Abstract
Zentrosomen sind kleine, aber wichtige Organellen, wie die Pole der mitotischen Spindel, um genomische Integrität aufrecht zu erhalten oder zu montieren primären Zilien der Sinnesfunktionen in Zellen zu erleichtern dienen. Der Pegel eines Proteins kann unterschiedlich an Zentrosomen als an anderen Orten .cellular reguliert werden, und die Variation in der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine an unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint für die richtige Regulierung der centriole Anordnung sein. Wir entwickelten eine quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay, der relativen Änderungen der Pegel eines Proteins an Zentrosomen in fixierten Zellen aus verschiedenen Proben, wie in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder nach der Behandlung mit verschiedenen Reagenzien misst. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich, und zu normalisieren, dass die Messung an der gleichen für ein anderes Protein, das nicht unter den gewählten Versuchs c nicht ändertondition. Unter Verwendung dieses Assays in Kombination mit BrdU Impuls und chase Strategie zur ungestörten Zellzyklen zu untersuchen, haben wir quantitativ durch Proteasom-vermittelten Abbau speziell an Zentrosomen validiert unserer jüngsten Beobachtung, daß die zentrosomalen Pool von VDAC3 an Zentrosomen während des Zellzyklus reguliert wird, wahrscheinlich.
Introduction
Zentrosomen bestehen aus einem Paar von Centriolen pericentriolar Material (PCM) umgeben ist. Als die großen Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) in Säugerzellen dienen Zentrosomen als die beiden Pole der mitotischen Spindel in sich teilenden Zellen, und damit zur Erhaltung der genomischen Integrität ein. In ruhenden Zellen (zB während G0-Phase), einer der beiden Centriolen der Zentrosomen, nämlich die Mutter centriole, wird in eine Basaltemperatur transformiert, um die primären Zilien, einen sensorischen Organelle aus der Zelloberfläche herausragen 2 zusammenzubauen. Sobald die Zellen erneut in den Zellzyklus werden die primären Zilien zerlegt und jedes centriole lenkt den Zusammenbau eines procentriole an seinem proximalen Ende, die sich allmählich verlängert, um eine reife centriole 3 bilden. Zu Beginn der S-Phase wird ein Wagenrad artigen Struktur, die das 9-fache Symmetrie um Centriols stellt auf der Oberfläche eines jeden vorhandenen centriole gebildet und wird die Basis jedes procentriole geworden. SAS6 tHut ist unverzichtbar für centriole Baugruppe wird eingestellt, um die Nabe der Wagenrad 4-6 zu bilden. Andere centriolar Proteine werden dann auf das Wagenrad in einem stark reguliert, von proximal nach distal Weise 7 montiert. Nach genau Abschluss centriole Vervielfältigung, Zellen zusammen zusätzliche pericentriolar Materialien zu zwei Funktions Zentrosomen bis Ende G2-Phase 8 bauen. Neben den Kern centriolar Komponenten 9-11, mehrere andere Proteine einschließlich Kinasen, Phosphatasen, Chaperone, Gerüstteile, membranassoziierte Proteine und Abbaumaschinen mit Centriolen, Basalkörpern und PCM zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus 12-16 verbunden. Es wird oft festgestellt, dass die zentrosomale Ebenen vieler Proteine sind zeitlich um zentrosomale Targeting-Mechanismen und / oder auf den proteasomalen Abbau Zentrosomen geregelt. Wichtig ist, dass die Schwankungen der zentrosomalen Pegel mehrerer Proteine wie Plk4, Mps1, SAS6 und CP110 eint unterschiedlichen Punkten des Zellzyklus scheint entscheidend centriole Anordnung 5,17-22 regulieren zu können, und im Falle von Mps1 Verhinderung dieser zentrosomalen Abbau führt zur Bildung von überschüssigem Centriolen 19. Andererseits sind die zentrosomalen Fraktionen von mehreren Proteinen weniger labil gegenüber cytosolischen Pools. Zum Beispiel Herunterregulierung der Centrin 2 (Cetn2) siRNA-vermittelte führte nur zu einem moderaten Rückgang der Protein-Ebene an den Zentriolen trotz großer Verminderung seiner ganzen Zelle Ebenen 23. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Änderungen in der Ebene der zentrosomalen Proteine am Centrosom anstelle der Messung der Gesamtzellproteinspiegel bei der Bewertung ihrer Zentrosomen spezifische Funktionen zu messen.
In dieser Studie haben wir einen Test unter Verwendung der indirekten Immunfluoreszenz (IIF), das relative Niveau eines Proteins an Zentrosomen zu quantifizieren. Dieser Test ist besonders entwickelt, um Zellen, die aus verschiedenen Proben zu analysierenund können daher nicht gleichzeitig abgebildet werden. Diese Proben können die Zellen, die mit verschiedenen Reagenzien (dh Medikament gegen Kontrolle), die zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, behandelt wurden (dh Pulsgegen chase) oder in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Messung der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensität, die ein Protein in einem kleinen Bereich und um diesen Wert gegen den gleichen für ein anderes Protein, deren Pegel nicht unter den gewählten experimentellen Bedingungen variieren normalisieren. Mehrere Studien in Biologie Zentrosom vor kurzem benutzt verschiedene quantitative Mikroskopie-Techniken, in beiden Live-oder fixierten Zellen, um das Zentrosom-spezifische Funktion der Kandidatenproteine 24-27 bestimmen. Ähnlich den Tests misst die vorliegende Technik auch den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität des Testproteins. Jedoch würde die Einbeziehung der Normalisierung mit internem Standard in diesem Test wahrscheinlich größer anbietenGenauigkeit und Sicherheit bei der Analyse von zwei verschiedenen Proben, die auf zwei verschiedenen Deckgläser sind. Ferner, zusätzlich zu der Prüfung des Protein-Ebene zu Zentrosomen, mit geringfügigen Anpassungen dieses Verfahren kann auf einen unterschiedlichen Satz von Testbedingungen oder in anderen zellulären Stellen aufgebracht werden.
