Abstract
Centrosomes sont petits mais importants organites qui servent de pôles de fuseau mitotique pour maintenir l'intégrité génomique ou assembler les cils primaires pour faciliter les fonctions sensorielles dans les cellules. Le niveau d'une protéine peut être réglé différemment au centrosome que dans d'autres endroits .cellular, et la variation du niveau centrosomale de plusieurs protéines à différents points du cycle cellulaire semble être crucial pour le bon régulation de l'assemblage centriole. Nous avons développé un dosage quantitatif microscopie fluorescence qui mesure les changements relatifs dans le taux d'une protéine dans des centrosomes dans des cellules fixées provenant de différents échantillons, comme à différentes phases du cycle cellulaire ou après le traitement avec divers réactifs. Le principe de ce test réside dans la mesure de l'intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région, et qui normalise la même mesure par rapport à une autre protéine qui ne varie pas dans le cadre du c expérimental choisiondition. Utilisant cet essai en combinaison avec impulsion de BrdU et la stratégie de la chasse à étudier cycles cellulaires non perturbés, nous avons quantitativement validé notre récente observation que la piscine centrosomale de VDAC3 est réglementée au centrosomes au cours du cycle cellulaire, vraisemblablement par la dégradation par le protéasome spécifiquement au centrosome.
Introduction
Centrosomes sont constitués d'une paire de centrioles entourées par un matériau péricentriolaire (PCM). Étant les principaux centres d'organisation des microtubules (de MTOCs) dans les cellules de mammifères, centrosomes servent les deux pôles de fuseau mitotique dans les cellules en division, et contribuent ainsi à maintenir l'intégrité du génome 1. Dans les cellules au repos (par exemple, pendant la phase G0), l'un des deux centrioles du centrosome, à savoir le centriole mère, est transformé en un corps de base pour assembler le cil primaire, un organite sensoriel faisant saillie de la surface de la cellule 2. Une fois les cellules re-entrer dans le cycle cellulaire, les cils primaires sont démonté et chaque centriole dirige l'assemblage d'un procentriole à son extrémité proximale qui se allonge progressivement pour former un centriole maturité 3. Au début de la phase S, une structure de roue en forme qui assure la symétrie neuf fois au centriole est formée sur la surface de chaque centriole existant et deviendra la base de chaque procentriole. SAS6 tchapeau est indispensable pour l'assemblage de centriole est recruté pour former le moyeu de la roue 4-6. D'autres protéines centriolaires sont ensuite assemblés sur la roue dans un très réglementé, de manière proximale à distale 7. Après avoir terminé précisément duplication centriole, les cellules se assemblent matériaux péricentriolaire supplémentaires pour construire deux centrosomes fonctionnels d'ici la fin de la phase G2 8. En plus des composants principaux centriolaires 9-11, plusieurs autres protéines kinases, y compris, les phosphatases, chaperons, des composants d'échafaudage, protéines associées à membrane et des machines de dégradation sont associés à des centrioles, les organismes de base et PCM à différents moments du cycle cellulaire 12-16. Il est souvent noté que les niveaux centrosomales de nombreuses protéines sont temporellement régulées par des mécanismes de ciblage centrosomales et / ou dégradation par le protéasome au centrosome. Fait important, les fluctuations du niveau centrosomale de plusieurs protéines telles que PLK4, Mps1, SAS6, et un CP110t différents points du cycle cellulaire semble être cruciale pour réguler ensemble de centriole 5,17-22, et dans le cas de Mps1 empêcher cette dégradation centrosomale conduit à la formation d'excès centrioles 19. D'autre part, les fractions centrosomales de plusieurs protéines sont moins labiles par rapport aux piscines cytosoliques. Par exemple siRNA médiée par régulation à la baisse de Centrin 2 (Cetn2) ne conduit à une diminution modérée de la teneur en protéines dans les centrioles malgré une grande réduction dans les niveaux de cellules entières 23. Il est donc crucial pour mesurer les changements dans le niveau de protéines centrosomales au centrosome plutôt que de mesurer l'ensemble des niveaux de protéines de la cellule lors de l'évaluation de leurs fonctions spécifiques centrosome.
Dans cette étude, nous avons développé un test par immunofluorescence indirecte (IFI) pour quantifier le niveau relatif d'une protéine au centrosome. Cet essai a été développé en particulier pour analyser les cellules qui sont de différents échantillonset ainsi ne peut pas être imagée en même temps. Ces échantillons peuvent être des cellules qui ont été traitées avec différents réactifs (ce est à dire, un médicament par rapport au témoin), recueillies à différents points dans le temps (ce est à dire, le pouls contre la chasse), ou sont dans différentes phases du cycle cellulaire. Le principe de ce test réside dans la mesure de l'intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région et pour normaliser la valeur contre le même pour une autre protéine dont le niveau ne varie pas dans les conditions expérimentales choisies. Plusieurs études de la biologie des centrosomes ont récemment utilisé diverses techniques de microscopie quantitative, dans les deux cellules vivantes ou fixées, afin de déterminer la fonction spécifique du centrosome de protéines candidates 24-27. Similaires à ceux des essais, la présente technique mesure aussi l'arrière-plan corrigé intensité de fluorescence de la protéine d'essai. Toutefois, l'inclusion de la normalisation en utilisant un standard interne dans cet essai aurait probablement offrir une plus grandela précision et la confiance dans l'analyse de deux échantillons différents qui sont sur deux lamelles différentes. En outre, en plus de l'examen de la protéine au niveau de centrosomes, avec des ajustements mineurs ce procédé peut être appliqué à un ensemble diversifié de conditions expérimentales ou à d'autres sites cellulaires.
