Üretilmesi Published: October 31, 2014 doi: 10.3791/51934

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jonathan James Caguiat¹

¹Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

Summary

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Abstract

Prototrofik bakteri, bir karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılan bir ortam glukoz (M-9 ortamı) ile takviye edilmiş M-9 az tuzlar üzerinde büyür. Oksotroflan bir transposome kullanılarak üretilebilir. Bu protokolde kullanılan ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 türevi transposome transposaz bağlanma bölgeleri olarak görev yapabilmeleri bir R6K γ replikasyon orijini, kanamisin direnci ve iki mozaik dizisi ucu için bir geni ihtiva eden bir DNA doğrusal bir segmentten teşekkül eder. Bir DNA / transposaz protein kompleksi olarak sağlanır transposome, prototrofik soyu Enterobachter içine elektroporasyon ile dahil edilir. YSU ve rastgele bu konağın genomuna kendisini içerir. Transformantlar kanamisin, (LB-kan) ihtiva eden agar plakaları, Luria-Bertani üzerine ekildi çoğaltma ve kanamisin (M-9-kan) içeren E-9, orta agar plakaları üzerine bulunmaktadır. M-9-kan plakalarına LB-kan plakalarına büyür ancak Transformantlar oksotroflan olduğu kabul edilir. Saflaştırılmış genomikBir oksotrofdan DNA kısmen sindirilmiş bir pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) suşu lige ve dönüşür. R6Kγ replikasyon orijini plazmid pir ⁺ E. çoğaltmak için izin verir E. coli suşu ve kanamisin direnç marker plazmid seçimi sağlar. Her transformantı kesilen kromozomal bölgeye çevrili transpozonunda içeren yeni bir plazmid sahiptir. Sanger dizileme ve Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) kesilen genin bir varsayımsal kimliğini öneririz. Bu transposome mutajenez stratejiyi kullanarak üç avantajı vardır. İlk olarak, ana bilgisayar tarafından bir transposaz gen ifadesi üzerindeki dayanmaz. İkinci olarak, transposome elektroporasyon ile yerine konjugasyon veya transdüksiyonu ile hedef konakçı içine dahil edilir ve bu nedenle daha verimli olur. Üçüncü olarak, R6Kγ kopya kökenini kolay mutasyona uğramış g belirlemek için yaparkısmen yeniden birleştirici bir plazmit geri kazanılır en. Bu teknik, Enterobacter sp başka özellikleri ile ilgili genleri araştırmak için kullanılabilir. YSU veya bakteriyel suşlar için daha çeşitli.

Introduction

Prototrofik bakteri biyosentezi ^1, amino asitler, nükleik asitler ve vitaminler gibi öncüleri, oluşturmak için, merkezi karbon metabolizma sentez yollan ile glikoz dönüştürücüler, orta glukoz (M-9 ortamı) ihtiva eden E-9 minimal tuz büyür. E-9 ortamı, bir karbon ve enerji kaynağı olarak bir kükürt kaynağı ve glukoz gibi bir tampon madde ve fosfor kaynağı, magnezyum sülfat gibi bir nitrojen kaynağı, sodyum ve potasyum fosfat, amonyum klorür içermektedir. Luria-Bertani (LB) tripton gelen ve maya ekstraktı vitaminler, büyüme faktörleri, amino asitler açısından zengindir. M-9 ortamı üzerinde büyüme için gerekli olan amino asitler, vitaminler ve diğer büyüme faktörleri sentezleyemediği oksotrofları gelişimini destekler. Oksotroflan M-9 ortamında LB ortamında değil, büyüyecek ise Böylece prototrofları, LB ve M-9 ortamda büyür. Okzotrofik fenotipleri neden mutasyona uğramış genleri bakteri Prototrofik nüfusu mutasyonların sokulmasıyla ve tanımlayarak, bu po olduğunubakterisel bir suş içerisinde metabolizmasının daha iyi bir anlayış elde etmek ssible.

Transpozon mutagenezi M-9 ortam içinde glükoz üzerinde büyüme için gerekli olan genlerin çoğu belirlemek için kullanılabilir. Transposonlar konak genomuna ² içerisine rastgele kendilerini eklemek. E-9, orta agar plakaları üzerine LB agar levhaları onları kaplama çoğaltma transpozon transformantları tespit ederek, oksotrofları taranması mümkündür. Interrupted genler gen kurtarma yoluyla tespit edilir. Bu çalışma, bir ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 transposaz protein ile karıştırılmış olarak, bir lineer transpozon DNA segmentinin bir çözelti olarak sevk edildiği transposome -türevli kullanır. DNA segmenti bir transposaz gen yoksun ama kanamisin direnci için bir gen, bir R6K γ tekrarlama orijinini ve bunun sonrasında parçanın ^3,4 her bir ucunda bağlama transpozaz için DNA dizileri iki mozaik motifleri ihtiva eder. Transposaz proteinin DNA, tek başına DNA segmenti doğrudan ilave edilir yanatransposon olarak tanımlanır, ve DNA / transposaz protein kompleksi transposome olarak tanımlanır. Transposome bir kanamisin duyarlı konak (Şekil 1A) içine elektroporasyon ⁵ tarafından dönüştürülür. Kanamisin (LB-kan) içeren LB agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler kanamisin (M-9-kan) auksotroplan olan ihtiva eden E-9, orta agar plakaları üzerinde büyümeye başarısız transpozon ekler (Şekil 1B), ve çoğaltma kaplama, transformantların (Figire bilgisi 1C). Bir mutant genomik DNA saflaştırılmış ve kısmen 4-bazlı kesici sınırlama endonükleazı, BFU CI (Şekil 1D) ile sindirilmektedir. Bağlı DNA bu pir geni (Şekil 1E) içeren Escherichia coli (E. Coli) 'in bir tür haline dönüştürülür. Bu gen, plazmid transpozonu ihtiva eden ve E içinde replike konak kromozomal komşu bölge sağlar coli ^6. Kanamisin e dirençli gen olarak hizmet ederYeni plazmid için seçilebilir sıralarda kalem. Son olarak, kesilmiş olan genlerin kimliğini belirlemek için kullanılan transposon ve elde edilen dizinin Temel Lokal Hizalama Arama Aracı (BLAST) Analiz ^7,8 her ucuna tamamlayıcı olan primerler kullanılarak sıralanmasıyla gerçekleştirilmesidir.

