Summary
Enterobacter зр. ЕГУ растет в глюкозе минимальную солевую среду. Ауксотрофов генерируются путем преобразования его с transposome которые случайно вставляет себя в геном хозяина. Мутанты найден реплик из сложной среды в минимальной среде. Прерванный гены обозначаются гена спасения и секвенирования.
Abstract
Прототрофных бактерии растут на М-9 минимальную солевую среду, дополненную глюкозы (М-9 среде), который используется в качестве источника углерода и энергии. Ауксотрофов могут быть получены с использованием transposome. Коммерчески доступны, Tn 5 -derived transposome используется в данном протоколе состоит из линейного сегмента ДНК, содержащей γ начала репликации R6K, ген устойчивости к канамицину и две мозаики последовательности концах, которые служат в качестве сайтов связывания транспозазу. Transposome, предоставляется в качестве белкового комплекса ДНК / транспозазы, вводится путем электропорации в прототрофных в штамме Enterobacter, уд. ЕГУ, и случайным образом включает себя в геном этого хозяина. Трансформанты реплика была помещена на Лурии-Бертани агаром, содержащих канамицин, (LB-KAN) и с агаром, М-9-среды, содержащей канамицин (M-9-KAN). Трансформанты, которые растут на LB-кан пластин, но не на M-9-кан пластин считаются ауксотрофы. Очищенная геномнаяДНК из ауксотроф частично переваривается, лигирована и преобразован в PIR + кишечной палочки (E.coli) штамма. Репликация Происхождение R6Kγ позволяет плазмиды повторить в PIR + E. штаммы кишечной палочки, а также резистентность к канамицину маркер позволяет выбрать плазмиды. Каждый трансформант обладает новую плазмиду, содержащую транспозона фланкированную прерванного хромосомной области. Сэнгер секвенирования и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) предложить предполагаемый личность прерванной гена. Есть три преимущества использования этой transposome стратегию мутагенеза. Во-первых, она не зависит от экспрессии гена транспозазы хостом. Во-вторых, transposome вводится в целевом узле путем электропорации, а не путем конъюгации или трансдукции и, следовательно, является более эффективным. В-третьих, репликация происхождение R6Kγ позволяет легко идентифицировать мутантный ген, который частично восстановлены в рекомбинантной плазмиде. Этот метод может быть использован, чтобы исследовать гены, участвующие в других характеристик Enterobacter SP. ЕГУ или более разнообразных бактериальных штаммов.
Introduction
Прототрофных бактерии растут в М-9 минимальную солевую среду, содержащую глюкозу (М-9 среде), превращение глюкозы через центральные путей метаболизма углерода генерировать предшественники, такие как аминокислот, нуклеиновых кислот и витамины, для биосинтеза 1. М-9 среда содержит хлорид аммония в качестве источника азота, натрия и фосфат калия в качестве буфера и источника фосфора, сульфата магния в качестве источника серы и глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Лурия-Bertani (LB) среда богата аминокислотами из триптона и в витаминах и ростовых факторов из дрожжевого экстракта. Он поддерживает рост ауксотрофов, что не может синтезировать аминокислоты, витамины и другие факторы роста, необходимые для роста на М-9 среде. Таким образом, прототрофов вырастет в LB и М-9 среде, в то время как ауксотрофы вырастет в LB среде, но не в М-9 среде. Вводя мутации в прототрофным популяции бактерий и идентификации мутантных генов, которые вызывают ауксотрофные фенотипы, это роssible, чтобы получить лучшее представление о метаболизме в бактериальном штамме.
Транспозонов мутагенез может быть использован для идентификации многих генов, необходимых для роста на глюкозе в М-9 среде. Транспозоны включить себя случайно в геном хозяина 2. К пятнистость транспозона трансформантов на LB чашках с агаром и их реплик на М-9 средних чашках с агаром, можно показать на экране для ауксотрофов. Прерванный гены идентифицированы через гена спасения. Это исследование использует имеющиеся в продаже Tn 5 -derived transposome который поставляется в качестве решения линейного сегмента транспозонов ДНК смешивается с транспозазы белка. Сегмент ДНК отсутствует ген транспозазы, но содержит ген устойчивости к канамицину, на γ начала репликации R6K и две мозаичные мотивы, которые Последовательности ДНК для связывания транспозазы на каждом конце сегмента 3,4. Поскольку белок транспозаза добавляют непосредственно к ДНК, ДНК-фрагмента в одиночкуопределяется как транспозона, и белковый комплекс ДНК / транспозаза определяется как transposome. Transposome преобразуется путем электропорации в 5 чувствительного к канамицину хоста (фиг.1А). Колонии, которые растут на чашках с агаром LB, содержащей канамицин (LB-кан) имеют транспозона вставок (рис 1б), и реплики покрытием трансформантов, которые не расти на М-9 средних пластин агара, содержащей канамицин (М-9-кан) являются ауксотрофы (Figire 1С). Геномную ДНК из мутанта очищают и частично переваривают с 4-щелочного рестрикции эндонуклеазы резки, BFU CI (рис 1D). Сшита ДНК трансформируют в штамм Escherichia coli (E.coli), который содержит ген PIR (рис 1E). Этот ген позволяет новую плазмиду, содержащую транспозона и фланговые области хромосомы хозяина для репликации в E. палочка 6. Ген устойчивости к канамицину служит в качествеelectable маркер для новой плазмиды. Наконец, секвенирования с использованием праймеров, комплементарных каждом конце транспозонов и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) анализа 7,8 полученной последовательности используются для определения идентичности прерванной генов.