Ici, nous combinons notre analyse quantitative de microscopie avec une stratégie pulse-chase BrdU de comparer les cellules à différents stades du cycle cellulaire. Au lieu d'utiliser des techniques d'arrêt du cycle cellulaire standard et libération d'étudier divers moments du cycle cellulaire, les cellules en croissance de manière asynchrone sont incubées avec BrdU pour marquer les cellules en phase S, et les cellules marquées sont chassés pendant divers temps (typiquement 4-6 heures). La plupart des cellules marquées seront en phase S immédiatement après l'impulsion. La longueur de la chasse est choisi de manière que, après la chasse, cellules marquées seront à la fin de S, G2, ou mitose, qui peut être vérifié par des caractéristiques morphologiques telles de position as- du centrosome par rapport à nuclei, la distance entre les centrosomes, la condensation des chromosomes, etc. Ainsi, la longueur de la chasse dépend de la durée moyenne de S, G2 et M phase d'un type cellulaire particulier. Étant donné que cette approche évite les inhibiteurs du cycle cellulaire tels que l'hydroxyurée, l'aphidicoline, nocodazole, etc., il permet une analyse plus physiologiquement pertinente du cycle cellulaire.
Ainsi, nous démontrons ici que le dosage quantitatif de la microscopie par fluorescence seul, ou en combinaison avec BrdU test pulse-chase, est une technique simple mais puissant pour mesurer avec précision les changements relatifs dans le niveau centrosomale d'une protéine de candidat pendant une cycle cellulaire imperturbable. Nous avons mesuré le niveau de centrosomale VDAC3, une protéine que nous avons récemment identifié au centrosomes en plus de mitochondries 16,28, l'utilisation de ces tests. Les résultats obtenus ici vérifier notre observation précédente que la piscine centrosomale de VDAC3 est régulée par la dégradation, et varie également en un dependen du cycle cellulairet 16 manière, la validation outre l'applicabilité de cette méthode.
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Protocol
1. Culture cellulaire
- Utilisez télomérase humaine transcriptase inverse (hTERT) cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine immortalisées (hTERT-RPE1; appelle ici RPE1).
REMARQUE: les cellules sont des cellules humaines RPE1 quasi-diploïdes, non transformées qui sont couramment utilisés pour étudier ensemble centriole et ciliogenèse. Ces cellules suivent un cycle de duplication normale centriole coordonné avec un cycle cellulaire régulée. - Passage d'une boîte de 100 mm de culture cellulaire quasi-confluente de cellules RPE1 à 1: 5 dilution de la culture d'origine dans une boîte fraîche de 100 mm contenant 10 ml de DME / F-12 (1: 1) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine (milieu complet est désignée sous le DME / F-12). Cultiver les cellules à 37 ° C en présence de 5% CO 2.
- Incuber 12 mm lamelles de verre rondes dans 50 ml de HCl 1 N dans un bécher de verre couverte, O / N sans agitation, à 60 ° C dans un bain-marie ou incubateur.
- After jeter la solution acide, laver les lamelles trois fois dans 100 ml d'eau distillée par incubation pendant 15 min en agitant de temps. Répéter le lavage de manière similaire dans 70% d'éthanol et 95% d'éthanol.
- Sécher les lamelles couvre-objet en les étalant individuellement sur un papier buvard laboratoire dans une enceinte de sécurité biologique, suivi par une stérilisation avec un rayonnement UV pendant 60 min.
- 4.2 Placer les lamelles sec dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Diluer la solution de fibronectine ou de la fibronectine comme polymère d'ingénierie (concentration stock de 1 mg / ml) jusqu'à une concentration de 25 ug / ml dans une culture cellulaire PBS.
- Placez 80-100 ul de la solution diluée sur chaque lamelle et incuber pendant 60 min à enduire le côté haut de la lamelle. Laver les lamelles trois fois en utilisant du PBS avant d'ajouter un milieu complet.
2. la croissance de cellules et le traitement des cellules avec des inhibiteurs du protéasome
- Passage 2 x 10 5 croître de manière asynchroneING RPE1 cellules dans chaque boîte de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet et cultiver les cellules dans 2 ml de milieu complet. Remplacez le milieu de culture toutes les 24 heures avec un milieu complet frais préchauffé.
- Pour analyser l'effet de l'inhibition du protéasome au niveau centrosomale de la protéine de test (ici VDAC3 ou γ-tubuline), poussent les cellules dans deux boîtes de 35 mm pour 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet et ajouter soit MG115 ou le DMSO en tant que solvant témoin à une concentration finale de 5 uM ou 0,05%, respectivement. Dans le même temps, ajouter BrdU dans les cellules à une concentration finale de 40 uM et on incube les cellules pendant 4 heures.
- Transférer chaque lamelle dans une plaque de 24 puits. Ajouter 500 ul de methanol refroidi dans chaque puits et incuber la plaque à 20 ° C pendant 10 min pour fixer les cellules sur des lamelles couvre-objet. Laver immédiatement les lamelles trois fois avec 500 pi de tampon de lavage (1x PBS contenant 0,5 mM MgCl 2 et 0,05% de Triton X-100).
- Récolter les résiduellecellules de la boîte de 35 mm et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min. Utiliser le culot de cellules à analyser la protéine totale par buvardage de Western (étape 6).
3. BrdU Pulse et Chase essai pour analyser les niveaux de protéines dans les différentes phases du cycle cellulaire
- Pour analyser la variation du niveau d'une protéine (ici VDAC3, SAS6 ou Cep135) à centrosomes à différentes phases du cycle cellulaire, cultiver les cellules dans deux boîtes de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet pendant 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet contenant 40 uM de BrdU et incuber les cellules pendant 4 heures dans l'incubateur de culture cellulaire.