Bu transposome bir mütajenez stratejisi üç avantaj ³ içerir. Transposaz protein transposon ye direkt olarak bağlı olduğu için ilk, ekleme konak içinde, transposaz gen ifadesi üzerindeki bağlı değildir. Transpozonları bir konakçı genom içine kendisini içerir sonra, transposaz transpozonun ilave hareketinin önlenmesi, parçalanır. Ev sahibi bir endojen Tn 5 transpositional eleman sahip, ancak ilave hareketi önlenememektedir. İkinci olarak, elektroporasyon ile transposome katılması mümkün ana çok çeşitli kullanılmasını mümkün kılmaktadır. Ayrıca, bakteriyel birleşme ya da VI ile transpozonun tanıtmak ihtiyacını ortadan kaldırırral enfeksiyon. Her iki süreç konak duyarlılık gerektirir. Üçüncü olarak, kanamisin direnç geni ve transposome içinde R6K γ replikasyon kaynağının dahil edilmesi daha kolay kesilen genini belirlemek için yapar. Transpozon kesintili bölgeler kaydedilir ve gen tanımlaması için ters polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğini kullanmak için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, plazmidler gibi dizilenebilmektedir.

Bu video sunulan protokol Enterobacter sp transpozon mutagenezi için her bir aşamasını tarif etmektedir. YSU ⁹ kesintiye farazi geninin tanımlanması için bakteri hücreleri içine getirilmesi, bir transposome kullanılmıştır. Daha önce yayınlanmış protokollere ^3,4,10 ek olarak, oksotrofları taranması için çoğaltma kaplama nasıl kullanıldığına ilişkin yöntemler sunulmaktadır. Bu mutagenez tekniği ident için, farklı bakteri türleri, örneğin antibiyotik ve metal dirençleri gibi diğer fenotipleri, araştırmak için kullanılabilmektedirveya bunun genetik veya mikrobik fizyolojisi doğal bir laboratuar bileşeni öğretmek için sentetik biyolojisi çalışmalarında tanımlanmış bir kültür koşulları altında büyüme için gerekli olan genlerin az sayıda seçmek ile.

Protocol

Competent Cells'e ^5,11 1. Elektroporasyon

1. Enterobacter sp bir O / N LB kültürünü sulandırmak. Taze LB ortamında 50 ml YSU 1/20 ve 0.4 ve 0.6 arasında bir OD (600 nm), 30 ° C, 120 rpm'de sallama ve büyür. İsteğe bağlı olarak, optimal çoğalma sıcaklığında diğer bakteri soyları büyür.
2. 5 dakika santrifüj 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 7,000 x g buz üzerinde hücreleri soğutun.
3. , Supernatant 4 ° C'de steril buz gibi soğuk su ve santrifüj 50 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 5 dakika süreyle 7,000 x g. Bu adımı tekrarlayın.
4. Süpernatant atılır ve hücre topağı hacmine eşit buz gibi soğuk su hacminde tekrar süspansiyon hücreleri. Uzun süreli depolama için -80 ° C arasında ve çözülme buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, depo eşit pelet hacimde buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, tekrar süspansiyon 10 ml Hücreleri yıkamak Elektroporasyonun önce buz üzerinde.
5. 40 ul transposome 0.5 ul eklehücreler. Ticari olarak temin edilebilen transposome çözeltisi 0.33 ug / ul DNA konsantrasyonda sağlanır. 0.33 ug tavsiye edilir, ancak, 0.165 mg DNA yeterlidir.
6. Bir buz soğukluğunda, 0.2 mm elektroporasyon küveti içinde hücre / transposome karışım konulur ve küvetin altındaki karışımın dokunun. 25 iF 200 Ω ve 2.5 kV hücreleri Şok. , Hücreler soğutulmuş kalmasını sağlamak kullanılmadan önce -20 ° C derin dondurucuda elektroporasyon küvetleri saklamak için.
7. Hemen, katabolik baskı (SOC) ortamı ile süper optimum suyu sterilize filtre 960 ul ekleyin. Aşağı yukarı pipetleme ile karıştırın ve steril bir 1.5 ml mikrofüj tüpe hücreleri aktarın.
   NOT: Hücreler şoktan sonra ölmeye başlar, ama SOC ortamında tuz onları kurtarmak için olanak sağlar. Tasarruf için, transposome eklemek ya da negatif kontrol hücreleri şok için gerekli değildir. Sadece bunu steril SOC orta 960 ul ekleyin.
8. 30 ° C f hücreleri inkübeya da 120 rpm'de çalkalayarak 45-60 dakika. Bu kanamisin direnci ifade transposome hücreler, konakçı genomu ile için rekombine için zaman sağlar.
9. LB-kan agar plakası üzerinde 100 ul hücre yayıldı ve 30 ° C de bord O / N inkübe edin. 4 ° C'de buzdolabında kalan dönüşüm karışımı saklayın. Gerekirse ilk elektroporasyon 2 hafta sonra bir sonraki tarih kadar ek miktarda yayıldı.

