, les envelopper dans du papier aluminium et re-autoclave eux.
  10. Incuber les plaques à 30 ° CO / N. Les colonies qui se développent sur les deux plaques de gélose LB-Kan, mais ne parviennent pas à se développer sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes (
  11. Streak sur auxotrophes de plaque numéro un sur une plaque de gélose LB frais-kan, et incuber la plaque à 30 ° CO / N.
  12. Streak à l'isolement 3 colonies de la plaque de série à l'étape 3.11 sur une plaque LB-kan frais. Incuber la plaque à 30 ° CO / N. Cela garantit que le mutant est bien isolé. Divisez la plaque en tiers et série sur chaque colonie dans une section.
  13. Coin de colonies provenant des colonies striées à 3,12 dérivés de l'étape sur une plaque de LB-Kan fraîche pour former une grille comme dans les étapes 2.1 à 2.4. Chaque mutant est re-testé en triple.
  14. Reproduire à nouveau la plaque comme dans les étapes 3.1 à 3.10 pour confirmer le phénotype auxotrophe.

4. Gene sauvetage

  1. Cultiver un 3 ml O / N culture d'une colonie isolée à partir de l'étape mutant 3,13 en milieu liquide LB-Kan à 30 ° C. Purifier l'ADN génomique à partir de 1 ml de la culture en utilisant un kit de purification d'ADN génomique disponibles dans le commerce.
  2. Mettre en place un mélange de 0,025 UBFU CI endonucléase de restriction et 14 ul de 1 ug / ul d'ADN génomique dans un volume réactionnel de 20 ul sur de la glace. Depuis FBu CI coupe le transposon à douze sites différents, il peut être plus efficace d'utiliser l'endonucléase de restriction BFA I ou III Hae, qui coupe le transposon à deux et trois sites différents, respectivement.
  3. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 25 min et ensuite à 80 ° C pendant 20 min pour inactiver l'enzyme. Analyser 3 pl de l'ADN partiellement digéré sur un gel d'agarose à 0,8% (figure 3). A réussi la digestion partielle à un test de plus de 10 ko vers le bas du gel.
  4. Ligaturer 15 pl de l'ADN génomique partiellement digéré en utilisant 800 unités d'ADN ligase T4 dans une réaction de 500 ul. Incuber la réaction O / N à 4 ° C. Le grand volume de réaction maximise la ligature de fragments simple pour eux-mêmes et minimise les interactions entre deux ou plusieurs fragments d'ADN.
  5. Précipitate l'ADN lié par addition de 50 ul d'acétate de sodium 3 M, pH 5,5, et 1 ml d'éthanol à 95% et en incubant à -20 ° C pendant 20 min.
  6. Microfuge l'ADN à 4 ° C et 13 500 g pendant 10 min, laver le culot avec 70% d'éthanol, le sécher dans un concentrateur sous vide centrifuge, et remettre en suspension dans 10 pi d'eau sans nucléase. En variante, l'ADN peut être séché à l'air à température ambiante pendant 15 min.
  7. Utilisez 4 pl d'ADN remis en suspension pour transformer E. coli souche pir ou ECD100D ECD100D pir116 par électroporation de l'article 1. L'origine de réplication γ R6k nécessite une souche bactérienne avec un gène pir pour reproduire 6. Les résultats de la souche pir dans les plasmides de copie bas, et la souche pir116 contient un gène mutant pir qui se traduit par des plasmides élevé de copies. Chaque transformant contient un plasmide nouveau avec le transposon et d'une région du chromosome d'interruption (Figure 1E).
  8. Inoculmangé 5 ml de milieu LB-Kan avec une seule colonie, cultiver O / N avec agitation à 120 rpm et 37 ° C, et on purifie l'ADN de plasmide à partir de l'ensemble O / N culture en utilisant un kit commercial.
  9. Digérer 14 ul du plasmide en utilisant l'endonucléase de restriction Xho I. Assurez-vous que le volume final de la réaction est de 20 pi. Cette enzyme reconnaît un site au milieu du transposon à l'extrémité 5 'du gène de résistance à la kanamycine. Analyse 10 ul de la non digéré et digéré le plasmide sur un gel d'agarose à 0,8% (figure 3). Le plasmide est constitué de l'ADN de l'hôte 2 de transposon flanquant ainsi kb.