Эта стратегия transposome мутагенеза обеспечивает три преимущества 3. Во-первых, так как этот белок связывается транспозаза непосредственно к транспозона, вставка не зависит от экспрессии гена транспозазы в хосте. После того, как транспозона включает себя в геном хозяина, транспозаза ухудшается, предотвращая дополнительное движение транспозона. Однако, дополнительное движение не может быть предотвращено, если хост имеет эндогенный Tn 5 транспозиционные элемент. Во-вторых, введение transposome путем электропорации дает возможность использовать его в различных хостов. Это также устраняет необходимость введения транспозон бактериальной конъюгации или В.И.RAL инфекция. Оба процесса требуют восприимчивость хозяина. В-третьих, включение гена устойчивости к канамицину и γ репликации происхождения R6K в transposome делает его легче идентифицировать прерванный ген. Транспозона-прерывается регионы могут быть сохранены и секвенировали как плазмиды, устраняя необходимость использования обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации генов.
Протокол, представленные в этом видео описывается каждый шаг для транспозонов мутагенеза Enterobacter зр. ЕГУ 9 использованием transposome от его введения в бактериальных клеток к идентификации предполагаемого гена он прервал. В дополнение к ранее опубликованным протоколам 3,4,10, подробные способы использования реплик для скрининга ауксотрофов представлены. Эта техника мутагенеза может быть использован для исследования других фенотипы, например, антибиотиков и металлических сопротивлений, в различных видов бактерий, для идентifying минимальное число генов, необходимых для роста при определенных условиях культивирования в синтетических исследований биологии, или для обучения лабораторный компонентом генетики или микробной физиологии конечно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Электропорация компетентных клеток 5,11
- Развести в O / N LB культуру Enterobacter зр. ЕГУ 1/20 в 50 мл свежей LB среде и расти при встряхивании при 120 оборотах в минуту и 30 ° C до оптической плотности (600 нм) между 0,4 и 0,6. При желании, растут другие бактериальные штаммы в их оптимальной температуре роста.
- Холод клетки на льду в течение 5 мин и центрифугируют при 4 ° С и 7000 х г в течение 5 мин.
- Жидкость над осадком сливают, ресуспендирования клеток в 50 мл стерильной ледяной водой и центрифугируют при 4 ° С и 7000 мкг в течение 5 мин. Повторите этот шаг.
- Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в объеме ледяной воды, равном объему осадка клеток. Для длительного хранения, промыть клетки с 10 мл охлажденного льдом 10% (об / об) глицерина, ресуспендируют в равном объеме гранул охлажденного льдом 10% (объем / объем) глицерин, хранить при температуре -80 ° С, и оттепели на льду до электропорации.
- Добавить 0,5 мкл transposome 40 мклклетки. Коммерчески доступный раствор transposome подается в концентрации ДНК 0,33 мкг / мкл. Хотя 0,33 мкг рекомендуется, 0,165 мкг ДНК достаточна.
- Поместите клеток / transposome смеси на ледяной холод, 0,2 мм, кювету для электропорации и нажмите смесь на дно кюветы. Удар клетки при 25 мкФ, 200 Ω, и 2,5 кВ. Чтобы убедиться, что клетки остаются охлажденными, хранить электропорации кюветы в -20 ° C морозильнике до использования.
- Сразу, добавить 960 мкл фильтр стерилизованные супер оптимальный отвар с катаболитной репрессии (SOC) среды. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз, и передавать клеткам стерильным 1,5 мл пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: клетки начинают умирать после шока, но соль в SOC среды позволяет восстановить их. Чтобы сэкономить, не стоит добавлять transposome или шокировать негативные контрольные клетки. Просто добавьте 960 мкл стерильной SOC среды к нему. - Инкубируйте клетки при 30 ° C Fили 45-60 мин при встряхивании при 120 оборотах в минуту. Это обеспечивает время для transposome рекомбинировать с геномом хозяина и для клеток, чтобы выразить устойчивость к канамицину.
- Spread 100 мкл клеток на LB-агаром кан и инкубируйте O / N при 30 ° С. Храните оставшуюся смесь трансформации в холодильнике при температуре 4 ° С. Спред дополнительные суммы на более поздний срок до 2-х недель после первоначального электропорации при необходимости.
