Summary
엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.
Abstract
Prototrophic 박테리아는 탄소 및 에너지 원으로 사용되는 배지 글루코오스 (M-9 배지)로 보충 M-9 최소 염에 성장. 영양 요구는 transposome를 이용하여 생성 될 수있다. 이 프로토콜에 사용되는 상용, 테네시 (5) 유도 된 transposome은 트랜스 결합 부위의 역할을 R6K γ 복제 기원, 카나마이신 저항과 두 개의 모자이크 순서 종료하는 유전자를 포함하는 DNA의 선형 세그먼트로 구성되어 있습니다. DNA / 트랜스 단백질 복합체로서 제공 transposome는, prototrophic 균주, 엔테로 SP는 일렉트로로 도입된다. YSU, 그리고 무작위로이 숙주의 게놈에 자신을 통합합니다. 형질 전환 체는 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 한천 플레이트 루리아 - 베르 타니에 도금 복제본 카나마이신 (M-9 칸)을 함유하는 M-9 배지 아가 플레이트 상이다. M-9 칸 접시에 LB-관 판에 성장하지만 형질 전환 영양 요구로 간주됩니다. 정제 게놈영양 요구로부터 DNA는 부분적으로 소화 PIR + 대장균 (E. 콜라이) 균주에 결찰 및 변환된다. R6Kγ 복제 원점은 플라스미드 PIR + E.에 복제 할 수 있습니다 콜라이 균주 및 카나마이신 저항 마커 플라스미드의 선택을 허용한다. 각 형질 전환 중단 된 염색체 영역에 의해 측면에 트랜스포존을 포함하는 새로운 플라스미드를 보유하고있다. 생거 시퀀싱 및 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST)는 중단 된 유전자의 추정 정체성을 제안한다. 이 transposome 돌연변이 유발 전략을 사용하는 세 가지 이점이있다. 첫째, 호스트에 의한 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 둘째, transposome는 전기에 의하여보다는 접합 또는 형질 도입에 의하여 대상 호스트에 도입하고, 따라서보다 효율적이다. 셋째, R6Kγ 복제 원점 쉽게 돌연변이 g을 식별 할 수있게부분적으로 재조합 플라스미드에 복구 에너지. 이 기술은 엔테로 박터 (SP)의 다른 특성에 관여하는 유전자를 조사하기 위하여 사용될 수있다. YSU 또는 균주의 넓은 다양한.
Introduction
Prototrophic 박테리아 생합성 1, 아미노산, 핵산, 비타민 등의 전구체를 생성하도록 중앙 탄소 대사 경로를 통해 글루코즈 변환 매체 글루코스 (M-9 매체)를 포함하는 M-9 최소 염 성장. M-9 매체는 탄소 및 에너지 원으로서 황 공급원 및 글루코스 버퍼 및 인 소스, 황산 마그네슘 등의 질소원, 나트륨 및 인산 칼륨 등의 암모늄 클로라이드를 포함한다. 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 트립에서 효모 추출물 비타민과 성장 인자의 아미노산이 풍부하다. 그것은 M-9 매체 상 성장에 필요한 아미노산, 비타민 및 다른 성장 인자를 합성 할 수없는 영양 요구의 성장을 지원한다. 영양 요구는 M-9 매체에 LB 배지에서 성장할 수 있지만 반면 따라서 prototrophs는 LB 및 M-9 배지에서 성장할 것이다. 영양 요 구성 돌연변이 표현형을 야기하는 유전자를 박테리아 prototrophic 인구에 돌연변이를 도입하고 식별함으로써, 포는균주의 대사의 더 나은 이해를 얻을 ssible.
트랜스포존 돌연변이는 M-9 배지에서 포도당에서의 성장에 필요한 유전자의 대부분을 식별하는데 사용될 수있다. 트랜스포존는 숙주 게놈 2에 무작위로 자신을 삽입합니다. M-9 배지 아가 플레이트 상에 LB 아가 플레이트 및 이들을 도금 복제본 트랜스포존 형질을 스폿 팅함으로써, 영양 요구 스크리닝 할 수있다. 중단 된 유전자는 유전자 구조를 통해 확인된다. 본 연구는 시판 테네시 5 트랜스 단백질과 혼합 선형 트랜스포존 DNA 세그먼트의 용액으로서 제공되는 transposome - 유래를 이용한다. DNA 세그먼트는 트랜스 유전자가 부족하지만 카나마이신 저항성 유전자, R6K γ 복제 원점과 세그먼트 3,4의 각 끝 부분에 결합 트랜스에 대한 DNA 서열 두 개의 모자이크 모티브가 포함되어 있습니다. 트랜스 단백질은 DNA 단독 DNA 세그먼트에 직접 첨가되어 있기 때문에트랜스포존으로 정의되고, DNA / 트랜스 단백질 복합체 transposome로서 정의된다. transposome은 카나마이신 민감한 호스트 (그림 1A)에 전기 (5)에 의해 변환된다. 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 성장 콜로니를 카나마이신 (M-9 칸) 영양 요구 아르 함유 M-9 배지 아가 플레이트상에서 성장되지 트랜스포존 삽입 (도 1B), 및 복제 도금 형질 (Figire있을 1C). 돌연변이로부터 게놈 DNA 정제 부분적 4베이스 절삭 제한 엔도 뉴 클레아 제, BFU CI (도 1D)로 분해된다. DNA 라이 게이션은 그 PIR 유전자 (도 1E)를 포함 대장균 (E. 콜라이)의 균주에 형질 전환된다. 이 유전자는 새로운 플라스미드 트랜스포존을 포함하고 E.에서 복제 호스트 염색체 영역을 측면에서는 수 있습니다 대장균 6. 카나마이신 내성 유전자와 같은 역할새로운 플라스미드에 대한 electable 마커. 마지막으로, 중단 유전자의 신원을 결정하는 데 사용되는 트랜스포존 얻어진 시퀀스의 기본 로컬 검색 정렬 도구 (BLAST) 분석 7,8의 각 단부에 상보적인 프라이머를 이용하여 시퀀싱.