Dabei kombinieren wir unsere quantitativen Mikroskopie Assay mit einem BrdU Pulse-Chase-Strategie, um Zellen aus verschiedenen Zellzyklusphasen zu vergleichen. Anstelle der Verwendung von Standard-Zellzyklusarrest und Trenntechniken, um verschiedene Zellzykluszeitpunkten zu untersuchen, asynchron wachsenden Zellen werden mit BrdU inkubiert, um Zellen in die S-Phase zu kennzeichnen, und die markierten Zellen werden für unterschiedliche Zeiten (typischerweise 4-6 Stunden) verfolgt. Die meisten der markierten Zellen in S-Phase unmittelbar nach dem Impuls sein. Die Länge der Lauflicht wird so gewählt, daß nach dem Chase werden markierte Zellen in späten S, G2 oder Mitose voranzuschreiten, was durch morphologische Merkmale wie-Position Zentrosomen bezüglich nuc prüft werden könnenleu, Abstand zwischen Zentrosomen, Kondensation Chromosomen usw. Somit kann die Länge des den Punkt von der mittleren Dauer der S, G2 und M Phase einen bestimmten Zelltyp. Da dieser Ansatz vermeidet Zellzyklus-Inhibitoren, wie Hydroxyharnstoff, Aphidicolin, Nocodazol usw., erlaubt es eine physiologisch relevante Zellzyklusanalyse.
Somit zeigen wir hier, dass die quantitative Fluoreszenzmikroskopie Assay allein oder in Kombination mit BrdU Pulse-Chase-Assay ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, um die relativen Änderungen der zentrosomalen Pegel eines Kandidatenprotein während einer ungestörten Zellzyklus genau zu messen. Wir maßen die zentrosomale Niveau VDAC3, ein Protein, das wir an Zentrosomen zusätzlich kürzlich identifizierten Mitochondrien 16,28, mit diesen Tests. Ergebnisse hier erzielt überprüfen unseren früheren Beobachtungen, dass der Pool von zentrosomale VDAC3 durch Abbau reguliert und variiert ebenfalls in einer Zellzyklus dependent Weise 16, ferner die Validierung der Anwendbarkeit dieses Verfahrens.
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Protocol
1. Zellkultur
- Verwenden menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) verewigt retinalen Pigmentepithelzellen (hTERT-RPE1, die hier als RPE1).
HINWEIS: RPE1 Zellen sind nahezu diploiden, nicht-transformierten menschlichen Zellen, die üblicherweise verwendet werden, um die Montage und centriole ciliogenesis studieren. Diese Zellen einer Normal centriole Vervielfältigung Zyklus mit einem geregelten Zellzyklus abgestimmt. - Passage eine nahezu konfluente 100 mm Zellkulturschale RPE1 Zellen in einer 1: 5 Verdünnung der ursprünglichen Kultur in ein frisches 100-mm-Schale, die 10 ml DME / F-12 (1: 1) -Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (das komplette Medium als DME / F-12-Medium bezeichnet). Wachsen Zellen bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2.
- Inkubieren Sie 12 mm Runddeckgläschen in 50 ml 1 N HCl in einem abgedeckten Becherglas, O / N ohne Schütteln bei 60 ° C im Wasserbad oder Inkubator.
- After Verwerfen der Säurelösung, waschen Sie die Deckgläser dreimal in 100 ml destilliertem Wasser durch Inkubation für 15 Minuten unter gelegentlichem Schütteln. Wiederholen des Wasch ähnlich in 70% Ethanol und 95% Ethanol.
- Man trocknet die Deckgläser durch individuelles breitet sie auf einer Laborlöschpapier in einer biologischen Sicherheitswerk, gefolgt von einer Sterilisierung mit UV-Strahlung für 60 min.
- Zeigen 2-4 trockenen Deckgläser in einer 35 mm-Zellkulturschale. Verdünne die Lösung von Fibronektin oder Fibronektin wie entworfen Polymer (Stammkonzentration von 1 mg / ml) auf eine Konzentration von 25 ug / ml in der Zellkultur PBS.
- Zeigen 80-100 ul der verdünnten Lösung auf jedes Deckglas und Inkubation für 60 min zur Beschichtung der Oberseite des Deckglases. Dreimal mit PBS vor der Zugabe Vollmedium Waschen Sie die Deckgläser.
2. Wachsende Zellen und Behandlung von Zellen mit Proteasom-Inhibitoren
- Durchgang 2 x 10 5 asynchron wachsening RPE1 Zellen in jeder 35 mm Schale mit Deckgläsern und wachsen die Zellen in 2 ml Vollmedium. Tauschen Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden mit frischem vorgewärmten Vollmedium.
- Um die Wirkung der Proteasom-Hemmung auf die zentrosomale Ebene des Testproteins zu analysieren (hier VDAC3 oder γ-Tubulin), wachsen die Zellen in zwei 35-mm-Schalen für 44 Std. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit Vollmedium und fügen entweder MG115 oder DMSO als Kontrolle Lösungsmittel bei einer Endkonzentration von 5 uM oder 0,05% zu. Zur gleichen Zeit wird in BrdU zu den Zellen bei einer Endkonzentration von 40 uM und inkubieren Zellen 4 Stunden.
- Übertragen Sie jede Deckglas in einer 24-Well-Platte. Fügen Sie 500 ul gekühltem Methanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 20 ° C für 10 Minuten, um die Zellen auf den Deckgläsern zu beheben. Dreimal mit 500 ul Waschpuffer Sofort die Deckgläser (1x PBS, enthaltend 0,5 mM MgCl 2 und 0,05% Triton-X 100).
- Ernten Sie die RestZellen von der 35 mm-Schale und Zentrifugation der Zellen bei 1000 × g für 5 min. Verwenden Sie das Zellpellet, das Gesamtprotein durch Western Blot (Schritt 6) analysieren.
3. BrdU Puls und Chase Assay auf Proteinebene in verschiedenen Zellzyklusphasen Analysieren
- Um die Variation des Niveaus eines Proteins (hier VDAC3, SAS6 oder Cep135) an Zentrosomen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu analysieren, wachsen Zellen, die in zwei 35-mm-Schalen mit Deckgläschen für 44 Std. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit komplettem Medium, das 40 & mgr; M BrdU und inkubieren Sie die Zellen 4 h im Zellkulturbrutschrank.
- Von einem Gericht, übertragen Sie die Deckgläser auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die Zellen mit gekühltem Methanol fixieren, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben.