- D'un plat, transférer les lamelles à une plaque de 24 puits pour fixer les cellules à l'aide de méthanol glacé comme décrit à l'étape 2.1.2.
- Après l'impulsion de BrdU 4 heures, retirer le milieu contenant BrdU, laver les cellules une fois avec du PBS et une fois avec du milieu complet, ajouter du milieu frais, puis les cellules croître en l'absence de BrdU pendant divers temps (typiquement un autre 4 hpour les cellules RPE1) avant de fixer les cellules comme décrit à l'étape 2.1.2.
NOTE: Pour les cellules RPE1, la majorité des cellules positives à la BrdU sont à la fin de S ou G2 phase après une poursuite de 4 heures. Cela doit être déterminé de façon indépendante pour chaque type de cellule.
4. Immunocoloration
- Incuber les cellules fixées sur des lamelles dans 200 ul de tampon de blocage (2% de BSA et 0,1% de Triton X-100 dans du PBS 1x) pendant 30 min.
- Incuber les cellules avec un mélange d'anticorps primaires (typiquement chez le lapin a soulevé une et l'autre soulevée dans une souris) dilué dans du tampon de blocage O / N à 4 ° C dans une chambre humidifiée.
- Pour faire une chambre humidifiée, mettre une serviette en papier humide dans la moitié inférieure d'un mille ul boîte de pointe de la pipette vide. Déposer une bande de Parafilm sur la surface de crémaillère, et repérer une gouttelette (15 à 20 pi) de la solution d'anticorps sur le Parafilm pour chaque lamelle à incuber. Inverser une lamelle couvre-objet sur une gouttelette de solution d'anticorps (de sorte que les cellules sont immergées) et à proximitéle couvercle de la boîte de pointe.
- Inversez lamelles encore et les retourner à la boîte de 24 puits. Laver les lamelles couvre-objet, puis les incuber en mélange 150 ul de l'anticorps secondaire (ici colorant anti-lapin conjugué fluorescent vert-rouge et un colorant fluorescent conjugué anti-souris dilué dans du tampon de blocage) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lamelles trois fois.
NOTE: Les anticorps secondaires conjugués fluorophores sont sensibles à la lumière. Protéger les échantillons de la lumière pendant les étapes 4.1.3-5.1.2.
- Préparation pour la coloration anti-BrdU en fixant les cellules colorées RPE1 de nouveau avec 500 ul de methanol refroidi à -20 ° C pendant 10 min, comme décrit dans l'étape 2.1.2. Laver les lamelles trois fois.
REMARQUE: Cette fixation fixe le primaire et le secondaire marquage de l'anticorps de la protéine (s) d'intérêt au cours du processus d'hydrolyse acide dans l'étape suivante.- Incuber les cellules dans 200 ul de HCl 2 N pendant 30 minutes à température ambiante. Neutraliser avec 300 pi de 1 M Tris-Cl, pH 8 uneD laver les cellules trois fois avec le tampon de lavage.
- Bloquer de nouveau les cellules en utilisant 200 ul de tampon de blocage pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber les cellules avec des anticorps de rat anti-BrdU (dilué dans du tampon de blocage) pendant 45 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée. Retourner les lamelles de retour à l'antenne de 24 puits, lavez-les et puis incuber avec un colorant bleu anticorps secondaire fluorescent conjugué anti-rat (dilué dans 150 pi de tampon de blocage dans un plat de 24 puits pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les lamelles trois fois. Repérer une goutte (environ 3-6 pi) d'une solution de montage contenant antifade réactif sur une lame de microscope en verre. Inverser une lamelle couvre-objet, avec la cellule du côté orienté vers le bas, sur la solution de montage. Essuyez l'excès de liquide en appuyant doucement la lamelle contre la diapositive en utilisant des tissus de nettoyage doux. Appliquer le vernis à ongles transparent le long du bord de la lamelle pour la sceller sur la lame de microscope.
5. immunofluorescence image Acquisition et Analyse
- Utilisez un objectif à immersion d'huile plan 100X Apo (avec une ouverture numérique de 1,4) pour acquérir les images de cellules RPE1 BrdU-positifs à la température ambiante.
- Placer une lame sur le microscope (voir équipement) attaché avec une caméra capable de l'imagerie numérique. Pour chaque fluorophore, déterminer le temps d'exposition approprié (typiquement entre 300-1000 ms) en examinant manuellement tous les échantillons d'une expérience. Avant l'acquisition des images d'une cellule, déterminer manuellement la partie supérieure appropriée et fond plan focal le long de l'axe Z (en général 0,2 um taille de pas). Acquérir des images de différents échantillons qui sont sur des lamelles séparées en utilisant le temps d'exposition identique pour différents fluorophores le long de l'axe Z en utilisant un logiciel d'imagerie par microscopie numérique.
- Effectuer déconvolution (dans ces cas en utilisant l'algorithme Pas de voisin) de toutes les piles d'images acquises le long de l'axe-Z.
- Obtenir la projection totale de l'intensité de chaque pile d'images le longl'axe-Z.
- Dans les cellules où centrosomes sont proches (distance entre deux centrosomes est inférieure à 2 um), dessiner un petit carré (généralement 20 à 30 pixels par côté) autour des deux centrosomes et marquer la zone sélectionnée.
- Dessinez un carré plus grand (en général de 24 à 35 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée de la grande place.
- Obtenir la zone (A) et l'intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte (S désigne petite boîte et L désigne grande boîte).