2. Гридинг трансформантов
- Лента сетки к крышке пустой 100 х 15 мм чашки Петри. Скопируйте сетку из "Краткого курса в бактериальной генетики" 12.
- Нарисуйте линию на дне чашки с агаром LB-кан. Используйте небольшой кусочек ленты привязать его к координатной привязкой крышкой так, что сетка видна через агар. Убедитесь, что линия на нижней пластине совмещена с верхней, центральной части сетки. Закрепление пластины с лентой держит его от скольжения, что позволяет даже гриддинга, Линия облегчает идентификацию колоний после реплик.
- Pick одну трансформанта с стерильной зубочисткой и обнаружить его в центре квадрата в сетке. Просто нажмите на колонию и место. Не рой зубочистку в агар. Во избежание загрязнения пластину, обрабатывать зубочистку только на одном конце.
- Найди еще трансформанту в соседней площади, как в шаге 2.3. Когда пластина заполнена, инкубировать ее O / N при 30 ° С. Это мастер пластины.
3. Копия Покрытие для Определите ауксотроф фенотип 12
- Для каждой пластины, которая была с сеткой, чтобы стек три свежих чашках с агаром пронумерованных от одного до трех: один для LB-кан, два для М-9-кан и три для LB-кан. Сушат пластины вверх дном, O / N, при 37 ° С перед использованием.
- Нарисовать линию на верхней части каждой пластины, как на стадии 2.2.
- Протрите реплик инструмент с 70% этанола, разместить стерильный вельвет квадрат в верхней части реплик вол и зажать вельвет квадрат вниз. Руки кишат микробы даже после мытья их. Предотвратить введение загрязняющих микробов путем обработки вельвет квадрат по его краю.
- Выравнивание линии на основной матрицы с линией, проведенной на зажиме и поместите пластину на верхней части вельвета площади. Нежный давление передать бактерии от пластины к вельвета площади. Будьте осторожны, чтобы не размазать бактерии. Снимите главный пластину из вельвета площади.
- Совместите линию, проведенную на пластине номер один с линии на зажим и поместите его в верхней части вельвета площади. Слегка надавливайте на передачу бактерий от вельвета площади к плите. Снимите пластину номер один.
- Откажитесь от вельвет площадь в стакан воды и поместите чистую, стерильную вельвет квадрат на инструмент реплик, как в шаге 3.3. Этот шаг позволяет более-прививки, которая вызывает рост прорыв и ложноположительные результаты.
- СовместитеЛиния на пластине номер один с линии на зажим и поместите его поверх нового вельвета площади. Слегка надавливайте на передачу бактерий от пластины номер один в вельвета площади. Снимите пластину номер один.
- Совместите линию, проведенную на пластине номер два с линии на зажим и поместите его в верхней части вельвета площади. Слегка надавливайте на передачу бактерий от вельвета площади для плиты номер два. Снимите пластину номер два.
- Повторите шаг 3.8 для пластины номер три. Третий пластина управления для полного перевода из основной матрицы от двух других пластин. Откажитесь от вельвет площадь в стакан воды. Для повторного использования вельветовые квадраты, автоклав стакан, содержащий загрязненные вельветовые квадраты, мыть их, высушите их, обернуть их в алюминиевую фольгу и вновь автоклав их.
- Инкубируйте пластин при 30 ° CO / N. Колонии, которые растут на обеих LB-кан чашках с агаром, но не растут на М-9-кан пластин считаются ауксотрофы (
- Подряд из ауксотрофы от пластины номер один на свежем LB-кан агаром и инкубировать пластины при температуре 30 ° CO / N.
- Серия для изоляции 3 колоний от разводов пластины в шаге 3.11 на свежем LB-кан пластины. Инкубируйте планшет при 30 ° CO / N. Это гарантирует, что мутант хорошо изолирована. Разделите тарелку на три части и серию из каждой колонии в одном разделе.
- Точечные колонии от полосатых из колоний, полученных из шага 3,12 на свежем LB-кан пластины, чтобы сформировать сетку, как на этапах 2.1-2.4. Каждый мутант повторного испытания в трех экземплярах.
- Репликация пластину снова, как в шагах 3.1-3.10 для подтверждения фенотип ауксотроф.
4. Джин Rescue
- Вырастить 3 мл O / N культуру изолированной мутанта колонии с шага 3,13 в жидком LB-кан среде при температуре 30 ° C. Очищают геномной ДНК из 1 мл культуры с использованием коммерчески доступного набора для очистки геномной ДНК.
- Настройте смесь 0,025 UBFU ДИ эндонуклеазы рестрикции и в 14 мкл 1 мкг / мкл геномной ДНК в 20 мкл реакционной смеси на льду. Так как BFU ДИ разрезает транспозона на двенадцати различных сайтах, это может быть более эффективным в использовании эндонуклеазы рестрикции, БФА I или Hae III, который режет транспозона в двух и трех различных участков, соответственно.
- Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 25 мин, а затем при 80 ° С в течение 20 мин, чтобы инактивировать фермент. Анализ 3 мкл частично переваренной ДНК в 0,8% агарозном геле (рис 3). А успешные промежуточные результаты пищеварения в мазке из выше 10 кб вниз к нижней части геля.
- Лигировать 15 мкл частично переваренной геномной ДНК с использованием 800 единиц ДНК-лигазы Т4 в 500 мкл реакции. Выдержите реакция O / N в 4 ° C. Большой объем реакционной смеси максимизирует лигирование отдельных фрагментов с собой и сводит к минимуму взаимодействие между двумя или более фрагментов ДНК.
- PrecipitaТе лигируют ДНК путем добавления 50 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,5, и 1 мл 95% этанола и инкубирование ее при -20 ° С в течение 20 мин.
- ДНК микроцентрифуге при 4 ° С и 13500 х г в течение 10 мин, промыть осадок с 70% -ным этанолом, сушат его в вакуумной центробежного концентратора, и ресуспендируют его в 10 мкл нуклеазы свободной воды. Альтернативно, ДНК может быть сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Используйте 4 мкл ресуспендированного ДНК для трансформации E. Штамм ECD100D пир или ECD100D pir116 путем электропорации, как в разделе 1. R6k γ инициации репликации требуется бактериальный штамм с геном ПИР повторить 6. Результаты деформации пир в низких плазмид копирования и штамм pir116 содержит ПИР мутантный ген, который приводит к высоким плазмид копирования. Каждый трансформант содержит новую плазмиду с транспозона и область прерванного хромосоме (рис 1E).
- Inoculели 5 мл LB-среды с кан одной колонии, вырастить его O / N при встряхивании при 120 оборотах в минуту и температуре 37 ° С и очищают плазмиду ДНК из всей O / N культуры с использованием коммерческого набора.
- Дайджест 14 мкл плазмиды с помощью рестрикции Xho I. Убедитесь, что конечный объем реакции 20 мкл. Этот фермент распознает участок в середине транспозона на 5'-конце гена устойчивости к канамицину. Анализ 10 мкл непереваренной и переваривается плазмиды на 0,8% агарозном геле (рис 3). Плазмида состоит из 2 кб транспозонов плюс фланкирующей ДНК хозяина.
Секвенирование 5. ДНК
- Последовательность этой плазмиды с использованием коммерчески доступного набора для секвенирования, праймеры, которые гомологичны каждом конце транспозона и систему анализа капиллярной секвенирования. С другой стороны, плазмиды могут быть отправлены на внешний учреждения для секвенирования.
- Используйте молекулярную стандарт веса (1 кб лестница) вГель, чтобы оценить размер плазмиды. Тогда, оценить количество нг (нг) плазмиды, что требуется для 50 фМоль.
- Измерение концентрации плазмидной ДНК с использованием спектрофотометра при длине волны 260 нм (260) и 280 нм (280). Убедитесь, длина пути света через кювету 1 см. Определить концентрацию путем умножения оптическую плотность при 260 нм с помощью 50 нг / мкл. Высокое качество ДНК плазмиды будет иметь 260 / A 280 соотношение между 1,8 и 2,0.
- Объем ДНК, необходимого для каждой реакции секвенирования это количество, необходимое для нг 50 фмоль деленное на концентрации плазмиды. Смешайте объем требуемой плазмиды с водой, чтобы довести общий объем до 10 мкл.
- Плазмидную ДНК / смесь воды теплоемкость при 96 ° С в течение 1 мин, а затем охлаждают ее до комнатной температуры.
- Добавить 8 мкл мастер микс из комплекта секвенирования и 2 мкл 1,6 мкМ одного из секвенирования праймеров.
- Фолнизкий протокол от секвенирования комплект для программы термоциклера и реакции очистки.
- Анализ каждого образца с помощью системы анализа капиллярной ДНК.
- Используйте имеющийся в продаже программный пакет для просмотра последовательности ДНК. Поиск последовательности ", 5'-GAGACAG-3 ',", который является последним 7 пар оснований транспозонов (рисунок 4). Последовательность перед 5'-конца этого отрезка 7 п.о. принадлежит транспозона. Последовательность после 3'-конца этого отрезка 7 п.о. принадлежит к прерванному гена.