- Nach 4 h BrdU puls, entfernen Sie den BrdU-enthaltenden Medium, Waschen der Zellen einmal mit PBS und einmal mit komplettem Medium, fügen frisches Medium und dann wachsen die Zellen in Abwesenheit von BrdU für verschiedene Zeiten (in der Regel weitere 4 hfür RPE1 Zellen) vor Fixierung der Zellen wie in Schritt 2.1.2 beschrieben.
HINWEIS: Für RPE1 Zellen die Mehrzahl der BrdU-positiven Zellen im späten S oder G2-Phase nach einer 4 Stunden Chase. Dies muss unabhängig für jeden Zelltyp bestimmen.
4. Immunfärbung
- Inkubieren der fixierten Zellen auf Deckgläsern in 200 ul Blockierungspuffer (2% BSA und 0,1% Triton X-100 in 1 × PBS) für 30 min.
- Inkubieren der Zellen mit einer Mischung aus primären Antikörper (üblicherweise einen in Kaninchen aufgezogen und in der Maus eine andere angehoben) in Blockierungspuffer O / N bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer verdünnt.
- Um einen feuchten Kammer zu machen, setzen Sie einen nassen Papiertuch in der unteren Hälfte eines leeren 1.000 ul Pipettenspitze ein. Verlegen eines Streifens aus Parafilm auf dem Gestell Oberfläche und vor Ort eine Tröpfchen (15-20 ul) der Antikörperlösung auf die Parafilm für jedes Deckglas inkubiert werden. Kehren Sie ein Deckglas auf einem Tropfen Antikörperlösung (so dass die Zellen eingetaucht) und in der Näheder Deckel des Spitzenfeld.
- Invert Deck wieder und bringt sie zurück in die Schale mit 24 Vertiefungen. Waschen Deckgläser und dann inkubieren in 150 & mgr; l sekundärem Antikörper Gemisch (hier grün fluoreszierenden Farbstoff konjugierten anti-Kaninchen und roten Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Anti-Maus in Blockierungspuffer verdünnt) für 1 h bei RT. Dreimal Waschen Sie die Deckgläser.
HINWEIS: Die fluorophorkonjugierten Sekundäre Antikörper sind lichtempfindlich. Schützen Sie die Proben vor Licht während der Schritte 4.1.3-5.1.2.
- Planen für Anti-BrdU-Färbung durch Fixierung der gefärbten RPE1 Zellen wiederum mit 500 ul gekühltem Methanol bei -20 ° C für 10 min, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. Dreimal Waschen Sie die Deckgläser.
ANMERKUNG: Diese Fixierung sichert die primäre und sekundäre Antikörpermarkierung des Proteins (e) von Interesse während der Säurehydrolyse Prozess im folgenden Schritt.- Inkubieren der Zellen in 200 ul 2 N HCl für 30 min bei RT. Neutralisieren mit 300 ul 1 M Tris-Cl, pH 8 eind waschen Sie die Zellen dreimal mit Waschpuffer.
- Blockieren die Zellen wiederum mit 200 ul Blockierungspuffer für 30 Minuten bei RT.
- Inkubieren der Zellen mit Ratten-anti-BrdU-Antikörper für 45 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer (in Blockierungspuffer verdünnt). Bringen Sie die Deckgläser zurück in die Schale mit 24 Vertiefungen, waschen Sie sie dann mit blau-fluoreszierenden Farbstoff konjugierten Anti-Ratten-Sekundärantikörper (in 150 ul Blockierungspuffer in Schale mit 24 Vertiefungen für 1 h bei RT verdünnt inkubiert.
- Dreimal Waschen Sie die Deckgläser. Spot eine Tröpfchen (ungefähr 3-6 & mgr; l) einer Lösung, die Montage verblassungshemmenden Reagenz auf einem Glasobjektträger. Kehren Sie ein Deckglas mit der Zellseite nach unten, auf die Montagelösung. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Eindrücken der Deckglas gegen den Schieber mit einem weichen Reinigungstuch. Bewerben transparentem Nagellack am Rand des Deckglases, um es auf dem Objektträger zu versiegeln.
5. Immunfluoreszenzbild ACQUisition und Analyse
- Verwenden Sie einen Plan Apo 100X Ölimmersionsobjektiv (mit einem 1,4 numerische Apertur), um die Bilder von BrdU-positiven Zellen RPE1 bei Raumtemperatur erhalten.
- Setzen Sie einen Dia am Mikroskop (siehe Anlagen) mit einer Kamera in der Lage, digitale Bildbearbeitung angebracht. Für jeden Fluorophor, die geeignete Belichtungszeit (in der Regel zwischen 300-1000 ms) durch die manuelle Prüfung aller Proben eines Experiments. Vor dem Erfassen von Bildern einer Zelle, manuell die geeignete obere und untere Brennebene entlang der Z-Achse (in der Regel 0,2 um Schrittgröße). Erwerben Bilder unterschiedlicher Proben, die auf separaten Deck mit gleicher Belichtungszeit für verschiedene Fluorophore entlang der Z-Achse unter Verwendung eines digitalen Mikroskopie Softwarepaket sind.
- Führen Entfaltung (in diesen Fällen mit Nicht-Nachbar-Algorithmus) aller entlang der Z-Achse aufgenommenen Bildstapeln.
- Ermitteln Sie die Gesamtintensität Projektion jedes Bildstapel entlangdie Z-Achse.
- In Zellen, in denen Zentrosomen nahe (Abstand zwischen zwei Zentrosomen weniger als 2 um), zeichnen Sie einen kleinen Platz (in der Regel 20 bis 30 Pixel pro Seite) um die beiden Zentrosomen und markieren Sie den ausgewählten Bereich.
- Zeichnen Sie einen größeren Platz (in der Regel 24 bis 35 Pixel pro Seite) um den ersten Platz und markieren Sie den ausgewählten Bereich des großen Platz.
- Erhalten die Fläche (A) und der Gesamtfluoreszenzintensität (F) jedes Fluorophor in jedem Feld (S bezeichnet kleine Box und L großen Kasten).
- Analysieren Sie den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität jeder Fluorophor mit dem von Howell et al 29 beschriebenen Formel:. F = F S - [(F L - F S) x Ein S / (A L - A S)].