Transformantların 2. Gridleme

1. Bant boş bir 100 x 15 mm Petri kabı kapağı için bir ızgara. "Bakteriyel Genetik A Short Course" ¹² bir ızgara kopyalayın.
2. LB-kan agar levhasının alt tarafında bir çizgi çizin. Izgara agar boyunca görünür şekilde gridded kapağın onu tutturmak için bant küçük bir parça kullanın. Plakanın alt çizgi, ızgaranın üst, merkezi ile hizalanmış olduğundan emin olun. Bant ile plaka Sabitleştirilmesi bile gridding için izin kaymasını onu tutar. Hat çoğaltma sonra kaplama koloni tespitini kolaylaştırır.
3. Steril bir kürdan ile bir tek transforman almak ve ızgara bir kare merkezinde o noktaya. Sadece koloni ve yere dokunur. Agar içine kürdan kazmak yok. Plaka kirletmesini önlemek için, yalnızca bir ucunda kürdan anlaştım.
4. Adım 2.3 olarak bitişik bir karede başka dönüştürülmüşü nokta. Plaka dolduğunda, 30 ° C / o n inkübe. Bu ana plaka.

3. Kopya Kaplama auxotroph fenotipe ¹² belirleme

1. LB-kan için M-9-kan için LB-kan için bir, iki ve üç: gridded her plakanın için, bir ile üç numaralı üç taze agar plakaları destesini yapmak. Kullanımdan önce 37 ° C 'de, ters O / N plakaları kurutunuz.
2. Aşama 2.2 olarak her bir plakanın üstünde bir çizgi çizin.
3. % 70 etanol ile çoğaltma kaplama aracı silin kopya kaplamanın üstüne steril bir pamuklu kadife kare yerleştirmekol ve kadife kare dizginlenebileceği. Eller hatta onları yıkadıktan sonra mikroplarla iç içedir. Kenarndan kadife kare ele mikropları kirletici girişini önlemek.
4. Kelepçe üzerine çizilen bir çizgi ile ana plaka üzerinde çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne plaka yerleştirin. Kadife meydanına plakadan bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Bakterileri smear için dikkatli olun. Kadife meydanından ana plakasını sökün.
5. Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka numaralı çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plakasına kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın.
6. Su behere kadife kare atın ve adım 3.3 gibi çoğaltma kaplama aracı üzerinde temiz, steril pamuklu kadife kare yerleştirin. Bu adım aşırı aşılamadan atılım büyüme ve yanlış pozitif sonuçlara neden önler.
7. Hizalayınkelepçe üzerinde çizgi ile plaka numarasına bir line ve yeni kadife kare üstüne yerleştirin. Kadife meydanına plaka numara gelen bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın.
8. Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka sayısı iki çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plaka sayısı iki kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası iki çıkarın.
9. Plaka numarası üç için yineleyin 3.8. Üçüncü levha ise bir diğer iki levha için ana plaka tam devri için bir kontroldür. Su ihtiva eden bir kap içine kadife kare atın. Onları kuru, yıkayın alüminyum folyoya sarın ve bunları yeniden kaynatmayın, kirlenmiş pamuklu kadife kareler içeren beher otoklavlamayın, kadife kareler tekrar kullanmak için.
10. 30 ° CO / N de inkübe. Her iki LB-kan agar plakaları üzerinde büyür ancak M-9-kan plakalarına büyümeye başarısız koloniler oksotroflan (olduğu düşünülmektedir
11. Streak dışarı taze LB-kan agar plaka üzerine plakası itibaren oksotroflan ve 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır.
12. Izolasyon taze LB-kan plaka üzerine adım 3.11 çizgi plaka 3 koloniler için dışarı Streak. 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır. Bu mutant iyi izole olmasını sağlar. Bir bölümde her koloninin dışarı üçte içine plaka ve çizgi bölün.
13. Taze LB-kan plaka üzerine adım 3.12 türetilen üzerine şerit kolonilerden Spot koloniler adımlar 2,1-2,4 gibi bir tablo oluşturmak için. Her mutant üçlü olarak yeniden test ediliyor.
14. Oksotrofu fenotip onaylamak için adımlar 3,1-3,10 gibi yine plaka çoğaltmak.