- Определите возможные функции прерванной гена с помощью Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Используйте следующие link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Вставить последовательность прерыванияген ред в строке запроса, выберите «других» в рамках базы данных и нажмите на кнопку "BLAST" в нижней части страницы. Когда появится результат, прокрутить страницу вниз, чтобы просмотреть результаты выравнивания (рисунок 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Трансформация Enterobacter зр. ЕГУ путем электропорации с transposome инициирован случайную вставку генома в геном хозяина (рис 1а, б). Успешный электропорации дали несколько тысяч трансформантов, которые росли на LB-кан пластин. Чтобы получить 300-400, хорошо разнесены колоний на чашку, количество преобразований смеси распространения на каждом LB-агаром кан был оптимизирован. Каждый Трансформант содержится хотя бы один транспозонов вставку, но не было ясно, если важный ген роста на М-9 среде был прерван без экранирования реплик. Трансформанты были переданы свежих LB-кан пластин в сетках 88 и реплика была помещена на М-9 среде. Примечание, чтобы гарантировать, что транспозона поддерживается в трансформантов, раздел Протоколы рекомендует добавлять канамицин в М-9 средних пластин. М-9 среда не была дополнена канамицина в этом случае, но это было еще возможно получить ауксотрофов без него. В
Некоторые колонии, возможно, были заражены соседних колоний во время реплик. Для выделения мутанта в качестве чистой культуры, она была прожилками из LB-кан пластины номер один в шаге 3.1 на свежую LB-агаром кан и выращивали O / N при 30 ° С. Три колонии, выросшие были прожилками выходят на второй свежей LB-кан пластины и выращивали O / N при 30 ° С. Затем, одной колонии, которые возникли из каждого из трех колоний была замечена на третьей свежей LB-кан пластины. Реплика покрытие обратно на М-9 минимальной Mediгм пластина проверяется в трех экземплярах на ауксотрофного фенотип, который наблюдался на рисунке 2. Из 1760 транспозонов трансформантов экранированных в 2013 Микробная физиологии конечно, 23 были ауксотрофы.
Прерванный ген из ауксотроф затем идентифицированы с помощью генной спасение. Ауксотрофный колонии от второй пластины полоска выше (Шаг 3,13) выращивали O / N в LB-среде кан, и геномной ДНК очищали из культуры с использованием набора для очистки геномной ДНК. Электрофорез в агарозном геле показал, что очищенную ДНК была больше, чем 10 кб по размеру (Рисунок 3, дорожка 2). Чтобы разорвать геномной ДНК на более мелкие фрагменты, которые содержали транспозона и фланговые прерванных хост-области (рис 1D), он был частично переваривают с 0,025 единиц BFU CI в течение 25 мин при 37 ° С. Это ограничение сокращения эндонуклеазы на 5'-GATC-3 »сайтов, которые происходят приблизительно каждые 200 до 500 пар оснований. Несмотря на то,двенадцать 5'-GATC-3 'сайты внутри транспозона, большое количество фрагментов, содержащих интактный транспозона и фланкирующих геном хозяина все еще будет присутствовать в частично расщепленной ДНК. Дорожка 3 из показано на рисунке 3, частично переваривают геномной ДНК с ДНК мазка, начинающегося выше 10 кб, на всем пути до дна геля до температуры ниже 0,5 кб. Если мазок ДНК начинается ниже 2 кб, размер транспозона, затем ДНК была переваривается слишком много. Будет необходимо, чтобы уменьшить количество добавленного фермента, в 37 ° C время инкубации, или оба. Если нет Мазок и полоса с расщепленной ДНК имеет такой же размер, как ДНК с ДНК непереваренной, то не произошло расщепление. Будет необходимо, чтобы увеличить количество добавленного фермента, в 37 ° C Время инкубации или оба. Вместо того чтобы использовать BFU CI, он может быть пригоден для использования рестрикционных эндонуклеаз БФА I или Hae III, который разрезать транспозона в двух и трех различных сайтовсоответственно. Использование одного из этих ферментов может увеличить E. палочка пир + трансформация выход во гена спасения.
Частично переваренной ДНК лигировали в реакции 500 мкл. Этот увеличенный объем свести к минимуму взаимодействие между другими фрагментами ДНК и максимальной вероятности того, что каждый фрагмент лигировали с собой с образованием круговой молекулы. Лигировали ДНК осаждали и трансформировали путем электропорации в E. Штамм ECD100D pir116. Смесь преобразование было распространено на LB-кан пластин. Колонии, которые росли содержала новую плазмиду, состоящий из транспозона и область прерванного гена-хозяина (рис 1E). Число колониеобразующих единиц в диапазоне от 0 до 2000 на мл смеси трансформации. Если фланкирующих область хромосомной кодирует белок, который был токсичен к Е. палочка хозяин, эффективность преобразования была низкой или только небольшой сегмент хромонекоторые были связаны с новой плазмиды. Плазмидную ДНК очищали от культуры, которые инокулировали одной трансформанта и расщепляли рестриктазой, Xho I, в которой признается один сайт в центре транспозона вблизи 5'-конца гена устойчивости к канамицину. Дорожка 4 на рисунке 3 содержал плазмиду непереваренной а полоса 5 содержал плазмиду переваривали. Поскольку очищенной плазмидной ДНК, как правило, суперскрученной, он мигрировал с большей скоростью, чем та же нить линейной ДНК переваривали. Правильный размер этой плазмиды было 3 кб. Он содержал 2 кб транспозона, плюс около 1 кб прерванной гена хозяина. Если фланкирующих ДНК хозяина содержит один или несколько Xho I сайтов узнавания, два или более плазмидные полосы будет наблюдаться в полосе с Xho I переваренной ДНК.