5. Séquençage de l'ADN

  1. La séquence du plasmide en utilisant un kit disponible dans le commerce de séquençage, des amorces qui sont homologues à chaque extrémité du transposon et d'un système d'analyse de séquençage capillaire. Alternativement, le plasmide peut être expédiée à une institution extérieure pour le séquençage.
  2. Utilisez le standard de poids moléculaire (1 kb ladder) dansle gel d'estimer la taille du plasmide. Ensuite, estimer le nombre de nanogrammes (ng) de plasmide qui est nécessaire pour 50 fmol.
  3. Mesurer la concentration de l'ADN plasmidique en utilisant un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 260 nm (260 A) et 280 nm (A 280). Veiller à la longueur du trajet de la lumière à travers la cuvette est de 1 cm. Déterminer la concentration en multipliant l'absorbance à 260 nm par 50 ng / pl. ADN plasmidique de qualité aura un A 260 / A 280 rapport entre 1,8 et 2,0.
  4. Le volume de l'ADN requis pour chaque réaction de séquençage est le nombre de ng de 50 fmol requis divisé par la concentration du plasmide. Mélanger le volume requis de plasmide avec de l'eau pour porter le volume total à 10 ul.
  5. Chauffer le mélange ADN de plasmide / eau à 96 ° C pendant 1 min, puis refroidir à TA.
  6. Ajouter 8 pi de mélange maître de la trousse de séquençage et 2 pi de 1,6 M de l'une des amorces de séquençage.
  7. Folbas le protocole du kit de séquençage pour le programme du thermocycleur et la réaction de nettoyage.
  8. Analyser chaque échantillon en utilisant un système d'analyse d'ADN de capillaire.
  9. Utilisez un logiciel disponible dans le commerce pour voir la séquence d'ADN. Recherche de la séquence », 5'-GAGACAG-3 '", qui est la 7 dernières pb de la transposon (figure 4). La séquence avant de l'extrémité 5 'de ce segment 7 pb appartient au transposon. La séquence après l'extrémité 3 'de ce segment 7 pb appartient au gène interrompu.
  10. Déterminer la fonction possible du gène interrompu à l'aide du Local Alignment Search Tool (de BLAST) 7,8 de base. Utilisez la suite link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Coller la séquence de l'interruptiongène ed dans la boîte de recherche, sélectionner "Autres" sous la base de données et cliquez sur "BLAST" au bas de la page. Lorsque le résultat apparaît, faites défiler la page pour afficher les résultats de l'alignement (Figure 5).

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Representative Results

Transformation de Enterobacter sp. UEE par électroporation avec le transposome initié insertion du génome aléatoire dans le génome de l'hôte (Figure 1A, B). Une électroporation réussie a donné plusieurs milliers de transformants qui se sont développées sur des plaques LB-Kan. Pour obtenir 300-400, colonies par plaque bien espacées, la quantité de mélange transformation propagation sur chaque plaque de gélose LB-kan a été optimisé. Chaque transformant contenait au moins un insert de transposon, mais on ne sait pas si un gène important pour la croissance sur milieu M-9 a été interrompue sans dépistage par des répliques. Les transformants ont été transférés sur des plaques LB-Kan frais dans les réseaux de 88 et réplique plaquée sur M-9 moyen. Notez, faire en sorte que le transposon est maintenue dans les transformants, la section Protocoles recommande d'ajouter à la kanamycine les M-9 des plaques de milieu. Le milieu M-9 n'a pas été complété avec de la kanamycine dans ce cas, mais il était encore possible d'obtenir auxotrophes sans elle. Dans (figure 1C). Les 86 autres colonies n'a pas eu d'interruption dans un gène qui est nécessaire pour une croissance sur milieu M-9 minimal.