4. Gen Kurtarma

1. 30 ° C de sıvı LB-kan ortamı içinde aşama 3.13 arasında bir izole edilmiş mutant bir koloni 3 mi göre O / N kültür büyütün. Bir ticari olarak temin edilebilen genomik bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak kültürün 1 ml genomik DNA arındırın.
2. 0.025 U karışımı kurmakBFU CI kısıtlama endonükleaz ve buz üzerinde 20 ul reaksiyon / ul genomik DNA 1 mcg 14 ul. BFU CI oniki farklı sitelerde transpozonunda keser bu yana, restriksiyon endonükleaz, BFA I veya sırasıyla, iki ve üç farklı sitelerde transpozonunda keser Hae III, kullanmak daha verimli olabilir.
3. 25 dakika boyunca 37 ° C'de reaksiyonu inkübe ve daha sonra 80 ° C de 20 dakika enzimler inaktive edildi. % 0.8 agaroz jeli (Şekil 3), kısmen sindirilmiş DNA 3 ul analiz eder. Jel dibine yukarıdaki 10 kb bir karalama başarılı kısmi sindirimi sonuçları.
4. 500 ul reaksiyon maddesi içinde T4 DNA ligazı 800 birimleri kullanarak kısmen sindirilmiş genomik DNA 15 ul Arter. Reaksiyon O / N 4 ° C'de inkübe edin. Büyük bir reaksiyon hacmini kendileri tek fragmanların ligasyonu arttırır, ve iki ya da daha fazla DNA fragmanları arasındaki etkileşimi en aza indirir.
5. Bir çökeltite 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ve 1 ml% 95 etanol içinde 50 ul ilave edilmesi ve 20 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edilerek Bağlı DNA.
6. % 70 etanol ile yıkayın pelet, 10 dakika boyunca 4 ° C'de DNA ve 13,500 xg mikrofüj santrifüj vakum yoğunlaştırıcısı kurutun ve nükleaz serbest su 10 ul içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Seçenek olarak ise, DNA, havada 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurutulabilir.
7. E. dönüştürmek için yeniden süspanse DNA 4 ul kullanın bölüm 1. R6k γ replikasyon orijini olarak elektroporasyon ile E. coli suşu ECD100D pir veya ECD100D pir116 ⁶ çoğaltmak için bir pir gen ile bir bakterinin gerektirir. Düşük kopya plasmidlerde pir zorlanma sonucu, ve pir116 gerginlik yüksek kopya plazmidler sonuçlanan bir pir mutant genini içerir. Her bir transformant transposon ve kesintiye kromozom (Şekil 1 E) bir bölgesi ile bir plazmid içerir.
8. InokülasyonlaraTek bir koloni LB-kan, ortamın 5 ml yedi, 120 rpm'de ve 37 ° C'de çalkalama ile G / Ç N çoğaltılmasını ve ticari bir kit kullanılarak bütün O / N kültürden plazmid DNA saflaştırılması.
9. Kısıtlama endonükleaz Xhol I'in kullanılması suretiyle plazmidin 14 ul Digest Reaksiyonun nihai hacmi, 20 ul olduğundan emin olun. Bu enzim, kanamisin direnç geninin 5 'ucundaki transpozonun ortasında bir site tanır. Sindirilmemiş 10 ul analiz eder ve bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 3) ile sindirilmiş plasmide. Plasmid 2 kb transpozon artı eteklenen konukçu DNA'dan oluşur.

5. DNA Dizilimi

1. Bir ticari olarak temin edilebilir dizileme kiti, transposon her bir ucuna homolog olan primerler ve bir kılcal dizilim analizi sistemi kullanılarak plazmid dizisi. Seçenek olarak ise, plazmid sekanslama için bir dış kuruma sevk edilebilir.
2. Moleküler ağırlık standardı (1 kb merdiven) kullanımJel plazmidin boyutunu tahmin etmek. Daha sonra, 50 fmol için gerekli olan plazmid nanogram (ng) kestirilebilir.
3. 260 nm ₍₂₆₀₎ ve 280 nm (A ₂₈₀₎ dalga boylarında bir spektrofotometre kullanılarak plazmid DNA konsantrasyonu ölçümü. Küvetinden geçen ışık uzunluğu 1 cm olduğundan emin olun. 50 ng / ml ile 260 nm'de absorbansı çarpılarak konsantrasyonunun belirlenmesi. Yüksek kaliteli plazmid DNA, bir A ₂₆₀ / 1.8 ve 2.0 arasında bir ₂₈₀ oranına sahip olacaktır.
4. Her sekanslama reaksiyonu için gerekli DNA hacmi plazmid konsantrasyonu ile bölünen, 50 fmol için gerekli ng sayısıdır. 10 ul toplam hacmi getirmek için su ile gerektiği plazmidin miktarda karıştırın.
5. 1 dakika boyunca 96 ° C 'de plazmid DNA / su karışımının ısıtılması ve daha sonra oda sıcaklığına kadar soğutulması.
6. Dizileme kiti ana karışımı 8 ul ve sekanslama primerleri birinin uM 1.6 2 ul ekleyin.
7. Foltermal döngü programı ve reaksiyon temizliği için dizileme kiti düşük protokolü.
8. Bir kılcal DNA analiz sistemi kullanılarak her bir örnek analiz edin.
9. DNA dizisini görüntülemek için piyasada satılan bir yazılım paketi kullanın. Transposon (Şekil 4) ve son 7 bp dizisi, "5'-GAGACAG-3 '," ara. Bu 7 bp'lik segment 5 'ucunda önce sırası transposon aittir. Bu 7 bp'lik segment 3 'ucundan sonraki sekansı kesintiye uğramış gene aittir.
10. Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) ^7,8 kullanılarak kesilen genin olası fonksiyonunu belirler. Aşağıdaki kullanın link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Interrupt'ının dizisini yapıştırınsorgu kutusuna ed gen, veritabanı altında "diğerleri" seçeneğini seçin ve sayfanın altındaki "BLAST" üzerine tıklayın. Sonuç göründüğünde, hizalama sonuçları (Şekil 5) görüntülemek için sayfayı aşağı kaydırın.

Representative Results

Enterobacter sp dönüşümü. Transposome ile elektroporasyon yöntemiyle YSU bunlar, konakçı genomu (Şekil 1A, B) rastgele genom ekleme başlatmıştır. Başarılı bir elektroporasyon LB-kan plakaları üzerinde büyüdü birkaç bin Transformantları vermiştir. 300-400 elde edilmesi için, plaka başına koloni iyi aralıklı, her bir LB-kan agar plakası üzerinde bir dönüşüm karışımı, toplam yayılan optimize edilmiştir. Her Transformant en az bir transposon eki içerdiği, ancak M-9 ortamda büyüme için önemli bir gen replika plaka ile tarama olmadan kesildi eğer belli değildi. Transformantlar M-9 ortamına kaplandı 88 ızgaralar ve yinelemede yeni LB-kan plakalarına aktarılmıştır. Transpozon, Protokoller bölümünde M-9 ve orta plakalara kanamisin eklenmesi tavsiye transformantlarda muhafaza edilmesini sağlamak için, dikkat edin. M-9 orta bu durumda kanamisin ile takviye edilmiş, ancak bu olmadan oksotropları elde edilmesi hala mümkündü değildi. Içinde (Şekil 1C) LB aracı madde içinde yer almayan ancak, bir amino asit, bir nükleik asit ya da bir vitamin sentezinde dahil olan genlerdeki kesintileri ihtiva etmiştir. Diğer 86 kolonileri E-9 minimal ortamda büyümesi için gerekli olan bir genin bir kesinti yoktu.

