Summary
Enterobacter sp. YSU växer i glukosminimalt saltmedium. Auxotrofer genereras genom att transformera den med en transposome som slumpvis infogar sig själv in i värdgenomet. Mutanter hittas av replica plating från komplext medium till minimalmedium. Avbrutna gener identifieras genom gen räddning och sekvensering.
Abstract
Prototrofa bakterier växa på M-9 minimala saltmedium kompletterat med glukos (M-9 medium), som används som en kol- och energikälla. Auxotrofer kan genereras med en transposome. Den kommersiellt tillgängliga, Tn 5 härrörande transposome används i detta protokoll består av ett linjärt segment av DNA som innehåller en R6K γ replikationsursprung, en gen för kanamycinresistens och två mosaik sekvens slutar, som tjänar som transposas bindningsställen. Den transposome, tillhandahålls som en DNA / transposas proteinkomplex, inleds med elektroporering i prot stammen, Enterobacter sp. YSU, och innehåller i sig slumpmässigt i denna värd genom. Transformanter är replika ströks ut på Luria-Bertani-agar innehållande kanamycin (LB-kan) och upp på M-9 medel agarplattor innehållande kanamycin (M-9-kan). De transformanter som växer på LB-Kan-plattor men inte på M-9-Kan skyltar anses vara auxotrofer. Renat genomisktDNA från en auxotrof delvis smält, ligeras och transformeras till en pir + Escherichia coli (E. coli) stam. Den R6Kγ replikationsursprung tillåter plasmiden att replikera i pir + E. coli-stammar och den kanamycin-resistensmarkör möjliggör plasmiden val. Varje transformant besitter en ny plasmid som innehåller transposonen flankerad av den avbrutna kromosomal region. Sanger-sekvensering och Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) tyder på en förmodad identitet den avbrutna genen. Det finns tre fördelar med att använda denna transposome mutagenes strategi. Först förlitar sig inte på uttrycket av en transposas-gen av värden. För det andra är transposome införes i målvärden genom elektroporering, snarare än genom konjugation eller genom transduktion och därför är mer effektiva. För det tredje gör R6Kγ replikeringsursprunget det lätt att identifiera den muterade g-en som delvis utvinnes i en rekombinant plasmid. Denna teknik kan användas för att undersöka de som är involverade i andra egenskaper hos Enterobacter sp gener. YSU eller av ett större antal olika bakteriestammar.
Introduction
Prototrofa bakterier växa i M-9 minimala saltmedium innehållande glukos (M-9 medium), omvandling av glukos via centrala kol metabolismvägar för att generera prekursorer, såsom aminosyror, nukleinsyror och vitaminer, för biosyntes 1. M-9 medium innehåller ammoniumklorid som kvävekälla, natrium- och kaliumfosfat som buffert och fosforkälla, magnesiumsulfat som en svavelkälla och glukos som en kol- och energikälla. Luria-Bertani (LB) medium är rikt på aminosyror från trypton och i vitaminer och tillväxtfaktorer från jästextrakt. Den stöder tillväxten av auxotrofer som inte kan syntetisera aminosyror, vitaminer och andra tillväxtfaktorer som behövs för tillväxt på M-9-medium. Således kommer prototrofer växa i LB och M-9-medium, medan auxotrofer kommer att växa i LB-medium, men inte i M-9-medium. Genom att introducera mutationer i ett prot population av bakterier och identifiera muterade gener som orsakar auxotrofa fenotyper är det possible för erhållande av en bättre förståelse av metabolismen i en bakteriestam.
Transposon mutagenes kan användas för att identifiera många av de gener som krävs för tillväxt på glukos i M-9-medium. Transposoner infoga sig själva slumpvis i värdgenomet 2. Genom observation transposonmutanter transformanter på LB-agarplattor och replika plating dem till M-9-medium agarplattor, är det möjligt att screena för auxotrofer. Avbrutna gener identifieras genom gen räddning. Denna studie använder en kommersiellt tillgänglig Tn 5 härledda transposome som levereras som en lösning av en linjär transposon DNA-segment blandat med transposas protein. DNA-segmentet saknar en transposas-gen, men den innehåller en gen för kanamycinresistens, en R6K γ-replikationsursprung och två mosaikmotiv som är DNA-sekvenser för transposas som binder vid varje ände av segmentet 3,4. Eftersom transposas-protein tillsätts direkt till DNA, ensam DNA-segmentetdefinieras som den transposon, och DNA / transposas proteinkomplexet definieras som transposome. Den transposome transformeras genom elektroporation 5 in i ett kanamycin känslig värd (Figur 1A). Kolonier som växer på LB-agarplattor innehållande kanamycin (LB-kan) ha transposonmutanter skär (Figur 1B), och replika pläterade transformanter som misslyckas med att växa på M-9-medium agarplattor innehållande kanamycin (M-9-kan) är auxotrofer (Figire 1C). Genomiskt DNA från en mutant renas och partiellt med den 4-base skär restriktionsendonukleas, BFU CI (figur 1D). Det ligerade DNA: t transformeras in i en stam av Escherichia coli (E. coli) som innehåller pir-genen (figur 1E). Denna gen ger den nya plasmid som innehåller transposonen och flankerande värdkromosomregion att replikera i E. coli 6. Kanamycinresistensgenen fungerar som såelectable markör för den nya plasmiden. Slutligen sekvensera med användning av primrar som är komplementära till vardera änden av transposonen och Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analys 7,8 av den resulterande sekvensen används för att bestämma identiteten för de avbrutna gener.