Certaines colonies peuvent avoir été contaminés par des colonies adjacentes au cours des répliques. Pour isoler un mutant comme une culture pure, il a été rayé du numéro de plaque LB-kan un à l'étape 3.1 sur une plaque de gélose LB-kan frais et cultivé O / N à 30 ° C. Trois colonies qui se sont développées ont été tracées sur une seconde plaque LB-kan frais et cultivés O / N à 30 ° C. Puis, une colonie qui a surgi de chacune des trois colonies a été repéré sur une troisième plaque LB-kan frais. Des répliques en arrière sur un M-9 medi minimalum plaque vérifiée en trois exemplaires le phénotype auxotrophe qui a été observé dans la figure 2. Sur les 1 760 transformants de transposons projetés dans un cours 2013 physiologie microbienne, 23 étaient auxotrophes.

Le gène interrompu par un auxotrophe a ensuite été identifié à l'aide de sauvetage de gène. Une colonie auxotrophe de la seconde plaque de série ci-dessus (étape 3.13) a été cultivée O / N dans du milieu LB-Kan, et on a purifié l'ADN génomique à partir de la culture en utilisant un kit de purification d'ADN génomique. Une électrophorèse sur gel d'agarose a montré que l'ADN purifié a été de plus de 10 kb (figure 3, piste 2). Pour briser l'ADN génomique en fragments plus petits qui contenaient le transposon et de flanc interrompu régions d'accueil (Figure 1D), il a été partiellement digéré avec 0,025 unités de FBu CI pendant 25 min à 37 ° C. Cette restriction endonucléase coupes à 5'-GATC-3 'des sites qui se produisent environ tous les 200 à 500 paires de bases. Même si ilDouze 5'-GATC-3 sites «Dans le transposon, un grand nombre de fragments contenant le transposon intact et d'accompagnement génome de l'hôte sera toujours présente dans l'ADN partiellement digéré. La piste 3 de la figure 3 montre partiellement digéré l'ADN génomique avec un frottis à partir de l'ADN de plus de 10 kb, tout le chemin vers le bas du gel au-dessous de 0,5 kb. Si le test de l'ADN commence en dessous de 2 ko, la taille du transposon, puis l'ADN a été digéré trop. Il sera nécessaire de diminuer la quantité d'enzyme ajoutée, le temps à 37 ° C d'incubation, ou les deux. Si il n'y a pas frottis et la voie avec l'ADN digéré est la même taille que l'ADN avec l'ADN non digéré, alors pas de digestion est survenue. Il sera nécessaire d'augmenter la quantité d'enzyme ajoutée, le temps d'incubation de 37 ° C ou les deux. Au lieu d'utiliser de FBu CI, il peut être possible d'utiliser les endonucléases de restriction Bfa I ou Hae III, ce qui a coupé le transposon à deux et trois sites différentsrespectivement. L'utilisation de l'une de ces enzymes peut augmenter le E. coli pir + transformation rendement au cours de sauvetage de gène.

L'ADN partiellement digéré a été ligaturé dans une réaction de 500 ul. Cette augmentation de volume réduit au minimum les interactions entre d'autres fragments d'ADN et de maximiser la probabilité que chaque fragment ligaturé avec lui-même pour former une molécule circulaire. L'ADN ligaturé a été précipité et transformé par électroporation dans E. coli pir116 souche ECD100D. Le mélange de transformation a été étalé sur des plaques LB-Kan. Les colonies qui se sont développées contenaient un nouveau plasmide constitué du transposon et d'une région du gène de l'hôte d'interruption (Figure 1E). Le nombre d'unités formant des colonies varie de 0 à 2000 par ml de mélange de transformation. Si la région chromosomique flanquant codait pour une protéine qui est toxique pour le E. coli hôte, l'efficacité de transformation est faible ou seulement un petit segment de la chromoune partie a été associée avec le nouveau plasmide. L'ADN plasmidique a été purifié à partir d'une culture qui a été inoculé avec une seule cellule transformée et digéré par l'endonucléase de restriction, Xho I, qui reconnaît un site unique dans le centre du transposon près de l'extrémité 5 'du gène de résistance à la kanamycine. La piste 4 de la figure 3 contient le plasmide non digéré et la piste 5 contient le plasmide digéré. Parce que l'ADN plasmidique purifié a tendance à être super-enroulé, il a émigré à un rythme plus rapide que le même brin d'ADN linéaire digéré. La taille correcte de ce plasmide était de 3 kb. Il contenait 2 kb du transposon, plus d'environ 1 kb du gène de l'hôte interrompue. Si l'ADN d'hôte flanquantes contient un ou plusieurs sites de reconnaissance Xho I, deux ou plusieurs bandes de plasmides seront observés dans le couloir avec Xho I de l'ADN digéré.