Bazı koloniler replika plaka sırasında komşu kolonileri ile kirlenmiş olabilir. Saf kültürün bir mutantı ayrıştırmak için, bir yeni LB-kan agar plakası üzerine Aşama 3.1 LB-kan plakası itibaren çizilmiş ve 30 ° C'de O / N büyütüldü. Büyüdü üç koloni, ikinci yeni LB-kan plaka üzerine çizilmiş ve 30 ° C'de O / N büyütülmüştür. Bundan sonra, üç kolonilerin her birinden ortaya çıkan bir koloni, bir üçüncü yeni LB-kan plaka üzerine tespit edildi. Yineleme, bir M-9 minimal medi üzerine geri kaplamaum plaka, üç kopya halinde Şekil 2 'de gözlendi okzotrofik fenotip sunmaktadır. Bir 2013 Microbial Physiology sırasında filtrelenmiş 1760 transpozon transformantların, 23 oksotroflan idi.

Bir oksotrofdan kesintiye uğramış geni daha sonra gen kurtarma kullanılarak belirlenmiştir. Yukarıdaki ikinci sürme levhanın (3,13 Adım) için bir oksotrofik koloni, LB-ortamı içinde kan O / N büyütüldü, ve genomik DNA, genomik DNA saflaştırma kiti kullanılarak kültürden saflaştırılmıştır. Agaroz jel elektroforezi saflaştınlmış DNA, boyutu daha büyük olan 10 kb'lık (Şekil 3, bölüm 2) olduğunu göstermiştir. Transpozon içeren ve ana bölge (Şekil 1D) kesintiye yan yanadırlar küçük parça halinde genomik DNA kırmak için, kısmen, 37 ° C'de 25 dakika süreyle BFU CI 0.025 birimleri ile sindirilmiştir. Yaklaşık her 200-500 baz çifti ortaya 5'-GAİK-3 'siteleri Bu kısıtlama endonükleaz keser. Orada bile olsatransposon içindeki on iki 5'-GATC-3 'bölgeleri vardır, konakçı genomu sağlam transpozon içeren ve komşu parçaları hala çok sayıda, kısmen sindirilmiş DNA mevcut olacaktır. Şekil 3'de görüldüğü gibi bir şerit 3, kısmen 0.5 kb aşağıdaki tüm yol jelin dibine, 10 kb üzerinde başlayan bir DNA yayması ile sindirilmiş genomik DNA'nın. DNA yayma 2 kb aşağı başlarsa, transpozonun boyutu, daha sonra DNA çok dijeste edilmiştir. Bu eklenen enzim miktarı, 37 ° C de inkübasyon süresi ya da her ikisi azaltmak için gerekli olacaktır. Yayma ve dijeste edilen DNA ile şerit sindirilmemiş DNA ile DNA ile aynı boyutta mevcut ise, o zaman herhangi bir sindirim oluştu. Bu, 37 ° C'de kuluçka süresi ya da her ikisinin ilave enzim miktarını artırmak gerekli olacaktır. Bunun yerine BFU CI kullanarak, bu kısıtlama, iki ve üç farklı sahada transpozonun kesilmiş BFA I ya da Hae III, endonükleazlar kullanmak mümkün olabilirsırasıyla. Bu enzimlerin herhangi birinin kullanımı, E. artırabilir Gen kurtarma sırasında coli pir ⁺ dönüşüm verimi.

Kısmen sindirilmiş DNA, bir 500 ul reaksiyon bağlanmıştır. Bu artan hacmi diğer DNA fragmanları arasındaki etkileşimi en aza indirilir ve kendisi ile bağlanmıştır, her parçası, dairesel bir molekül oluşturmak üzere olasılığını maksimize etmiştir. Bağlı DNA çökeltildi ve E. coli içine elektroporasyon ile transforme edilmiştir E. coli suşu ECD100D pir116. Transformasyon karışımı, LB-kan plakalarına alana yayılır. Büyüyen koloniler transposon ve kesintiye ev sahibi genin (Şekil 1E) bir bölgede oluşan bir plazmid içermiştir. Koloni oluşturan birimlerin sayısı 0 ila dönüşüm karışımı ml'si başına 2,000 arasında değişmektedir. Yan kromozomal bölge E'ye toksik bir protein kodlanmış ise coli konakçı, dönüşüm etkinliği düşük ya da kromozomal sadece küçük kademeli olarakBazı yeni plazmid ile ilişkilendirilmiştir. Plazmid DNA, tek bir transformant ile aşılanır ve kanamisin direnç geninin 5 'ucuna yakın bir transpozonun merkezinde tek sitesi tanınan sınırlama endonükleazı, Xho I ile sindirilmiş, bir kültürden saflaştırılmıştır. Şekil 3'te Şerit 4 sindirilmemiş plazmid içerir ve şerit 5 sindirilmiş plazmit ihtiva eder. Arıtılmış, plazmid DNA, süper olma eğilimindedir, çünkü, bu doğrusal aynı iplikli DNA'yı dijeste daha hızlı bir oranda geçirilir. Bu plazmidin doğru boyutta 3 kb'dir. Bu transpozonun 2 kb, artı kesilen ev sahibi genin yaklaşık olarak 1 kb ihtiva etmiştir. Eteklenen konukçu DNA, bir ya da daha Xho I tanıma yerleri içeriyorsa, iki ya da daha çok plazma grupları I DNA ile sindirilmiş Xhol ile şeritte gözlenecektir.