- Analyser le fond corrigé intensité de fluorescence de chaque fluorophore en utilisant la formule décrite par Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x S A / (A L - A S)].
- Obtenir l'intensité de fluorescence normalisée de la protéine d'intérêt (ici ou VDAC3 SAS6) en calculant le rapport de l'intensité de fluorescence d'arrière-plan corrigé de ses fluorophore à celle du fluorophore utilisé pour le standard interne choisi (ici γ-tubuline, ou SAS6 Cep135).
- Dans le cas de l'analyse de cellules où centrosomes sont bien séparées (distance entre deux centrosomes est supérieure à 2 um), analyser séparément chaque centrosome en traçant deux ensembles distincts de boîtes. Dessinez un petit carré (généralement 15 à 25 pixels par côté) autour de chaque centrosome et marquer la zone sélectionnée. Dessinez un carré plus grand (20 à 30 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée.
- Obtenir la zone (A) et l'intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte, et de calculer les intensités de fluorescence corrigée fond de chaque fluorophore, séparément pour chaque centrosome, comme décrit à l'étape 5.3.3.
- Combiner les intensités de fluorescence de fond corrigé de chaque protéine à partir des deux centrosomes pour obtenir le niveau centrosomale totale de cette protéine dans cette cellule.
- Obtenir leintensité normalisée pour la protéine d'intérêt en calculant le rapport de son intensité totale centrosomale à l'intensité centrosomale totale de l'étalon interne.
- Analyser au moins 15 à 25 cellules pour chaque condition expérimentale et tracer le graphique dans une feuille de calcul.
6. Analyse de la protéine totale Utilisant Western Blot
- Resuspendre les cellules dans radioimmunoprecipitation dosage (RIPA) un tampon contenant 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium à 1%, 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) et incuber pendant 10 min sur de la glace à lyser les cellules.
- Centrifuger le mélange à 10 000 xg pendant 10 minutes, séparer le lysat provenant de la fraction de culot et de mesurer la concentration totale en protéines de chaque lysat en utilisant un acide bicinchoninique (BCA) trousse de dosage.
- Mélanger 40 pg de lysat avec SDS-PAGE 4x tampon de chargement (50 mM de Tris-Cl, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glycerol, 100 mM de dithiothréitol, 0,1% Bromophenol bleu).
- Faire bouillir les échantillons pendant 10 min et exécuter les échantillons sur un 12,5% de dénaturation SDS-PAGE à une tension constante de 200 V.
- Transférer les protéines séparées sur SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose en utilisant la technique du Western blot (à une tension constante de 90 V pendant 1 heure à froid).
- Bloquer la membrane avec 3% de lait écrémé dans du PBS 1x, puis incuber la membrane avec des solutions d'anticorps primaire dilué (dans ce cas de lapin anti-VDAC3, lapin anti-γ-tubuline et de souris anti-α-tubuline) pour une heure à température ambiante.
- Après avoir lavé la membrane trois fois (chaque 5 minutes d'incubation sous agitation) à l'aide du tampon PBS-T (PBS 1x et 0,2% de Tween-20), incuber la membrane dans un mélange de proche infrarouge (IR) colorant fluorescent conjugué anti-lapin et Anticorps de colorant fluorescent IR anti-souris conjuguée secondaires (dilué dans du PBS-T) pendant 1 heure.
- Laver la membrane trois fois, puis balayer la membrane d'analyser les bandes en utilisant un f infrarougeSystème d'imagerie par luorescence approprié pour la détection par immunotransfert.
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Representative Results
Nos études récentes ont identifié roman localisation centrosomale et la fonction de VDAC3, l'un des porines mitochondriales 16,28. Immunocoloration de plusieurs cellules de mammifères y compris les cellules RPE1 utilisant un anticorps spécifique VDAC3 a présenté une coloration centrosomale proéminent et relativement faible coloration mitochondriale. Nous avons également montré que VDAC3 centrosomale est préférentiellement associée à la centriole mère, et la piscine centrosomale à la fois endogènes et ectopique exprimé VDAC3 est réglementée par la dégradation 16. Afin de valider le dosage quantitatif IIF nous avons examiné les changements dans le pool de VDAC3 centrosome associée à des cellules qui sont en phase S.