- Erhalten des normierten Fluoreszenzintensität des Proteins von Interesse (hier VDAC3 oder SAS6) durch Berechnen des Verhältnisses des hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensität der fluorophore derjenigen des Fluorophors für den gewählten internen Standards (hier γ-Tubulin SAS6 oder Cep135) verwendet.
- Im Fall der Analyse von Zellen, in denen Zentrosomen gut voneinander getrennt (Abstand zwischen zwei Zentrosomen größer als 2 & mgr; m), Analyse jedes Zentrosomen separat indem zwei getrennte Sätze von Kästen. Zeichnen Sie einen kleinen Platz (in der Regel 15 bis 25 Pixel pro Seite) um jede Zentrosom und markieren Sie den ausgewählten Bereich. Zeichnen Sie einen größeren Platz (20-30 Pixel pro Seite) um den ersten Platz und markieren Sie den ausgewählten Bereich.
- Erhalten die Fläche (A) und der Gesamtfluoreszenzintensität (F) jedes Fluorophor in jedem Feld, und berechnen die hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Fluorophor getrennt für jede Zentrosomen, wie in Schritt 5.3.3 beschrieben.
- Kombinieren Sie die hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensitäten jedes Proteins aus den beiden Zentrosomen, die Gesamt zentrosomale Niveau dieses Proteins in der Zelle zu erhalten.
- Bezugsquellen für dasnormalisierte Intensität für das Protein von Interesse durch Berechnen des Verhältnisses der Gesamt zentrosomalen Intensität zu der Gesamt zentrosomalen Intensität des internen Standards.
- Analysieren Sie mindestens 15 bis 25 Zellen für jede Versuchsbedingung und den Graphen in einer Tabellenkalkulation.
6. Analyse des Gesamtproteins durch Western Blot
- Die Zellen in Radioimmunopräzipitation Assays (RIPA) Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und Inkubation für 10 min auf Eis um die Zellen zu lysieren.
- Zentrifugieren der Mischung bei 10.000 × g für 10 min trennen das Lysat aus der Pelletfraktion und messen die Gesamtproteinkonzentration von jedem Lysat mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Assay-Kit.
- Mischungs 40 ug Lysat mit 4x SDS-PAGE-Beladungspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 100 mM Dithiothreitol, 0,1% BromPhenol blau).
- Kochen Sie die Proben für 10 Minuten und führen Sie die Proben auf einem 12,5% igen denaturierenden SDS-PAGE mit einer konstanten Spannung von 200 V.
- Transfer der Proteine auf SDS-PAGE getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung von Western-Blot-Technik (bei einer konstanten Spannung von 90 V für 1 Stunde in kaltem).
- Blockieren der Membran mit 3% fettfreier Milch in 1x PBS, und dann Inkubieren der Membran mit Lösungen von verdünnten primären Antikörper (in diesem Fall Kaninchenanti VDAC3, Kaninchen-Anti-γ-Tubulin und Maus-anti-α-Tubulin) 1 h bei RT.
- Nach dem Waschen der Membran dreimal (jeweils 5 min Inkubation unter Schütteln) unter Verwendung von PBS-T-Puffer (1 × PBS und 0,2% Tween-20), Inkubation der Membran in eine Mischung von im nahen Infrarotbereich (IR) Fluoreszenzfarbstoff konjugierten anti-Kaninchen und IR Fluoreszenzfarbstoff konjugierten anti-Maus-Sekundärantikörper für 1 Stunde (in PBS-T verdünnt).
- Dreimal Waschen Sie die Membran und scannen Sie dann die Membran, um die Bänder zu analysieren mit einem Infrarot-fluorescence Bildsystem für Immunoblot-Detektion.
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Representative Results
Unsere jüngsten Studien identifiziert neuartige zentrosomale Lokalisation und Funktion von VDAC3, einer der mitochondrialen Porine 16,28. Die Immunfärbung von mehreren Säugerzellen, einschließlich RPE1 Zellen unter Verwendung eines VDAC3-spezifischen Antikörper zeigte prominente zentrosomale Färbung und vergleichsweise schwachen mitochondrialen Färbung. Wir haben auch gezeigt, dass zentrosomale VDAC3 wird vorzugsweise mit der Mutter centriole und der zentrosomale Pool sowohl der endogenen und ektopische Expression VDAC3 durch Abbau 16 geregelt. Um die quantitative IIF-Assay zu validieren suchten wir die Änderungen in der Zentrosomen assoziierten VDAC3 Pools in den Zellen, in die S-Phase sind.
Hier wurden asynchron wachsenden RPE1 Zellen entweder mit dem Proteasom-Inhibitor MG115 oder der Steuer Lösungsmittel DMSO 4 h behandelt. Um unsere Analyse auf Zellen, die in der S-Phase und unterziehen Zentrosom Montage geltenden Bestimmungen, die wir nur untersuchten Zellen, die BrdU du eingeRing die gleiche 4 h und hatte zwei eng beieinander liegenden Zentrosomen (innerhalb von 2 & mgr; m voneinander beabstandet). Wir untersuchten mehrere Zufallsfeldern von Zellen für BrdU gefärbt und Kerne von beiden Steuer und MG115 Behandlung (1A) zu dem Schluss, dass die kurze Behandlung von MG115 hatte keinen Einfluss auf den BrdU-Einbau (ca. 58%) im Vergleich zur Behandlung kontrollieren (etwa 56%) in RPE1 Zellen. Da wir nur die Zellen, die in der S-Phase sind (wie durch das Vorhandensein von zwei γ-Tubulin Foci innerhalb von 2 & mgr; m voneinander beabstandet beurteilt) Vergleichen betrachteten wir γ-Tubulin als potentieller interner Standard für die Normalisierung. So haben wir zunächst untersucht, ob zentrosomale γ-Tubulin-Ebenen in BrdU-positiven Zellen unterschiedlich auf Proteasominhibition. Es überrascht nicht, da es erhebliche Zell-zu-Zell-Variante in γ-Tubulin-Fluoreszenzintensität von einer Zelle zur anderen, und wir fanden, dass diese Variation am besten in der Box und Whisker-Diagramme, die die Daten als Ganzes verfügbar gesetzt präsentieren dargestellt. Ichn Box und Whisker-Diagramme, Kästen stellen die untere und obere Quartil der Marker in das Feld zeigt den Median jeder Serie, und die Barthaare stellen Minimal- und Maximalwerte, die oft (aber nicht immer) Ausreißer. Wie in Figur 1D zu sehen ist, war die zentrosomalen γ-Tubulin Pegel nicht signifikant verschieden zwischen BrdU-positive Zellen entweder mit MG115 oder DMSO behandelt wird, zu validieren γ-Tubulin als interner Standard für dieses Experiment. Im Gegensatz zu den γ-Tubulin wurde das grundkorrigierten Fluoreszenzintensität entspricht zentrosomalen VDAC3 etwa 2,5-fach höher in MG115-behandelten Zellen als in den Kontrollzellen (Abbildung 1C). Wenn wir normalisierte Gesamt VDAC3 Fluoreszenz gegen die der γ-Tubulin sank die fachen Anstieg leicht auf etwa zweifachen (1E). Obwohl die fache Veränderung war größer, ohne Normalisierung, mehr Vertrauen in die Richtigkeit der normalisierten Daten, die wir fühlen, wir haben better steuert für jede allgemeine Wirkung MG115 Behandlung sowie Variation aufgrund der Probenverarbeitung. VDAC3 Färbung bei Nicht zentrosomalen Stellen (1B) oder des gesamten zellulären Niveau VDAC3 (1F) wurde durch Proteasom-Inhibierung betroffen. So haben wir quantitativ überprüfen unseren früheren Beobachtung, dass der Pool von zentrosomale VDAC3 durch Proteasom-vermittelten Abbau reguliert.