Şekil 4, bir oksotrofdan izole edilmiş bir plazmid için ardışık sonucunu göstermektedir. SHO çıkarıldıktan sonraKalın RT transposon dizisi, konakçı DNA sekansı Temel Lokal Hizalama Arama Aracı (BLAST) analizi ^7,8 tabi tutulmuştur. BLAST sonuçlarından biri kesilen sekansı bir Enterobacter cloacae subsp benzer olduğunu göstermiştir. cloacae NCTC 9394 (EMB | FP929040.1 |) -L-tirosin ve L-fenilalanin (Şekil 5) ¹³ biyosentezinde yer almaktadır korismat mutaz, gen. Bazen, kısmen sindirilmiş genomik DNA'nın ligasyonu sırasında, doğrusal transpozon, bir veya daha fazla başka BFU Cl fragmanları bağlar. Bir genin kimlik aniden değiştirir çünkü bu BLAST kafa karıştırıcı sonuçları yapabilirsiniz. Örneğin, başka bir okzotrofunun ilk 41 baz çifti, prolin biyosentezine ^{1 'de} yer almaktadır glutamat-5-dehidrogenaz için bir gen eşleştirilir. Daha sonra, bir sonraki 219 baz çiftli lipit A-disakaritler, bir 62 baz çifti segmenti ile takip eden bir ribonükleosit-difosfat redüktaz alt-birimi için bir başka gen de eşleştirilir haride kinaz olabilir. Son 295 baz çifti segmenti yeniden glutamat-5-semialdehit dehidrogenaz'a eşleşti. BFU CI için 5'-GATC-3 sitelerinin varlığı, iki daha küçük DNA fragmanları kurtarılan plasmidine lige önerdi. Bu nedenle, bağlama reaksiyonları için, kısmen sindirilmiş DNA seyreltme tamamen küçük fragmanların ligasyonu kaynaklanan arka planı elimine etmez. Bu sonuçlardan, bu gen için sekans transposon hemen bitişik olduğu için transposome glutamat-5-dehidrogenaz için gen kendi içine sonucuna varılmıştır. Diğer oksotroflan metionin biyosentezine katılan cystathione p liazı için geninde kesinti bulunan; histidin biyosentezine katılan histidinol dehidrojenaz için; serin, glisin ve sistein biyosentezine katılan fosfoserin fosfataz için; ve lösin, izolösin ve valin biyosentezinde ^{1 'de} yer ketol asit redüktoizomerazının için.

nt "fo: keep-together.within sayfa =" always ">
Şekil 1. Transpozon mutagenezi. (A) ortam glikoz içeren E-9 minimal tuz büyümesi için gerekli olan bir geni içeren bakteri hücreleri. Kutulu M-9 da okzotrofik bir geni ifade eder. (B) transposome elektroporasyon ile bakteriyel soyu içine dahil edilir, ve her bir mozaik ucuna bağlı transposaz proteini (oklar) rastgele konakçı kromozomuna ^3,4 içine transpozon ekler. Sadece transpozon içeren başkalaşımlar, LB-kan ortamı plakaları üzerinde büyüyecektir. (C) Transformantlar glikoz içeren E-9 ortamı üzerine ve LB-kan ortamı üzerine koyulur ve çoğaltma bulunmaktadır. Başarısız Transformantlar glükoz auksotroplan olan ihtiva eden E-9 ortamı üzerinde (çapraz-out) büyümeye. (D) Genomik DNA, oksotrofları saflaştırılır ve kısmen 4-baz Kabloları parçalama ile sindirilmektedirEr, DNA bölge olarak tanımlandığı BFU Cl, 5'-GATC-3 '. (E) kısmen sindirilmiş DNA, T4 DNA ligazı ile muamele edilmiş ve E. coli içine elektroporasyon ile transforme edilir E. coli suşu ECD100D pir transpozonun ve M-9 ortamda büyüme için gerekli olan kesilen kromozomal genini içeren bir plazmid oluşturulabilir. Pir geni plazmitte ⁶ içinde replikasyon orijini olarak hizmet etmek transposon olarak R6K γ replikasyon orijinini ihtiva eden dairesel DNA parçaları için izin verir. Kanamisin direnç geni, yeni plazmid için seçilebilir bir işaretleyici olarak hizmet vermektedir. Plazmid arındırılır, ve kesilen genin bir ~ 500 bp dizisi transpozonun her bir ucuna homolog primerler (oklar) ile belirlenir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Replica Kaplama Şekil. LB-kan agar plakası üzerine transfer edilmiştir transformantların (A) Taşıyıcı. (B), bir M-9 levha transfer edildi, aynı transformantların Izgara. Oksotroflan ancak M-9 ortamı plakaları üzerinde LB-kan plakalarına büyüdü. Bu siyah kareler tarafından tespit edilir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3.% 0.8 agaroz jeli Şerit 1:. 1 kb merdiveni. Şerit 2: sindirilmemiş genomik DNA olabilir. Şerit 3: BFU Cı kısmen sindirilmiş genomik DNA'nın. Şerit 4: sindirilmemiş kurtarıldı plazmaid. Şerit 5: Xhol kurtarıldı sindirilmiş plazmit kullanmak avantajlıdır.