Denna transposome mutagenes strategi ger tre fördelar 3. Först, eftersom transposas proteinet är bundet direkt till transposonen, insättning inte beror på uttryck av nämnda transposas-gen i värden. När transposonen inkorporerar själv in i värdgenomet, är transposas nedbrytes, vilket förhindrar ytterligare rörelse av transposonet. Däremot kan ytterligare rörelse inte hindras om värden besitter en endogen Tn 5 transpositional element. För det andra, gör införandet av transposome genom elektroporering det möjligt att använda den i en mängd olika värdar. Det eliminerar också behovet av att införa transposonen genom bakteriell konjugering eller viral infektion. Båda processerna kräver värd känslighet. För det tredje, inkludering av kanamycinresistensgenen och R6K γ replikationsursprung i transposome gör det lättare att identifiera den avbrutna genen. Transposon-avbruten regioner kan lagras och sekvenserades såsom plasmider, vilket eliminerar behovet av att använda den inversa polymeraskedjereaktion (PCR) teknik för genidentifiering.
Protokollet presenteras i denna video beskriver varje steg för transposonmutagenes av Enterobacter sp. YSU 9 med en transposome från dess införande i bakteriecellerna till identifieringen av den förmodade gen den avbröts. Förutom tidigare publicerade protokoll 3,4,10, detaljerade förfaranden för användning replica plating för att screena för auxotrofer presenteras. Denna mutagenesteknik kan användas för att undersöka andra fenotyper, såsom antibiotika och metall resistanser, i olika typer av bakterier, för identifying minimalt antal gener som krävs för tillväxt under definierade odlingsbetingelser i syntetisk biologi studier, eller för att lära ett laboratorium komponent i en genetik eller mikrobiell fysiologi kursen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektroporation av behöriga celler 5,11
- Späd en O / N LB-odling av Enterobacter sp. YSU 1/20 i 50 ml färskt LB-medium och odla med skakning vid 120 rpm och 30 ° C till en OD (600 nm) mellan 0,4 och 0,6. Eventuellt odla andra bakteriestammar i sin optimala tillväxttemperatur.
- Chill cellerna på is under 5 min och centrifugera vid 4 ° C och 7000 x g under 5 min.
- Kasta bort supernatanten, resuspendera cellerna i 50 ml sterilt iskallt vatten och centrifugera vid 4 ° C och 7000 x g under 5 min. Upprepa det här steget.
- Kasta bort supernatanten och slamma cellerna i en volym av iskallt vatten lika med cellpelleten volymen. För långtidsförvaring, tvätta cellerna med 10 ml iskall 10% (v / v) glycerol, återsuspendera i en lika stor pellet volym av iskall 10% (volym / volym) glycerol, förvara vid -80 ° C och tining på is före elektroporering.
- Lägg 0,5 ul av transposome till 40 | il avceller. Den kommersiellt tillgängliga transposome lösning tillförs vid en DNA-koncentration av 0,33 | ig / | il. Även 0,33 ug rekommenderas, är 0,165 mikrogram DNA räcker.
- Placera cellen / transposome blandningen i en iskall, 0,2 mm, elektroporering kyvett och tryck på den blandning till botten av kyvetten. Shock cellerna vid 25 ^ F, 200 Ω och 2,5 kV. För att säkerställa att cellerna förblir kyld, lagra elektroporation kyvetter i en -20 ° C frys före användning.
- Omedelbart till 960 pl filter steriliserat super optimal buljong med katabolitrepression (SOC) medium. Blanda genom att pipettera upp och ned och överföra cellerna till en steril 1,5 ml mikrofugrör.
OBS: De celler börjar dö efter chocken, men saltet i SOC-medium tillåter dem att återhämta sig. För att ekonomisera, är det inte nödvändigt att tillsätta transposome eller för att chocka de negativa kontrollcellerna. Lägg bara till 960 l sterilt SOC medium till det. - Inkubera cellerna vid 30 ° C feller från 45 till 60 min med skakning vid 120 rpm. Detta ger tid för transposome att rekombinera med värdgenomet och för cellerna att uttrycka kanamycinresistens.
- Sprid 100 pl av cellerna på en LB-kan agarplatta och inkubera plattan O / N vid 30 ° C. Lagra det återstående transformationsblandningen i kylskåp vid 4 ° C. Sprid ytterligare belopp vid ett senare tillfälle upp till 2 veckor efter den första elektroporering om det behövs.
2. gridding av transformanter
- Tape ett rutnät för att locket på en tom 100 x 15 mm petriskål. Kopiera ett rutnät från "A Short Course in Bacterial Genetics" 12.
- Rita en linje på botten av en LB-kan agarplatta. Använd en liten bit tejp för att förankra den till inrutade locket så att nätet är synlig genom agar. Säkerställa att den linje på botten av plattan är inriktad med toppen, mitten av gallret. Förankring plattan med tejp håller det från att glida, vilket möjliggör även gridding. Linjen underlättar kolonin efter replica plating.
- Välj en enskild transformant med en steril tandpetare och upptäcka det i mitten av en kvadrat i rutnätet. Tryck bara på kolonin och plats. Inte gräva tandpetare i agar. För att undvika kontaminerande plattan, hantera tandpetaren endast vid en ände.
- Spot annan trans i en intilliggande torg som i steg 2.3. När plattan är full, inkubera det O / N vid 30 ° C. Detta är masterplattan.
3. Replica Plating att Bestäm auxotrof Fenotyp 12
- För varje platta som inrutade, gör en stapel med tre färska agarplattor numrerade ett till tre: en för LB-kan, två för M-9-kan och tre för LB-kan. Torka plattorna upp och ned, O / N, vid 37 ° C före användning.
- Rita en linje på den övre delen av varje platta som i steg 2,2.
- Torka replica plating verktyg med 70% etanol, placera en steril velveteen kvadrat ovanpå replica plating tillol och klämma sammets torget ner. Händer vimlar av mikrober även efter att tvätta dem. Förhindra införande av förorenande mikrober genom att hantera sammets torget i kanten.
- Rikta linjen på masterplattan med en linje dragen på klämman och placera plattan ovanpå velveteen kvadrat. Tryck lätt att överföra bakterierna från plattan till velveteen kvadrat. Var noga med att inte smeta bakterierna. Ta masterplattan från velveteen torget.
- Rikta in linje dragen på plattan nummer ett med linjen på klämman och placera den ovanpå velveteen torget. Tryck lätt att överföra bakterierna från sammets torget till plattan. Ta bort plattan nummer ett.
- Släng sammets torget i en bägare med vatten och placera en ren, steril velveteen fyrkant på replica plating verktyget som i steg 3.3. Detta steg förhindrar över ympning som orsakar genombrott tillväxt och falska positiva resultat.
- Rikta inlinje på plattan nummer ett med linjen på klämman och placera den ovanpå den nya velveteen torget. Tryck lätt att överföra bakterierna från plattan nummer ett till velveteen torget. Ta bort plattan nummer ett.
- Rikta in linje dragen på plattan nummer två med linjen på klämman och placera den ovanpå velveteen torget. Tryck lätt att överföra bakterierna från sammets torget till platta nummer två. Ta bort plattan nummer två.
- Upprepa steg 3,8 för platt nummer tre. Den tredje plattan är en kontroll för fullständig överföring från masterplattan med de andra två plattorna. Kassera velveteen kvadrat i en bägare med vatten. För att återanvända velveteen torg, autoklav bägaren som innehåller de kontaminerade velveteen torg, tvätta dem, torka dem, slå in dem i aluminiumfolie och åter autoklav dem.
- Inkubera plattorna vid 30 ° CO / N. Kolonier som växer på båda LB-Kan-agarplattor men misslyckas med att växa på M-9-kan skyltar anses vara auxotrofer (
- Streak ut auxotrofer från plattan nummer ett på en ny LB-kan agarplatta och inkubera plattan vid 30 ° CO / N.
- Streak ut för isolering 3 kolonier från strimma plattan i steg 3.11 på en ny LB-kan platta. Inkubera plattan vid 30 ° CO / N. Detta säkerställer att mutanten är väl isolerad. Dela upp plattan i tredjedelar och strimma ut varje koloni i ett avsnitt.
- Spot kolonier från strimmiga ut kolonierna härrörande från steg 3,12 på en ny LB-kan platta för att bilda ett rutnät som i steg från 2,1 till 2,4. Varje mutant är nytt testas i tre exemplar.
- Replikatplatta igen som i steg från 3,1 till 3,10 för att bekräfta auxotrof fenotyp.
4. Gene Rescue
- Odla en 3 ml O / N-kulturen i en isolerad mutant koloni från steg 3,13 i flytande LB-kan-medium vid 30 ° C. Rena genomiskt DNA från 1 ml odlings med hjälp av en kommersiellt tillgänglig iskt DNA reningskit.
- Sätt upp en blandning av 0,025 UBFU CI restriktionsendonukleas och 14 ^ 1 mikrogram / l iskt DNA i en 20 pl reaktion på is. Sedan BFU CI skär transposonen på tolv olika platser, kan det vara mer effektivt att använda restriktionsendonukleas, Bfa I eller Hae III, som klipper transposonen på två och tre olika platser, respektive.
- Inkubera reaktionen vid 37 ° C under 25 minuter och därefter vid 80 ° C under 20 minuter för att inaktivera enzymet. Analysera 3 pl av det partiellt digererade DNA på en 0,8% agarosgel (figur 3). En framgångsrik partiell spjälkning resulterar i en smutsfläck från över 10 kb ner till botten av gelen.
- Ligera 15 pl av delvis spjälkat genomiskt DNA med användning av 800 enheter T4-DNA-ligas i en 500 pl reaktion. Inkubera reaktions O / N vid 4 ° C. Den stora reaktionsvolymen maximerar ligering av enstaka fragment till sig själva och minimerar interaktioner mellan två eller flera DNA-fragment.
- Precipitate det ligerade DNA: t genom att tillsätta 50 ul av 3 M natriumacetat, pH 5,5, och 1 ml 95% etanol och inkubera det vid -20 ° C under 20 min.
- Mikrofug DNA vid 4 ° C och 13.500 x g under 10 min, tvätta pelleten med 70% etanol, torka den i en centrifugal vakuumkoncentrator, och återsuspendera det i 10 | il av nukleasfritt vatten. Alternativt kan DNA: t lufttorkas vid RT i 15 min.
- Använd 4 pl suspenderades DNA för transformation av E. coli-stam ECD100D pir eller ECD100D pir116 genom elektroporering som i avsnitt 1. R6K γ replikering ursprung krävs en bakteriestam med en pir-genen att replikera 6. De pir stam ger låga kopierings plasmider, och pir116 stammen innehåller en pir mutant gen som leder till höga kopierings plasmider. Varje transformant innehåller en ny plasmid med transposonen och en region av den avbrutna kromosomen (Figur 1E).
- Inoculåt 5 ml LB-kan-medium med en enda koloni, växer det O / N med skakning vid 120 rpm och 37 ° C, och rena plasmid-DNA från hela O / N-kulturen med hjälp av ett kommersiellt kit.
- Smälta 14 pl av plasmiden med användning av restriktionsendonukleaset Xho I. Se till att den slutliga volymen av reaktionen är 20 | il. Detta enzym känner igen ett ställe i mitten av transposonet vid 5 'änden av kanamycinresistensgenen. Analysera 10 pl av den osmälta och digererades plasmiden på en 0,8% agarosgel (figur 3). Plasmiden består av 2 kb transposonen plus flankerande värd DNA.
5. DNA-sekvensering
- Sekvensera plasmid med användning av ett kommersiellt tillgängligt sekvenseringskit, primers som är homologa med varje ände av transposonen, och en kapillär sekvenseringsanalys-system. Alternativt kan plasmiden levereras till en utanför institutionen för sekvensering.
- Använd molekylviktsstandard (1 kb stege) igelén för att uppskatta storleken på plasmiden. Sedan uppskatta antalet nanogram (ng) av plasmid som krävs för 50 fmol.
- Mäta koncentrationen av plasmid-DNA med användning av en spektrofotometer vid våglängderna 260 nm (A 260) och 280 nm (A 280). Säkerställa jusväglängd genom kuvetten är 1 cm. Bestäm koncentrationen genom multiplicering av absorbansen vid 260 nm med hjälp av 50 ng / | il. Högkvalitets plasmid-DNA kommer att ha en A 260 / A-280-förhållande mellan 1,8 och 2,0.
- Volymen av DNA som krävs för varje sekvenseringsreaktion är antalet ng som erfordras för 50 fmol dividerat med koncentrationen av plasmiden. Blanda den volym som krävs för plasmid med vatten för att bringa den totala volymen upp till 10 | il.
- Värm blandningen plasmid-DNA / vatten vid 96 ° C under 1 min och sedan kyla den till RT.
- Lägg 8 | il av huvudblandning från den sekvenseringskitet och 2 | il av 1,6 | iM av en av de sekvenseringsprimrar.
- Follåg protokollet från sekvense kit för termocyklern programmet och reaktions sanering.
- Analysera varje prov med användning av en kapillär-DNA-analyssystem.
- Använd en kommersiellt tillgänglig programpaket för att se DNA-sekvensen. Söka efter sekvensen "5'-GAGACAG-3 '", som är den sista 7 bp av transposonen (Figur 4). Sekvensen före 5'-änden av denna 7 bp segmentet tillhör transposonen. Sekvensen efter 3'-änden av denna 7 bp-segment hör till den avbrutna genen.
- Bestäm möjliga funktion den avbrutna genen att använda det grundläggande Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Använd följande link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Klistra sekvensen av avbrotteted-genen i frågerutan, välj "övriga" under databasen och klicka på "BLAST" längst ner på sidan. När resultatet visas, bläddra ner på sidan för att visa justeringsresultat (Figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transformation av Enterobacter sp. YSU genom elektroporation med transposome initieras slump genomet infogning i värdgenomet (figur 1 A, B). En lyckad elektroporering gav flera tusen transformanter som växte på LB-Kan-plattor. För att få 300-400, väl fördelade kolonier per platta, var mängden transformationsblandningen sprids på varje LB-kan agarplatta optimeras. Varje transformant innehöll minst en transposon insats, men det var inte klart om en viktig gen för tillväxt på M-9-medium avbröts utan screening av replica plating. Transformfördes till färska LB-Kan-plattor i galler av 88 och replik pläterade på M-9 medium. Notera, att säkerställa att transposonen bibehålls i transformanterna, avsnittet Protocols rekommenderar tillsats av kanamycin till M-9-mediumplattor. M-9 medium kompletterat med kanamycin i det här fallet, men det var fortfarande möjligt att få auxotrofer utan den. I
Vissa kolonier kan ha kommit i kontakt med angränsande kolonier under replica plating. För att isolera en mutant som en ren kultur, var det strimmiga från LB-kan plattan nummer ett i steg 3,1 på en färsk LB-kan-agarplatta och odlades O / N vid 30 ° C. Tre kolonier som växte ströks ut på en andra färsk LB-kan plattan och odlades O / N vid 30 ° C. Sedan tillsattes en koloni som uppstod från vardera av de tre kolonierna fläckas på en tredje färsk LB-kan plattan. Replica plätering tillbaka på en M-9 minimal medium plattan verifieras i tre exemplar den auxotrofa fenotyp som observerades i figur 2. Av de 1760 transposonmutanter-trans avskärmade i en 2013 Microbial fysiologi kursen, 23 var auxotrofer.
Den avbrutna genen från en auxotrof sedan identifieras med gen räddning. En auxotrof koloni från den andra strimma plattan ovan (steg 3,13) odlades O / N i LB-kan mediet, och genomiskt DNA renades från kulturen med hjälp av ett genomiskt DNA-reningskit. Agarosgelelektrofores visade att det renade DNA: t var större än 10 kb i storlek (Figur 3, bana 2). För att bryta den genom-DNA i mindre fragment som innehöll transposonen och flankerande avbrutna värd regioner (figur 1D), var det partiellt med 0,025 enheter av BFU CI för 25 min vid 37 ° C. Denna restriktionsendonukleasställen nedskärningar vid 5'-GATC-3 "områden som inträffar ungefär var 200-500 baspar. Även om detfinns tolv 5'-GATC-3 "platser inom transposonen, kommer ett stort antal fragment som innehåller den intakta transposonen och flankerande värdgenomet finnas kvar i den delvis spjälkat DNA. Lane 3 i fig 3 visar partiellt spjälkat genomiskt DNA med ett utstryk av DNA som börjar ovanför 10 kb, hela vägen till botten av gelén till under 0,5 kb. Om DNA smear börjar under 2 kb, storleken på transposonen, då DNA: t har digererats för mycket. Det kommer att vara nödvändigt att minska mängden av enzym tillsattes, 37 ° C, inkubationstid, eller båda. Om det inte finns någon smear och körfält med den omsatta DNA är i samma storlek som DNA med osmält DNA, då ingen matsmältning inträffade. Det kommer att bli nödvändigt att öka mängden av enzym tillsattes, 37 ° C, inkubationstid eller båda. Istället för att använda BFU Cl, kan det vara möjligt att använda restriktionsendonukleaserna Bfa I eller Haelll, som skär transposonen vid två och tre olika platserrespektive. Användning av en av dessa enzymer kan öka E. coli pir + transformation avkastning under gen räddning.
Den partiellt uppslutet DNA ligerades i en 500 pl reaktion. Denna ökade volymen minimeras interaktioner mellan andra DNA-fragment och maxim sannolikheten att varje fragment ligerades med sig för att bilda en cirkulär molekyl. Det ligerade DNA: t fälldes ut och transformerades genom elektroporering in i E. coli stam ECD100D pir116. Transformationsblandningen utbreddes på LB-Kan-plattor. Kolonier som växte innehöll en ny plasmid som består av transposonen och en region av den avbrutna värdgenen (figur 1E). Antalet kolonibildande enheter varierade från 0 till 2000 per ml av transformationsblandningen. Om den flankerande kromosomal region kodade för ett protein som är toxiskt för E. coli-värd, var låg eller endast ett litet segment av kromoformen transformationseffektivitetennågra var associerad med den nya plasmiden. Plasmid-DNA renades från en kultur som ympades med en enda transformant och digererades med restriktionsendonukleas, Xhol, som kände igen en enda plats i centrum av transposonen nära 5'-änden av kanamycinresistensgenen. Spår 4 i figur 3 innehöll osmält plasmiden och bana 5 innehöll klippt plasmid. Eftersom renat plasmid-DNA: t tenderar att vara supertvinnade, migrerade det i en snabbare takt än samma sträng av linjär digererad DNA. Den korrekta storleken på denna plasmid var 3 kb. Den innehöll 2 kb av transposonen, plus ca 1 kb av den avbrutna värdgenen. Om den flankerande värd DNA innehåller en eller flera Xhol igenkänningsställen, två eller flera plasmid band kommer att observeras i körfältet med Xhol omsatta DNA.
Figur 4 visar en sekvense resultat för en plasmid som isolerades från en auxotrof. Efter avlägsnande av short transposon sekvens i fetstil, var värd DNA-sekvensen som lämnats in för Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analys 7,8. En av BLAST resultat föreslog att den avbrutna sekvensen liknar ett Enterobacter cloacae subsp. cloacae NCTC 9394 (emb | FP929040.1 |) genen för korismat mutas, som är involverat i biosyntesen av L-tyrosin och L-fenylalanin (Figur 5) 13. Ibland under ligering av partiellt spjälkat genomiskt DNA, ligerar den linjära transposonen till ett eller flera andra BFU CI-fragment. Detta kan göra det BLAST resultat förvirrande eftersom identiteten för en gen ändrar abrupt. Till exempel de första 41 basparen i annan auxotrof matchas till en gen för glutamat-5-semialdehyd-dehydrogenas, som är involverat i prolin biosyntes 1. Sedan, de nästa 219 basparen matchas till en gen för ett ribonukleosid-difosfat-reduktas-subenheten, följt av en 62 baspars segment för lipid-A-disacc haride kinas. De sista 295 baspar segment matchas till glutamat-5-semialdehyd dehydrogenas igen. Närvaron av 5'-GATC-3 "ställen för BFU CI föreslog att två mindre DNA-fragment ligerades till räddade plasmiden. Således innebär utspädning av partiellt digererade DNA: t för ligeringsreaktioner inte helt eliminera bakgrunden orsakad av ligering av mindre fragment. Från dessa resultat drogs slutsatsen att transposome sätts sig in genen för glutamat-5-semialdehyd dehydrogenas eftersom sekvensen för denna gen var i direkt anslutning till transposon. Andra auxotrofer innehöll avbrott i genen för cystation beta-lyas involverad i metionin-biosyntes; för histidinol dehydrogenas inblandade i histidin biosyntesen; för fosfoserin fosfatas involverad i serin, glycin och cystein biosyntes; och för ketol-syra reductoisomerase involverad i leucin, isoleucin och valin biosyntesen 1.
nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. transposonmutagenes. (A) Bakteriella celler innehållande en gen som erfordras för tillväxt på M-9 minimala saltmedium innehållande glukos. Den inramade M-9 representerar en auxotrof gen. (B) Den transposome införes i bakteriestam med elektroporering och transposas-protein bundet till varje mosaik ände (pilar) infogar slumpvis transposonen in i värdkromosomen 3,4. Endast transposonmutanter innehållande transformanter kommer att växa på LB-Kan-mediumplattor. (C) Transforman är replika utstrykes på M-9-medium innehållande glukos och på LB-kan mediet. De transformanter som inte växer (överkorsad) på M-9 medium innehållande glukos är auxotrofer. (D) Iskt DNA renas från auxotrofer och partiellt med den 4-base cutter, BFU CI, som erkänner DNA site, 5'-GATC-3 '. (E) Den delvis omsatta DNA behandlas med T4 DNA-ligas och transformerades genom elektroporering i E. coli stam ECD100D pir för att bilda en ny plasmid som innehåller transposonet och den avbrutna kromosomal gen, som krävs för tillväxt i M-9-medium. Pir-genen möjliggör cirkulära DNA-fragment innehållande R6K γ replikationsursprung i transposonen att tjäna som ett replikationsursprung i det nya plasmiden 6. Kanamycinresistensgenen tjänar som en selekterbar markör för den nya plasmiden. Plasmiden renas, och ett ~ 500 bp sekvens av den avbrutna genen bestäms med hjälp av primers (pilar) som är homologa med varje ände av transposonet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Replica plätering. (A) Grid av transformanter som överfördes till en LB-kan agarplatta. (B) Grid av samma transformanter som överfördes till en M-9 mellanplatta. Auxotrofer växte på LB-Kan-plattor, men inte på M-9 mediumplattor. De är markerade med svarta rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. 0,8% agarosgel Lane 1:. 1 kb stege. Lane 2: Ospjälkad iskt DNA. Spår 3: BFU C jag delvis smält iskt DNA. Bana 4: Ospjälkad räddade plasmid. Lane 5: Xhol digererad räddade plasmiden.
Figur 4. Partiell DNA-sekvens av en plasmid. Sekvensen i fetstil är en del av transposon och har inte genomgått någon BLAST-analys. Resten av sekvensen är ett segment av de räddade gener från värden.
Figur 5. BLAST Analysis 7,8. Från den första basen (Query), visas den avbrutna genen att koda en Enterobacter cloacae korismat mutas, som är involverat i fenylalanin och tyrosin biosyntesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transposonmutagenes använder ett transposome är ett effektivt verktyg för att skapa auxotrofer i Enterobacter sp. YSU och andra typer av Gram-negativa och Gram-positiva bakterier 3,4. Processen initierades genom att införa Tn 5 härledda transposome i värden genom elektroporering. För att identifiera kolonier med inlägg, den otransformerade målet stammen måste vara känsliga för kanamycin för att selektera för resistens markör bärs av transposon. Vissa värdar producera restriktionsendonukleaser som nedbryter transposonen DNA innan den kan rekombinera med värdgenomet. Tillsats av ett restriktionsendonukleas inhibitor till elektro mixen kan minimera nedbrytning och öka omvandlingen avkastningen 3. Samtidigt förbereder elektroporering kompetenta bakterier, var det viktigt att ta bort så mycket salt som möjligt för att förhindra en elektrisk ljusbåge eller gnista som dödar bakterierna som orsakas av närvaron av salt. Även i frånvaro aven elektrisk ljusbåge, började cellerna att dö snabbt efter att chocka dem. Lägga saltet innehåller SOC odlingsmedium omedelbart återställs den osmotiska balansen, minimerad celldöd och ökad omvandlingseffektivitet 5. Kanamycinresistenta transformades därefter i fläckar på ett färskt LB-kan platta och replikaplattades på att M-9 minimalt medium-agar. För att förhindra över ympning som kan orsaka falskt positiva resultat som missar möjliga auxotrofer var velveteen rutor slås i steg 3.6 innan resten av plattorna ympades. Sedan, under replica plating, var bara tillräckligt tryck appliceras för att överföra kolonierna utan att orsaka utsmetning eller kontaminering mellan angränsande kolonier.
De muterade gener i auxotrofer identifierades genom gen räddning. Iskt DNA från varje auxotrof klipptes med hjälp av en partiell spjälkning med frequent base fräs BFU C I. Partiella digestions använder Bfa I eller Hae III, vilket skär transposon mer sällan, kan förbättra transposon omvandlingseffektiviteten. Det är även möjligt att använda ett komplett uppslutning med andra restriktionsendonukleaser, 6-bas och 8-bas fräsar, som saknar platser inom transposon. Det digererade DNA: t ligerades sedan och transformerades in i E. coli stam ECD100D pir eller ECD100D pir116 6. Även om E. coli pir116 stam transformerades genom elektroporering i steg 4,8, är det också möjligt att använda kemiskt kompetenta celler. I detta fall bör hela transformations spridas för att erhålla ett stort urval av räddade plasmider. Pir-genen gör det möjligt för den cirkulariserade transposonen att replikera som ett lågt kopietal-plasmid, och pir116 mutanta genen gör det möjligt att replikera som en högt kopietal-plasmid. Låga omvandlingsutbyten genom att använda pir116 stammen kan bero på uttrycket av toxiska genprodukter från den ursprungliga värden. Toxicitet kan reduceras genom användning av lågt kopietal
Genomisk sekvense 10 och PCR-sekvensering 14 är alternativa metoder till gen räddning. Den genomiska sekvenseringsmetod sekvenser de flankerande kromosomala regioner direkt från renat genomiskt DNA. Denna strategi är användbar när genomet hos målorganismen redan har sekvenserats. När den muterade regionen har identifierats genom genomisk sekvensering och BLAST kan hela regionen amplifieras genom PCR och klonades för ytterligare analys. PCR-metoden använder två PCR-reaktioner och fyra olika primrar. De första reaktionsparen en transposon homolog primer (primer 1) med en degenererad primer som innehåller en kort DNA-linker-sekvensen (primer 2). Den andra PCR-reaktionen är en kapslad PCR-reaktion, att para ihop en annan transposon homolog primer (primer 3) med en homolog linkersekvens primern (primer 4). Evakueringsplats för primer 3belägen på 3'-sidan av den primande ställe för primer 1. Därefter amplicand från andra PCR-reaktionen städas upp och sekvenserades. Denna automatiserade sekvenseringsmetoden förstärker DNA direkt från muterade celler, vilket eliminerar behovet av både genomiskt DNA-rening och plasmid räddning.
Istället för att identifiera gener som är involverade i auxotrofi kan transposonmutagenes också användas för att studera andra lätt analyserade fenotyper. Enterobacter sp. YSU är en multi-metall resistent bakteriestam som också är resistent 100 | ig / ml ampicillin (opublicerade data). Dess minsta hämmande koncentration (MIC) för HgCl2 är 70 ^ M, ZnCl2 är 800 iM, AgNO 3 är 80 ^ M och NaAsO 2 är 14 mM 9. Efter införandet av transposome i denna stam och gridding transformanter på LB-Kan-plattor, kan den inrutade kolonier replika klädd på medel innehållande metaller vid koncentrationer under MIC för denna bacterial stam. Undsättning och sekvensering av en avbruten gen från en mutant med en sänkt MIC kan avslöja en gen som ger resistens mot en av dessa metaller.
Förutom att generera mutanter kan transposome användas som en vektor in vitro eller in vivo för att identifiera funktionsökning gener, såsom antibiotika eller metall motstånd. För strategin in vitro, genomiskt DNA från Enterobacter sp. YSU digereras med ett restriktionsendonukleas som känner igen platser utanför transposonen. Detta DNA ligerades och blandas med transposome i en buffert innehållande Mg2 +. Efter rekombination mellan transposonen och slumpmässiga genomiska fragment, E. coli stam ECD100D PIR transformeras med DNA och spreds på plattor innehållande ampicillin eller ett metallsalt. Kolonier som växer kommer att ha en ny plasmid som innehåller transposonet ligger intill värdens resistensgenen. För in vivo strategy, Enterobacter sp. YSU transformeras med transposome. Därefter är hela transformationsreaktionen odlades i LB-kan flytande medium för att selektera för en stor population med slumpmässiga transposonmutanter skär. Genomiskt DNA digereras med ett restriktionsendonukleas som känner igen platser utanför transposome, ligerades och transformerades in i E. coli-stam ECD100D pir. Liksom i in vitro-metod, är transform sprids på ampicillin eller metallplattor. Återigen kommer den resulterande plasmiden består av transposonen insatt intill en resistensgen. Dessa två strategier kommer att lyckas bara om målet resistensgenen kan uttryckas och är aktiv i E. coli-stam.
Transposon mutagenes kan användas för att identifiera den minimala antalet gener en bakteriestam kräver för tillväxt 15,16. Två transposomes innehållande loxP platser och olika markörer för antibiotikaresistens krävs för denna strategi ina bakteriestam med en känd genomsekvens. Efter de två transposoner integrera, katalyserar uttryckt Cre-rekombinas en rekombinationsreaktion mellan de två loxP-ställen, vilket eliminerar kromosomregioner mellan transposoninsättningar. Kunskap om den genomsekvensen gör det möjligt att identifiera vilka gener elimineras. Förmågan att växa visar att de eliminerade gener inte krävs för tillväxt. Denna teknik är arbetskrävande, och en minimal genomet för tillväxt med hjälp av denna strategi har ännu inte slutförts. Men uppskattningsvis en automatiserad transposonmutagenes studie av Pseudomonas aeruginosa med hjälp av PCR-sekvensering som 300-400 gener som krävs för tillväxten av denna bakterie i rikt medium 14. Denna studie använde inte loxP / cre rekombinassystem.
Mikrober med minimala genomen är användbara för syntetisk biologi 17. En bakteriestam med minimal ett genom är especially användbart för att eliminera produktionen av oönskade biprodukter. Till exempel Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) som används för att producera biobränsle, butanol 18. Under dess tillväxt, producerar denna stam butanol vid slutet av dess exponentiella tillväxtfasen strax innan den inträder stationär fas. Vid denna punkt blir det känsligt för butanol och andra fermentationsprodukter och bildar vilande endosporer vilka upphör att syntetisera produkten. Sedan transposomes har använts för att studera Clostridium perfringens 3, kan det vara möjligt att använda en liknande transposome / loxP / Cre-rekombinas systemet att konstruera en stam av C. acetobutylicum som saknar generna för icke önskvärda fermentationsprodukter och sporbildning, men innehåller gener för större butanol tolerans. Denna stam skulle öka produktutbytet med minimala föroreningar.
Sammanfattningsvis här videon tidskriftsartikel ger en komplett step för steg beskrivning av de förfaranden som används för att skapa auxotrofer av transposonmutagenes. Det omfattar att införa transposome genom elektroporering, screening för mutationer av replica plating, rädda muterade gener genom kloning tekniker och identifiering av avbrutna gener genom DNA-sekvensering. Denna teknik kan användas för att identifiera funktionen av okända gener eller för eventuellt konstruera en bakteriestam som kan användas i en industriell process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författaren vill tacka alla mina grundutbildning Oberoende forskning Studenter och alla mina Microbial Physiology doktorander som testade mina transposonmutagenes idéer under 2010-2014 vårterminen. Detta arbete har finansierats av Institutionen för Biological Sciences vid Youngstown State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS - Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
- Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J.
- Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