Ici, les cellules RPE1 croissance asynchrone ont été traités avec l'inhibiteur de protéasome MG115 ou le contrôle DMSO pendant 4 heures. Pour limiter notre analyse à des cellules qui qui sont en phase S et subissant ensemble centrosome, nous ne les cellules qui ont incorporé BrdU du examinésonner la même 4 heures et a eu deux centrosomes étroitement espacées à l'intérieur espacées (2 um les uns des autres). Nous avons examiné plusieurs champs aléatoires de cellules colorées pour BrdU et noyaux de contrôle et de traitement MG115 (figure 1A) de conclure que le traitement de courte durée des MG115 ne affecte pas l'incorporation de BrdU (environ 58%) par rapport à contrôler le traitement (environ 56%) dans les cellules RPE1. Comme nous l'avons comparé seules les cellules qui étaient en phase S (comme jugé par la présence de deux foyers de γ-tubuline espacée à l'intérieur de 2 um les uns des autres), nous avons considéré γ-tubuline en tant que standard interne pour la normalisation potentiel. Ainsi, nous avons d'abord examiné si les niveaux γ-tubuline centrosomales dans les cellules positives à la BrdU varient sur l'inhibition du protéasome. Sans surprise, on observe une variation de cellule à cellule considérable dans γ-tubuline intensité de fluorescence d'une cellule à une autre, et nous avons trouvé que cette variation a été mieux présenté en boîte et moustaches diagrammes qui présentent l'ensemble comme un tout les données disponibles. Jen boîte et moustaches diagrammes, boîtes représentent le quartile inférieur et supérieur, le marqueur dans la case indique la médiane de chaque série et les moustaches représentent des valeurs minimales et maximales, qui sont souvent (mais pas toujours) les valeurs aberrantes. Comme on le voit sur la figure 1D, le niveau de γ-tubuline centrosomale ne était pas significativement différent entre les cellules positives à la BrdU traités par MG115 ou le DMSO, validant ainsi γ-tubuline en tant qu'étalon interne pour cette expérience. Contrairement à la γ-tubuline, l'intensité de fluorescence d'arrière-plan corrigé correspondant à VDAC3 centrosomale était d'environ 2,5 fois plus élevée dans les cellules traitées avec MG115 que dans les cellules de contrôle (Figure 1C). Lorsque nous avons normalisé fluorescence VDAC3 totale contre celle de γ-tubuline, la multiplication a légèrement baissé à environ deux fois (figure 1E). Bien que le facteur de variation était plus grande sans normalisation, nous avons plus confiance dans l'exactitude des données normalisées, qui nous semblent bettcontrôles à l'urgence pour un effet général du traitement MG115, ainsi que la variation due au traitement de l'échantillon. VDAC3 coloration sur des sites non-centrosomales (figure 1B) ou niveau cellulaire total de VDAC3 (figure 1F) n'a pas été affectée par l'inhibition du protéasome. Ainsi, nous vérifions quantitativement notre observation précédente que la piscine centrosomale de VDAC3 est réglementée par la dégradation par le protéasome.
Afin de mesurer le changement de VDAC3 centrosomale au cours du cycle cellulaire nous avons marqué les cellules avec une impulsion de BrdU 4 h suivie d'une poursuite de 4 heures des cellules marquées. Depuis que les cellules en phase S intégreront BrdU pendant l'impulsion (distance moyenne entre deux centrosomes est de 1,35 ± 0,16 um), la majorité des cellules de RPE1 BrdU positif après quatre chase h sera soit à la fin de S-phase ou phase G2 tôt ( distance moyenne entre deux centrosomes est de 1,55 ± 0,22 um), avec une population mineure à la phase G2 fin où le centroune certaine paire a considérablement séparés (distance moyenne entre deux centrosomes> 2 pm) 30. γ-tubuline, étant une composante majeure de PCM accumule fortement au cours de la maturation des centrosomes centrosome qui a lieu à la phase G2 31,32, et cette augmentation fait un étalon interne pauvres pour évaluer les variations du cycle cellulaire d'autres protéines centrosomales. D'autre part, SAS6 est recruté pour procentrioles au début de la phase S de stimuler assemblage des roues de charrettes 4,5,7, et reste à la base des centrioles nouvellement formés jusqu'à cellules entrent en mitose quand il commence à se dégrader (Figure 2 et la référence 5). Cependant, dans les cellules HeLa ou U2OS, le niveau de centriolaire SAS6 augmente progressivement à mesure que les cellules progressent de S-phase à G2 5. Par conséquent, nous avons mesuré le niveau SAS6 centrosomale par rapport à celle de Cep135, une autre protéine centriolaire de base qui se localise dans les extrémités proximales des centrioles partoutle cycle cellulaire 33. Nous ne avons pas observé de différence significative dans le total des intensités de fluorescence de fond corrigée de Cep135 ou SAS6 dans les cellules RPE1 BrdU positif de pouls ou la chasse, quand centrosomes sont étroitement espacés (figure 3A-D; «fermer» les cellules distance à laquelle moyenne entre deux centrosomes est inférieure à 2 um). En conséquence, le niveau SAS6 normalisée est resté similaire dans ces cellules (Figure 3E). Cependant, nous avons observé une augmentation modeste de l'ensemble des valeurs d'intensité de fluorescence de SAS6 et une légère augmentation de la même chose pour Cep135 dans les cellules où centrosomes sont bien séparés (distance entre deux centrosomes> 2 pm; cellules «lointains»). En conséquence, le niveau total centrosomale SAS6 normalisée dans des cellules à deux centrosomes bien séparées était légèrement, mais statistiquement significativement supérieure à celle dans les cellules avec des centrosomes étroitement espacés. Cela est probablement dû à la réglementation inhérente à l'esprit SAS6 niveauh progression du cycle cellulaire 5. Cependant, il est également possible que les légères augmentations (ou dont la signification statistique du bas) sont dues à l'addition des intensités de fluorescence des deux centrosomes qui ont été analysés séparément par rapport à l'analyse des deux centrosomes en même temps dans les cellules avec centrosomes étroitement espacés. Néanmoins, lorsque l'intensité de fluorescence de VDAC3 a été étalonnée par rapport à celui de SAS6 seul, le niveau de VDAC3 à deux centrosomes rapprochées a été augmentée d'environ 1,5 fois dans les cellules qui sont à la fin de S- / petite G2 en phase, par rapport à la phase S précoce cellules (figure 4A-C, F, les cellules «étroits»). Lorsque ces cellules progressent à la fin de la phase G2, le niveau de VDAC3 normalisé à deux centrosomes a été réduit de 2,4 fois par rapport à celle à la fin de la phase S (Figure 4C, F).
Parce que les niveaux SAS6 augmentent légèrement de la fin de la phase S à G2, en utilisant SAS6 comme standard interne conduit à une légère surestimation de ces diminutionsra is VDAC3 des niveaux dans les cellules en phase G2 fin (centrosomes sont séparés par plus de 2 um). Bien que nos données suggèrent que Cep135 est un meilleur choix comme standard interne pour évaluer les variations du cycle cellulaire, nous ne pouvons pas l'utilisons pour VDAC3 parce que les anticorps VDAC3 et Cep135 se offrent à nous sont à la fois du lapin. Cependant, la multiplication de la valeur médiane pour VDAC3 SAS6 normalisée (F VDAC3 / F SAS6) par la valeur médiane des Cep135 normalisé SAS6 nous donne une valeur approximative pour VDAC3 Cep135 normalisée [(F VDAC3 / F SAS6) x (F SAS6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Lorsque nous avons effectué cette analyse, le changement dans les niveaux VDAC3 entre la fin S / G2 précoce et tardive G2 diminue légèrement à 2 fois. cellules positives à la BrdU qui sont dans ne importe quel stade de la mitose à en juger par les chromosomes condensés et faible coloration SAS6 sont exclus de notre analyse, en raison de la baisse spectaculaire des niveaux SAS6. Cependant, nous avons constaté que le niveau VDAC3 centrosomale rerestée faible au cours de la mitose (données non présentées). Parce que les niveaux Cep135 ne tombent pas lors de la mitose (données non présentées), nous pourrions, en principe, répétez la procédure re-normalisation pour estimer les niveaux de VDAC3 Cep135 normalisées dans la mitose. Cependant, en réalité centrosomales niveaux SAS6 en mitose étaient trop variables pour permettre une détermination précise des niveaux de VDAC3 SAS6-normalisées en premier lieu. Peu importe, dans l'ensemble, nos données ont vérifié que la piscine centrosomale de VDAC3 est réglementée au centrosomes au cours du cycle cellulaire.
Figure 1. cellules RPE1 croissance asynchrone ont été incubées avec BrdU et MG115 (MG) ou le DMSO (DM) pendant 4 heures. (A) indiqués sont des champs aléatoires de DMSO ou MG115 traités cellules colorées avec l'anticorps anti-BrdU (rouge) et Hoechst ( ADN; bleu). Ici et dans toutes les autres images de la barre représente 5 um.(BE) DMSO ou MG115 cellules traitées ont été colorées avec des anticorps contre VDAC3, γ-tubuline et BrdU. cellules positives à la BrdU ont été imagées dans des conditions d'imagerie identiques (exposition fois- 400 ms pour le bleu fluorophore / BrdU; 500 ms pour le vert fluorophore / VDAC3; 300 ms pour fluorophore rouge / γ-tubuline), et l'arrière-plan corrigée intensités de fluorescence des VDAC3 et γ-tubuline ont été déterminés. Images représentatives montrant VDAC3 (VD3, le vert), γ-tubuline (γ-baignoire; rouge) et BrdU (bleu) sont présentés dans (B). Ici et dans toutes les autres images, encarts montrent agrandie numériquement centrosomes comme indiqué par les carrés. Les intensités de fluorescence de fond corrigé (F; en unités arbitraires) correspondant à VDAC3 et γ-tubuline de vingt-cinq cellules sont représentées dans le diagramme des quartiles en (C) et (D) respectivement. Ici et dans tous les autres cas, les boîtes représentent inférieur et le quartile supérieur, le marker dans la case (-) indique la valeur médiane de chaque série, et les trichites représentent des valeurs minimales et maximales. Les valeurs d'intensité de fluorescence normalisée de VDAC3 de ces vingt-cinq cellules sont tracées en (E). Pour (CE), la valeur de p est dérivé du test t non apparié. *** Indique p <10 -5, et ns indique p> 0,05. (F) Immunoblots montrant les niveaux de cellules entières de VDAC3 (deux VDAC3a et VDAC3b 16) et γ-tubuline (γ-baignoire) où α-tubuline (α-baignoire) chargement de contrôle. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. cellules RPE1 croissance asynchrone qui ont été étiquetés avec un 4 h Brimpulsions dU et ciselé pour un autre 4 heures en l'absence de BrdU ont été colorées avec des anticorps contre SAS6 (vert) et γ-tubuline (γ-baignoire; rouge). Des images représentatives montrent SAS6 coloration cours (A) de la phase S (avec deux à proximité SAS6 foyers), (B) métaphase (deux faibles foyers SAS6 aux pôles) et (C) télophase (foyers SAS6 sont perdus des pôles). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Cellules en croissance de façon asynchrone de RPE1 Figure 3. ont été marquées avec une impulsion de BrdU 4 h et chassés pour un autre 4 heures en l'absence de BrdU. Cellules positives à la BrdU colorées pour Cep135 et SAS6 ont été imagées dans des conditions d'imagerie identiques (exposition fois- 400 msecpour le bleu fluorophore / BrdU; 400 ms pour fluorophore vert / Cep135; 500 ms pour fluorophore rouge / SAS6), et corrigées pour les intensités de fluorescence et SAS6 Cep135 ont été déterminées. La distance entre deux centrosomes a également été mesurée dans toutes les cellules. Une cellule où la distance entre deux centrosomes est inférieure à 2 um a été considérée comme «proche» et où la valeur est supérieure à 2 um a été classé comme «lointaine». (AB) images représentatives montrant Cep135 (C135; vert), SAS6 (rouge) et BrdU (bleu) sont présentés. En (B), C1 et C2 sont les deux centrosomes de la cellule représentant «distant». (DR) Les intensités de fluorescence de fond corrigée (F; en unités arbitraires) correspondant à SAS6 (C) et Cep135 (D) de quinze cellules de chaque catégorie sont tracées dans la boîte et le diagramme de moustache. (E) des intensités normalisées de SAS6 from ces cellules sont tracées dans la boîte et le diagramme de moustache. Pour (CE), la valeur de p est dérivé du test t non apparié. * Indique 0,001 <p <0,05, et ns indique p> 0,05. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure de cellules 4. BrdU-positifs de l'essai d'impulsion de chasse BrdU ci-dessus (Figure 3) colorées pour VDAC3 et SAS6 été imagées dans des conditions d'imagerie identiques (exposition fois- 400 ms pour le bleu fluorophore / BrdU; 500 ms pour fluorophore vert / SAS6; 1000 ms pour le rouge fluorophore / VDAC3), et le fond corrigée intensités de fluorescence de SAS6 et VDAC3 ont été déterminés. La distance entre deux centrosomes a été mesurée dans toutes les cellules, et les cellules ont été classés comme «cperdre »(la distance entre deux centrosomes <2 um) et« lointain »(la distance entre deux centrosomes> 2 um), comme dans la figure 3. (AC) images représentatifs de« fermer »la cellule dans BrdU impulsion (A), dans chase BrdU (B), et la cellule «lointaine» à la poursuite de BrdU (C) colorées pour VDAC3 (VD3; vert), SAS6 (rouge) et BrdU (bleu) sont présentés. En (C), C1 et C2 sont les deux centrosomes. [DE] Les intensités d'arrière-plan de fluorescence corrigée (F; en unités arbitraires) correspondant à VDAC3 (D) et SAS6 (E) à partir de quinze cellules de chaque catégorie sont représentés graphiquement dans la case et le diagramme de whiskers. (F) intensités normalisées de VDAC3 de ces cellules sont tracées dans la boîte et le diagramme de moustache. Pour (DF), la valeur de p est dérivé du test t non apparié. *** Indique p <10 -5, **indique 10 -5 <p <0,001, et ns indique p> 0,05. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La microscopie quantitative en biologie cellulaire est souvent associée à des tests d'imagerie cellules vivantes telles que Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), etc. Cependant, il ya des exemples croissants de biologistes cellulaires développement différents tests de microscopie quantitative pour fixe cellules au cours des dernières années 27,34-36. Fait important, les progrès dans la compréhension de la biologie centrosome nécessite souvent la compréhension de la fonction spécifique des protéines dont centrosome piscines centrosomale peut être réglementée différemment des autres piscines. Ainsi, nous avons développé un dosage quantitatif IIF pour analyser spécifiquement le niveau centrosomale relative d'une protéine dans deux échantillons traités différemment. Comme cela requiert que les cellules sont fixées et traitées sur des lamelles distinctes, on introduit donc un étalon interne à des fins de normalisation, à un meilleur contrôle des artefacts possibles en raison de la nécessité de traiter les deux experimecellulaire ntal Populations séparément, et d'augmenter la précision du dosage. Il ya seulement quelques études antérieures 37 qui ont utilisé un tel étalon interne pour mesurer l'intensité de fluorescence relative d'une protéine d'essai.
En choisissant une norme interne est cruciale pour l'exactitude de notre test, il est sans doute l'aspect le plus difficile. Idéalement, les doublons de paires centriole pendant la phase S, et les centrioles doubles accumulent alors PCM composants supplémentaires, y compris au cours de la tubuline γ-G2 de sorte que les deux centrosomes matures peuvent devenir des pôles du fuseau mitotique. Par conséquent, nous supposons que le niveau centrosomale de γ-tubuline ne changerait pas de manière significative dans les cellules qui sont strictement phase S. Cela semble être le cas dans les cellules RPE1 où les cellules en phase S sont marquées par une brève marquage BrdU. Toutefois, la validité d'un étalon interne doit être testé pour chaque type de cellule et de l'état expérimental. Par exemple, alors que le fond-CorreDECT VDAC3 fluorescence a augmenté plus de deux fois en réponse à l'inhibition du protéasome dans aphidicoline traités (phase S arrêté) U2OS cellules, il y avait aussi un petit mais statistiquement significative (0,001 <p <0,05) de centrosomale γ-tubuline (supplémentaire Figure). Ainsi, γ-tubuline ne est pas toujours un contrôle interne approprié, même pour les cellules qui sont arrêtés dans le cycle cellulaire.
Comme pour tous les autres tests de microscopie IIF, l'un des inconvénients de ce test est que les anticorps contre la protéine d'essai et l'étalon interne doivent être soulevées dans différentes espèces hôtes. Bien que nos données suggèrent que Cep135 est une norme interne mieux que SAS6, nous ne pouvions pas normaliser les niveaux VDAC3 contre Cep135 que les anticorps disponibles contre ces protéines ont tous deux été soulevées dans lapin. Ainsi, nous place normalisée contre SAS6, qui a causé une surestimation de la diminution des niveaux VDAC3 entre la fin de la phase S et G2. Dans une situation où l'interne norme varie modestement, on peut introduire un autre facteur de normalisation pour tenir compte de cette variation. Par exemple, pour corriger la variation de SAS6, nous avons multiplié l'intensité de VDAC3 SAS6 normalisée par l'intensité SAS6 Cep135 normalisé.
Dans les cas où le choix d'un étalon interne approprié est difficile, microsphères enrobées de colorant fluorescent (0,02 à 0,04 um de diamètre) peuvent fournir une stratégie alternative. Le signal d'une microsphère de fluorescence présente dans le même champ que la cellule d'intérêt peut être utilisé pour normaliser le signal de fluorescence correspondant à la protéine d'intérêt. D'autre part, si les cellules de test et de contrôle sont imagés ensemble, on peut ne pas avoir besoin d'un tel étalon interne pour la normalisation. Nous avons déjà utilisé une version de ce test pour comparer le niveau de centrosomale Mps1 dans les cellules surexprimant soit cycline A 19 ou 20 antizyme, qui soit à prévenir 19 ou 20 promouvoir le degradation de Mps1 à centrosomes, respectivement, que dans des cellules non transfectées imagées adjacentes en même temps.