Bir plazmitin 4. Kısmi DNA dizisi Şekil. Kalın olarak dizisi transpozonun bir parçasıdır ve BLAST analizi için gönderilmiştir değildi. Dizisinin geri kalan kısmı, ana bilgisayardan kurtarılan bir gen bölümüdür.

Şekil 5. BLAST analizi ^7,8. Birinci taban (sorgu) başlanarak, kesintili bir gen fenilalanin ve tirosin biyosentezine katılan bir Enterobacter cloacae korismat mutaz, kodladığı görülmektedir.

Discussion

Bir transposome kullanarak transpozonunun mutagenez Enterobacter sp oksotropları üretmek için etkili bir araçtır. YSU ve Gram negatif diğer türleri ve Gram pozitif bakteriler ^3,4. Işlem elektroporasyon ile konakçıya Tn 5 türevi transposome katılmasıyla başlatıldı. Uçlar ile kolonilerini teşhis etmek için, dönüştürülmemiş hedef soyu transposon tarafından taşınan direnç seviyesi seçmek için kanamisine karşı duyarlı olması gerekiyordu. Bazı ana bu şekilde konakçı genom ile rekombine önce transpozon DNA'yı sınırlama endonükleaz üretir. Elektroporasyon karışıma bir kısıtlama endonükleaz önleyicinin eklenmesi bozulmayı en aza indirmek ve dönüşüm verimi ³ arttırabilir. Elektroporasyon Güçlü bakterilerin hazırlarken tuzunun varlığının neden bakteri öldüren bir elektrik ark veya kıvılcım önlemek için mümkün olduğu kadar, bu kadar fazla tuz çıkarmak için çok önemliydi. Hatta yokluğundaBir elektrikli ark, hücreler tarafından şok sonrası hızlı bir şekilde ölmeye başladı. SOC büyüme ortamını içeren bir tuzunu ekleme hemen ozmotik dengesi, en aza, hücre ölümü ve artan transformasyon etkinliğini ⁵ geri. Kanamisin dirençli transformant sonra M-9 minimal ortam agar plâkaları üzerine taze LB-kan plaka ve çoğaltma üzerine tespit edildi. Mümkün oksotropları kaçırma yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir aşırı aşı önlemek için, kadife kareler plakaların geri kalanı aşılanmıştır önce adım 3.6 ile değiştirilmiştir. Ardından, çoğaltma kaplama sırasında, yeterli basınç komşu koloniler arasında lekelere veya kirlenmeye neden olmadan koloniler aktarmak için uygulanmıştır.

Oksotrofları içinde mutasyona uğramış gen, kurtarma ile tespit edilmiştir. Her oksotrofdan genomik DNA tr kesme BFA I ya da, Hae III kullanarak BFU Cı I kısmi sindirim kesici sık-baz ile kısmi sindirim kullanılarak kesildiansposon daha az, transpozon transformasyon etkinliğini geliştirmek olabilir. Bu transposon içindeki the yoksun diğer sınırlama endonükleazları, 6-taban ve 8-bazlı kesici, tam bir sindirim kullanmak da mümkündür. Parçalanan DNA daha sonra bağlanmıştır ve E. coli içine transforme edildi E. coli suşu ECD100D PIR veya ECD100D pir116 ^6. E. rağmen E. coli suşu pir116 aşama 4.8'de elektroporasyon ile transforme edilmiş, kimyasal olarak kompetan hücrelerini kullanmak da mümkündür. Bu durumda, bütün dönüşüm kurtarılan plasmidlerin yelpazesi elde etmek üzere yayılmalıdır. Daireselleşmiş Transpozonları bir düşük kopya sayılı plazmid olarak çoğaltmak için pir gen sağlar ve pir116 mutant gen yüksek bir kopya plazmid olarak çoğaltılmasını sağlar. Pir116 suşu kullanılarak, bu düşük bir dönüşüm verimi orijinal ana toksik gen ürünlerinin ifade edilmesine bağlı olabilir. Toksisite düşük kopya kullanılarak indirgenebilir pir zorlanma düşük plazmid verim dizileme daha zorlu yapabilirsiniz.

Genomik sıralama ¹⁰ ve PCR sıralama ¹⁴ gen kurtarmaya alternatif yöntemlerdir. Genomik dizileme yöntemi saflaştırılmış genomik DNA'dan doğrudan yan taraflarında bulunan kromozomal bölge dizileri. Hedef organizmanın genomu zaten dizilenmiş olan, bu strateji yararlıdır. Mutasyona uğramış bölge genomik dizileme ve BLAST tarafından tespit edildikten sonra, tüm bölgesi PCR ile büyütüldü ve daha fazla analiz için klonlanabilir. PCR yöntemi, iki PCR reaksiyonları ve dört farklı primer kullanır. Ilk tepki çiftleri kısa DNA, bağlayıcı dizisini (astar 2) içeren bir dejenere primer ile bir transpozonunun homolog primer (astar 1). İkinci PCR reaksiyonu homolog bir bağlantı kurucu dizi primer (astar 4) ile bir iç içe PCR reaksiyonu, bir transpozon homolog primeri eşleştirilmesi (primer 3) 'dir. Astar 3 astar sitedirDaha sonra primer 1 için hazırlama site 3 'tarafında bulunan ikinci bir PCR reaksiyonundan kaynaklanan, amplicand temizlenir ve dizilir. Bu otomatik dizileme yöntemi hem genomik DNA saflaştırılması ve plazmid kurtarma için ihtiyacı ortadan kaldırarak, mutant hücrelerin doğrudan DNA güçlendirir.