La figure 4 montre un résultat de séquençage pour un plasmide qui a été isolé à partir d'un auxotrophe. Après avoir retiré le short séquence du transposon en gras, la séquence d'ADN de l'hôte a été soumis pour Local Alignment Search Tool base (BLAST) analyse de 7,8. L'un des résultats de BLAST ont suggéré que la séquence d'interruption est similaire à une sous-espèce Enterobacter cloacae. cloacae NCTC 9394 (emb | FP929040.1 |) gène de la chorismate mutase, qui est impliqué dans la biosynthèse de la L-tyrosine et L-phénylalanine (figure 5) 13. Parfois, au cours de la ligature de l'ADN génomique partiellement digéré, le transposon linéaire ligature à un ou plusieurs autres fragments de FBu CI. Cela peut rendre le BLAST résultats confus parce que l'identité d'un gène change brusquement. Par exemple, les 41 premières paires de bases de l'autre auxotrophe correspondent à un gène pour la glutamate déshydrogénase-5-semialdéhyde qui est impliquée dans la biosynthèse de la proline 1. Ensuite, les 219 paires de bases à venir en correspondance avec un gène pour une sous-unité ribonucléoside-diphosphate réductase, suivi d'un segment de 62 paires de base de lipide-A-DISACC kinase haride. La dernière 295 paires de bases secteur correspond au glutamate-déshydrogénase semi-aldéhyde 5 fois. La présence de 5'-GATC-3 sites 'de FBu CI suggéré que deux petits fragments d'ADN ligaturés dans le plasmide secouru. Ainsi, la dilution de l'ADN partiellement digéré pour des réactions de ligature ne l'élimine pas complètement bruit de fond provoqué par la ligature de fragments plus petits. A partir de ces résultats, il a été conclu que la transposome lui-même inséré dans le gène de la glutamate-5-semi-aldéhyde déshydrogénase, car la séquence de ce gène est immédiatement adjacent au transposon. Autres auxotrophes contenaient des interruptions dans le gène de la bêta cystathione lyase impliquée dans la biosynthèse de méthionine; pour histidinol déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse de l'histidine; pour la phosphosérine phosphatase impliquée dans la sérine, la glycine, la cystéine et la biosynthèse; et pour réductoisomérase cétol-acide impliqué dans la leucine, l'isoleucine et la valine biosynthèse 1.

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Figure 1. mutagenèse par transposon. (A) des cellules bactériennes contenant un gène qui est nécessaire pour la croissance sur M-9 sels milieu minimal contenant du glucose. Le M-9 encadrée représente un gène auxotrophe. (B) Le transposome est introduit dans la souche bactérienne par électroporation, et la protéine de transposase lié à chaque extrémité de la mosaïque (flèches) insère au hasard du transposon dans le chromosome de l'hôte 3,4. Seulement transposon contenant transformants poussent sur ​​des plaques de milieu LB-Kan. (C) Les transformants sont réplique plaquée sur M-9 milieu contenant du glucose et sur ​​milieu LB-kan. Les transformants qui ne grandissent (barrée) sur M-9 milieu contenant du glucose sont auxotrophes. (D) ADN génomique est purifié à partir des auxotrophes et est partiellement digéré par le cutt 4-baseer, FBu CI, qui reconnaît le site de l'ADN, 5'-GATC-3 '. (E) L'ADN partiellement digéré est traité à la T4 DNA ligase et transformé par électroporation dans E. coli souche pir ECD100D pour former un nouveau plasmide contenant le transposon et le gène chromosomique d'interruption qui est nécessaire pour une croissance sur milieu M-9. Le gène pir permet de fragments d'ADN circulaire contenant l'origine de réplication de R6K γ dans le transposon pour servir une origine de réplication dans le nouveau plasmide 6. Le gène de résistance à la kanamycine sert de marqueur sélectionnable pour le nouveau plasmide. Le plasmide est purifié, et une séquence de pb ~ 500 du gène interrompu est déterminée en utilisant des amorces (flèches) qui sont homologues à chaque extrémité du transposon. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2. des répliques. (A) Grille de transformants qui ont été transférés à une plaque de gélose LB-kan. (B) Grille des mêmes transformants qui ont été transférés à une plaque de milieu M-9. Auxotrophes ont augmenté sur les plaques LB-Kan, mais pas sur les M-9 plaques de milieu. Ils sont identifiés par des carrés noirs. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. 0,8% gel d'agarose Lane 1:. 1 kb échelle. Piste 2: ADN génomique non digérée. Lane 3: FBu C Je partiellement digéré l'ADN génomique. Lane 4: non digérée plasma sauvéid. Lane 5: plasmide Xhol digérés sauvé.