На фиг.4 показан результат секвенирования для плазмиды, что был изолирован от ауксотроф, После удаления шоRT последовательность транспозонов жирным шрифтом, последовательность ДНК хозяина был представлен фундаментальных Local Alignment Search Tool (BLAST) анализа 7,8. Одним из результатов BLAST предположил, что прерывается последовательность похожа на Enterobacter клоаки подвид. клоаках НКТЦ 9394 (наб | FP929040.1 |) ген хоризматмутазы, который участвует в биосинтезе L-тирозина и L-фенилаланина (рисунок 5) 13. Иногда во время лигирования с частично переваренной геномной ДНК, линейный транспозона ligates к одному или нескольким другим фрагментам BFU CI. Это может сделать BLAST приводит в замешательство, поскольку личность гена резко меняется. Например, первые 41 пар оснований из другого ауксотроф согласован с геном для глутамата-5-дегидрогеназы полуальдегида который участвует в биосинтезе пролина 1. Тогда, в ближайшие 219 пар оснований согласован с геном для рибонуклеозид-дифосфат редуктазы субъединицы, а затем сегменте пара 62 базовой для липидного-A-disacc haride киназы. Последний 295 сегмент пар оснований снова согласована с глутамат-5-полуальдегида дегидрогеназы. Наличие 5'-GATC-3 'сайтов для БФУ CI предложил два небольших фрагментов ДНК лигируют спасенного плазмиды. Таким образом, разведение частично переваренной ДНК для лигирования реакций не полностью устранить фон, вызванной лигированием мелких фрагментов. Из этих результатов было сделано заключение, что transposome вставлен себя в ген для глутамат-5-дегидрогеназы полуальдегида потому что последовательность для этого гена был в непосредственной близости от транспозона. Другие ауксотрофы содержатся перебои в гене cystathione бета лиазы, участвующих в биосинтез метионина; для гистидинолом дегидрогеназы, участвующих в гистидин биосинтеза; для фосфосерина фосфатазы, участвующих в серин, глицин, цистеин и биосинтеза; и для ketol-кислоты reductoisomerase, участвующих в лейцин, изолейцин и валин биосинтеза 1.
нт "л: Keep-together.within-страница =" всегда ">
Рисунок 1. транспозонов мутагенеза. (А) Клетки бактерий, содержащие ген, который требуется для роста на М-9 минимальную солевую среду, содержащую глюкозу. В штучной упаковке М-9 представляет ауксотрофного ген. (Б) transposome вводится в бактериальном штамме путем электропорации, и транспозаза белок связан с каждой мозаичной конца (стрелки) случайным образом вставляет транспозона в хромосому хозяина 3,4. Только транспозонов, содержащий трансформанты будет расти на LB-кан средних пластин. (С) трансформанты реплика была помещена на М-9 среде, содержащей глюкозу и на LB-среде кан. Трансформанты, которые не растут (перечеркнутый) на М-9 среде, содержащей глюкозу в ауксотрофы. (D) Геномную ДНК очищали из ауксотрофов, и частично переваривают с 4-щелочного резки беэр, BFU ДИ, которые распознает сайт ДНК, 5'-GATC-3 '. (Е), частично расщепленную ДНК обрабатывают Т4 ДНК-лигазы и трансформировали путем электропорации в E. Штамм ECD100D PIR, чтобы сформировать новую плазмиду, содержащую транспозона и прерванный хромосомного гена, который требуется для роста на М-9 среде. Ген PIR позволяет круговых фрагментов ДНК, содержащих γ начала репликации R6K в транспозона, чтобы служить в качестве источника репликации в новой плазмиды 6. Ген устойчивости к канамицину служит в качестве селективного маркера для новой плазмиды. Плазмиду очищают и ~ 500 п.н. последовательность гена прерванного определяется с использованием праймеров (стрелки), которые гомологичны каждом конце транспозона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.
Рисунок 2. реплик. (A) Сетка трансформантов, которые были переданы на LB-кан агаром. (B) Сетка из тех же трансформантов, которые были переданы на М-9 средней пластине. Ауксотрофов вырос на LB-кан пластин, но не на М-9 средних пластин. Они обозначаются черными квадратами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. 0,8% агарозном геле Дорожка 1:. 1 кб лестницы. Полоса 2: Непереваренные геномной ДНК. Дорожка 3: BFU C I частично переваривают геномной ДНК. Полоса 4: Непереваренные спасли плазмаID. Дорожка 5: Xho Я переваривается спасли плазмиды.