Afin d'examiner l'effet de VDAC3 centrosomale sur l'inhibition du protéasome, nous avons utilisé marquage BrdU pour identifier et comparer les cellules qui sont en phase S. Bien que le traitement MG115 peut inhiber la progression du cycle cellulaire, cette inhibition nécessite une concentration significativement plus élevée 38 que celle utilisée dans la présente étude. Aux concentrations utilisées ici MG115 peut bloquer les points de contrôle du cycle cellulaire et de transitions, mais ne pas bloquer la progression du cycle cellulaire. Cependant, qui doivent être vérifiées pour chaque type de cellule, que nous avons fait ici en montrant que MG115 n'a pas modifié le pourcentage de cellules positives par rapport à BrdU DMSO. Cependant, arrêtant les cellules dans la phase S utilisant aphidicoline ou hydroxyurée (HU) ou la synchronisation des cellules en utilisant mitotique "shake-off 'et relâcher ou double bloc de thymidine et la libération pourraient être utilisés comme approches alternatives pour générer popula équivalenttions de cellules dans la phase S.
La stratégie pulse-chase BrdU pour étudier les points de temps du cycle cellulaire sera très utile dans de nombreux tests fonctionnels qui nécessitent un cycle cellulaire imperturbable. Il se agit d'un dosage biologique plus importante qui pourrait être en mesure de remplacer les techniques d'arrêt du cycle cellulaire en utilisant divers inhibiteurs du cycle cellulaire. L'utilisation de ces inhibiteurs peut souvent causer différents types de stress physiologique dans les cellules résultant en des changements dans les phénotypes aberrants du cycle cellulaire. Utilisation de l'approche pulse-chase nous a permis de démontrer que l'appauvrissement de Cetn2 seulement retardé ensemble de centriole 39 plutôt que de provoquer un bloc complet comme suggéré par des études antérieures 23. La détection de cellules positives à la BrdU nécessite une hydrolyse acide des échantillons. Nous et de nombreux autres chercheurs utilisent une technique qui re-fixe les cellules après coloration primaire et secondaire pour les protéines de test, avant d'hydrolyse acide, avec une perte insignifiante des intensités de coloration pour les différent 40 protéines du centrosome. Cependant, une alternative potentielle pourrait être d'utiliser 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (UED), un autre analogue de la thymidine qui est similaire à la BrdU incorporé efficacement dans la réplication de l'ADN 41. Visualisation des edu à l'aide 'click chemistry "ne nécessite pas hydrolyse acide 42, et peuvent donc plus approprié pour certains anticorps.
En outre, ce test peut facilement être utilisé pour mesurer le changement de modifications post-traductionnelles d'une protéine particulière au centrosome. Par exemple, le niveau de phosphorylation centrosomale peut être étalonnée par rapport au volume total de la protéine elle-même, à condition que des anticorps spécifiques à un site de phosphorylation existent. Ce dosage peut être immédiatement appliquée à évaluer les niveaux relatifs de phosphorylation entre conditions expérimentales ou des phases du cycle cellulaire, mais pourrait éventuellement être adapté pour évaluer les niveaux totaux de phosphorylation si les paramètres critiques de l'anticorps affinLITÉS sont connus ou peuvent être déterminées. Ce dosage devrait également être applicable pour l'étude de protéines à ne importe quel autre site dans les cellules, bien que la région d'intérêt ne doit pas être trop grande. Le dosage sera particulièrement utile pour mesurer la modulation spécifique au lieu d'une protéine qui est localisé sur plusieurs sites cellulaires.
Il existe un petit nombre de paramètres techniques tels que le photoblanchiment différentiel, l'effet de l'imagerie numérique, la linéarité des intensités de fluorescence des fluorophores, etc. bruit de fond qui doit être pris en considération afin d'optimiser la précision de la mesure 43. Par exemple, on peut basculer le fluorochrome associé à chaque anticorps secondaire pour évaluer la contribution de photoblanchiment. Beaucoup d'autres paramètres peuvent être bien contrôlés si l'on utilise des conditions identiques d'imagerie (temps d'exposition, le gain, la taille de l'étape, le nombre de Z-piles, etc.) et le même logiciel d'imagerie dans chaque série d'imagerie. Bien que nous utilisionsl'algorithme Pas de voisin au long de notre test pour effectuer la déconvolution d'images, ce test peut être combiné avec d'autres algorithme de déconvolution comme contraint itératif. Nous notons également qu'il devrait être facile d'adapter ce test pour un certain nombre de différents logiciels d'imagerie, comme le plus souvent disponibles logiciel d'analyse d'image dispose d'outils pour l'analyse de l'intensité de la fluorescence et les distances.
Ce test devrait être applicable à tout type de cellule, et notre choix de cellules ici est purement basée sur leur pertinence dans la recherche en biologie centrosome, et leur utilisation dans nos précédents examens de la fonction VDAC3 centrosomale 16,28. Toutefois, la validité des normes internes et des moments appropriés pour pulse-chase pour identifier les cellules dans la phase S, G2, ou mitose doit être déterminé pour chaque type de cellule. Dans l'ensemble, notre technique de fluorescence quantitative nouvellement développé en combinaison avec le test pulse-chase BrdU sera une méthode très utile pour résoudre plusieurs complexesmécanismes en biologie centrosome et dans de nombreux aspects plus larges de la biologie cellulaire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
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