Figure 4
Figure 4. séquence partielle d'ADN d'un plasmide. La séquence en gras fait partie du transposon et n'a pas été soumis à une analyse BLAST. Le reste de la séquence est un segment de gènes sauvés de l'hôte.

Figure 5
Figure 5. Analyse BLAST 7,8. A partir de la première base (requête), le gène interrompu semble coder pour une chorismate mutase Enterobacter cloacae, impliqué dans la biosynthèse de la phénylalanine et de la tyrosine.

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Discussion

Mutagenèse utilisant un transposon transposome est un outil efficace pour générer auxotrophes à Enterobacter sp. Bactéries positives YSU et d'autres types de bactéries Gram négatif et Gram 3,4. Le processus a été initié par l'introduction de la Tn 5 transposome -derived dans l'hôte par électroporation. Pour identifier les colonies avec des inserts, la souche non transformée de cible doit être sensible à la kanamycine afin de sélectionner pour le marqueur de résistance porté par le transposon. Certains hôtes produisent des endonucléases de restriction qui dégrade l'ADN du transposon avant qu'il puisse se recombiner avec le génome de l'hôte. L'addition d'un inhibiteur d'endonucléase de restriction pour le mélange d'électroporation peut minimiser la dégradation et augmenter le rendement de transformation 3. Lors de la préparation électroporation des bactéries compétentes, il était important d'enlever autant de sel que possible pour éviter un arc électrique ou une étincelle qui tue les bactéries causées par la présence de sel. Même en l'absence deun arc électrique, les cellules ont commencé à mourir rapidement après les choquer. L'ajout du sel contenant du milieu de croissance de SOC immédiatement rétabli l'équilibre osmotique, la mort cellulaire réduite au minimum et une efficacité accrue de 5 transformation. Les transformants résistant à la kanamycine ont ensuite été déposés sur une plaque LB-kan frais et réplique plaquée sur M-9, de milieu minimal gélose. Pour éviter une sur-inoculation qui peut entraîner des résultats faussement positifs qui manquent auxotrophes possibles, des carrés de velours sont passés à l'étape 3.6 avant que le reste des plaques ont été inoculés. Puis, au cours des répliques, juste assez de pression a été appliquée pour transférer les colonies sans provoquer de bavures ou de contamination entre les colonies voisines.

Les gènes mutés dans les auxotrophes ont été identifiés par le sauvetage de gène. L'ADN génomique de chaque auxotrophe a été cisaillé en utilisant une digestion partielle avec la fréquente base coupe de FBu C I. digestions partielles à l'aide Bfa I ou Hae III, qui a coupé le transposon moins fréquemment, peut améliorer transposon efficacité de transformation. Il est également possible d'utiliser une digestion complète avec d'autres endonucléases de restriction, 6 et 8 à base à base de fraises, qui manquent de sites à l'intérieur du transposon. L'ADN digéré a été ensuite ligaturé et transformé dans E. coli souche ECD100D pir ou ECD100D pir116 6. Bien que le E. coli souche pir116 a été transformée par électroporation à l'étape 4.8, il est également possible d'utiliser des cellules chimiquement compétentes. Dans ce cas, la transformation tout devrait être réparti à obtenir une large sélection de plasmides récupérés. Le gène pir permet de transposon circularisée à reproduire comme un faible nombre de copies du plasmide, et le gène mutant pir116 permet de reproduire une copie plasmide élevé. De faibles rendements de transformation à l'aide de la souche pir116 peut être due à l'expression des produits des gènes toxiques à partir de l'hôte d'origine. La toxicité peut être réduite en utilisant la copie bas de la souche pir peut faire séquençage plus difficile.