Рисунок 4. частичной последовательности ДНК плазмиды. Последовательность жирным шрифтом является частью транспозона и не был представлен для анализа BLAST. Остальная часть последовательности является сегментом спасенных генов от хоста.
Рисунок 5. Анализ BLAST 7,8. Начиная с первой базы (запрос), прерванный ген по-видимому, кодируют хоризматмутазы Enterobacter клоаки, который участвует в фенилаланина и тирозина биосинтеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Транспозонов мутагенеза, используя transposome является эффективным инструментом для создания ауксотрофов в Enterobacter зр. ЕГУ и других видов грамотрицательных и грамположительных бактерий 3,4. Процесс был инициирован введения Tn 5 -derived transposome в хозяина путем электропорации. Для идентификации колоний со вставками, нетрансформированный целевой штамм должен быть чувствительным к канамицину, чтобы выбрать для маркера устойчивости осуществляется с помощью транспозона. Некоторые хосты производить рестрикционных эндонуклеаз, которые ухудшают транспозонов ДНК, прежде чем он может рекомбинировать с геномом хозяина. Добавление ингибитора эндонуклеазы рестрикции к электропорации смеси может свести к минимуму деградацию и увеличить выход преобразования 3. При подготовке электропорации компетентные бактерии, важно было удалить как много соли, насколько это возможно предотвратить электрическое дуги или искры, который убивает бактерии, вызванные наличием соли. Даже в отсутствиеэлектрическая дуга, клетки стали быстро умирают после шокируя их. Добавление соли, содержащий питательную среду SOC немедленно восстановлены осмотического равновесия, свернутое гибель клеток и повышения эффективности преобразования 5. Устойчивых к канамицину трансформантов затем наносили на свежей LB-кан пластины и реплика была помещена на М-9 минимальной агаризованной среде. Для предотвращения чрезмерной прививку, которая может вызвать ложные положительные результаты, что мисс возможные ауксотрофов, вельветовые квадратов до остальной пластин были привиты были переведены на этапе 3.6. Затем, в течение реплик, только достаточно давления был применен к передаче колоний, не вызывая размытие или загрязнения между соседними колоний.
В мутировавших генов в ауксотрофов были определены в ходе генной спасения. Геномную ДНК из каждого ауксотроф был сдвигу с использованием частичного расщепления с частой-основы режущего BFU C I. Частичные переваривани с использованием БФА I или Hae III, который разрезать TRansposon реже, может повысить эффективность преобразования транспозонов. Кроме того, можно использовать полный пищеварение с другими эндонуклеазами рестрикции, 6-основных и 8-основных резцов, которые не имеют сайтов в пределах транспозона. Расщепленную ДНК затем лигируют и трансформируют в E. Штамм ECD100D пир или ECD100D pir116 6. Хотя E. pir116 штамм был трансформирован с помощью электропорации в шаге 4.8, также можно использовать химически компетентных клеток. В этом случае, весь преобразование должно быть распределены для получения большой выбор спасенных плазмид. Ген PIR позволяет циклической транспозона реплицировать как низкий числа копий плазмиды, и pir116 мутантный ген позволяет реплицировать как высокая копий плазмиды. Низкие выходы трансформации с использованием штамма pir116 может быть связано с экспрессией генов токсичных продуктов из исходном узле. Токсичность может быть уменьшена с помощью низкой копию
Секвенирование генома 10 и ПЦР секвенирование 14 альтернативные методы генной спасения. Метод геномной последовательности последовательностей фланкирующих областей хромосомные непосредственно из очищенной геномной ДНК. Эта стратегия полезна, когда геном организма-мишени уже упорядочены. После того, как мутировал область была определена геномной последовательности и BLAST, весь регион может быть усилен с помощью ПЦР и клонировали для дальнейшего анализа. Метод ПЦР использует две реакции ПЦР и четыре различных праймеров. Первые пары реакции транспозона гомологичны праймер (праймер 1) с вырожденным праймером, который содержит короткую ДНК, последовательность линкера (Праймер 2). Вторая реакция ПЦР является вложенной ПЦР, соединяя другой транспозонов гомологичной грунтовку (праймер 3) с гомологичной последовательности праймера линкер (4) праймера. Сайт грунтовка для грунтовки 3 являетсярасположенный на стороне 3 'участке праймера для грунтовочного 1. Затем amplicand из второй реакции PCR будет очищен и секвенирован. Этот автоматизированный метод секвенирования ДНК усиливает непосредственно из мутантных клеток, устраняя необходимость в обоих геномной ДНК и очистки плазмидной спасения.
Вместо того, чтобы идентифицировать гены, участвующие в ауксотрофии, транспозонов мутагенез также может быть использован для изучения других легко анализировали фенотипов. Enterobacter Sp. ЕГУ является мульти-металл устойчив бактериальный штамм, который также устойчив 100 мкг / мл ампициллина (неопубликованные данные). Его минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для HgCl 2 составляет 70 мкМ, ZnCl 2 800 мкМ, AgNO 3 составляет 80 мкМ и 2 NAASO 14 мМ 9. После введения transposome в этом штамме и гриддинга трансформантов на LB-кан пластин, нанесенные на сетку колонии могут быть реплика была помещена на среде, содержащей металлы в концентрациях ниже МИК этого bacteриала штамм. Спасения и секвенирование гена прерванного из мутанта с пониженной MIC может выявить ген, который придает устойчивость к одному из этих металлов.
В дополнение к генерации мутантов, transposome может быть использован в качестве вектора в пробирке или в естественных условиях, чтобы определить коэффициент усиления функциональных генов, таких как антибиотик или металлической сопротивления. Для стратегии в пробирке, геномная ДНК из Enterobacter зр. ЕГУ переваривается с рестриктазой, которая признает сайты за пределами транспозона. ДНК лигируют и смешивают с transposome в буфере, содержащем Mg 2+. После рекомбинации между транспозона и случайных геномных фрагментов, E. Штамм ECD100D PIR трансформируют ДНК и распространяется на чашках, содержащих ампициллин или соль металла. Колонии, которые растут будет обладать новый плазмиды, содержащий транспозон расположенный рядом с геном устойчивости хозяина. Для в естественных улrategy, Enterobacter зр. ЕГУ превращается с transposome. Тогда, реакция преобразования весь выращивается в LB-кан жидкой среде, чтобы выбрать для большой популяции со случайными транспозонов вставками. Геномную ДНК переваривают рестрикционной эндонуклеазой, который распознает участки за пределами transposome, лигируют и трансформируют в E. Штамм ECD100D PIR. Как и в способе в пробирке, трансформанты распространяться на ампициллин или металлическими пластинами. Опять же, в результате плазмида состоит из транспозона вставленной рядом с геном устойчивости. Эти две стратегии будет успешным только в том случае ген целевого сопротивление может быть выражена и является активным в E. Штамм.
Транспозонов мутагенез может быть использован, чтобы определить минимальное число генов бактериального штамма требует для роста 15,16. Два transposomes содержащие LoxP сайты и различные маркеров устойчивости к антибиотикам, необходимых для данной стратегии яNA бактериальный штамм с известной последовательности генома. После того, как два транспозоны интеграции, выражена CRE рекомбиназа катализирует реакцию рекомбинации между двумя LoxP сайтов, устраняя хромосомные регионы между вставками транспозона. Знание последовательности генома позволяет определить, какие гены будут устранены. Способность расти показывает, что исключенные гены не требуется для роста. Эта техника является трудоемким, и минимальный геном для роста, используя эту стратегию еще не завершена. Однако, автоматизированная транспозонов мутагенеза изучение синегнойной палочки, используя ПЦР последовательность оценкам, 300-400 гены, необходимые для роста этой бактерии в богатой среды 14. Это исследование не используйте систему рекомбиназы LoxP / CRE.
Микробы с минимальными геномов полезны для синтетической биологии 17. Бактериальный штамм с минимальным геномом является especiallу полезен для прекращения производства нежелательных побочных продуктов. Например, клостридии acetobutylicum (С. acetobutylicum) используется для получения биотоплива бутанол, 18, Во время его роста, этот штамм производит бутанол в конце его экспоненциальной фазе роста непосредственно перед входом стационарной фазы. В этот момент, она становится чувствительной к бутанола и других продуктов ферментации и образует бездействующие эндоспоры которые перестают синтезировать продукт. Поскольку transposomes были использованы для изучения Clostridium Perfringens 3, это может быть возможным использовать аналогичную систему transposome / LoxP / CRE рекомбиназы построить штамм C. acetobutylicum, который испытывает недостаток гены нежелательных продуктов ферментации и споруляции, но содержит гены для больше бутанол толерантность. Этот штамм бы увеличить выход продукта с минимальными загрязнений.
В целом, это видео журнальная статья предоставляет полный Steр за шагом описание процедур, используемых для создания ауксотрофов от транспозонов мутагенеза. Она охватывает введения transposome путем электропорации, скрининг на мутации по реплик, спасая мутировавших генов путем клонирования и идентификацию прерванных генов путем секвенирования ДНК. Эта техника может быть использована для идентификации функцию неизвестных генов или, возможно построение бактериальный штамм, который может быть использован в промышленном процессе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет ничего раскрывать.
Acknowledgments
Автор хотел бы поблагодарить всех моих студентов Независимый исследовательский студентов и всех моих Микробная физиологии аспирантов, протестированных мои транспозонов мутагенеза идеи в течение 2010-2014 весенних семестра. Эта работа финансировалась Департаментом биологических наук в государственном университете Янгстауна.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS - Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
- Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J.
- Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