이 transposome 돌연변이 유발 전략은 세 가지 장점 (3)를 제공한다. 트랜스 단백질 트랜스포존에 직접 결합되기 때문에 먼저, 삽입 호스트 내의 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 트랜스포존은 숙주 게놈 내로 그 자체를 포함하면 트랜스는 트랜스포존의 추가적인 이동을 방지 저하된다. 호스트가 내인성 테네시 5 transpositional 요소를 소유하는 경우에는, 추가 이동이 방지 될 수 없다. 둘째로, 전기 천공에 의해 도입 transposome은 가능한 호스트 다양한 그것을 사용한다. 또한 접합하여 또는 VI를하여 트랜스포존을 도입 할 필요성을 제거RAL 감염. 두 프로세스는 호스트 감수성을 필요로한다. 셋째, 카나마이신 내성 유전자 및 transposome에서 γ R6K 복제 기원의 포함은 쉽게 중단 유전자를 식별 할 수있다. 트랜스포존 중단 영역 저장 및 유전자 식별을위한 역 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용할 필요가 없어, 플라스미드로 서열화 될 수있다.
이 비디오에 제시된 프로토콜은 엔테로 박터 SP의 트랜스포존 돌연변이 유발을위한 각 단계를 설명합니다. YSU 9는 중단 추정되는 유전자의 식별에 박테리아 세포에 도입에서 transposome를 사용하여. 이전에 출판 프로토콜 3,4,10 이외에 영양 요구에 대해 스크리닝 복제본 도금을 사용하는 상세한 방법이 제시된다. 이 돌연변이 유발 기술은 식별자에 대한 박테리아의 다른 유형에서, 그러한 항생제 저항과 금속과 같은 다른 표현형을 조사하기 위해 사용될 수있다또는 유전학 또는 미생물 생리학 코스의 실험실 구성 요소를 가르치는 합성 생물학 연구에서 정의 된 배양 조건에서 성장에 필요한 유전자의 최소한의 수를 ifying.
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Protocol
관할 세포 5,11를 1. 일렉트로
- 엔테로 박터 SP의 O / N LB 문화를 희석. 신선한 LB 배지 50 ㎖에 YSU 1/20 0.4과 0.6 사이의 OD (600 ㎚)을 30 ° C를 120 rpm으로 진탕과 함께 성장한다. 선택적으로, 최적의 성장 온도에서 다른 균주 성장.
- 5 분 원심 분리기 4 ° C에서 5 분간 7,000 XG 얼음에 세포를 진정.
- , 상층 액을 제거한다 4 ° C에서 멸균 얼음 냉수 및 원심 분리기 50 ㎖의 세포를 재현 탁하고 5 분 동안 7,000 XG. 이 단계를 반복합니다.
- 상청액을 버리고 세포 펠렛 부피 동일 얼음 냉수의 부피로 세포를 재현 탁. 장기 저장을 위해, -80 ° C 및 해동에 빙냉 10 % (v / v) 글리세롤, 매장의 동일한 펠렛 부피 빙냉 10 % (v / v)의 글리세린,에 resuspend 10 ㎖로 세포를 씻어 전기하기 전에 얼음에.
- 40 μL에 transposome의 0.5 μl를 추가세포. 시판 transposome 용액 0.33 ㎍ / ㎕의 DNA의 농도로 공급된다. 0.33 μg의 권장되지만, 0.165 μg의 DNA는 충분하다.
- 얼음 감기, 0.2 mm, 전기의 큐벳에 셀 / transposome 혼합물을 놓고 큐벳의 바닥에 혼합물을 누릅니다. 25 μF 200 Ω, 2.5 kV의를 세포를 충격. 세포가 냉장 상태로 유지되도록 사용하기 전에 -20 ° C 냉동고에서 전기 큐벳을 저장합니다.
- 즉시, catabolite 탄압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 살균 필터의 960 μl를 추가합니다. 아래로 피펫 팅에 의해 혼합 및 멸균 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 세포를 전송합니다.
NOTE : 세포 충격 후 죽기 시작하지만, SOC 배지 염들을 복구 할 수있다. 절약하기 위해, transposome를 추가하거나 음성 대조군 세포에 충격을 할 필요가 없다. 그냥 멸균 SOC 매체의 960 μl를 추가합니다. - 30 ° C F에서 세포를 품어120 rpm으로 흔들어으로 45 ~ 60 분. 이 카나마이신 저항을 표현하는 transposome는 세포 숙주 게놈과과에 대한 재결합을위한 시간을 제공합니다.
- LB-관 한천 접시에 세포를 100 μl를 확산하고 30 ° C에서 판 O / N을 품어. 4 ° C의 냉장고에 남아있는 변환 믹스를 저장합니다. 필요한 경우 초기 전기 후 이주에 나중에 업에 추가 금액을 확산.
형질 전환 2. 리딩
- 테이프 빈 100 × 15mm 페트리 접시의 뚜껑에 그리드. "세균 유전학의 단기 코스"12에서 그리드를 복사합니다.