Le séquençage du génome 10 et le séquençage PCR 14 sont des méthodes alternatives à la rescousse de gène. Le procédé de séquençage génomique des séquences flanquant les régions chromosomiques directement à partir d'ADN génomique purifié. Cette stratégie est utile lorsque le génome de l'organisme cible a déjà été séquencé. Une fois que la région mutée a été identifié par séquençage génomique et BLAST, l'ensemble de la région peut être amplifié par PCR et clone pour d'autres analyses. La méthode PCR utilise deux réactions PCR et quatre amorces différentes. Les premiers couples de réaction d'une amorce homologue de transposon (amorce 1) avec une amorce dégénérée qui contient un court ADN, la séquence de lieur (amorce 2). La seconde réaction de PCR est une réaction de PCR nichée, l'appariement homologue autre transposon amorce (amorce 3 ') avec une amorce de séquence de liaison homologue (amorce 4). Le site d'amorçage pour l'amorce 3 estsitué sur le côté 3 'du site d'amorçage pour l'amorce 1. Puis, à partir de la amplicand seconde réaction de PCR a été nettoyé et séquence. Ce procédé de séquençage automatisé de l'ADN amplifie directement à partir des cellules mutantes, ce qui élimine la nécessité à la fois la purification de l'ADN génomique et plasmidique sauvetage.

Au lieu d'identifier des gènes impliqués dans l'auxotrophie, mutagenèse par transposon peut également être utilisé pour étudier d'autres phénotypes facilement dosés. Enterobacter sp. UEE est une souche bactérienne résistant multi-métal qui est également résistant à 100 ug / ml d'ampicilline (données non publiées). Sa concentration minimale inhibitrice (CMI) de HgCl2 est de 70 pM, ZnCl2 est de 800 uM, AgNO 3 est de 80 uM et NaAsO 2 9 est de 14 mm. Après l'introduction de la transposome dans cette souche et de maillage transformants sur des plaques LB-Kan, les colonies peuvent être maillées réplique étalées sur un milieu contenant de métaux à des concentrations inférieures à la CMI de cette bactesouche rial. Le sauvetage et le séquençage d'un gène interrompu à partir d'un mutant avec une MIC réduit peut révéler un gène qui confère une résistance à l'un de ces métaux.

En plus de la génération de mutants, la transposome peut être utilisé comme un vecteur in vitro ou in vivo pour déterminer le gain de la fonction de gènes, telles que la résistance aux antibiotiques ou en métal. Pour la stratégie in vitro, l'ADN génomique de Enterobacter sp. UEE est digéré par une endonucléase de restriction qui reconnaît des sites extérieurs du transposon. L'ADN est ligaturé et mélangé avec le transposome dans un tampon contenant du Mg2 +. Après recombinaison entre le transposon et des fragments génomiques au hasard, E. coli souche pir ECD100D est transformée avec l'ADN et étalée sur des plaques contenant de l'ampicilline ou un sel de métal. Les colonies qui se développent posséderont un nouveau plasmide contenant le transposon située près du gène de la résistance de l'hôte. Pour la st in vivoratégie, Enterobacter sp. UEE est transformée avec le transposome. Puis, toute la réaction de transformation est cultivé en milieu liquide LB-kan à sélectionner pour une grande population avec des inserts de transposons aléatoires. L'ADN génomique est digéré par une endonucléase de restriction qui reconnaît des sites à l'extérieur du transposome, ligaturé et transformé dans E. coli souche pir de ECD100D. Comme dans le procédé in vitro, les transformants sont étalés sur des plaques d'ampicilline ou de métal. Encore une fois, le plasmide résultant sera constitué du transposon inséré à côté d'un gène de résistance. Ces deux stratégies ne peut réussir que si le gène de résistance de la cible peut être exprimé et est actif dans le E. souche de E. coli.

Mutagenèse par transposon peut être utilisé pour identifier le nombre minimum de gènes d'une souche bactérienne de 15,16 nécessite de croissance. Deux transposomes contenant des sites loxP et différents marqueurs de résistance aux antibiotiques sont nécessaires pour cette stratégie ina souche bactérienne avec une séquence connue du génome. Après les deux transposons intégrer, exprimée recombinase cre catalyse une réaction de recombinaison entre les deux sites loxP, l'élimination des régions chromosomiques entre les insertions de transposons. La connaissance de la séquence du génome, il est possible d'identifier des gènes qui sont éliminés. La capacité à se développer démontre que les gènes éliminés ne sont pas nécessaires pour la croissance. Cette technique nécessite beaucoup de travail, et un génome minimal pour la croissance en utilisant cette stratégie n'a pas encore été achevée. Cependant, une étude de mutagénèse de transposon automatisé de Pseudomonas aeruginosa en utilisant le séquençage PCR estime que 300 à 400 gènes ont été nécessaires pour la croissance de cette bactérie en milieu riche 14. Cette étude n'a pas utilisé le système de recombinase loxP / cre.

Les microbes avec des génomes minimaux sont utiles pour la biologie synthétique 17. Une souche bactérienne avec un génome minimal est especiallY utile pour éliminer la production de sous-produits indésirables. Par exemple, Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) est utilisé pour produire des biocarburants, le butanol 18. Au cours de sa croissance, cette souche produit du butanol à la fin de la phase exponentielle de croissance juste avant son entrée dans la phase stationnaire. À ce stade, il devient sensible à butanol et d'autres produits de fermentation et forme endospores dormants qui cessent de faire la synthèse produit. Depuis transposomes ont été utilisées pour étudier Clostridium perfringens 3, il peut être possible d'utiliser un système transposome / loxP / CRE recombinase similaire à la construction d'une souche de C. acetobutylicum qui n'a pas les gènes codant pour les produits de fermentation indésirables et sporulation, mais contient les gènes pour la plus grande tolérance au butanol. Cette souche augmenterait le rendement en produit avec un minimum de contaminants.

En résumé, cet article de journal vidéo fournit une ste complètep décrit pas à pas les procédures utilisées pour créer auxotrophes par mutagénèse par transposon. Il couvre l'introduction de la transposome par électroporation, le criblage de mutations par placage de réplique, le sauvetage des gènes mutés par des techniques de clonage et identification des gènes interrompus par séquençage de l'ADN. Cette technique peut être utilisée pour identifier la fonction de gènes inconnus ou éventuellement pour la construction d'une souche bactérienne qui peut être utilisé dans un procédé industriel.

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Disclosures

L'auteur n'a rien à divulguer.

Acknowledgments

L'auteur tient à remercier l'ensemble de mon premier cycle de recherche indépendant étudiants et tous mes physiologie microbienne étudiants des cycles supérieurs qui ont testé mes idées transposon de mutagenèse pendant les semestres de printemps 2010-2014. Ce travail a été financé par le Département des sciences biologiques de l'Université d'État de Youngstown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit Epicentre (Illumina) TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) ECP09500 Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) EC6P095H Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts Thermo Fisher DF048517
Lennox LB Broth Thermo Fisher BP1427-2
Agar Amresco, Inc. J637-1KG Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate  Amresco, Inc. 0408-25G When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate Amresco, Inc. 0643-1KG
Yeast Extract Amresco, Inc. J850-500G
Tryptone Amresco, Inc. J859-500G
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G
NaCl Amresco, Inc. X190-1KG
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
MgSO2 Fisher Scientific BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I NEB R0636S Partial digestion of genomic DNA
Xho I NEB R0146S Plasmid digestion
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Nuclease Free Water Amresco, Inc. E476-1L For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1460 Plasmid purification
Replica Plating Block Thermo Fisher 09-718-1
Velveteen Squares Thermo Fisher 09-718-2 Replica plating
PetriStickers Diversified Biotech PSTK-1100 Grid for replica plating
Petri Dishes Thermo Fisher FB0875712
Gene Pulser II BioRad Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm BioExpress E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator Labconco 7970010 Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System Beckman Coulter DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0 Life Technologies 12605099 DNA sequence analysis

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References

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Microbiologie Numéro 92 Auxotrophe transposome transposon mutagenèse des répliques un milieu minimal glucose milieu complexe,
Génération de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. UEE auxotrophes utilisant mutagénèse par transposon
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Caguiat, J. J. Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis. J. Vis. Exp. (92), e51934, doi:10.3791/51934 (2014).

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