Um die Änderung in zentrosomalen VDAC3 während des Zellzyklus zu messen haben wir die Zellen mit BrdU 4 h Impuls, gefolgt von einem 4 Stunden Chase der markierten Zellen markiert. Da nur der S-Phase Zellen BrdU während des Pulses zu integrieren (durchschnittliche Abstand zwischen zwei Zentrosomen beträgt 1,35 ± 0,16 & mgr; m), die Mehrzahl der BrdU-positiven Zellen RPE1 nach 4 h Chase entweder späten S-Phase oder im frühen G2 Phase ( durchschnittliche Abstand zwischen zwei Zentrosomen beträgt 1,55 ± 0,22 & mgr; m), mit einer kleinen Population an späten G2-Phase, wo das Centroeinige Paar hat sich (zwischen zwei Zentrosomen> 2 & mgr; m mittlere Entfernung) 30 getrennt. γ-Tubulin, ein Hauptbestandteil während PCM Zentrosom Reifung, die in der G2-Phase 31,32 stattfindet, und dieser Anstieg ist es ein schlechter interner Standard für die Beurteilung der Zellzyklusschwankungen anderer zentrosomale Proteine stark reichert sich an Zentrosomen. Andererseits wird SAS6 zu procentrioles während der frühen S-Phase eingestellt, um die Montage der Wagenräder 4,5,7 stimulieren, und bleibt auf der Basis der neu gebildeten Centriolen bis Zellen geben Mitose, wenn sie auf (Abbildung 2 abgebaut werden beginnt und Referenz-5). In HeLa oder U2OS-Zellen, die centriolar Niveau SAS6 allmählich zu, wenn Zellen Fortschritte von S-Phase G2-Phase 5. Dazu wurden zunächst die gemessenen zentrosomalen SAS6 Ebene mit Bezug auf die des Cep135, anderen Kern centriolar Protein, das an den proximalen Enden der Centriolen gesamten lokalisiertder Zellzyklus 33. Wir fanden keine signifikanten Unterschiede in den Hintergrund-korrigierte Gesamtfluoreszenzintensitäten Cep135 oder SAS6 in BrdU-positiven Zellen aus RPE1 Puls oder jagen, zu beobachten, wenn Zentrosomen eng beieinander (3A-D; 'close' Zellen, in denen durchschnittliche Abstand zwischen zwei Zentrosomen weniger als 2 & mgr; m). Dementsprechend wird der normalisierte SAS6 Niveau geblieben wie in diesen Zellen (3E). Allerdings beobachteten wir einen leichten Anstieg in der Gesamtfluoreszenzintensität Werte SAS6 und einen leichten Anstieg des gleichen für Cep135 in Zellen, in denen Zentrosomen gut getrennt (Abstand zwischen zwei Zentrosomen> 2 & mgr; m; 'fernen' Zellen). Dementsprechend ist die normierte Gesamt zentrosomalen SAS6 Ebene in Zellen mit gut getrennten Zentrosomen leicht, aber statistisch signifikant höher als die in Zellen, die mit eng beabstandeten Zentrosomen. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der inhärenten Regulierung SAS6 Ebene Witzh Zellzyklus 5. Es ist jedoch auch möglich, dass die leichte Zunahmen (welche oder niedrigerer statistische Signifikanz) infolge Zugabe Fluoreszenzintensitäten der zwei Zentrosomen, die getrennt analysiert wurden, im Vergleich zu der Analyse zwei Zentrosomen gleichzeitig in Zellen, die mit eng beabstandeten Zentrosomen sind. Dennoch, wenn die Fluoreszenzintensität der VDAC3 wurde mit der von alleine SAS6 normalisiert die VDAC3 Ebene an zwei dicht beabstandeten Zentrosomen war etwa 1,5-fach in Zellen, die im späten S- / frühen G2-Phase erhöht wird, im Vergleich zu der frühen S-Phase Zellen (4A-C, F, 'close' Zellen). Wenn diese Zellen fortschreiten zu späten G2-Phase, wurde die normierte VDAC3 Ebene an zwei Zentrosomen 2,4-fache im Vergleich zu der in späten S-Phase (4C, F) verringert.
Da die SAS6 Spiegel erhöhen sich geringfügig von späten S-Phase zu G2, mit SAS6 als interner Standard führt zu einer leichten Überschätzung der Dezemberrease in VDAC3 Werte im letzten G2-Phasen-Zellen (Zentrosomen durch mehr als 2 & mgr; m voneinander getrennt). Während unsere Daten deuten darauf hin, dass Cep135 ist eine bessere Wahl als interner Standard für die Beurteilung der Zellzyklusschwankungen, können wir es nicht für VDAC3 weil die VDAC3 und Cep135 Antikörper zur Verfügung zu uns sind beide von Kaninchen. Allerdings Multiplikation der Medianwert für SAS6 normalisierte VDAC3 (F VDAC3 / F SAS6) durch den Medianwert Cep135-normalisiert SAS6 gibt uns einen Näherungswert für Cep135 normalisierte VDAC3 [(F VDAC3 / F SAS6) x (F SAS6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Wenn wir diese Analyse, die Änderung in VDAC3 Niveaus zwischen späten S / G2 frühen und späten G2 durchgeführt fällt leicht auf das 2-fache. BrdU-positive Zellen, die in jedem Stadium der Mitose wie durch kondensierte Chromosomen und schwach SAS6 Färbung beurteilt werden aus der Analyse ausgeschlossen, wegen der dramatischen Rückgang SAS6 Ebenen. Allerdings haben wir festgestellt, dass die zentrosomale VDAC3 Ebene Wiederblieb niedrig während der Mitose (Daten nicht gezeigt). Da Cep135 Spiegel nicht während der Mitose Drop (Daten nicht gezeigt), die wir im Prinzip wiederholen Sie den Wiedernormalisierungsverfahren, um die Cep135 normalisierte VDAC3 Ebenen in der Mitose zu schätzen. In Wirklichkeit jedoch zentrosomalen SAS6 Ebenen in Mitose waren zu variabel, um eine genaue Bestimmung der SAS6 normierten VDAC3 Niveau der ersten Stelle zu ermöglichen. Unabhängig insgesamt verifiziert unsere Daten, dass der Pool von zentrosomalen VDAC3 an Zentrosomen während des Zellzyklus reguliert wird.
Abbildung 1. asynchron wachsenden RPE1 Zellen mit BrdU und MG115 (MG) oder DMSO (DM) für 4 h inkubiert. (A) gezeigt sind Zufallsfeldern DMSO oder MG115 behandelten Zellen mit anti-BrdU-Antikörper (rot) und Hoechst (Bunt DNA, blau). Hier und in allen anderen Bilder der Balken repräsentieren 5 um.(BE) DMSO oder MG115 behandelten Zellen wurden mit Antikörpern gegen VDAC3, γ-Tubulin und BrdU gefärbt. BrdU-positiven Zellen wurden unter identischen Abbildungsverhältnisse abgebildet (Belichtungszeits 400 ms für blauen Fluorophor / BrdU; 500 ms für grüne Fluorophor / VDAC3; 300 ms für rote Fluorophor / γ-Tubulin) und die hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensitäten VDAC3 und γ-Tubulin wurden bestimmt. Repräsentative Bilder, die VDAC3 (VD3; grün), γ-Tubulin (γ Bad; rot) und BrdU (blau) in (B) gezeigt. Hier und in allen anderen Bilder zeigen Einsätze digital vergrößert Zentrosomen als durch die Quadrate angezeigt. Der korrigierte Hintergrundfluoreszenzintensitäten (F; in willkürlichen Einheiten) entsprechend VDAC3 und γ-Tubulin fünfundzwanzig Zellen werden in der Box und Whisker Diagramm in (C) und (D) jeweils aufgetragen. Hier und in allen anderen Fällen stellen Boxen unteren und oberen Quartil, den marker in das Feld (-) zeigt den Median an jeder Reihe, und die Whisker stellen Minimal- und Maximalwerten. Normierten Fluoreszenzintensitätswerten aus diesen VDAC3 fünfundzwanzig Zellen in (E) dargestellt. Für (CE) wird p-Wert von ungepaarten T-Test abgeleitet. *** Zeigt p <10 -5 und ns zeigt p> 0,05. (F) zeigt Immunoblots Ganzzellebenen VDAC3 (beide VDAC3a und VDAC3b 16) und γ-Tubulin (γ-Wanne), wo α-Tubulin (α-Wanne) geladen wird Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
Abbildung 2. asynchron wachsenden RPE1 Zellen, die mit einem 4 h Br markiert warendU Impuls und für weitere 4 h in Abwesenheit von BrdU erworben wurden mit Antikörpern gegen SAS6 (grün) und γ-Tubulin gefärbt (γ-Wanne; rot). Repräsentative Bilder zeigen SAS6 Färbung während (A) S-Phase (mit zwei nahe SAS6 Herde), (B) Metaphase (zwei schwachen SAS6 Herde an den Polen) und (C) Telophase (SAS6 Brennpunkte von den Polen verloren). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. asynchron wachsenden RPE1 Zellen wurden mit einer 4 h BrdU Impuls für weitere 4 h in Abwesenheit von BrdU markiert und vertrieben. BrdU-positive Zellen für Cep135 und SAS6 gefärbt wurden unter identischen Abbildungsbedingungen abgebildet (Belichtungszeits 400 mseczur blauen Fluorophor / BrdU; 400 ms für grüne Fluorophor / Cep135; 500 ms für rote Fluorophor / SAS6) und der hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensitäten SAS6 und Cep135 bestimmt. Der Abstand zwischen zwei Zentrosomen wurde auch in allen Zellen gemessen. Eine Zelle, in der der Abstand zwischen zwei Zentrosomen weniger als 2 & mgr; m wurde als "Schließen", und wenn der Wert mehr als 2 & mgr; m als "ferne" eingestuft betrachtet. (AB) Repräsentative Bilder, die Cep135 (C135; grün), SAS6 (rot) und BrdU (blau) werden angezeigt. In (B), C1 und C2 sind die beiden Zentrosomen des Vertreters 'fernen' Zelle. (CD) Die hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensitäten (F; in willkürlichen Einheiten) entspricht SAS6 (C) und Cep135 (D) von fünfzehn Zellen jeder Kategorie werden in der Box und Whisker-Diagramm aufgetragen. (E) Normierte Intensitäten SAS6 herm diese Zellen in der Box und Whisker-Diagramm aufgetragen. Für (CE) wird p-Wert von ungepaarten T-Test abgeleitet. * Zeigt 0,001 <p <0,05, und ns zeigt p> 0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Für VDAC3 und SAS6 befleckt Abbildung 4. BrdU-positiven Zellen aus der obigen BrdU Pulse-Chase-Test (Abbildung 3) wurden unter identischen Abbildungsverhältnisse abgebildet (Belichtungszeits 400 ms für blauen Fluorophor / BrdU; 500 ms für grüne Fluorophor / SAS6; 1.000 msec für rote Fluorophor / VDAC3) und die hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensitäten SAS6 und VDAC3 wurden bestimmt. Der Abstand zwischen zwei Zentrosomen wurde in allen Zellen gemessen, und die Zellen wurden als "c kategorisiertverlieren "(der Abstand zwischen zwei Zentrosomen <2 um) und" entfernte "(der Abstand zwischen zwei Zentrosomen> 2 um), wie in Fig. 3 (AC) Repräsentative Bilder der" schließen "Zelle BrdU Impuls (A), in BrdU Chase (B), und "fernen" Zelle in BrdU Chase (C) für VDAC3 gefärbt (VD3; grün), SAS6 (rot) und BrdU (blau) werden angezeigt. In (C), C1 und C2 sind die beiden Zentrosomen. [DE] Die Hintergrundkorrektur Fluoreszenzintensitäten (F; in willkürlichen Einheiten) entspricht VDAC3 (D) und SAS6 (E) aus fünfzehn Zellen jeder Kategorie werden in der Box und Whisker-Diagramm aufgetragen. (F) Normierte Intensitäten VDAC3 aus diesen Zellen werden in Box und Whisker-Diagramm aufgetragen. Für (DF) wird p-Wert von ungepaarten T-Test abgeleitet. *** Zeigt p <10 -5 **zeigt 10 -5 <p <0,001, ns und zeigt an, p> 0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Quantitative Mikroskopie in der Zellbiologie wird häufig mit Live-Cell-Imaging-Assays wie Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Recovery After Photobleaching verbunden (FRAP) usw. Allerdings gibt es wachsende Beispiele für Zellbiologen entwickeln verschiedene quantitative Mikroskopie Assays für feste Zellen in den letzten Jahren 27,34-36. Wichtig ist, dass Fortschritte im Verständnis der Biologie Zentrosom häufig erfordert Verständnis der Zentrosom spezifische Funktion von Proteinen, deren zentrosomale Pools können als andere Pools und Gemeinden unterschiedlich geregelt werden. Somit haben wir eine quantitative IIF-Assay, um die relative zentrosomalen Pegel eines Proteins in zwei unterschiedlich behandelten Proben spezifisch zu analysieren. Da dies erfordert, dass Zellen fixiert und auf separaten Deck verarbeitet daher stellten wir einen inneren Standard für die Zwecke der Normalisierung, um eine bessere Kontrolle für mögliche Artefakte aufgrund der Notwendigkeit der Handhabung der beiden Experimental Zellpopulationen getrennt, und erhöhen die Genauigkeit des Tests. Es gibt nur wenige frühere Studien 37, die eine solche interne Standard verwendet wurden, um die relative Fluoreszenzintensität einer Testprotein zu messen.
Bei der Auswahl eines internen Standards ist entscheidend für die Genauigkeit unserer Test, ist es wohl die größte Herausforderung. Idealerweise sind die centriole Paar Duplikate während der S-Phase und die duplizierten Centriolen dann sammeln sich zusätzliche PCM Komponenten, einschließlich γ-Tubulin während G2 so dass die beiden Zentrosomen reifen können die Pole der mitotischen Spindel zu werden. Daher gehen wir davon aus, dass die zentrosomale Niveau γ-Tubulin nicht erheblich in Zellen, die streng in S-Phase zu ändern. Dies scheint in RPE1 Zellen, in denen S-Phase-Zellen, werden durch kurzes BrdU markiert der Fall sein. Jedoch muss die Gültigkeit eines internen Standards für jeden Zelltyp und Versuchsbedingung getestet werden. Zum Beispiel, während der Hintergrund-corrected VDAC3 Fluoreszenz um mehr als das Zweifache in Reaktion auf die Hemmung in mit Aphidicolin behandelten Proteasom (S-Phase fest) U2OS-Zellen, gibt es auch eine kleine, aber statistisch signifikante (0,001 <p-Wert <0,05) Zunahme zentrosomalen γ-Tubulin (Ergänzungs Abbildung). Somit ist γ-Tubulin nicht immer eine geeignete interne Kontrolle, auch für Zellen, die in Zellzyklus arretiert sind.
Ähnlich wie alle anderen IIF Mikroskopie Assay einer der Nachteile dieses Assays ist, dass Antikörper gegen das Testprotein und dem internen Standard müssen in unterschiedlichen Wirtsspezies erhöht. Während unsere Daten zeigen, daß Cep135 eine bessere interne Standard als SAS6 könnten wir VDAC3 Ebenen gegen Cep135 nicht normalisieren verfügbaren Antikörper gegen diese Proteine wurden sowohl in Kaninchen erhöht. Somit wir stattdessen normiert gegen SAS6, die eine Überschätzung der Abnahme VDAC3 Niveaus zwischen späten S-Phase und G2 verursacht. In einer Situation, wo die internal Standard variiert geringfügig, kann man einen anderen Normierungsfaktor einzuführen, um für diese Variation zu berücksichtigen. Zum Beispiel, um die Veränderung in SAS6 korrigieren, multipliziert man den SAS6 normierten VDAC3 Intensität durch die Cep135 normierte SAS6 Intensität.
In Fällen, in denen die Auswahl eines geeigneten internen Standards ist schwierig, kann Fluoreszenzfarbstoff beschichteten Mikrosphären (0,02 bis 0,04 Mikrometer Durchmesser) bieten eine alternative Strategie. Das Signal der Fluoreszenzmikrokügelchen in dem gleichen Feld wie die Zelle von Interesse vorhanden ist, kann verwendet werden, um das Fluoreszenzsignal entsprechend dem Protein von Interesse zu normieren. Andererseits, wenn die Test- und Kontrollzellen werden zusammen abgebildet werden, es nicht notwendig kann eine solche innere Standard zur Normalisierung. Wir haben vorher eine Version dieses Assays die zentrosomalen Niveau Mps1 in überexprimierenden Zellen entweder Cyclin A 19 oder Antizym 20, die verhindern entweder 19 oder 20 fördern die degr vergleicheadation von Mps1 an Zentrosomen, jeweils an, daß die in benachbarten nicht-transfizierten Zellen zur gleichen Zeit abgebildet.
Um die Wirkung der zentrosomalen VDAC3 auf Proteasominhibition untersuchen, verwendeten wir BrdU-Markierung zu identifizieren und zu vergleichen, die Zellen in die S-Phase sind. Während MG115 Behandlung Zellzyklusprogression hemmen, diese Inhibierung benötigt eine wesentlich höhere Konzentration 38 als die in dieser Studie verwendet. Bei den hier verwendeten MG115 kann Zellzyklus-Kontrollpunkte und Übergänge zu blockieren, aber keine Zellzyklus blockieren Konzentrationen. Jedoch muss, dass für jeden Zelltyp überprüft werden, wie wir es hier zeigen, dass MG115 nicht den Anteil der BrdU-positiven Zellen im Vergleich zu DMSO ändern. Allerdings verhaften Zellen in S-Phase mit Aphidicolin oder Hydroxyharnstoff (HU) oder Synchronisieren von Zellen mit Hilfe mitotische 'shake-off "und lassen oder doppelten Thymidin Block und freigesetzt werden können, als alternative Ansätze zur Erzeugung gleichwertig Bevölkerung verwendet werdengen der Zellen in der S-Phase.
Die BrdU-Pulse-Chase-Strategie, um Zellzykluszeitpunkten studieren wird sehr nützlich in vielen funktionellen Assays, die eine ungestörte Zellzyklus erforderlich. Dies ist ein biologisch signifikanten Assay, der in der Lage, Zellzyklusarrest Techniken unter Verwendung von verschiedenen Zellzyklusinhibitoren ersetzen könnten. Verwendung dieser Inhibitoren kann oft dazu führen, unterschiedliche Arten von physiologischem Stress in den Zellen, was zu anomalen Änderungen der Zellzyklus-Phänotypen. Verwendung der Pulse-Chase-Ansatz ermöglichte es uns, dass die Depletion von Cetn2 zeigen nur centriole Anordnung 39, um verursacht eine vollständige Blockierung, wie durch frühere Studien 23 vorgeschlagen Gegensatz verzögert. Erkennen von BrdU-positiven Zellen erfordert saure Hydrolyse der Proben. Wir und viele andere Forscher mit einer Technik, die wieder fixiert die Zellen nach der primären und sekundären Färbung für Testproteine, vor der Säurehydrolyse, mit unbedeutenden Verlust Färbeintensitäten für different Zentrosom Proteine 40. Jedoch könnte eine mögliche Alternative zu 5-ethinyl-2'-desoxyuridin (EDU), ein weiteres Thymidin-Analog, das heißt, ähnlich zu BrdU, effizient in replizierende DNA 41 eingebaut wird. Visualisierung EdU mit "Klick-Chemie" erfordert keine saure Hydrolyse 42 und kann daher besser geeignet für einige Antikörper.
Darüber hinaus kann dieser Test einfach verwendet, um die Änderung in post-translationale Modifikationen des bestimmten Proteins an Zentrosomen zu messen. Zum Beispiel kann die zentrosomalen Phosphorylierungsgrad auf die Gesamtebene des Proteins selbst normiert werden, vorausgesetzt, dass die Phosphorylierung ortsspezifischen Antikörper vorhanden sind. Dieser Test könnte sofort auf die Beurteilung relativen Pegel der Phosphorylierung zwischen experimentellen Bedingungen oder Zellzyklusphasen angewendet werden, sondern möglicherweise auch für die Bewertung des Gesamtniveaus der Phosphorylierung angepasst werden, wenn kritische Parameter der Antikörper affinkeiten sind bekannt oder können bestimmt werden. Dieser Assay ist auch anwendbar für die Untersuchung von Proteinen an einem anderen Ort in der Zelle sein, obwohl der Bereich von Interesse nicht zu groß sein. Der Assay wird besonders nützlich sein, um die ortsspezifischen Modulation eines Proteins, das an mehreren zellulären Stellen lokalisiert ist, zu messen.
Es gibt einige wenige technische Parameter wie Differentialphotobleichen, die Wirkung der digitalen Bildbearbeitung, die Linearität der Fluoreszenzintensitäten der Fluorophore, Hintergrundrauschen usw., die in Betracht gezogen werden müssen, um die Genauigkeit der Messung 43 zu maximieren. Beispielsweise kann man das Fluorochrom mit jedem sekundären Antikörper verbunden, um den Beitrag des Photobleich beurteilen wechseln. Viele andere Parameter können auch gesteuert werden, wenn eine identische Abbildungsbedingungen (Belichtungszeit, Verstärkung, Schrittgröße, die Anzahl der Z-Stapel, etc.) und die gleiche Abbildungssoftware in jeder Abbildungslauf verwendet. Obwohl wir verwendetDie No-Nachbar-Algorithmus in unserer Test zu Bilddekonvolution durchführen, können diese Assays mit anderen Entfaltungsalgorithmus, wie eingeschränkt iterative kombiniert werden. Wir stellen ferner fest, dass es leicht, diesen Test zu einer beliebigen Anzahl von verschiedenen bildgebenden Software-Pakete anpassen zu können, wie die meisten gängigen Bildanalysesoftware verfügt über Werkzeuge für die Analyse der Fluoreszenzintensität und Entfernungen.
Dieser Test sollte für jeden Zelltyp sein, und unsere Wahl von Zellen hier ist rein auf ihre Relevanz in Zentrosom biologischen Forschung, und ihre Verwendung bei unseren früheren Untersuchungen zentrosomale VDAC3 Funktion 16,28 basiert. Die Gültigkeit des internen Standards und entsprechende Zeiten für Pulse-Chase-Zellen in S-Phase, G2 oder Mitose muß für jeden Zelltyp bestimmen identifizieren. Insgesamt wird die neu entwickelten quantitativen Fluoreszenztechnik in Kombination mit der BrdU-Pulse-Chase-Test eine sehr nützliche Methode mehrere komplizierte zu lösenMechanismen in Zentrosom Biologie und in vielen weiteren Aspekten der Zellbiologie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F.
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