- LB-관 한천 플레이트의 하단에 선을 그립니다. 그리드 한천을 통해 볼 수 있도록 격자 덮개에 고정하는 테이프의 작은 조각을 사용한다. 접시의 바닥에있는 선이 그리드의 상단 중앙에 정렬되어 있는지 확인합니다. 테이프와 함께 접시를 정박에도 리딩을 허용, 슬라이딩에서 유지. 라인은 복제 도금 후 식민지의 식별을 용이하게한다.
- 멸균 이쑤시개로 하나의 형질 전환 체를 선택하고 그리드의 사각형의 중심에 자리. 그냥 식민지 그 자리를 터치합니다. 한천에 이쑤시개를 발굴하지 마십시오. 플레이트가 오염되는 것을 방지하기 위해, 하나의 끝 부분에 이쑤시개를 처리합니다.
- 단계 2.3에서와 같이 인접한 광장에서 다른 형질 전환 체를 스팟. 플레이트가 가득 차면, 30 ° C에서 / O N 그것을 품어. 이것은 마스터 플레이트이다.
3. 복제 도금 영양 요구 표현형 (12)를 파악하기 위해
- LB-관에 대한 M-9 칸에 대한 LB 관 하나, 둘, 셋 : 격자로 된 각 플레이트를 들어, 세 가지를 통해 하나의 번호가 세 가지 신선한 한천 플레이트의 스택을 확인합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서, 거꾸로 O / N를 접시를 건조.
- 단계 2.2에서 각 판의 상단에 선을 그립니다.
- 70 % 에탄올로 복제 도금 도구를 닦아 복제 도금 가기에 멸균 벨벳 광장을 배치OL과 벨벳 광장을 단속. 손 심지어 세척 후 미생물로 가득합니다. 가장자리에 벨벳 광장을 처리하여 미생물 오염의 도입을 방지합니다.
- 클램프에 그려진 선으로 마스터 접시에 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에있는 플레이트에 배치합니다. 벨벳 광장 판에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 세균이 묻지 않도록주의하십시오. 벨벳 광장에서 마스터 플레이트를 제거합니다.
- 클램프 라인 판 번호 하나에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판에 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다.
- 물을 비이커에 벨벳 광장 폐기 단계 3.3에서와 같이 복제 도금 도구에 깨끗하고 멸균 벨벳 광장을 배치합니다. 이 단계에 걸쳐 접종 획기적인 성장과 거짓 긍정적 인 결과를 발생 방지 할 수 있습니다.
- 정렬클램프 라인 판 번호 하나에 라인과 새로운 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 벨벳 광장에 판 번호 하나에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다.
- 클램프 라인 판 두 번째에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판 두 번째로 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 번호판 두를 제거합니다.
- 번호판 세 단계를 반복 3.8. 3 플레이트는 다른 두 판을 마스터 플레이트로부터 완전한 전송을위한 제어이다. 물을 비이커에 벨벳 광장을 폐기하십시오. 그들을 건조, 씻어 알루미늄 호일을 감아을 다시 압력솥, 오염 된 벨벳 사각형이 들어있는 비커를 오토 클레이브, 벨벳 사각형을 다시 사용합니다.
- 30 ° CO / N에 번호판을 품어. 두 LB 칸 아가 플레이트상에서 성장하지만 M-9 칸 플레이트상에서 성장되지 콜로니 영양 요구 (것으로 간주
- 줄무늬와 신선한 LB 관 한천 판에 판 번호를 하나의 영양 요구하고, 30 ° CO / N에서 접시를 품어.
- 격리 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.11의 줄무늬 판 3 식민지 밖으로 행진. 30 ° CO / N에서 접시를 품어. 이 돌연변이가 잘 분리되어 있음을 보장합니다. 하나의 섹션에서 각 식민지 밖으로 분에 플레이트와 행진을 나눈다.
- 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.12에서 파생 된 아웃 줄무늬 식민지에서 스팟 식민지 단계 2.1-2.4 같이 격자를 형성한다. 각각의 돌연변이 중으로 다시 테스트되고있다.
- 영양 요 표현형을 확인하는 단계 3.1-3.10 같이 다시 판을 복제합니다.
4. 유전자 구조
- 30 ° C에서 액체 LB-관 매체에 단계 3.13에서 고립 된 돌연변이 식민지의 3 ㎖의 O / N 문화를 성장. 시판되는 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 배양액 1mL로부터 게놈 DNA를 정제.
- 0.025 U의 혼합물을 설정BFU CI의 제한 효소와 얼음에 20 μL 반응에서 / μL 게놈 DNA 1 μg의 14 μL. BFU CI 열두 다른 사이트에서 트랜스포존을 인하하기 때문에, 제한 효소, BFA I 또는 각각 두 세 가지 다른 사이트에서 트랜스포존 인하 해일 III를 사용하는 것이 더 효율적일 수있다.
- 25 분 동안 37 ° C에서 반응을 부화 한 후 80 ° C에서 20 분간 효소를 불 활성화하기 위해. 0.8 % 아가 로스 겔 (도 3)에 부분적으로 소화 DNA의 3 μl를 분석한다. 겔의 하단에 위에서 아래 10킬로바이트에서 도말 검사에서 성공적인 부분 소화 결과.
- 500 ㎕의 반응에 T4 DNA 리가 제 (800)의 단위를 사용하여 부분적으로 소화 된 게놈 DNA의 15 μl를 결찰. 반응 O / N에서 4 ℃를 품어. 큰 반응 부피 자체로 하나의 단편의 결찰을 극대화하고, 두 개 이상의 DNA 단편 사이의 상호 작용을 최소화한다.
- 강수테 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.5, 및 1 ml의 95 % 에탄올의 50 μl를 첨가하고 20 분 동안 -20 ° C에서 인큐베이팅하여 DNA 결찰.
- 70 % 에탄올로 펠렛을 씻어 10 분 동안 4 ° C에서 DNA 및 13,500 XG를 미세 원심 원심 진공 농축기에서 건조하고, 뉴 클레아 무료 물 10 μL에서 그것을 재현 탁. 대안 적으로, DNA는 공기는 15 분 동안 RT에서 건조 될 수있다.
- E.를 변환 재현 탁 DNA의 4 μL를 사용하여 제 1 절 R6K γ 복제 원점에서와 같이 전기에 의한 대장균 균주 ECD100D의 PIR 또는 ECD100D의 pir116 6을 복제하는 PIR 유전자와 균주가 필요합니다. 낮은 복사 플라스미드의 PIR 스트레인 결과 및 pir116 변형은 높은 사본 플라스미드 결과 PIR 돌연변이 유전자가 포함되어 있습니다. 각 형질 전환 트랜스포존과 중단 된 염색체 (그림 1E)의 영역으로 새로운 플라스미드가 포함되어 있습니다.
- Inocul단일 콜로니로 LB 칸 배지 5 ㎖를 먹었다, 120rpm으로 37 ° C에서 진탕 / O N 그것을 성장하고, 상업용 키트를 사용하여 전체 O / N의 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제.
- 제한 엔도 뉴 클레아 제의 I.을 XhoI를 이용 플라스미드를 14 μl를 다이제스트 반응의 최종 부피가 20 μL 있는지 확인합니다. 이 효소는 카나마이신 내성 유전자의 5 '말단에 트랜스포존의 중앙의 위치를 인식한다. 소화되지 않은 10 μl를 분석하고 0.8 % 아가 로스 젤 (그림 3)에 플라스미드를 소화. 플라스미드는 2 킬로바이트 트랜스포존 플러스 측면에서는 숙주 DNA로 구성되어 있습니다.
5. DNA 시퀀싱
- 시판의 시퀀싱 키트, 트랜스포존의 각 단부에 상동 프라이머 및 모세관 서열 분석 시스템을 이용하여 플라스미드를 시퀀싱. 또한, 플라스미드는 순서에 대한 외부 기관에 제공 할 수있다.
- 분자량 표준 (1킬로바이트 사다리)으로 사용합니다겔 플라스미드의 크기를 추정한다. 이어서, 50 fmol에 필요한 플라스미드의 나노 그램 (NG)의 개수를 추정한다.
- 260 nm의 (A 260)과 280 nm의 (A 280)의 파장에서 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 DNA의 농도를 측정한다. 큐벳을 통해 빛의 경로 길이가 1cm 있는지 확인하십시오. 50 NG / μL로 260 nm에서 흡광도를 곱하여 농도를 결정합니다. 높은 품질의 플라스미드 DNA는 260 / 1.8과 2.0 사이의 280 비율이있을 것이다.
- 각각의 시퀀싱 반응에 필요한 DNA의 부피는 플라스미드의 농도로 나눈 50 fmol 필요한 NG의 수이다. 10 μL로 총 부피를 가지고 물과 필요한 플라스미드의 볼륨을 섞는다.
- 1 분 동안 96 ° C에서 플라스미드 DNA / 물 혼합물을 가열 한 후 RT로 냉각.
- 시퀀싱 키트에서 마스터 믹스 8 μL 및 시퀀싱 프라이머 중 하나의 μM 1.6의 2 μL를 추가합니다.
- FOL열 자전거 타는 프로그램과 반응 정리에 대한 시퀀싱 키트에서 낮은 프로토콜입니다.
- 모세관 DNA 분석 시스템을 이용하여 각각의 샘플을 분석한다.
- DNA 서열을 볼 수 상용 소프트웨어 패키지를 사용합니다. 트랜스포존 (그림 4)의 지난 7 BP되는 순서 "5'-GAGACAG-3 ',"를 검색합니다. 이 7 bp의 세그먼트의 5 '말단 전에 시퀀스 트랜스포존에 속한다. 이 7 bp의 세그먼트의 3 '말단 서열은 이후 중단 유전자에 속한다.
- 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST) 7, 8을 사용하여 중단 된 유전자의 가능한 기능을 결정합니다. 다음을 사용하여 link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . 인터럽트의 순서를 붙여 넣기쿼리 상자에 ED 유전자 데이터베이스에서 "기타"를 선택하고 페이지 하단에 "BLAST"을 클릭합니다. 결과가 나타나면, 정렬 결과 (그림 5)을 볼 수 있도록 페이지를 아래로 스크롤합니다.
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Representative Results
엔테로 박터 SP의 변환. transposome와 일렉트로 의해 YSU는 숙주 게놈 (도 1A, B)에 임의의 게놈 삽입을 개시. 성공적인 전기는 LB-관 판에 성장 수천 개의 형질 전환 체를 얻었다. 300 ~ 400를 얻으려면, 판 당 식민지를 잘 간격, 각 LB 관 한천 접시에 변환 혼합 확산의 양을 최적화했다. 각 형질 전환 체는 적어도 하나의 트랜스포존 삽입물을 포함하지만, M-9 매체상의 성장에 중요한 유전자가 복제 도금에 의해 선별없이 중단 된 경우는 명확하지 않았다. 형질 전환은 M-9 매체에 도금 (88)의 그리드 및 복제에 신선한 LB 칸 접시에 옮겨졌다. 트랜스포존이 프로토콜 부분은 M-9 매체 판에 카나마이신을 추가 할 것을 권장 형질 전환에 유지할 수 있도록 유의하십시오. M-9 매체는이 경우의 카나마이신이 보충 된, 그러나 그것없이 영양 요구를 획득하는 것이 여전히 가능했다되지 않았다. 에
일부 식민지는 복제 도금 동안 인접한 식민지에 오염되었을 수 있습니다. 순수 배양으로 돌연변이를 분리하기 위해서는 신선한 LB-관 한천 플레이트에 단계 3.1 LB 관 번호판 하나 줄무늬가 30 ° C에서 O / N을 성장시켰다. 성장 세 식민지 두 번째 신선한 LB 칸 접시에 도말하고 30 ℃에서 O / N을 성장시켰다. 그런 다음, 세 개의 각 콜로니에서 발생 한 식민지 세 번째 신선한 LB 관 판에 발견되었다. 복제는 M-9 최소한의 메디에 다시 도금음 판 중으로 그림 2에서 관찰 된 영양 요 표현형을 확인했습니다. 2013 년 미생물 생리학 코스에서 상영 1,760 트랜스포존 형질 전환, (23)는 영양 요구했다.
영양 요에서 중단 된 유전자는 다음 유전자 구조를 사용하여 확인 하였다. 상기 제 연속 강판 (3.13 단계)에서 영양 요 콜로니를 LB 배지에서 칸 O / N을 성장시키고, 게놈 DNA는 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 배양액으로부터 정제 하였다. 아가로 오스 겔 전기 영동은 정제 된 DNA의 크기보다 큰 10킬로바이트 (도 3, 레인 2)였다. 트랜스포존을 포함하고 호스트 지역 (그림 1D)를 중단 측면에서는 작은 조각으로 게놈 DNA를 파괴하기 위해, 부분적으로 37 ° C에서 25 분 동안 BFU CI 0.025 단위로 소화했다. 마다 약 200~500 염기쌍 발생 5'-GATC-3 '부위에서 이러한 제한 효소 절단. 도있다하지만트랜스포존 내의 열두 5'-GATC-3 '부위는, 숙주 게놈을 그대로 트랜스포존을 함유 플 랭킹 단편 다수 여전히 부분적으로 소화 DNA 존재할 것이다. 그림 3의 레인 3은 부분적으로 0.5 KB 이하 모든 방법 겔의 바닥에, 10킬로바이트 위부터 DNA의 얼룩과 게놈 DNA를 소화. DNA 스미어가 2킬로바이트 이하 시작하면, 트랜스포존의 크기는 다음 DNA 너무 많이 분해되었다. 이것은 첨가 된 효소의 양을, 37 ° C에서 배양 시간, 또는 둘 모두를 감소시킬 필요가있을 것이다. 스미어 및 소화 DNA와 차선 소화 DNA와 DNA와 동일한 크기가된다 없다면, 더 분해가 발생하지 않았다. 또한, 37 ° C에서 배양 시간 또는 둘 모두를 첨가 된 효소의 양을 증가시킬 필요가있을 것이다. 대신 BFU의 CI를 사용하는 것이 제한 둘, 세 개의 다른 부위에서 트랜스포존 잘라 BFA I 또는 해일 III를, 엔도 뉴 클레아 사용할 수도각각. 이들 효소 중 하나의 사용을 증가시킬 수있다 E. 유전자 구조 중 대장균 PIR + 변환 수율.
부분적으로 소화 된 DNA는 500 ㎕의 반응에 결찰시켰다. 증가 된 부피는 다른 DNA 단편 사이의 상호 작용을 최소화하고 자체 결찰 각 단편은 원형 분자를 형성 할 확률을 최대화. 결찰 DNA가 침전 E.으로 전기에 의해 변환 된 대장균 균주 ECD100D의 pir116. 변환 혼합물 LB-관 판에 확산되었다. 성장한 콜로니 트랜스포존과 중단 숙주 유전자 (도 1E)의 영역으로 구성된 새로운 플라스미드를 함유 하였다. 콜로니 형성 단위의 수는 0 내지 변환 믹스 1 ㎖ 당 2,000였다. 플 랭킹 염색체 영역 E. 독성이었다 단백질을 인코딩하면 콜라이 숙주, 변환 효율이 낮거나 chromo의 작은 세그먼트이었다일부는 새로운 플라스미드와 관련이 있었다. 플라스미드 DNA는 단일 형질 접종 및 카나마이신 내성 유전자의 5 '말단 근처에서 트랜스포존의 중심에 하나의 사이트를 인식 제한 엔도 뉴 클레아 제, I을 XhoI으로 절단 한 배양 물로부터 정제 하였다. 도 3의 레인 4는 소화되지 않은 플라스미드를 함유하고 레인 5는 소화 플라스미드를 함유 하였다. 정제 된 플라스미드 DNA는 수퍼 코일되는 경향이 있기 때문에, 선형의 동일한 가닥 DNA를 소화보다 빠른 속도로 이주. 이 플라스미드의 정확한 크기는 3 KB했다. 그것은 트랜스포존 2 KB, 플러스 중단 된 호스트 유전자의 약 1 킬로바이트가 포함되어 있습니다. 측면에서는 호스트 DNA는 하나 이상의을 XhoI 인식 사이트가 포함되어있는 경우 두 개 이상의 플라스미드 밴드는 내가 DNA를 소화을 XhoI과 차선에서 관찰됩니다.
도 4는 영양 요구로부터 분리 된 플라스미드위한 시퀀싱 결과를 나타낸다. 소를 제거한 후굵게 실온 트랜스포존 서열은 숙주 DNA 서열은 베이직 로컬 얼라인먼트 검색 도구 (BLAST) 분석 7,8 위해 제출 하였다. BLAST 결과 중 하나는 인터럽트 서열 엔테로 박터 클로 아카에 subsp 유사한 것을 제안했다. 박터 클로 아카 NCTC 9394 (EMB | FP929040.1 |) L 티로신과 L- 페닐알라닌 (그림 5) (13)의 생합성에 관여하는 chorismate 글루코사민 뮤 타제에 대한 유전자. 가끔 부분적으로 분해 된 게놈 DNA의 결찰 동안 선형 트랜스포존은 하나 이상의 다른 BFU CI 단편에 ligates. 유전자의 신원이 갑자기 변경되기 때문에이 폭발 혼란을 초래 할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 영양 요구의 제 41 염기쌍 프롤린 생합성에 관여 한 글루타메이트 -5- 테이트 세미 알데히드 디 히드로게나 제에 대한 유전자에 매칭. 그리고, 다음의 219 염기쌍 지질-A-disacc위한 62 염기쌍 세그먼트 뒤에 리보 - 디 포스페이트 리덕 타제 서브 유닛에 대한 유전자, 매칭 haride 키나제. 마지막 295 염기쌍 세그먼트는 다시 글루타메이트 -5- 테이트 세미 알데히드 디 히드로게나 매칭. BFU CI에 대한 5'-GATC-3 '사이트의 존재는 두 개의 작은 DNA 조각이 구출 된 플라스미드로 결찰하는 것이 좋습니다. 따라서, 결찰 반응 부분적으로 소화 DNA의 희석은 완전히 작은 조각의 결찰에 의한 배경을 제거하지 않습니다. 이들 결과로부터,이 유전자에 대한 서열은 트랜스포존에 바로 인접 때문에 transposome 글루타메이트 -5- 테이트 세미 알데히드 디 히드로게나 제에 대한 유전자에 자체를 삽입한다는 결론 지었다. 기타 영양 요구 메티오닌 생합성에 관여 cystathione 베타 리아제 유전자의 중단을 포함; 히스티딘 생합성에 관여 히스티딘 탈수소 효소; 세린, 글리신, 시스테인 생합성에 관여 포스 포세린 포스파타제 용; 류신, 이소류신 및 발린 생합성 일에 관여 ketol 산 reductoisomerase합니다.
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그림 1. 트랜스포존 돌연변이 유발. (A) 배지의 포도당을 함유하는 M-9 최소 염에 성장에 필요한 유전자를 함유하는 박테리아 세포. 박스형 M-9는 영양 요 유전자를 나타낸다. (B) transposome은 전기에 의해 균주 내로 도입되고, 각각의 모자이크 단부에 결합 트랜스 단백질 (화살표) 임의로 숙주 염색체 3,4-으로 트랜스포존을 삽입한다. 만 트랜스포존 포함하는 형질 전환 LB 칸 매체 판에 성장할 것입니다. (C)를 형질 전환 포도당이 포함 된 M-9 매체에와 LB-관 매체에 도금 복제 있습니다. 실패 형질 전환 포도당 영양 요구됩니다 포함 된 M-9 매체에 (교차 아웃) 성장합니다. (D) 게놈 DNA는 영양 요구에서 정제와 부분적으로 4 기반의 단편을 절단하여 소화어, DNA 부위를 인식 BFU CI, 5'-GATC-3 '. (E) 부분적으로 소화 DNA는 T4 DNA 리가 아제로 처리하고 E.로 일렉트로 변환 콜라이 균주 ECD100D의 PIR는 트랜스포존 및 M-9 매체 상에 성장을 위해 필요한 인터럽트 염색체 유전자를 포함하는 신규 플라스미드를 형성한다. PIR 유전자는 새로운 플라스미드 6 복제 기점 역할을하는 트랜스포존의 γ R6K 복제 원점을 포함하는 원형의 DNA 단편을 허용한다. 카나마이신 내성 유전자가 플라스미드에 대한 새로운 선택 마커로서 기능한다. 플라스미드 정제하고, 중단 된 유전자의 ~ 500 bp의 순서가 트랜스포존의 양 끝을 상동 프라이머 (화살표)를 사용하여 결정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 복제 도금 그림. LB-관 한천 플레이트에 전송 된 형질 전환 체의 (A) 그리드. (B) M-9 매체 판에 전송 된 동일한 형질 전환 체의 그리드. 영양 요구가 아닌 M-9 매체 접시에 LB-관 판에 성장했다. 이들은 검은 색 사각형으로 식별됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 0.8 % 아가 로스 젤 레인 1 :. 1킬로바이트 사다리. 레인 2 : 소화되지 않은 게놈 DNA. 레인 3 : BFU C 내가 부분적으로 게놈 DNA를 소화. 레인 4 : 소화되지 않은 구조 원형질ID입니다. 레인 5 :을 XhoI 구출 소화 플라스미드.
4. 플라스미드의 부분 DNA 시퀀스도. 굵게 시퀀스 트랜스포존의 일부이며 BLAST 분석을 위해 제출하지 않았다. 시퀀스의 나머지 부분은 호스트로부터 구조 유전자 세그먼트이다.
그림 5. BLAST 분석 (7, 8). 상기 제 1베이스 (쿼리)에서 시작이 중단 된 유전자는 페닐알라닌과 티로신 생합성에 관여하는 엔테로 박터 클로 아카에 균의 chorismate 글루코사민 뮤 타제를 인코딩하기 위해 나타납니다.
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Discussion
transposome을 사용하여 트랜스포존 돌연변이 유발 엔테로 SP의 영양 요구를 생성하기위한 효과적인 도구이다. YSU과 그람 음성의 다른 유형과 그람 양성 세균 3,4. 프로세스는 일렉트로 의해 숙주에 테네시 5 유래 transposome 도입함으로써 개시 하였다. 인서트 콜로니를 확인하기 위하여, 변형되지 않은 대상 균주는 트랜스포존에 의해지지 저항 마커 선택하기 위해 카나마이신에 민감했다. 일부 호스트는 숙주 게놈 재결합 전에 트랜스포존 DNA를 제한 엔도 뉴 클레아 저하 생산. 일렉트로 믹스 제한 효소 억제제를 첨가 저하를 최소화하고 변환 수율 (3)을 증가시킬 수있다. 일렉트로 유능한 박테리아를 제조하는 동안 염의 존재로 인한 박테리아를 전기 아크 또는 스파크를 방지 할 수있다, 그것은 많은 염을 제거하는 것이 중요했다. 도의 부재하에전기 아크는, 세포는 그들을 충격적인 후에 급속 죽기 시작했다. SOC의 성장 배지를 함유하는 염을 추가하면 즉시 삼투압 밸런스 최소화 세포 사멸 증가 변환 효율 5 복원. 카나마이신 내성 형질 전환 후 M-9 최소 배지 한천에 도금 신선한 LB-관 플레이트와 복제에 발견되었다. 수 영양 요구를 그리워 거짓 양성 결과가 발생할 수 있습니다 이상 접종을 방지하기 위해, 벨벳 사각형은 판의 나머지 부분을 접종하기 전에 단계 3.6에서 전환되었다. 이어서, 복제 도금 중에, 충분한 압력이 인접한 콜로니간에 번짐이나 오염을 일으키지 않고 콜로니를 전송하기 위해 적용 하였다.
영양 요구에 돌연변이 유전자는 유전자 구조를 통해 확인되었다. 각각의 영양 요에서 게놈 DNA는 TR을 잘라 BFA I 또는 해일 III를 사용하여 BFU C의 I. 부분 digestions 커터 자주 사용되는베이스 부분 소화를 사용하여 전단되었다ansposon 덜 자주, 트랜스포존 변환 효율을 향상시킬 수있다. 이는 트랜스포존 내의 사이트 부족한 다른 제한 엔도 뉴 클레아 6 계 8 계 절단기 함께 완전 소화를 사용하는 것도 가능하다. 소화 DNA는 결찰 및 E. 변모했다 대장균 균주 ECD100D의 PIR 또는 ECD100D pir116 6. E. 비록 콜라이 균주 pir116 단계 4.8에서 일렉트로 형질 전환하고, 이는 화학적 적격 세포를 사용하는 것도 가능하다. 이 경우, 전체의 변환은 구출 플라스미드의 큰 선택을 수득 확산되어야한다. 고리 화 트랜스포존은 적은 카피 수의 플라스미드로 복제하기 위해 PIR 유전자는 허용하고 pir116 돌연변이 유전자는 높은 플라스미드 카피로 복제 할 수있다. pir116 변형을 사용하여 낮은 변환 수익률은 원래 호스트에서 독성 유전자 산물의 발현에 기인 할 수있다. 독성이 적은 카피를 사용함으로써 감소 될 수있다
게놈 시퀀싱 (10)과 PCR 시퀀싱 (14)는 유전자 구조하는 다른 방법도 있습니다. 게놈 시퀀싱 방법은 정제 게놈 DNA로부터 직접 염색체 영역을 플 랭킹 서열. 대상 생물의 게놈 염기 서열이 이미 된 경우이 전략은 유용합니다. 변이 영역은 게놈 시퀀싱 및 BLAST 의해 식별되면, 전체 영역은 PCR에 의해 증폭하고 추가 분석을 위해 복제 될 수있다. PCR 방법은 두 개의 PCR 반응과 네 개의 다른 프라이머를 사용한다. 제 반응 쌍 짧은 DNA, 링커 서열 (프라이머 2)를 포함 축퇴 프라이머와 트랜스포존 상동 프라이머 (프라이머 1). 두 번째 PCR 반응은 상동 링커 서열 프라이머 (프라이머 4)와 중첩 PCR 반응 다른 트랜스포존 상동 프라이머 페어링 (프라이머 3)이다. 프라이머 3 프라이밍 사이트입니다이어서 프라이머 1. 프라이밍 부위의 3 '측에 위치하고, 두 번째 PCR 반응으로부터 amplicand 정리할 및 서열화된다. 이 자동화 시퀀싱 방법은 모두 게놈 DNA 정제 플라스미드 구조에 대한 필요성을 제거, 돌연변이 세포로부터 직접적으로 DNA를 증폭한다.
대신 영양 요구에 관여하는 유전자를 식별하는, 트랜스포존 돌연변이 유발은 다른 쉽게 분석 표현형. 엔테로 SP는 연구하는데 이용 될 수있다. YSU는 저항 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린 (게시되지 않은 데이터)도 다중 금속 내성 균주이다. HgCl 2에 대한 최소 억제 농도 (MIC)는 AGNO 3 80 μM이고 NaAsO 2 mM의 9 (14)이며, ZnCl 2가 800 μM이고, 70 μM이다. LB-관 판에 형질 전환이 변형에 transposome를 도입하고 리딩 후, 격자 식민지 복제본이 bacte의 MIC 이하의 농도로 포함하는 배지 금속에 도금 할 수 있습니다리알 변형. 인하 MIC와 함께 구출 및 돌연변이에서 중단 된 유전자의 염기 서열을 다음 금속 중 하나에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 공개 할 수 있습니다.
생성 돌연변이 외에도 transposome는 항생제 또는 금속 저항으로서 기능 유전자의 이득을 식별하기 위해 시험 관내 또는 생체 벡터로서 사용될 수있다. 엔테로 박터 SP에서 체외 전략 게놈 DNA. YSU는 트랜스포존의 외측 부위를 인식하는 제한 효소로 분해된다. DNA 결찰 2+ 및 Mg를 함유하는 버퍼 내의 transposome와 혼합된다. 트랜스포존 임의 게놈 조각, E. 사이의 재결합 후 콜라이 균주 ECD100D의 PIR은 DNA로 형질 전환하고, 암피실린 또는 금속염을 함유하는 플레이트 상에 확산된다. 성장 식민지는 호스트의 저항성 유전자 옆에있는 트랜스포존을 포함하는 새로운 플라스미드를 가지고 있습니다. 생체 보안 목표 명세서rategy, 엔테로 박터 SP. YSU는 transposome으로 변환됩니다. 그리고, 전체의 변환 반응은 랜덤 트랜스포존 삽입과 큰 집단을 위해 선택 칸 LB 액체 배지에서 성장된다. 게놈 DNA는, transposome 외측 부위를 인식 제한 효소로 소화 및 결찰로 변형된다 E. 대장균 균주 ECD100D의 PIR은. 체외 방법에서와 같이, 형질 전환 암피실린 또는 금속 플레이트에 확산된다. 다시 말하지만, 결과 플라스미드는 내성 유전자 옆에 삽입 된 트랜스포존 구성됩니다. 이 두 전략 목표 내성 유전자가 발현 할 수있는 경우에만 성공 및 E.에서 활약 것 대장균 균주.
트랜스포존 돌연변이 유발 균주는 성장 15,16 위해 필요 유전자의 최소 개수를 식별하는 데 사용될 수있다. 에 loxP 사이트와 다른 항생제 내성 마커를 포함하는 두 transposomes는이 전략에 필요한 I공지 게놈 서열과 NA 균주. 두 트랜스포존를 통합 한 후, 발현 CRE 재조합 효소는 트랜스포존 삽입 간의 염색체 영역을 제거 두에 loxP 부위 사이에서 재조합 반응을 촉매. 게놈 서열에 대한 지식은 가능한 제거 된 유전자를 식별 할 수있다. 성장 할 수있는 기능은 제거 된 유전자가 성장에 필요하지 않은 것을 보여줍니다. 이 기법은 노동 집약적이고,이 전략을 사용하여 성장을위한 최소한의 게놈은 아직 완료되지 않았다. 그러나, PCR 시퀀싱을 사용하여 녹농균의 자동화 된 트랜스포존 돌연변이 유발 연구는 300-400 유전자가 풍부한 물질 (14)이 세균의 성장에 필요 한 것으로 추정. 이 연구에 loxP / CRE 재조합 효소 시스템을 사용하지 않았다.
최소한의 게놈과 미생물 합성 생물학 (17)에 유용합니다. 최소한의 게놈을 가진 균주는 especiall입니다바람직하지 않은 부산물의 생성을 제거하는데 유용 Y. 예를 들어, 클로스 트리 디움 아세토 부 틸리 쿰 (C. acetobutylicum의)는 바이오 부탄올 (18)를 생성하는데 사용된다. 성장 중에이 균주는 정지상에 진입하기 직전의 지수 성장기의 끝에서 부탄올을 생성한다. 이 시점부터, 부탄올 및 다른 발효 제품에 민감 해지고 중단 제품을 합성하는 휴면 내생 포자를 형성한다. transposomes는 클로스 트리 디움 퍼프 린 젠스 (3)을 연구하기 위해 사용되었다 때문에, 바람직하지 않은 발효 제품 및 포자에 대한 유전자를 결여 C. acetobutylicum의 균주를 구축 유사한 transposome /에 loxP / CRE 재조합 효소 시스템을 사용하는 것이 가능하지만, 더 관여하는 유전자가 포함되어있다 부탄올 내성. 이 균주는 최소한의 오염 물질과 제품 수율을 증가시킬 것입니다.
요약하면,이 비디오 저널 기사는 완전한 인트를 제공합니다트랜스포존 돌연변이 유발에 의한 영양 요구를 만드는 데 사용되는 절차의 단계의 설명에 의해 페이지. 그것은 DNA의 염기 서열 기술과 중단 된 유전자의 식별을 복제하여 변이 된 유전자를 구출, 복제 도금에 의해 돌연변이 선별 검사, 전기에 의해 transposome을 도입 다룹니다. 이 기술은 알려지지 않은 유전자의 기능을 식별하기위한 또는 아마도 산업 공정에 사용될 수있는 균주를 생성하기 위해 사용 될수있다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없습니다.
Acknowledgments
저자는 2010-2014 봄 학기 동안 내 트랜스포존 돌연변이 유발 아이디어를 테스트 내 미생물 생리학 대학원생의 학부 독립적 인 연구의 모든 학생 모두에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 영스 타운 주립 대학의 생물학의 부에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS - Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
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