Bunun yerine oksotrofinin içerisinde yer alan genleri belirleme, transpozon mutajenezi diğer kolay tahlil fenotipini. Enterobachter incelemek için kullanılabilir. YSU dayanıklı 100 ug / ml ampisilin (yayınlanmamış veriler), aynı zamanda, bir çoklu metal dirençli bakteriyel suşudur. HgCl ₂ Onun için minimum önleyici konsantrasyon (MIC) iyodinin ₃ 80 uM ve NaAsO ₂ ila ⁹ 14 olduğu, _ZnCl2 800 uM'dir, 70 uM'dir. LB-kan plakaları üzerine Transformantları bu gerginlik içine transposome tanıtılması ve gridding sonra, gridded koloniler çoğaltma bu bacte bir MIC altındaki konsantrasyonlarda içeren ortamda metaller üzerine kaplama yapılabilirriyali süzün. Alçaltılmış MIC kurtarılmaya ve bir mutant bir kesintiye uğramış gen dizilim, bu metallerden biri karşı direnç kazandıran bir gen ortaya çıkarabilir.

Üretilmesi mutantlara ilave olarak, transposome, antibiyotik ya da metal direnç olarak işlev genlerinin kazancını belirlemek için in vitro olarak, bir vektör ya da in vivo olarak kullanılabilir. Enterobacter sp in vitro strateji için, genomik DNA olabilir. YSU transpozonun dışında the tanıyan bir sınırlama endonükleazı ile sindirilir. DNA bağlanır ve Mg ^{+ 2} ihtiva eden bir tampon içinde transposome ile karıştırılır. Transposon ve rasgele genomik fragmanlar, E. arasında rekombinasyon sonra E. coli suşu ECD100D pir DNA ile dönüştürülmüş ve ampisilin ya da bir metal tuzu ihtiva eden plakalar üzerine yayılır. Büyümek Koloniler konağın direnç geni yanında bulunan transpozonunda içeren bir plazmid sahip olacaktır. In vivo st içinrategy, Enterobachter. YSU transposome ile transforme edilir. Daha sonra, bütün transformasyon reaksiyonu rastgele transpozon uçlar ile büyük bir nüfusun seçilmesi için LB-kan, sıvı bir ortam içinde büyütülür. Genomik DNA, transposome dışında bölgeleri tanıyan bir sınırlama endonükleazı ile bağlanmıştır ve E. coli içine transforme edilir E. coli suşu ECD100D PIR. in vitro yöntemde olduğu gibi, transformantlar, ampisilin veya metal plakalar üzerine yayılır. Aynı şekilde elde edilen plazmid, bir direnç geni olacak şekilde yerleştirilmiş transpozonun oluşacaktır. Bu iki strateji hedef direnç geni eksprese edilebilir durumunda başarılı ve E aktif olacak coli suşu.

Transpozon mutagenezi, bir bakteri suşu büyüme ^15,16 için ihtiyaç genlerinin az sayıda tespit etmek için kullanılabilir. LoxP the ve farklı antibiyotik dirençli işaretleyiciler ihtiva eden iki transposomes Bu strateji için gerekli olan Ibilinen bir genom sekansı ile Na bakteri suşu. İki transposonlar entegre sonra, ifade CRE rekombinaz transpozonu eklemeleri arasında kromozomal bölgeleri ortadan kaldırarak, iki loxp siteler arasında bir rekombinasyon reaksiyonu katalize. Genom sekansının bilinmesi mümkün silinmektedir hangi genlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Yetiştirme yeteneği elendiği genler, büyüme için gerekli olmadığını göstermektedir. Bu teknik, emek yoğun ve bu stratejiyi kullanarak büyüme için bir asgari genom henüz tamamlanmamıştır. Fakat, PCR dizilemesi kullanılarak, Pseudomonas aeruginosa, otomatik bir transpozon mutagenezi çalışma 300-400 genler zengin ortam ¹⁴ içinde bu bakterinin büyümesi için gerekli olduğu tahmin edilmiştir. Bu çalışma loxp / cre rekombinazından sistemi kullanmak vermedi.

En az genlere sahip mikrop sentetik biyoloji ¹⁷ için de yararlıdır. En az bir genomu olan bir bakteri suşu olup, especiallİstenmeyen yan ürünlerin üretimini ortadan kaldırılması için yararlı y. Örneğin, Clostridium acetobutylicum (C acetobutylicum) biyoyakıt, bütanol ¹⁸ üretmek için kullanılır. Büyüme sırasında, bu suşu hareketsiz faz girmeden hemen önce logaritmik büyüme fazının sonunda butanol üretir. Bu noktada, butanol ve diğer fermantasyon ürünleri hassas hale gelir ve kes bir ürünü sentezlemek üzere atıl endosporlar oluşturur. Transposomes, Clostridium perfringens'in ³ incelemek için kullanılmış olan bu yana, istenmeyen fermantasyon ürünleri ve sporlanma için genler yoksun C acetobutyicum bir suşunu inşa etmek için de benzer bir transposome / loxP / CRE rekombinaz sistemi kullanılması da mümkündür, ama daha büyük için genleri ihtiva edebilir bütanol tolerans. Bu gerginlik az kirletici olan ürün verimini artıracaktır.

Özetle, bu video dergi makalesi ste eksiksiz sağlarTranspozon mutagenezi ile oksotropları oluşturmak için kullanılan prosedürlerin adım açıklaması s. Bu DNA dizilimi ile teknikleri ve kesintiye genlerin belirlenmesi klonlama ile mutasyona uğramış genler tahlisiye, replika plaka ile mutasyonların taranması, elektroporasyon ile transposome tanıtan kapsar. Bu teknik, bilinmeyen genlerin işlevini belirlemek için ya da muhtemelen bir sınai işlemde kullanılabilecek bir bakteriyel suşun oluşturulması için kullanılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis