Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52030
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

Abstract

Centrosomes هي عضيات صغيرة ولكنها مهمة التي تشكل أقطاب الإنقسامية المغزل للحفاظ على سلامة الجينوم أو التجمع أهداب الأساسي لتسهيل مهام الحسية في الخلايا. يجوز تنظيم مستوى بروتين مختلف في centrosomes من في مواقع .cellular أخرى، والاختلاف في مستوى centrosomal من عدة بروتينات في نقاط مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم السليم التجمع مريكز. قمنا بتطوير مضان الكمي المجهري الفحص الذي يقيس التغيرات النسبية في مستوى البروتين في centrosomes في الخلايا الثابتة من عينات مختلفة، مثل في مراحل مختلفة من دورة الخلية أو بعد العلاج مع مختلف الكواشف. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة، وتطبيع أن قياس ضد نفسه للبروتين آخر لا تختلف تحت ج التجريبية المختارةondition. استخدام هذا الاختبار في تركيبة مع نبض BrdU واستراتيجية مطاردة لدراسة دورات خلية رابط الجأش، لدينا التحقق من صحة كميا الملاحظة الأخيرة في أن ينظم التجمع centrosomal من VDAC3 في centrosomes خلال دورة الخلية، من المحتمل بسبب تدهور بوساطة proteasome وتحديدا في centrosomes.

Introduction

تتكون Centrosomes من زوج من centrioles محاطة المواد محيط بالمريكز (PCM). يجري المراكز الرئيسية أنيبيب المنظمة (MTOCs) في خلايا الثدييات، centrosomes بمثابة قطبي مغزل الإنقسامية في تقسيم الخلايا، وبالتالي تساعد على الحفاظ على سلامة الجينوم 1. في الخلايا هادئة (على سبيل المثال، خلال مرحلة G0)، واحد من اثنين من centrioles من الجسيم المركزي، وهي مريكز الأم، وتحويلها إلى هيئة القاعدية لتجميع هدب الابتدائي، عضية الحسية جاحظ الخروج من سطح الخلية 2. مرة واحدة الخلايا إعادة إدخال دورة الخلية، ويتم تفكيكها أهداب الابتدائي وكل مريكز يوجه التجمع من طليعة المريكز في نهايته القريبة أن يستطيل تدريجيا لتشكيل مريكز ناضجة 3. في بداية S-المرحلة، يتم تشكيل بنية تشبه عجلة العربة التي توفر التماثل 9 أضعاف إلى مريكز على سطح كل مريكز القائمة وسوف تصبح قاعدة كل طليعة المريكز. Sas6 رقبعة أمر لا غنى عنه ليتم تجنيده التجمع مريكز لتشكيل محور عجلة العربة 4-6. ثم يتم تجميع البروتينات مريكزي أخرى على عجلة العربة في درجة عالية من التنظيم، الأقرب إلى الطريقة البعيدة 7. بعد الانتهاء بالضبط الازدواجية مريكز، وخلايا تجميع المواد محيط بالمريكز إضافية لبناء اثنين centrosomes وظيفية بحلول نهاية المرحلة G2 8. وبالإضافة إلى المكونات الأساسية مريكزي 9-11، والعديد من البروتينات الأخرى بما في ذلك تحركات، الفسفاتازات، مرافقين، مكونات سقالة، غشاء البروتينات المرتبطة بها والآلات تدهور ترتبط مع centrioles والهيئات القاعدية وPCM في أوقات مختلفة من دورة الخلية 12-16. ويلاحظ في كثير من الأحيان أن مستويات centrosomal من العديد من البروتينات تنظم زمنيا من قبل آليات الاستهداف centrosomal و / أو تدهور proteasomal في centrosomes. الأهم من ذلك أن التقلبات في مستوى centrosomal من عدة بروتينات مثل Plk4، Mps1، Sas6، وCP110 لنقاط ر مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم التجمع مريكز 5،17-22، وفي حالة Mps1 منع هذا التدهور centrosomal يؤدي إلى تشكيل centrioles الزائدة 19. من ناحية أخرى، فإن الكسور centrosomal من عدة بروتينات أقل عطوب بالمقارنة مع حمامات عصاري خلوي. على سبيل المثال سيرنا بوساطة أسفل تنظيم Centrin 2 (Cetn2) أدى إلى سوى انخفاض معتدل من مستوى البروتين في centrioles على الرغم من انخفاض كبير في مستوياته خلية كاملة 23. ولذا فمن الأهمية بمكان لقياس التغيرات في مستوى البروتينات centrosomal في الجسيم المركزي بدلا من قياس مستويات البروتين خلية كاملة عند تقييم وظائف الجسيم المركزي الخاصة بهم.

في هذه الدراسة قمنا بتطوير فحص باستخدام المناعي غير المباشر (معهد التمويل الدولي) لتحديد المستوى النسبي للبروتين في centrosomes. تم تطوير هذا الفحص بشكل خاص لتحليل الخلايا التي هي من عينات مختلفةوبالتالي لا يمكن تصويرها في نفس الوقت. ويمكن لهذه العينات أن تكون الخلايا التي تم التعامل مع الكواشف المختلفة (أي المخدرات مقابل السيطرة)، التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة (أي نبض مقابل مطاردة)، أو هي في مراحل مختلفة من دورة الخلية. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة وتطبيع تلك القيمة ضد نفسه للبروتين آخر والتي لا تختلف في ظل الظروف التجريبية اختيار المستويات. وقد استخدمت العديد من الدراسات في علم الأحياء الجسيم المركزي مؤخرا مختلف تقنيات المجهر الكمية، في كل الخلايا الحية أو الثابتة، لتحديد وظيفة الجسيم المركزي محددة من البروتينات مرشح 24-27. مماثلة لتلك المقايسات، والتقنية الحالية أيضا يقيس الخلفية تصحيح كثافة مضان من البروتين الاختبار. ومع ذلك، فإن إدراج تطبيع باستخدام معيار الداخلي في هذا الاختبار من المرجح تقديم أكبردقة وثقة في تحليل عينتين المختلفة التي هي على اثنين من coverslips مختلفة. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى فحص مستوى البروتين في centrosomes، مع تعديلات طفيفة هذه الطريقة يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية أو في مواقع الخلوية الأخرى.

هنا، ونحن لدينا الجمع بين الكمي المجهري الفحص مع استراتيجية نبض مطاردة BrdU لمقارنة الخلايا من مختلف مراحل دورة الخلية. بدلا من استخدام التقنيات القياسية اعتقال دورة الخلية وإطلاق لدراسة مختلف نقاط زمنية دورة الخلية، وخلايا المتزايد بشكل غير متزامن يتم تحضين مع BrdU لتسمية الخلايا في S-المرحلة، ومطاردة الخلايا المسمى لأوقات مختلفة (عادة 4-6 ساعة). ومعظم الخلايا المسمى يكون في S-المرحلة مباشرة بعد النبض. يتم اختيار طول مطاردة وذلك بعد مطاردة، الخلايا المسمى سيكون في أواخر S، G2، أو الانقسام، والتي يمكن التحقق منها من قبل الخصائص المورفولوجية مثل هذا الموقف الفلك من centrosomes فيما يتعلق مجلس التوحيد الوطنىليو، وبعد المسافة بين centrosomes، والتكثيف من الكروموسومات الخ وهكذا، وطول مطاردة يعتمد على متوسط ​​مدة S، M G2 ومرحلة من نوع خلية معينة. منذ هذا النهج يتجنب مثبطات دورة الخلية مثل هيدروكسي يوريا، aphidicolin، نوكودازول، وما إلى ذلك، يتيح تحليل دورة الخلية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.

وبالتالي، علينا أن نظهر هنا أن الكمية الفحص المجهري مضان وحدها، أو بالاشتراك مع BrdU نبض مطاردة الفحص، هي تقنية بسيطة لكنها قوية لقياس بدقة التغيرات النسبية في مستوى centrosomal من بروتين مرشح خلال دورة الخلية رابط الجأش. قمنا بقياس مستوى centrosomal من VDAC3، وهو البروتين الذي حددنا مؤخرا في centrosomes بالإضافة إلى الميتوكوندريا 16،28، وذلك باستخدام هذه المقايسات. النتائج التي تم الحصول عليها هنا تحقق من ملاحظتنا السابقة أن تجمع centrosomal من VDAC3 ينظمه تدهور، وتختلف أيضا في dependen دورة الخليةر بطريقة 16 والتأكد من صحتها وعلاوة على ذلك إمكانية تطبيق هذا الأسلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. استخدام التيلوميراز البشري الناسخ العكسي (hTERT) الصباغ الشبكية الخلايا الظهارية خلد (hTERT-RPE1، المشار إليها هنا كما RPE1).
    ملاحظة: خلايا RPE1 هي شبه مضاعفا الخلايا البشرية، غير حولت التي تستخدم عادة لدراسة التجمع المركزيه وتكون الأهداب. هذه الخلايا تتبع دورة الازدواجية مريكز طبيعية منسقة مع دورة الخلية الخاضعة للتنظيم.
  2. مرور على شبه متموجة 100 مم طبق ثقافة خلية من خلايا RPE1 في 1: 5 التخفيف من الثقافة الأصلية إلى الطازج 100 ملم طبق تحتوي على 10 مل من بورصة دبي للطاقة / F-12 (1: 1) متوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل G و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (ويشار المتوسطة كاملة كما DME / F-12 متوسطة). زراعة خلايا في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2.
    1. احتضان 12 مم coverslips الزجاج مستديرة في 50 مل من حمض الهيدروكلوريك N 1 في كوب من الزجاج مغطى، O / N دون أن تهتز، في 60 درجة مئوية في حمام مائي أو الحاضنة.
    2. AFثالثا التخلص من محلول حمض، وغسل لل coverslips ثلاث مرات في 100 مل من الماء المقطر التي يحتضنها لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في بعض الأحيان. تكرار غسل بالمثل في 70٪ من الإيثانول و 95٪ من الإيثانول.
    3. تجفيف coverslips عن طريق نشر بشكل فردي بها على ورقة النشاف مختبر في خزانة السلامة البيولوجية، تليها التعقيم مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة.
  3. ضع 2-4 coverslips الجافة في 35 مم طبق ثقافة الخلية. تمييع الحل فبرونيكتين أو فبرونيكتين مثل البوليمر هندسة (تركيز المخزون من 1 ملغ / مل) إلى تركيز 25 ميكروغرام / مل في زراعة الخلايا PBS.
    1. ضع 80-100 ميكرولتر من محلول مخفف على كل ساترة واحتضان لمدة 60 دقيقة لمعطف الجانب العلوي من ساترة. غسل لل coverslips ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني قبل إضافة المتوسطة كاملة.

2. خلايا تزايد وعلاج الخلايا مع proteasome ومثبطات

  1. مرور 2 × 10 5 تنمو بشكل غير متزامنخلايا جي RPE1 في كل 35 ملم صحن يحتوي على coverslips وتنمو الخلايا في 2 مل المتوسطة كاملة. استبدال مستنبت كل 24 ساعة مع قبل تحسنت الطازجة المتوسطة كاملة.
    1. لتحليل تأثير proteasome وتثبيط على مستوى centrosomal من البروتين اختبار (هنا VDAC3 أو γ تويولين)، وتنمو الخلايا في اثنين من 35 ملم أطباق لمدة 44 ساعة. استبدال الثقافة المتوسطة مع المتوسطة كاملة وإما إضافة أو MG115 DMSO مثل المذيبات تحكم في تركيز النهائي من 5 ميكرومتر أو 0.05٪ على التوالي. في نفس الوقت، إضافة BrdU إلى الخلايا في تركيز النهائي من 40 ميكرومتر واحتضان الخلايا لمدة 4 ساعات.
    2. نقل كل ساترة في 24 لوحة جيدا. إضافة الميثانول 500 ميكرولتر المبردة إلى كل بئر واحتضان لوحة عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإصلاح الخلايا على لل coverslips. يغسل فورا لل coverslips ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر غسل العازلة (1X PBS تحتوي على 0.5 ملي MgCl 2 و 0.05٪ تريتون X-100).
  2. حصاد المتبقيةالخلايا من الطبق 35 مم وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق. استخدام بيليه خلية لتحليل البروتين الكلي من قبل النشاف الغربي (الخطوة 6).

3. BrdU نبض وتشيس الفحص لتحليل مستويات البروتين في مختلف مراحل دورة الخلية

  1. لتحليل التباين في مستوى بروتين (هنا VDAC3، Sas6 أو Cep135) في centrosomes في مراحل مختلفة من دورة الخلية، وتنمو الخلايا في اثنين من 35 ملم الأطباق التي تحتوي على coverslips لمدة 44 ساعة. استبدال الثقافة المتوسطة مع المتوسطة كاملة تحتوي على 40 BrdU ميكرومتر واحتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في حاضنة الثقافة الخلية.
  2. من طبق واحد، ونقل لل coverslips إلى لوحة 24-جيدا لإصلاح الخلايا باستخدام الميثانول المبردة كما هو موضح في الخطوة 2.1.2.
  3. بعد 4 ساعات BrdU النبض، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على BrdU، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومرة ​​واحدة مع المتوسطة كاملة، إضافة متوسطة جديدة، ومن ثم تنمو الخلايا في غياب BrdU لأوقات مختلفة (عادة ساعة أخرى 4لخلايا RPE1) قبل تحديد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.1.2.
    ملاحظة: للحصول على خلايا RPE1، والغالبية العظمى من الخلايا BrdU إيجابي هي في أواخر S أو G2-المرحلة بعد مطاردة 4 ساعة. وهذا يجب أن يتم تحديدها بشكل مستقل لكل نوع من الخلايا.

4. المناعية

  1. احتضان الخلايا الثابتة coverslips على في 200 ميكرولتر العازلة حظر (2٪ BSA و 0.1٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 30 دقيقة.
    1. احتضان الخلايا مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية (عادة أثار واحدة في أرنب ورفع آخر في الماوس) المخفف في عرقلة العازلة O / N عند 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب.
    2. لجعل غرفة ترطيب، ووضع منشفة ورقية مبللة في النصف السفلي من 1،000 ميكرولتر فارغة مربع ماصة. وضع شريط من بارافيلم على سطح الرف، وبقعة قطرات (15-20 ميكرولتر) من الحل الأجسام المضادة على بارافيلم لكل ساترة لتكون المحتضنة. عكس ساترة على قطرات من محلول الأجسام المضادة (بحيث تغمر خلايا) وعلى مقربةغطاء مربع تلميح.
    3. عكس coverslips مرة أخرى والعودة إليها مرة أخرى إلى الطبق 24 بئرا. غسل coverslips ثم احتضان لهم في 150 ميكرولتر مزيج الأجسام المضادة الثانوية (هنا الأخضر الفلورسنت صبغ مترافق المضادة للأرنب وصبغ أحمر فلوري مترافق المضادة للماوس المخفف في عرقلة العازلة) لمدة 1 ساعة على RT. غسل لل coverslips ثلاث مرات.
      ملاحظة: إن الأجسام المضادة الثانوية-fluorophore مترافق خفيفة حساسة. حماية العينات من الضوء خلال الخطوات 4.1.3-5.1.2.
  2. الاستعداد لتلطيخ مكافحة BrdU عن طريق تحديد الخلايا RPE1 الملون مرة أخرى مع 500 ميكرولتر الميثانول المبردة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، كما هو موضح في الخطوة 2.1.2. غسل لل coverslips ثلاث مرات.
    ملاحظة: هذا التثبيت يؤمن وضع العلامات الأجسام المضادة الأولية والثانوية من البروتين (ق) من الفائدة خلال عملية التحلل الحمضي في الخطوة التالية.
    1. احتضان الخلايا في 200 ميكرولتر من 2 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 30 دقيقة في RT. تحييد مع 300 ميكرولتر من 1 M تريس، الكلور، ودرجة الحموضة 8 لد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام غسل العازلة.
    2. منع الخلايا مرة أخرى باستخدام 200 ميكرولتر العازلة حظر لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمكافحة الفئران BrdU (المخفف في عرقلة العازلة) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب. العودة لل coverslips إلى الطبق 24-جيدا، وغسلها ثم احتضان مع صبغ مترافق مكافحة الفئران الضد الثانوية زرقاء فلوري (مخففة في 150 ميكرولتر العازلة حظر في صحن 24-جيدا لمدة 1 ساعة على RT.
  3. غسل لل coverslips ثلاث مرات. بقعة قطرة (حوالي 3-6 ميكرولتر) من الحل المتصاعدة التي تحتوي على antifade كاشف على شريحة المجهر والزجاج. عكس ساترة، مع الجانب الخلية أسفل، على حل المتصاعدة. مسح السائل الزائد عن طريق الضغط بلطف ساترة ضد الشريحة باستخدام الأنسجة التنظيف الناعمة. تطبيق طلاء الأظافر الشفاف على طول حافة ساترة لختم وضعها على شريحة المجهر.

5. المناعي صورة Acquisition وتحليل

  1. استخدام هدفا الغمر النفط 100X خطة آبو (مع 1.4 الفتحة العددية) للحصول على الصور من خلايا RPE1-BrdU إيجابي عند درجة حرارة الغرفة.
    1. وضع الشريحة على المجهر (انظر المعدات) المرفقة مع الكاميرا قادرة على التصوير الرقمي. لكل fluorophore، وتحديد زمن التعرض المناسب (عادة بين 300-1،000 ميللي ثانية) عن طريق فحص جميع العينات من تجربة يدويا. قبل الحصول على الصور من خلية، وتحديد رأس المناسب والمستوى البؤري أسفل على طول المحور Z (عادة 0.2 ميكرون خطوة حجم) يدويا. الحصول على صور من العينات المختلفة التي هي coverslips على منفصلة باستخدام متطابقة زمن التعرض للfluorophores مختلفة على طول المحور Z باستخدام حزمة برامج التصوير المجهري الرقمية.
  2. أداء إزالة التفاف (في هذه الحالات باستخدام خوارزمية لا الجار) من جميع مداخن صورة استحوذت على طول Z-المحور.
    1. الحصول على الإسقاط كثافة الكلي للكل صورة كومة على طولوZ-المحور.
  3. في الخلايا حيث centrosomes قريبة (المسافة بين اثنين من centrosomes أقل من 2 ميكرون)، رسم مربع صغير (عادة 20-30 بكسل لكل جانب) حول كل centrosomes وبمناسبة المنطقة المحددة.
    1. رسم مربع أكبر (عادة 24-35 بكسل لكل جانب) المحيطة المربع الأول ووضع علامة المساحة المحددة للمربع كبير.
    2. الحصول على منطقة (A) وكثافة مضان الإجمالية (F) من كل fluorophore في كل مربع (S يدل على مربع صغير وL يدل على المربع الكبير).
    3. تحليل الخلفية تصحيح كثافة مضان من كل fluorophore باستخدام الصيغة التي وصفها هاول وآخرون 29: F = F S - [(F L - F S) × A S / (A L - A S)].
    4. الحصول على كثافة مضان تطبيع للبروتين من الفائدة (هنا VDAC3 أو Sas6) عن طريق حساب نسبة كثافة مضان لتصحيح خلفية فلوريدا لهاuorophore إلى أن من fluorophore المستخدمة في معيار اختيار الداخلي (هنا γ تويولين، Sas6 أو Cep135).
  4. في حالة تحليل الخلايا حيث يتم فصل centrosomes جيدا (المسافة بين اثنين من centrosomes أكبر من 2 ميكرون)، وتحليل كل الجسيم المركزي بشكل منفصل عن طريق رسم مجموعتين منفصلتين من الصناديق. رسم مربع صغير (عادة 15-25 بكسل لكل جانب) حول كل الجسيم المركزي وبمناسبة المنطقة المحددة. رسم مربع أكبر (20-30 بكسل لكل جانب) المحيطة المربع الأول وبمناسبة المنطقة المحددة.
    1. الحصول على منطقة (A) وكثافة مضان الإجمالية (F) من كل fluorophore في كل مربع، وحساب الخلفية تصحيح كثافة مضان من كل fluorophore، بشكل منفصل لكل الجسيم المركزي، كما هو موضح في الخطوة 5.3.3.
    2. الجمع بين الخلفية تصحيح كثافة مضان من كل من البروتين من centrosomes اثنين للحصول على المستوى الإجمالي centrosomal من أن البروتين في تلك الخلية.
    3. الحصول علىكثافة تطبيع للبروتين من الفائدة عن طريق حساب نسبة من إجمالي شدته centrosomal إلى إجمالي كثافة centrosomal من المعيار الداخلي.
  5. تحليل 15-25 على الأقل خلايا لكل حالة تجريبية ورسم على الرسم البياني في جدول بيانات.

6. تحليل البروتين الكلي عن طريق الغربية التنشيف

  1. resuspend الخلايا في الترسيب المناعي الشعاعي فحص (RIPA) العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ Nonidet P-40، 1٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد لليز الخلايا.
    1. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة، فصل المحللة من جزء بيليه وقياس تركيز البروتين الكلي لكل المحللة باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) طقم الفحص.
  2. خلط 40 ميكروغرام من المحللة مع 4X SDS-PAGE العازلة تحميل (50 ملي تريس، الكلور، ودرجة الحموضة 6.8، 2٪ SDS، الجلسرين 10٪، و 100 ملي Dithiothreitol، 0.1٪ بروميتش البيونophenol الأزرق).
    1. غلي العينات لمدة 10 دقيقة وتشغيل العينات على 12.5٪ تغيير طبيعة SDS-PAGE في الجهد المستمر من 200 V.
  3. نقل البروتينات فصل على SDS-PAGE على غشاء النيتروسليلوز باستخدام تقنية النشاف الغربية (في الجهد المستمر من 90 V لمدة 1 ساعة في البرد).
    1. منع الغشاء مع 3٪ الحليب الخالي من الدسم في برنامج تلفزيوني 1X، ثم احتضان الغشاء مع حلول الأجسام المضادة الأولية مخففة (في هذه الحالة أرنب مكافحة VDAC3، أرنب مكافحة γ تويولين والفأر مكافحة α تويولين) لمدة 1 ساعة على RT.
    2. بعد غسل غشاء ثلاث مرات (كل حضانة 5 دقائق تحت الهز) باستخدام PBS-T عازلة (1X PBS و 0.2٪ توين-20)، واحتضان الغشاء في خليط من القريب من الأشعة تحت الحمراء (IR) صبغة الفلورسنت مترافق المضادة للأرنب و صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء الأجسام المضادة مترافق المضادة للماوس الثانوية (المخفف في PBS-T) لمدة 1 ساعة.
    3. يغسل الغشاء ثلاث مرات ثم مسح الغشاء لتحليل العصابات باستخدام الأشعة تحت الحمراء ونظام التصوير luorescence مناسبة للكشف عن طخة مناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حددت لدينا دراسات حديثة توطين centrosomal الرواية وظيفة VDAC3، واحدة من porins الميتوكوندريا 16،28. أظهر المناعية من عدة خلايا الثدييات بما في ذلك الخلايا RPE1 باستخدام الأجسام المضادة VDAC3 محددة تلطيخ centrosomal بارز وضعيفة نسبيا تلطيخ الميتوكوندريا. أظهرنا أيضا أن VDAC3 centrosomal يرتبط بشكل تفضيلي مع مريكز الأم، وتجمع centrosomal كل من الذاتية، وأعرب عن ectopically ينظم VDAC3 بتدهور 16. من أجل التحقق من صحة معهد التمويل الدولي الفحص الكمي درسنا التغيرات في تجمع VDAC3 المرتبط الجسيم المركزي في الخلايا التي هي في S-المرحلة.

هنا، تم علاج الخلايا RPE1 المتزايد بشكل غير متزامن مع إما المانع MG115 proteasome وأو سيطرة DMSO المذيبات لمدة 4 ساعة. لتقييد تحليلنا إلى الخلايا التي التي هي في S-مرحلة وتمر التجمع الجسيم المركزي، فإننا الخلايا التي أدرجت BrdU دو فحص فقطعصابة نفس 4 ساعات، وكان اثنين من centrosomes المتقاربة (متباعدة في غضون 2 ميكرون من بعضها البعض). درسنا حقول عشوائية متعددة من الخلايا الملون لBrdU ونوى من كل من السيطرة والعلاج MG115 (الشكل 1A) أن نستنتج أن العلاج وجيزة من MG115 لم تؤثر على التأسيس BrdU (حوالي 58٪) مقارنة للسيطرة على العلاج (حوالي 56٪) في الخلايا RPE1. كما كنا مقارنة الخلايا فقط التي كانت في S-المرحلة (كما يحكم من خلال وجود اثنين من γ تويولين بؤر متباعدة في غضون 2 ميكرون من بعضها البعض)، رأيناها γ تويولين كمعيار الداخلي المحتمل للتطبيع. وهكذا، درسنا أولا إذا centrosomal مستويات γ تويولين في خلايا BrdU إيجابي تختلف على proteasome وكبت. ليس من المستغرب، كان هناك تباين كبير خلية الى خلية في γ تويولين كثافة مضان من خلية واحدة إلى أخرى، وجدنا أن هذا الاختلاف كان أفضل عرض في مربع والخط الطولي الرسوم البيانية التي تقدم مجموعة البيانات ككل المتاحة. أنان مربع والخط الطولي الرسوم البيانية، وصناديق تمثل الربع السفلي والعلوي، وعلامة في المربع يشير متوسط ​​كل سلسلة، وتمثل شعيرات القيم الدنيا والقصوى، التي غالبا ما تكون (ولكن ليس دائما) القيم المتطرفة. كما رأينا في الشكل 1D، كان مستوى-γ تويولين centrosomal لا تختلف كثيرا بين خلايا BrdU إيجابي تعامل مع أي MG115 أو DMSO، وبالتالي التحقق من صحة γ تويولين كمعيار داخلي لهذه التجربة. وعلى النقيض من γ تويولين، كانت لتصحيح خلفية كثافة مضان الموافق VDAC3 centrosomal ما يقرب من 2.5 أضعاف العالي في خلايا MG115 المعاملة من التحكم في الخلايا (الشكل 1C). عندما كنا تطبيع الكلي مضان VDAC3 ضد ذلك من γ تويولين، انخفضت أضعاف قليلا إلى ما يقرب من اثنين وأضعاف (الشكل 1E). على الرغم من أن التغيير كان أكبر أضعاف دون التطبيع، لدينا المزيد من الثقة في دقة البيانات تطبيع، والتي نشعر BETTضوابط إيه لأي التأثير العام للعلاج MG115، فضلا عن الاختلاف بسبب تجهيز العينات. لم يتأثر VDAC3 تلطيخ في مواقع غير centrosomal (الشكل 1B) أو المستوى الخلوي الكلي للVDAC3 (الشكل 1F) من خلال proteasome وكبت. وبالتالي، فإننا كميا تحقق ملاحظتنا السابقة التي ينظم تجمع centrosomal من VDAC3 بتدهور بوساطة proteasome و.

من أجل قياس التغير في VDAC3 centrosomal خلال دورة الخلية لقد وصفت الخلايا مع نبض BrdU 4 ساعة تليها مطاردة 4 ساعات من الخلايا المسمى. منذ فقط خلايا S-المرحلة سوف تتضمن BrdU خلال النبض (متوسط ​​المسافة بين اثنين من centrosomes هي 1.35 ± 0.16 ميكرون)، والغالبية العظمى من الخلايا RPE1-BrdU إيجابية بعد 4 ساعات مطاردة سيكون إما في أواخر S-المرحلة أو المرحلة G2 في وقت مبكر ( متوسط ​​المسافة بين اثنين من centrosomes هي 1.55 ± 0.22 ميكرون)، ويبلغ عدد سكانها طفيفة في أواخر المرحلة G2 حيث سنتروبعض الأزواج قد فصل بشكل كبير (متوسط ​​المسافة بين اثنين من centrosomes> 2 ميكرون) 30. γ تويولين، لكونها المكون الرئيسي PCM تتراكم بشكل كبير في centrosomes خلال نضوج الجسيم المركزي الذي يحدث في المرحلة G2 31،32، وهذه الزيادة يجعل من معيار داخلي الفقراء لتقييم الاختلافات دورة الخلية من البروتينات centrosomal الأخرى. من ناحية أخرى، يتم تجنيده Sas6 إلى procentrioles خلال أوائل S-المرحلة لتحفيز الجمعية العامة للرياضة تقوية العضلات 4،5،7، ويبقى في قاعدة centrioles التي شكلت حديثا حتى تدخل خلايا الانقسام عندما يبدأ تكون رديئة (الشكل 2 والمرجع 5). ومع ذلك، في خلايا هيلا أو U2OS، ومستوى مريكزي من Sas6 يزيد تدريجيا مع تقدم الخلايا من S-مرحلة إلى مرحلة G2 5. لذلك، علينا أولا قياس مستوى Sas6 centrosomal مع الاحترام لتلك التي Cep135، وآخر مريكزي البروتين الأساسية التي يموضع إلى أقاصي القريبة من centrioles في جميع أنحاءدورة الخلية 33. نحن لم نلاحظ أي اختلاف كبير في إجمالي كثافة مضان لتصحيح خلفية Cep135 أو Sas6 في الخلايا RPE1-BrdU إيجابي من النبض أو المطاردة، عندما متقاربون centrosomes (الشكل 3A-D، 'وثيقة' الخلايا حيث متوسط ​​المسافة بين اثنين centrosomes أقل من 2 ميكرون). وفقا لذلك، ظل مستوى Sas6 تطبيع مماثل في هذه الخلايا (الشكل 3E). ومع ذلك، لاحظنا زيادة متواضعة في قيم الكثافة مضان الشاملة للSas6 وزيادة طفيفة من الشيء نفسه بالنسبة Cep135 في الخلايا حيث يتم فصل centrosomes جيدا (المسافة بين اثنين من centrosomes> 2 ميكرون، الخلايا البعيدة '). وفقا لذلك، بلغ مجموع مستوى Sas6 centrosomal تطبيع في الخلايا مع اثنين من centrosomes فصل جيدا قليلا، ولكن أعلى إحصائيا بكثير من أن في الخلايا مع centrosomes متباعدة عن كثب. هذا هو الأرجح بسبب تنظيم المتأصل في Sas6 مستوى الذكاءدورة ح خلية تقدم 5. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن زيادات طفيفة (والذي أو ذات دلالة إحصائية أقل) هي نتيجة لإضافة كثافة مضان اثنين centrosomes التي تم تحليلها بشكل منفصل، بالمقارنة مع تحليل اثنين centrosomes في نفس الوقت في الخلايا مع centrosomes متباعدة عن كثب. ومع ذلك، عندما تم تطبيع كثافة مضان من VDAC3 إلى أن من Sas6 وحده، تم زيادة مستوى VDAC3 على اثنين من centrosomes متباعدة عن كثب ما يقرب من 1.5 أضعاف في الخلايا التي هي في أواخر S- / أوائل G2-المرحلة، مقارنة مع S-المرحلة المبكرة الخلايا (الشكل 4A-C، F، خلايا 'وثيقة'). عندما تتقدم هذه الخلايا إلى أواخر المرحلة G2، تم تخفيض مستوى VDAC3 تطبيع في اثنين centrosomes بنسبة 2.4 أضعاف مقارنة بما كان عليه في أواخر S-المرحلة (الشكل 4C، F).

لأن مستويات Sas6 تزيد قليلا من أواخر S-مرحلة لG2، وذلك باستخدام Sas6 كمعيار داخلي يؤدي إلى المبالغة طفيف في ديسمبرrease في مستويات VDAC3 في الخلايا G2-المرحلة المتأخرة (يتم فصل centrosomes بأكثر من 2 ميكرون). في حين أن البيانات تشير الى أن Cep135 هو الخيار الأفضل كمعيار داخلي لتقييم الاختلافات دورة الخلية، لا يمكننا استخدامه لVDAC3 لأن الأجسام المضادة VDAC3 وCep135 المتاحة لنا على حد سواء من الأرانب. ومع ذلك، ضرب القيمة الوسطية لVDAC3 Sas6-تطبيع (F VDAC3 / F Sas6) من قيمة وسيطة من Cep135 تطبيع-Sas6 يعطينا قيمة تقريبية للVDAC3 Cep135-تطبيع [(F VDAC3 / F Sas6) س (F Sas6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. عندما أجرينا هذا التحليل، فإن التغير في مستويات VDAC3 بين أواخر S / G2 أوائل وأواخر G2 قطرات قليلا إلى 2 أضعاف. يتم استبعاد الخلايا BrdU إيجابي التي هي في أي مرحلة من مراحل الانقسام كما تقرره الكروموسومات المختصرة وضعف Sas6 تلطيخ من تحليلنا، وذلك بسبب انخفاض حاد في مستويات Sas6. ومع ذلك، لاحظنا أن مستوى VDAC3 centrosomal إعادةيتبدل منخفضة خلال الانقسام (لا تظهر البيانات). لأن مستويات Cep135 لا تسقط أثناء الانقسام (لا تظهر البيانات)، ونحن يمكن من حيث المبدأ كرر الإجراء إعادة تطبيع لتقدير مستويات VDAC3 Cep135-تطبيع في الانقسام. ومع ذلك، في الواقع كانت centrosomal مستويات Sas6 في الانقسام متغير جدا للسماح لتحديد دقيق لمستويات VDAC3 Sas6-تطبيع في المقام الأول. بغض النظر، عموما، التحقق من البيانات لدينا أن هذا المجمع centrosomal من VDAC3 ينظم في centrosomes خلال دورة الخلية.

الشكل (1)
وحضنت الشكل 1. خلايا RPE1 المتزايد بشكل غير متزامن مع BrdU وMG115 (MG) ​​أو DMSO (DM) لمدة 4 ساعة. (A) يظهر حقول عشوائية من DMSO أو MG115 تعامل خلايا ملطخة مكافحة BrdU الأضداد (الحمراء)، وهويشت ( DNA، الأزرق). هنا وفي جميع الصور الأخرى شريط تمثل 5 ميكرون.(BE) DMSO أو MG115 المعالجة كانت ملطخة الخلايا مع أجسام مضادة ضد VDAC3، γ تويولين وBrdU. تم تصوير الخلايا BrdU إيجابي في ظل ظروف التصوير متطابقة (التعرض مرات-400 ميللي ثانية لfluorophore الأزرق / BrdU، 500 ميللي ثانية لfluorophore أخضر / VDAC3، 300 ميللي ثانية لfluorophore أحمر / γ تويولين)، وتصحيح الخلفية شدة مضان من VDAC3 و γ تويولين تم تحديدها. وتظهر وBrdU (الأزرق) في (ب) صور تمثيلية تظهر VDAC3 (VD3 ؛؛ الأخضر)، γ تويولين (أحمر γ-الحوض). هنا وفي جميع الصور الأخرى، تظهر إدراجات تضخيم رقميا centrosomes كما هو مبين من الساحات. يتم رسم الموافق VDAC3 وγ تويولين 20-5 الخلايا في مربع والخط الطولي الرسم في (C) و (D) على التوالي؛ الخلفية تصحيح كثافة مضان (في وحدات التعسفي F). هنا وفي جميع الحالات الأخرى، وصناديق تمثل الدنيا والربع العلوي، أماهrker في مربع (-) تدل على متوسط ​​كل سلسلة، وتمثل شعيرات الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم. يتم رسم القيم كثافة مضان تطبيع من VDAC3 من تلك الخلايا خمسة وعشرين في (E). ل(CE)، مشتق قيمة ص من أونبايريد T-الاختبار. *** يدل ع <10 -5، ونانوثانية تشير P> 0.05. (F) Immunoblots تظهر مستويات خلية كاملة من VDAC3 (سواء VDAC3a وVDAC3b 16) وγ تويولين (γ-الحوض) حيث α تويولين (α-الحوض) حيث يتم تحميل السيطرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. خلايا RPE1 المتزايد بشكل غير متزامن التي وصفت مع ساعة 4 غرفكانت ملطخة دو النبض وطارد للساعة 4 أخرى في غياب BrdU مع الأجسام المضادة ضد Sas6 (الخضراء) وγ تويولين (γ-حوض، أحمر). تظهر الصور التمثيلية Sas6 تلطيخ خلال (A) S-المرحلة (مع اثنين من قريب Sas6 بؤر)، (B) الطورية (اثنان ضعف بؤر Sas6 في القطبين) و (C) الطور النهائي (تضيع بؤر Sas6 من القطبين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم تصوير الخلايا BrdU إيجابي وصفت الشكل 3. خلايا RPE1 المتزايد بشكل غير متزامن مع نبض BrdU 4 ساعة وطارد للساعة 4 أخرى في غياب BrdU. الملون لCep135 وSas6 في ظل ظروف التصوير متطابقة (التعرض مرات-400 ميللي ثانيةلfluorophore الأزرق / BrdU. 400 ميللي ثانية لfluorophore الأخضر / Cep135. تم تحديد 500 ميللي ثانية لfluorophore أحمر / Sas6)، والخلفية تصحيح كثافة مضان من Sas6 وCep135. وقد تم قياس المسافة بين اثنين من centrosomes أيضا في جميع الخلايا. خلية حيث المسافة بين اثنين من centrosomes أقل من 2 ميكرون كان يعتبر 'وثيقة' وحيث كانت القيمة تم تصنيف أكثر من 2 ميكرون ك "بعيدة". (AB) وصور الممثل تظهر Cep135 (C135، الأخضر)، وتظهر Sas6 (أحمر) وBrdU (الأزرق). في (B)، وC1 C2 هما centrosomes الخلية تمثيلية "بعيدة". (CD) الخلفية تصحيح كثافة مضان (F، في وحدات التعسفي) الموافق Sas6 (C) وCep135 (D) من خمسة عشر خلايا كل فئة يتم رسم مربع والخط الطولي الرسم البياني في. (E) شدة تطبيع من Sas6 جيئة وذهابايتم رسم م تلك الخلايا مربع والخط الطولي الرسم البياني في. ل(CE)، مشتق قيمة ص من أونبايريد T-الاختبار. * يشير إلى 0.001 <P <0.05، ونانوثانية يشير P> 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. خلايا BrdU إيجابية من BrdU أعلاه نبض مطاردة فحص (الشكل 3) الملون لVDAC3 وSas6 تم تصوير تحت ظروف التصوير متطابقة (التعرض مرات-400 ميللي ثانية لfluorophore الأزرق / BrdU، 500 ميللي ثانية لfluorophore الأخضر / Sas6. تم تحديد 1،000 ميللي ثانية لfluorophore أحمر / VDAC3)، والخلفية تصحيح كثافة مضان من Sas6 وVDAC3. وقد تم قياس المسافة بين اثنين من centrosomes في جميع الخلايا، وصنفت خلايا باسم 'جيخسر "(المسافة بين اثنين من centrosomes <2 ميكرون) و" البعيدة "(المسافة بين اثنين من centrosomes> 2 ميكرون)، كما في الشكل (3). (AC) صور الممثل" خلية قريبة "في BrdU النبض (A)، في مطاردة BrdU (B)، وخلية "البعيدة" في BrdU مطاردة (C) الملون لVDAC3 (VD3، الأخضر)، وترد Sas6 (أحمر) وBrdU (الأزرق). في (C)، وC1 C2 هي centrosomes اثنين. [DE] الخلفية تصحيح كثافة مضان (F، في وحدات التعسفي) يتم رسم الموافق VDAC3 (D) وSas6 (E) من خمسة عشر خلايا كل فئة مربع والخط الطولي الرسم البياني في. يتم رسم (F) شدة تطبيع من VDAC3 من تلك الخلايا مربع والخط الطولي الرسم البياني في. ل(DF)، مشتق قيمة ص من أونبايريد T-الاختبار. *** يدل ع <10 -5 **يشير 10 -5 <P <0.001، ونانوثانية تشير P> 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المجهر الكمي في بيولوجيا الخلية ويرتبط عادة مع فحوصات التصوير الخلية الحية، مثل نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق)، الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP)، وما إلى ذلك، هناك أمثلة متزايد من علماء الأحياء الخلايا نامية مختلفة المقايسات المجهري الكمية لثابت الخلايا في السنوات الأخيرة 27،34-36. الأهم من ذلك، التقدم في فهم البيولوجيا الجسيم المركزي وغالبا ما يتطلب فهم وظيفة الجسيم المركزي محددة من البروتينات التي يمكن تنظيمها بشكل مختلف عن غيرها من أحواض حمامات centrosomal. وهكذا، قمنا بتطوير معهد التمويل الدولي الفحص الكمي لتحليل تحديدا على مستوى centrosomal النسبي للبروتين في عينتين تعامل بشكل مختلف. لأن هذا يتطلب أن الخلايا يتم إصلاحها ومعالجتها coverslips على منفصلة، ​​وبالتالي فإننا أدخلت معيارا الداخلي لغرض التطبيع، لتحسين السيطرة عن القطع الأثرية محتملة، بسبب ضرورة التعامل مع experime اثنينالسكان الخلية ntal على حدة، وزيادة دقة الفحص. لا يوجد سوى عدد قليل من الدراسات السابقة 37 التي استخدمت هذا المعيار الداخلي لقياس كثافة مضان النسبية للبروتين الاختبار.

حين اختيار معيار الداخلي هو أمر حاسم لدقة فحص لدينا، فإنه يمكن القول إن الجانب الأكثر تحديا. من الناحية المثالية، التكرارات زوج مريكز خلال S-المرحلة، وcentrioles المكررة ثم تتراكم مكونات PCM إضافية بما في ذلك γ تويولين خلال G2 ذلك أن اثنين من centrosomes الناضجة يمكن أن تصبح أقطاب المغزل الإنقسامية. ولذلك، فإننا نفترض أن مستوى centrosomal من γ تويولين لن تتغير بشكل ملحوظ في الخلايا التي هي بدقة وS-المرحلة. ويبدو أن هذا هو الحال في خلايا RPE1 حيث يتم وضع علامة خلايا S-المرحلة قبل وضع العلامات BrdU وجيزة. ومع ذلك، يجب أن يتم اختبار صلاحية معيار الداخلي لكل نوع من الخلايا وحالة تجريبية. على سبيل المثال، في حين أن خلفية-كورزادت المديرية التنفيذية VDAC3 مضان أكثر من اثنين أضعاف ردا على proteasome وتثبيط في aphidicolin المعالجة (S-المرحلة اعتقلت) U2OS الخلايا، كان هناك أيضا (0.001 <P-قيمة <0.05) زيادة صغيرة ولكن ذات دلالة إحصائية في centrosomal γ تويولين (التكميلية الشكل). وهكذا، γ تويولين ليست دائما على الرقابة الداخلية الملائمة، حتى بالنسبة للخلايا التي يتم القبض عليه في دورة الخلية.

وعلى غرار كل معهد التمويل الدولي المجهري الفحص الآخر، واحدة من عيوب هذا الاختبار هو أن الأجسام المضادة ضد البروتين الاختبار والمعيار الداخلي يجب أن تثار في الأنواع المضيفة مختلفة. في حين أن البيانات تشير الى أن Cep135 هو المعيار الداخلي أفضل من Sas6، لم نتمكن من تطبيع مستويات VDAC3 ضد Cep135 مثل الأجسام المضادة المتاحة ضد هذه البروتينات كان كلا أثيرت في الأرنب. وبالتالي، فإننا بدلا تطبيع ضد Sas6، الذي تسبب في المبالغة في تقدير الانخفاض في مستويات VDAC3 بين أواخر S-مرحلة وG2. في الحالة التي تكون فيها الأسواق العالمية ضغطهامعيار rnal يختلف متواضعة، يمكن للمرء أن إدخال عامل التطبيع آخر لحساب هذا الاختلاف. على سبيل المثال، لتصحيح التباين في Sas6، ضربنا كثافة VDAC3 Sas6-تطبيع من شدة Sas6 Cep135 تطبيع.

في الحالات التي يكون فيها اختيار المعيار الداخلي المناسب أمر صعب، قد صبغة الفلورسنت المجهرية المغلفة (0،02-0،04 ميكرون قطر) توفر استراتيجية بديلة. إشارة من المكروية مضان الحالي في نفس المجال مثل خلية من الفائدة يمكن استخدامها لتطبيع إشارة مضان المقابلة لبروتين من الفائدة. من ناحية أخرى، إذا كان يتم تصوير الاختبار ومراقبة الخلايا معا، واحدة قد لا تحتاج مثل هذا المعيار الداخلي للتطبيع. لقد استخدمت سابقا نسخة من هذا الاختبار لمقارنة مستوى centrosomal من Mps1 في الخلايا overexpressing إما السيكلين و19 أو 20 مضاد الإنزيم، التي إما منع 19 أو 20 لتعزيز degradation من Mps1 في centrosomes، على التوالي، لأنه في خلايا untransfected المجاورة تصويرها في نفس الوقت.

من أجل دراسة تأثير VDAC3 centrosomal على proteasome وكبت، كنا وضع العلامات BrdU لتحديد ومقارنة الخلايا التي هي في S-المرحلة. بينما العلاج MG115 قد تحول دون تقدم دورة الخلية، وهذا تثبيط يتطلب أعلى بكثير تركيز 38 من تلك المستخدمة في هذه الدراسة. في التراكيز المستخدمة هنا MG115 يمكن منع نقاط التفتيش دورة الخلية والتحولات، ولكن لا يمنع تقدم دورة الخلية. ومع ذلك، يجب التحقق من كل نوع من الخلايا، كما فعلنا هنا من خلال إظهار أن MG115 لم يغير النسبة المئوية للخلايا إيجابية BrdU مقارنة DMSO. ومع ذلك، إلقاء القبض على الخلايا في S-المرحلة باستخدام aphidicolin أو هيدروكسي يوريا (HU) أو مزامنة الخلايا باستخدام الإنقسامية "يهز حالا" والافراج أو يمكن استخدام مزدوج كتلة ثيميدين وإطلاق مع اقتراب بديلة لتوليد شعبية يعادلستعقد من الخلايا في S-المرحلة.

فإن استراتيجية نبض مطاردة BrdU لدراسة نقاط زمنية دورة الخلية تكون مفيدة جدا في العديد من المقايسات الفنية التي تتطلب دورة الخلية رابط الجأش. هذا هو مقايسة بيولوجيا أكثر أهمية التي قد تكون قادرة على استبدال التقنيات اعتقال دورة الخلية باستخدام مختلف مثبطات دورة الخلية. استخدام هذه المثبطات قد غالبا ما تسبب أنواع مختلفة من الإجهاد الفسيولوجية في الخلايا مما يؤدي إلى تغيرات شاذة في الظواهر دورة الخلية. استخدام نهج نبض مطاردة مكننا من إثبات أن استنزاف Cetn2 تأخير فقط التجمع مريكز 39 بدلا من التسبب في كتلة كاملة على النحو الذي اقترحه الدراسات السابقة 23. الكشف عن خلايا BrdU إيجابي يتطلب التحلل الحامض من العينات. نحن وكثير من الباحثين الآخرين يستخدمون الاسلوب الذي إعادة إصلاح الخلايا بعد تلطيخ الابتدائي والثانوي للبروتينات اختبار، قبل التحلل الحمضي، مع خسارة ضئيلة من شدة تلطيخ للمختلفار البروتينات الجسيم المركزي 40. ومع ذلك، يمكن أن يكون بديلا محتملا لاستخدام 5-إيثينيل-2'-deoxyuridine (EDU)، وآخر التناظرية ثيميدين هذا هو، على غرار BrdU، أدرجت كفاءة في تكرار DNA 41. التصور من ايدو باستخدام 'انقر الكيمياء "لا يتطلب التحلل الحامض 42، ويجوز لها بالتالي أكثر ملاءمة لبعض الأجسام المضادة.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الفحص بسهولة أن تستخدم لقياس التغير في التعديلات بعد متعدية من بروتين معين في centrosomes. على سبيل المثال، فإن مستوى centrosomal من الفسفرة يمكن تطبيع ضد المستوى الإجمالي من البروتين نفسه، شريطة أن الأجسام المضادة في مواقع محددة الفسفرة موجودة. ويمكن تطبيق هذا الاختبار على الفور لتقييم المستويات النسبية للالفسفرة بين ظروف تجريبية أو مراحل دورة الخلية، ولكن من المحتمل أن تتكيف مع تقييم المستويات الإجمالية من الفسفرة إذا المعلمات الحرجة من الأجسام المضادة affinومن المعروف ities أو يمكن تحديده. وينبغي أيضا أن يكون هذا الاختبار للتطبيق لدراسة البروتينات في أي موقع آخر في الخلايا، على الرغم من أن المنطقة ذات الاهتمام يجب أن لا تكون كبيرة جدا. سوف مقايسة تكون مفيدة بشكل خاص لقياس تعديل موقع معين من البروتين الذي يكون موضعيا في مواقع الخلوية متعددة.

وهناك عدد قليل من المعايير الفنية مثل photobleaching من التفاضلية، وتأثير التصوير الرقمي، والخطي من شدة مضان من fluorophores، والضوضاء الخلفية الخ التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار لتحقيق أقصى قدر من الدقة في قياس 43. على سبيل المثال، يمكن للمرء تبديل تألقي المرتبطة بكل الضد الثانوية لتقييم مساهمة photobleaching من. العديد من المعالم الأخرى يمكن التحكم بشكل جيد إذا واحد يستخدم ظروف مماثلة التصوير (زمن التعرض، وزيادة حجم خطوة، وعدد من Z-مداخن، الخ) ونفس برامج التصوير في كل شوط التصوير. على الرغم من أننا المستخدمةالخوارزمية لا الجار طوال فحص لدينا لأداء صورة إزالة التفاف، وهذا الفحص يمكن دمجها مع الخوارزمية إزالة التفاف أخرى مثل مقيدة تكرارية. ونلاحظ أيضا أنه ينبغي أن يكون من السهل على التكيف مع هذا الاختبار إلى أي عدد من مختلف حزم البرمجيات والتصوير، لأن معظم المتاحة عموما برمجيات تحليل الصور ديه أدوات لتحليل كثافة مضان والمسافات.

وينبغي أن يكون هذا الاختبار ينطبق على أي نوع من الخلايا، وخيارنا الخلايا هنا يستند بحتة على أهميتها في مجال البحوث البيولوجيا الجسيم المركزي، واستخدامها في امتحاناتنا السابقة من centrosomal وظيفة VDAC3 16،28. ومع ذلك، فإن صلاحية المعايير الداخلية والأوقات المناسبة لنبض مطاردة لتحديد الخلايا في S-المرحلة، G2، أو الانقسام يجب أن تحدد لكل نوع من الخلايا. وعموما، سيكون لدينا وضعت حديثا تقنية مضان الكمية في تركيبة مع BrdU نبض مطاردة فحص تكون وسيلة مفيدة جدا لحل العديد معقدةآليات في علم الأحياء الجسيم المركزي وفي كثير من الجوانب الأوسع لبيولوجيا الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma F8141 Stock of 1 mg/ml in water
DMSO Sigma D2650
MG115 Sigma SCP0005 Stock of 10 mM in DMSO
BrdU Sigma B5002 Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) Sigma T 6557 1:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)  Aviva Systems Biology ARP35180-P050 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)  Santa cruz biotechnology sc-81431 1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) Abcam ab-75005 1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)  Abcam ab6326 1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Life technologies A21093 1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21202 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21203 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21206 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21207 1:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) Sigma T5192 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) Sigma T9026 1:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A10043 1:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated Rockland antibodies 610-731-002 1:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent  Life technologies S36936 Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1 Fisherbrand 12-545-80
Olympus IX-81 microscope Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera QImaging  32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective Olympus 1.4 numerical aperture
Slidebook software package Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay Thermo Scientific 23227
U-MNU2 Narrow UV cube Olympus U-M622 Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube Olympus U-M643 Filter
U-MNU2 Narrow Green cube Olympus U-M663 Filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 94، والتجمع الجسيم المركزي، دورة الخلية، وتدهور centrosomal، الكمي المجهري مضان، التطبيع، VDAC3، BrdU نبض مطاردة
الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Majumder, S., Fisk, H. A.… More

Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes. J. Vis. Exp. (94), e52030, doi:10.3791/52030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter