Abstract
Los centrosomas son pequeñas pero importantes orgánulos que sirven como los polos del huso mitótico para mantener la integridad genómica o ensamblar cilios primarios para facilitar las funciones sensoriales en las células. El nivel de una proteína puede ser regulada de manera diferente en los centrosomas que en otros lugares .cellular, y la variación en el nivel centrosomal de varias proteínas en diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para la adecuada regulación de montaje centríolo. Hemos desarrollado un ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa que mide los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en células fijadas de diferentes muestras, tales como en las diferentes fases del ciclo celular o después del tratamiento con varios reactivos. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región, y normalizar que la medición contra el mismo para otra proteína que no varía bajo la c experimental elegidoondition. Utilizando este ensayo en combinación con pulso de BrdU y la estrategia de persecución para estudiar ciclos celulares no perturbadas, hemos validado cuantitativamente nuestra reciente observación de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada a centrosomas durante el ciclo celular, probablemente por la degradación mediada por proteasoma específicamente a los centrosomas.
Introduction
Los centrosomas consisten en un par de centriolos rodeados por el material pericentriolar (PCM). Siendo los principales centros organizadores de microtúbulos (COMT) en células de mamíferos, los centrosomas actúan como los dos polos de husos mitóticos en células en división, y por lo tanto ayudan a mantener la integridad genómica 1. En las células quiescentes (por ejemplo, durante la fase G0), uno de los dos centriolos del centrosoma, a saber, el centríolo madre, se transforma en un cuerpo basal de montar el cilio primario, un orgánulo sensorial que sobresale hacia fuera de la superficie de la célula 2. Una vez que las células vuelvan a entrar en el ciclo celular, los cilios primarios se desmonta y cada centríolo dirige el montaje de un procentriole en su extremo proximal que se alarga gradualmente para formar un centríolo madura 3. En el inicio de la fase S, una estructura de rueda de carro como que proporciona la simetría 9 veces a la centriolo se forma sobre la superficie de cada centríolo existente y se convertirá en la base de cada procentriole. SAS6 tsombrero es indispensable para el montaje es reclutado centríolo para formar el eje de la rueda de carro 4-6. Otras proteínas centriolares se ensamblan en la rueda de carro en un muy regulado, proximal a distal manera 7. Después de completar con precisión la duplicación centríolo, las células se ensamblan materiales pericentriolar adicionales para construir dos centrosomas funcionales para el final de la fase G2 8. Además de los componentes básicos centriolares 9-11, varias otras proteínas, incluyendo quinasas, fosfatasas, chaperones, los componentes de andamios, proteínas de membrana asociados y maquinaria degradación están asociados con centríolos, cuerpos basales y PCM en diferentes momentos del ciclo celular 12-16. A menudo se observó que los niveles centrosomales de muchas proteínas están temporalmente regulados por mecanismos de focalización centrosomales y / o la degradación proteasomal en centrosomas. Es importante destacar que las fluctuaciones en el nivel centrosomal de varias proteínas tales como PLK4, Mps1, SAS6, y CP110 unat diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para regular el montaje centriolo 5,17-22, y en el caso de Mps1 la prevención de esta degradación centrosomal conduce a la formación de un exceso de 19 centríolos. Por otra parte, las fracciones centrosomales de varias proteínas son menos lábiles en comparación con piscinas citosólicas. Por ejemplo siRNA mediada baja regulación de Centrin 2 (Cetn2) llevó a sólo una disminución moderada del nivel de proteína en los centríolos pesar de la gran reducción en sus niveles de células enteras 23. Por tanto, es crucial para medir los cambios en el nivel de proteínas centrosomales en el centrosoma en lugar de medir el conjunto de los niveles de proteína celular al evaluar sus funciones centrosoma específico.
En este estudio, hemos desarrollado un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para cuantificar el nivel relativo de una proteína en los centrosomas. Este ensayo se desarrolló especialmente para analizar células que son de diferentes muestrasy por lo tanto no puede ser reflejado al mismo tiempo. Estas muestras pueden ser células que fueron tratados con diferentes reactivos (es decir, las drogas versus control), recogidas en diferentes puntos de tiempo (es decir, el pulso frente a la persecución), o están en diferentes fases del ciclo celular. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región y para normalizar dicho valor contra el mismo para otra proteína cuyos niveles no varían en las condiciones experimentales elegidas. Varios estudios en la biología del centrosoma han utilizado recientemente varias técnicas de microscopía cuantitativa, tanto en células vivas o fijas, para determinar la función del centrosoma específica de proteínas candidatas 24-27. Similares a los ensayos, la presente técnica también mide la corrección de fondo intensidad de fluorescencia de la proteína de prueba. Sin embargo, la inclusión de la normalización utilizando un patrón interno en este ensayo probablemente ofrecería mayorprecisión y confianza en el análisis de dos muestras diferentes que se encuentran en dos cubreobjetos diferentes. Por otra parte, además de examinar el nivel de proteína en los centrosomas, con ajustes menores este método se puede aplicar a un conjunto diverso de condiciones experimentales o en otros sitios celulares.
Aquí, combinamos nuestro ensayo microscopía cuantitativa con una estrategia de pulso y persecución BrdU para comparar las células de las etapas del ciclo celular diferentes. En lugar de utilizar técnicas de detención del ciclo celular estándar y de liberación para estudiar diversos puntos de tiempo del ciclo celular, las células que crecen de forma asíncrona se incuban con BrdU para marcar las células en la fase S, y las células marcadas son perseguidos durante diversos tiempos (normalmente 4-6 horas). La mayoría de las células marcadas estarán en la fase S inmediatamente después del pulso. La longitud de la persecución se elige de manera que después de la caza, las células marcadas serán a finales de S, G2, o mitosis, que puede ser verificado por las características morfológicas, de posición AS- de centrosomas con respecto a nucLei, distancia entre los centrosomas, la condensación de cromosomas, etc. Por lo tanto, la longitud de la persecución depende de la duración media de S, G2 y la fase M de un tipo de célula particular. Dado que este enfoque evita inhibidores del ciclo celular, tales como hidroxiurea, afidicolina, nocodazol, etc., permite un análisis más fisiológicamente relevantes del ciclo celular.
Por lo tanto, aquí demostrar que el ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa solo, o en combinación con BrdU ensayo de pulso-caza, es una técnica simple pero potente para medir con precisión los cambios relativos en el nivel de una proteína centrosomal candidato durante un ciclo celular imperturbable. Se midió el nivel de centrosomal VDAC3, una proteína que se identificó recientemente en los centrosomas, además de las mitocondrias 16,28, el uso de estos ensayos. Los resultados obtenidos aquí verificar nuestra observación anterior de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada por la degradación, y también varía en un dependen del ciclo celulart forma 16, además, la validación de la aplicabilidad de este método.
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Protocol
1. Cultivo Celular
- Utilice la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), las células epiteliales del pigmento de la retina inmortalizadas (hTERT-RPE1; se hace referencia aquí como RPE1).
NOTA: RPE1 células son células humanas diploides, casi no transformadas que se utilizan comúnmente para estudiar el montaje centriolo y ciliogenesis. Estas células siguen un ciclo normal de duplicación centriolo coordinado con un ciclo celular regulado. - Passage un casi confluente 100 mm placa de cultivo celular de las células RPE1 a 1: 5 dilución del cultivo original en un plato de 100 mm fresco que contiene 10 ml de DME / F-12 (1: 1) el medio suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (medio completo se conoce como DME / medio F-12). Se cultivan las células a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2.
- Incubar 12 mm cubreobjetos de vidrio redondas en 50 ml de HCl 1 N en un vaso de vidrio cubierto, O / N sin agitación, a 60 ° C en un baño de agua o una incubadora.
- After descartando la solución de ácido, lavar los cubreobjetos tres veces en 100 ml de agua destilada por incubación durante 15 min con agitación ocasional. Repetir el lavado de manera similar en 70% de etanol y 95% de etanol.
- Seque los cubreobjetos mediante la difusión individualmente a cabo en un papel secante de laboratorio en una cabina de bioseguridad, seguido de esterilización con radiación UV durante 60 min.
- Coloca 2-4 cubreobjetos secos en un 35 mm placa de cultivo celular. Diluir la solución de fibronectina o fibronectina como polímero de ingeniería (concentración de solución madre de 1 mg / ml) a una concentración de 25 mg / ml en cultivo celular PBS.
- Coloque 80-100 l de la solución diluida sobre cada cubreobjetos y se incuba durante 60 min a recubrir el lado superior del cubreobjetos. Lavar los cubreobjetos tres veces usando PBS antes de la adición de medio completo.
2. Las células de cultivo y tratamiento de las células con inhibidores del proteasoma
- Paso 2 x 10 5 crecer de forma asíncronaING RPE1 células en cada placa de 35 mm que contiene cubreobjetos y crecer las células en 2 ml de medio completo. Reemplace el medio de cultivo cada 24 horas con medio completo fresco precalentado.
- Para analizar el efecto de la inhibición del proteasoma en el nivel centrosomal de la proteína de prueba (aquí VDAC3 o γ-tubulina), crecen las células en dos placas de 35 mm de 44 hr. Reemplazar el medio de cultivo con medio completo y añadir ya sea MG115 o DMSO como disolvente de control a una concentración final de 5 mM o 0,05%, respectivamente. Al mismo tiempo, añadir BrdU a las células a una concentración final de 40 mM y se incuban las células durante 4 horas.
- Traslado cada cubreobjetos en una placa de 24 pocillos. Añadir metanol 500 l refrigerada a cada pocillo y se incuba la placa a -20 ° C durante 10 min para fijar las células sobre los cubreobjetos. Lavar inmediatamente los cubreobjetos tres veces con tampón de lavado 500 l (1X PBS que contenía 0,5 mM de MgCl 2 y 0,05% de Triton X-100).
- Se recoge el residuolas células de la placa de 35 mm y centrifugar las células a 1000 xg durante 5 min. Utilice el sedimento de células para analizar la proteína total por el Western Blot (paso 6).
3. Pulso BrdU y Chase Ensayo para analizar los niveles de proteína en diferentes fases del ciclo celular
- Para analizar la variación del nivel de una proteína (aquí VDAC3, SAS6 o Cep135) en los centrosomas en diferentes fases del ciclo celular, crecer las células en dos placas de 35 mm que contienen cubreobjetos de 44 hr. Sustituir el medio de cultivo con medio completo que contenía 40 mM BrdU e incubar las células durante 4 horas en la incubadora de cultivo celular.
- Desde un plato, transferir los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos para fijar las células utilizando metanol frío como se describe en el paso 2.1.2.
- Después del pulso BrdU 4 horas, se elimina el medio que contiene BrdU-, lavar las células una vez con PBS y una vez con medio completo, se añade medio fresco, y luego crecer las células en ausencia de BrdU durante diversos tiempos (normalmente otro 4 hrpara las células RPE1) antes de la fijación de las células tal como se describe en el paso 2.1.2.
NOTA: Para las células RPE1, la mayoría de las células BrdU-positivas están en S tarde o G2 fases después de una persecución de 4 horas. Esto se debe determinar de forma independiente para cada tipo de célula.
4. La inmunotinción
- Se incuban las células fijadas sobre cubreobjetos en 200 l de tampón de bloqueo (2% de BSA y 0,1% Triton X-100 en 1X PBS) durante 30 min.
- Se incuban las células con una mezcla de anticuerpos primarios (típicamente uno en conejo y otro criados en ratón) diluido en tampón de bloqueo O / N a 4 ° C en una cámara humidificada.
- Para hacer una cámara húmeda, poner una toalla de papel húmeda en la mitad inferior de una caja de puntas de pipeta de 1.000 l vacía. Colocar una tira de Parafilm sobre la superficie rack, y detectar una gota (15-20 l) de la solución de anticuerpo en el Parafilm para cada cubreobjetos para ser incubados. Invertir un cubreobjetos sobre una gota de solución de anticuerpo (de modo que las células están inmersas) y cercala tapa de la caja de propina.
- Invierta cubreobjetos de nuevo y volver de nuevo a la placa de 24 pocillos. Lavar cubreobjetos y luego se incuba en 150 l mezcla de anticuerpo secundario (aquí tinte anti-conejo conjugado fluorescente verde y colorante rojo fluorescente conjugado anti-ratón diluidos en tampón de bloqueo) durante 1 hora a RT. Lavar los cubreobjetos tres veces.
NOTA: Los anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado son sensibles a la luz. Proteja las muestras de la luz durante los pasos 4.1.3-5.1.2.
- Preparar para la tinción de anti-BrdU mediante la fijación de las células teñidas RPE1 de nuevo con 500 l de metanol enfriada a -20 ° C durante 10 min, como se describe en el paso 2.1.2. Lavar los cubreobjetos tres veces.
NOTA: Esta fijación asegura el etiquetado de anticuerpos primaria y secundaria de la proteína (s) de interés durante el proceso de hidrólisis ácida en el siguiente paso.- Se incuban las células en 200 l de HCl 2 N durante 30 min a RT. Neutralizar con 300 l de 1 M Tris-Cl, pH 8 unad lavar las células tres veces con tampón de lavado.
- Bloquear las células de nuevo utilizando 200 l de tampón de bloqueo durante 30 min a RT.
- Se incuban las células con anticuerpo de rata anti-BrdU (diluido en tampón de bloqueo) durante 45 min a 37 ° C en una cámara humidificada. Devolver los cubreobjetos de nuevo a la placa de 24 pocillos, lavar y luego se incuba con el tinte azul-anticuerpo conjugado fluorescente anti-rata secundario (diluido en 150 l de tampón de bloqueo en el plato de 24 pocillos durante 1 hora a RT.
- Lavar los cubreobjetos tres veces. Detectar una gota (aproximadamente 3-6 l) de una solución de montaje que contiene antifade reactivo en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Invierta un cubreobjetos, con vistas al-células hacia abajo, hacia la solución de montaje. Limpie el exceso de líquido presionando suavemente el cubreobjetos contra la diapositiva utilizando tejido de limpieza suave. Aplicar esmalte de uñas transparente a lo largo del borde del cubreobjetos para sellarlo sobre el portaobjetos de microscopio.
5. La inmunofluorescencia Imagen acquisition y análisis
- Utilice un objetivo de inmersión en aceite 100X Plan de Apo (con una apertura numérica 1.4) para adquirir las imágenes de las células RPE1 BrdU-positivas a temperatura ambiente.
- Ponga un portaobjetos en el microscopio (ver equipos) adjunto con una cámara capaz de imagen digital. Para cada fluoróforo, determinar el tiempo de exposición apropiado (típicamente entre 300-1.000 mseg) manualmente mediante el examen de todas las muestras de un experimento. Antes de la adquisición de imágenes de una célula, determinar manualmente la parte superior apropiado y plano focal inferior a lo largo del eje Z (típicamente 0,2 m de tamaño de paso). Adquirir imágenes de diferentes muestras que están en cubreobjetos separadas utilizando el tiempo de exposición idénticos para diferentes fluoróforos a lo largo del eje Z utilizando un paquete de software de formación de imágenes de microscopía digital.
- Realizar deconvolución (en estos casos usando No algoritmo de vecino) de todas las pilas de imágenes adquiridas a lo largo del eje Z.
- Obtener la proyección total de intensidad de cada pila de imágenes a lo largo deel eje Z.
- En las células donde centrosomas están cerca (distancia entre dos centrosomas es inferior a 2 micras), dibuja un pequeño cuadrado (típicamente 20 a 30 píxeles por lado) alrededor de los dos centrosomas y marcar el área seleccionada.
- Dibuja un cuadrado más grande (por lo general 24 a 35 píxeles por lado) que rodea a la primera plaza y marcar el área seleccionada de la gran plaza.
- Obtener el área (A) y la intensidad de la fluorescencia total (F) de cada fluoróforo en cada caja (S denota pequeña caja y L denota caja grande).
- Analizar la corrección de fondo intensidad de la fluorescencia de cada fluoróforo utilizando la fórmula descrita por Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)].
- Obtener la intensidad de fluorescencia normalizada de la proteína de interés (aquí VDAC3 o SAS6) mediante el cálculo de la relación de la intensidad de fluorescencia de sus fl fondo corregidofluoróforo a la del fluoróforo utilizado para el estándar elegido interna (aquí γ-tubulina, SAS6 o Cep135).
- En el caso de análisis de las células donde centrosomas están bien separados (distancia entre dos centrosomas es mayor que 2 micras), analizar cada centrosoma separado trazando dos conjuntos separados de cajas. Dibuja un cuadrado pequeño (típicamente 15 a 25 píxeles por lado) alrededor de cada centrosoma y marcar el área seleccionada. Dibuja un cuadrado más grande (20 a 30 píxeles por lado) que rodea a la primera plaza y marcar el área seleccionada.
- Obtener el área (A) y la intensidad de la fluorescencia total (F) de cada fluoróforo en cada caja, y calcular las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de cada fluoróforo, por separado para cada centrosoma, como se describe en el paso 5.3.3.
- Combinar las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de cada proteína a partir de los dos centrosomas para obtener el nivel centrosomal total de esa proteína en esa célula.
- Obtenga elintensidad normalizada para la proteína de interés mediante el cálculo de la relación de su intensidad total de centrosomal a la intensidad centrosomal total del patrón interno.
- Analizar al menos 15 a 25 células para cada condición experimental y dibujar el gráfico en una hoja de cálculo.
6. Análisis de la proteína total usando Western Blot
- Resuspender las células en ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) mM tampón que contiene Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 150 mM, 1% Nonidet P-40, 1% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) y se incuba durante 10 min en hielo para lisar las células.
- Centrifugar la mezcla a 10.000 xg durante 10 min, separar el lisado de la fracción de sedimento y medir la concentración total de proteínas de cada lisado usando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
- Mezclar 40 g de lisado con 4x SDS-PAGE de tampón de carga (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,1% Bromophenol azul).
- Hervir las muestras durante 10 minutos y correr las muestras en un 12,5% de desnaturalización SDS-PAGE a una tensión constante de 200 V.
- Transferir las proteínas separadas en SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa utilizando la técnica de Western Blot (a un voltaje constante de 90 V durante 1 hora en frío).
- Bloquear la membrana con leche desnatada al 3% en 1 x PBS, y luego se incuba la membrana con soluciones de anticuerpos primarios diluidos (en este caso de conejo anti-VDAC3, conejo anti-γ-tubulina y el ratón anti-α-tubulina) durante 1 hr a RT.
- Después de lavar la membrana tres veces (5 min cada incubación con agitación) usando tampón PBS-T (1x PBS y 0,2% Tween-20), incubar la membrana en una mezcla de infrarrojo cercano (IR) colorante fluorescente conjugado anti-conejo y tinte fluorescente IR anticuerpos secundarios anti-ratón conjugados (diluido en PBS-T) durante 1 hora.
- Lavar la membrana tres veces y luego escanear la membrana para analizar las bandas utilizando un f infrarrojossistema de imágenes luorescence adecuado para la detección de inmunotransferencia.
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Representative Results
Nuestros estudios recientes identificaron novela localización centrosomal y la función de VDAC3, una de las porinas mitocondriales 16,28. La inmunotinción de varias células de mamíferos que incluyen células RPE1 utilizando un anticuerpo VDAC3 específica mostró prominente tinción centrosomal y comparativamente débil tinción mitocondrial. También demostramos que VDAC3 centrosomal se asocia preferentemente con el centríolo madre, y la piscina centrosomal tanto de la endógena y expresó ectópica VDAC3 está regulada por la degradación 16. Con el fin de validar el ensayo cuantitativo IIF examinamos los cambios en la piscina VDAC3 centrosoma asociadas en las células que se encuentran en la fase S.
Aquí, las células RPE1 asincrónicamente creciente fueron tratados con el inhibidor del proteasoma MG115 o el disolvente DMSO de control para 4 hr. Para restringir el análisis a las células que están en la fase S y someterse asamblea centrosoma, sólo las células que incorporaron BrdU du Examinamossonar el mismo 4 horas y tuvo dos centrosomas poco espaciados (espaciadas dentro de 2 micras de la otra). Examinamos varios campos al azar de las células teñidas para BrdU y los núcleos de ambos control y tratamiento MG115 (Figura 1) para concluir que el tratamiento breve de MG115 no afectó a la incorporación de BrdU (aproximadamente 58%) en comparación con el tratamiento control (aproximadamente 56%) en las células RPE1. Como estábamos comparando sólo las células que estaban en la fase S (como se juzga por la presencia de dos focos γ-tubulina espaciados dentro de 2 m uno de otro), hemos considerado γ-tubulina como un potencial estándar interno para la normalización. Por lo tanto, lo primero que examinó si los niveles de γ-tubulina centrosomales en células BrdU-positivas varían sobre la inhibición del proteosoma. No es sorprendente que hubo una considerable variación de célula a célula en la intensidad de fluorescencia-γ-tubulina de una célula a otra, y nos pareció que esta variación se presenta mejor en los diagramas de caja y bigote que presentan el conjunto de datos en su conjunto disponible. YOdiagramas de caja y bigotes n, cajas representan el cuartil inferior y superior, el marcador en el cuadro indica la mediana de cada serie, y los bigotes representan valores mínimos y máximos, que son a menudo (aunque no siempre) los valores atípicos. Como se ve en la Figura 1D, el nivel de γ-tubulina centrosomal no fue significativamente diferente entre las células BrdU-positivas tratadas con MG115 o DMSO, validando así γ-tubulina como un estándar interno para este experimento. En contraste con γ-tubulina, la intensidad de fluorescencia de fondo corregido correspondiente a VDAC3 centrosomal era aproximadamente 2,5 veces mayor en las células tratadas con MG115 que en las células control (Figura 1C). Cuando normalizaron fluorescencia total VDAC3 frente a la de γ-tubulina, el aumento pliegue disminuyó ligeramente a aproximadamente dos veces (Figura 1E). Aunque el cambio veces fue mayor sin normalización, tenemos más confianza en la exactitud de los datos normalizados, que a nuestro juicio bettcontroles er para cualquier efecto general del tratamiento MG115, así como la variación debido al procesamiento de la muestra. Tinción VDAC3 en sitios no centrosomales (Figura 1B) o el nivel celular total de VDAC3 (Figura 1F) no fue afectada por la inhibición del proteasoma. De este modo, se verifica cuantitativamente nuestra observación anterior de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada por la degradación del proteasoma mediada.
Con el fin de medir el cambio en VDAC3 centrosomal durante el ciclo celular que hemos denominado las células con un pulso de BrdU 4 horas seguido de una persecución de 4 h de las células marcadas. Dado que sólo las células en fase S incorporarán BrdU durante el pulso (distancia media entre dos centrosomas es de 1,35 ± 0,16 m), la mayoría de las células RPE1 BrdU-positivas después de 4 horas de persecución será a ya sea a finales de la fase S o G2 fase temprana ( distancia media entre dos centrosomas es de 1.55 ± 0.22 m), con una población menor a finales de la fase G2 en el centroalgún par se ha separado de forma significativa (distancia media entre dos centrosomas> 2 M) 30. γ-tubulina, siendo un componente importante de PCM se acumula en gran medida en los centrosomas durante la maduración del centrosoma que tiene lugar en la fase G2 31,32, y este aumento hace que sea un mal patrón interno para la evaluación de las variaciones del ciclo celular de otras proteínas centrosomales. Por otro lado, SAS6 es reclutado para procentrioles durante la fase S temprana para estimular el montaje de las ruedas de carro 4,5,7, y permanece en la base de los centríolos recién formadas hasta que las células entran en mitosis cuando comienza a degradarse (Figura 2 y la referencia 5). Sin embargo, en células HeLa o U2OS, el nivel de centriolar SAS6 aumenta gradualmente a medida que las células progresan desde la fase S a la fase G2 5. Por lo tanto, se midió primero el nivel SAS6 centrosomal con respecto a la de Cep135, otra proteína centriolar núcleo que se localiza en los extremos proximales de los centriolos en todoel ciclo celular 33. No se observó ninguna diferencia significativa en la intensidad de fluorescencia totales antecedentes corregido de Cep135 o SAS6 en células RPE1 BrdU-positivas de pulso o la persecución, cuando los centrosomas están estrechamente espaciados (Figura 3-D; 'close' células distancia en promedio entre dos centrosomas es inferior a 2 micras). Por consiguiente, el nivel SAS6 normalizado se mantuvo similar en estas células (Figura 3E). Sin embargo, se observó un modesto aumento en los valores globales de intensidad de fluorescencia de SAS6 y un ligero aumento de la misma para Cep135 en las células donde centrosomas están bien separados (distancia entre dos centrosomas> 2 micras; células "distante"). Por consiguiente, el nivel total de centrosomal normalizado SAS6 en células con dos centrosomas bien separados fue ligeramente, pero estadísticamente significativamente mayor que en las células con los centrosomas estrechamente espaciados. Esto es probablemente debido a la regulación inherente de SAS6 ingenio nivella progresión del ciclo celular 5 h. Sin embargo, también es posible que los ligeros aumentos (que o de significación estadística inferior) se deben a la adición de intensidades de fluorescencia de dos centrosomas que se analizaron por separado, en comparación con el análisis de dos centrosomas al mismo tiempo en las células con los centrosomas estrechamente espaciados. Sin embargo, cuando la intensidad de fluorescencia de VDAC3 se normalizó a la de solo SAS6, el nivel VDAC3 en dos centrosomas estrechamente espaciadas se aumentó aproximadamente 1,5 veces en las células que son a finales de S- / G2-fase temprana, en comparación con los principios de la fase S células (Figura 4A-C, F; células 'Cerrar'). Cuando estas células progresan a finales de la fase G2, el nivel VDAC3 normalizada en dos centrosomas se redujo en 2,4 veces en comparación con que a finales de la fase S (Figura 4C, F).
Debido a que los niveles SAS6 aumentan ligeramente desde finales de la fase S a G2, usando SAS6 como estándar interno conduce a una ligera sobreestimación de la dismRease en los niveles de VDAC3 en las células G2-fase tardía (centrosomas están separados por más de 2 micras). Mientras que nuestros datos sugieren que Cep135 es una mejor opción como estándar interno para evaluar las variaciones del ciclo celular, no podemos usarlo para VDAC3 porque los anticuerpos VDAC3 y Cep135 disponibles para nosotros son tanto de conejo. Sin embargo, multiplicando el valor de la mediana para VDAC3 SAS6 normalizado (F VDAC3 / F SAS6) por el valor de la mediana de normalizado-Cep135 SAS6 nos da un valor aproximado para VDAC3 Cep135 normalizado [(F VDAC3 / F SAS6) x (F SAS6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Cuando llevamos a cabo este análisis, el cambio en los niveles VDAC3 entre finales S / G2 temprana y tardía G2 cae ligeramente hasta 2 veces. Células BrdU-positivas que se encuentran en cualquier etapa de la mitosis como se juzga por los cromosomas condensados y débil tinción SAS6 están excluidos de nuestro análisis, debido a la drástica caída en los niveles de SAS6. Sin embargo, hemos observado que el nivel de re VDAC3 centrosomalpermaneció bajo durante la mitosis (datos no mostrados). Dado que los niveles Cep135 no caen durante la mitosis (datos no mostrados), podríamos repetir en principio el procedimiento de re-normalización para estimar los niveles VDAC3 Cep135 normalizados en la mitosis. Sin embargo, en realidad centrosomales niveles SAS6 en mitosis eran demasiado variable para permitir una determinación precisa de los niveles VDAC3 SAS6 normalizados en el primer lugar. De todos modos, en general, nuestros datos verifican que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada a centrosomas durante el ciclo celular.
Figura 1. Las células RPE1 asincrónicamente creciente se incubaron con BrdU y MG115 (MG) o DMSO (DM) durante 4 h. (A) Se muestra son campos aleatorios de DMSO o MG115 tratadas las células teñidas con el anticuerpo anti-BrdU (rojo) y Hoechst ( ADN; azul). Aquí y en todas las demás imágenes de la barra representa 5 micras.(BE) DMSO o MG115 trataron las células se tiñeron con anticuerpos contra VDAC3, γ-tubulina y BrdU. Células BrdU-positivas fueron imágenes en condiciones de formación de imágenes idénticas (exposición veces- 400 ms para el azul fluoróforo / BrdU; 500 ms para verde fluoróforo / VDAC3; 300 ms para fluoróforo rojo / γ-tubulina), y la corrección de fondo a las intensidades de fluorescencia de VDAC3 y γ-tubulina se determinó. Imágenes representativas que muestran VDAC3 (VD3; verde), γ-tubulina (γ-bañera; rojo) y BrdU (azul) se muestran en (B). Aquí y en todas las demás imágenes, inserciones muestran digitalmente magnifican centrosomas como se indica por los cuadrados. Las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo (F; en unidades arbitrarias) correspondientes a VDAC3 y γ-tubulina entre veinticinco y las células se representan en el diagrama de cajas y bigotes en (C) y (D) respectivamente. Aquí y en todos los demás casos, cajas representan inferior y el cuartil superior, el maRKER en la caja (-) indica la mediana de cada serie, y los bigotes representan los valores mínimo y máximo. Valores de intensidad de fluorescencia normalizada de VDAC3 de esos veinticinco células se representan gráficamente en (E). Para (CE), el valor p se deriva de T-test no pareado. *** Indica p <10 -5, y ns indica p> 0,05. (F) Las inmunotransferencias que muestran los niveles de células enteras de VDAC3 (tanto VDAC3a y VDAC3b 16) y γ-tubulina (γ-bañera), donde α-tubulina (α-bañera) se está cargando control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Las células RPE1 asincrónicamente creciente que fueron etiquetados con un 4 hr Brpulso dU y perseguido durante otras 4 horas en ausencia de BrdU se tiñeron con anticuerpos contra SAS6 (verde) y γ-tubulina (γ-bañera; rojo). Imágenes representativas muestran tinción SAS6 durante (A) de la fase S (con dos cerca SAS6 focos), (B) metafase (dos débiles focos SAS6 en los polos) y (C) telofase (focos SAS6 se pierden de los polos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Células BrdU-positivas Figura 3. RPE1 células asincrónicamente creciente fueron etiquetados con un pulso de BrdU 4 horas y persiguieron durante otras 4 horas en ausencia de BrdU. Teñidas para Cep135 y SAS6 fueron imágenes en condiciones de formación de imágenes idénticas (exposición veces- 400 mspara el azul fluoróforo / BrdU; 400 ms para fluoróforo verde / Cep135; Se determinaron los 500 mseg para fluoróforo rojo / SAS6), y las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de SAS6 y Cep135. La distancia entre dos centrosomas también se midió en todas las células. Una celda en la que la distancia entre dos centrosomas es inferior a 2 micras se consideró como "cerca" y donde el valor es más de 2 micras se clasificó como "distante". (AB) Imágenes representativas que muestran Cep135 (C135, verde), SAS6 (rojo) y BrdU (azul) se muestran. En (B), C1 y C2 son los dos centrosomas de la célula representativa "distante". (CD) con corrección de fondo Las intensidades de fluorescencia (F; en unidades arbitrarias) correspondiente a SAS6 (C) y Cep135 (D) a partir de quince células de cada categoría se representan en la caja y bigotes diagrama. (E) las intensidades normalizadas de SAS6 from esas células se representan en la caja y el diagrama de la barba. Para (CE), el valor p se deriva de T-test no pareado. * Indica 0,001 <p <0,05, y ns indica p> 0.05. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. células BrdU-positivas del ensayo de pulso-caza BrdU anteriormente (Figura 3) teñidas para VDAC3 y SAS6 fueron imágenes en condiciones de formación de imágenes idénticas (exposición veces- 400 ms para el azul fluoróforo / BrdU; 500 ms para fluoróforo verde / SAS6; Se determinaron 1,000 mseg para fluoróforo rojo / VDAC3), y las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de SAS6 y VDAC3. La distancia entre dos centrosomas se midió en todas las células, y las células se clasificaron como 'cperder "(la distancia entre dos centrosomas <2 m) y" distante "(la distancia entre dos centrosomas> 2 micras), como en la figura 3. (AC) Imágenes representativas de 'close' célula en BrdU pulso (A), en persecución BrdU (B), y la célula "distante" en persecución BrdU (C) teñidas para VDAC3 (VD3; verde), SAS6 (rojo) y BrdU (azul) se muestran. En (C), C1 y C2 son los dos centrosomas. [DE] Las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo (F; en unidades arbitrarias) correspondientes a VDAC3 (D) y SAS6 (E) a partir de quince células de cada categoría se representan en la caja y bigotes diagrama. (F) intensidades normalizadas de VDAC3 de esas células se representan en la caja y el diagrama de la barba. Para (DF), el valor p se deriva de T-test no pareado. *** Indica p <10 -5, **indica 10 -5 <p <0,001, y ns indica p> 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Microscopía cuantitativa en biología celular se asocia comúnmente con los ensayos de formación de imágenes de células vivas, como Energía de Resonancia Fluorescente Transfer (FRET), la fluorescencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), etc. Sin embargo, hay cada vez más ejemplos de los biólogos celulares en desarrollo diferentes ensayos de microscopía cuantitativos para fijo las células en los últimos años 27,34-36. Es importante destacar que, el progreso en la comprensión de la biología del centrosoma a menudo requiere la comprensión de la función del centrosoma específica de proteínas cuya piscinas centrosomal puede estar regulada de manera diferente que otras piscinas. Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo IIF para analizar específicamente el nivel centrosomal relativa de una proteína en dos muestras tratadas de manera diferente. Debido a esto requiere que las células se fijaron y procesaron en cubreobjetos separadas, por lo tanto, introdujimos un estándar interno para el propósito de la normalización, a un mejor control de los posibles artefactos debido a la necesidad de manejar los dos EXPERIMENTAL poblaciones de células por separado, y aumentar la precisión del ensayo. Hay sólo unos pocos estudios previos 37 que han utilizado un nivel tan interno para medir la intensidad de la fluorescencia relativa de una proteína de prueba.
Si bien la elección de un patrón interno es crucial para la precisión de nuestro ensayo, es sin duda el aspecto más desafiante. Idealmente, el par de centríolos duplicados durante la fase S, y los centriolos duplicados entonces se acumulan componentes adicionales, incluyendo PCM γ-tubulina durante G2 modo que los dos centrosomas maduros pueden convertirse en los polos del huso mitótico. Por lo tanto, se supone que el nivel centrosomal de γ-tubulina no cambiaría significativamente en células que son estrictamente de S-fase. Este parece ser el caso en las células RPE1 donde las células en fase S se caracterizan por un breve etiquetado BrdU. Sin embargo, la validez de una norma interna debe ser probado para cada tipo de célula y condición experimental. Por ejemplo, mientras que el fondo corre-cted VDAC3 fluorescencia aumentó más de dos veces en respuesta a la inhibición del proteasoma en afidicolina tratada (fase S arrestado) U2OS células, también hubo una pequeña pero estadísticamente significativa (0,001 <valor de p <0.05) aumento de centrosomal γ-tubulina (complementario Figura). Por lo tanto, γ-tubulina no siempre es un control interno adecuado, incluso para las células que están detenidas en el ciclo celular.
Similar a todos los demás ensayo de microscopía IIF, uno de los inconvenientes de este ensayo es que los anticuerpos contra la proteína de prueba y el patrón interno deben ser criados en diferentes especies huésped. Mientras que nuestros datos sugieren que Cep135 es un mejor nivel interno de SAS6, no podríamos normalizar los niveles VDAC3 contra Cep135 como los anticuerpos disponibles contra estas proteínas fueron tanto planteadas en conejo. Por lo tanto, en lugar normalizado contra SAS6, lo que provocó una sobreestimación de la disminución en los niveles VDAC3 entre finales de la fase S y G2. En una situación donde el inteestándar rnal varía modestamente, se puede introducir otro factor de normalización para tener en cuenta que la variación. Por ejemplo, para corregir la variación en SAS6, multiplicamos la intensidad VDAC3 SAS6 normalizado por la intensidad SAS6 normalizado-Cep135.
En los casos en los que es difícil elegir un patrón interno adecuado, microesferas recubiertas de tinte fluorescente (0,02 a 0,04 m de diámetro) pueden proporcionar una estrategia alternativa. La señal de una microesfera de fluorescencia presente en el mismo campo que la célula de interés puede ser utilizado para normalizar la señal de fluorescencia correspondiente a la proteína de interés. Por otro lado, si las células de ensayo y de control se crean imágenes juntos, uno puede no necesitar un estándar tales interno para la normalización. Hemos utilizado anteriormente una versión de este ensayo para comparar el nivel de centrosomal Mps1 en células que sobreexpresan bien ciclina A 19 o antizyme 20, que sea a prevenir 19 o 20 promover la degradation de Mps1 en centrosomas, respectivamente, para que en las células no transfectadas adyacentes fotografiados al mismo tiempo.
Con el fin de examinar el efecto de VDAC3 centrosomal sobre la inhibición del proteasoma, se utilizó etiquetado BrdU para identificar y comparar las células que se encuentran en la fase S. Mientras que el tratamiento MG115 puede inhibir la progresión del ciclo celular, esta inhibición requiere una concentración significativamente mayor 38 que el utilizado en este estudio. A las concentraciones utilizadas aquí MG115 puede bloquear los puntos de control del ciclo celular y transiciones, pero no bloquean la progresión del ciclo celular. Sin embargo, que debe verificarse para cada tipo celular, como lo hicimos aquí demostrando que MG115 no alteró el porcentaje de células BrdU positivas en comparación con DMSO. Sin embargo, la detención de las células en la fase S usando afidicolina o hidroxiurea (HU) o la sincronización de las células utilizando mitótico 'sacudir-off' y suelte o bloque doble timidina y la liberación podría ser utilizado como enfoques alternativos para la generación de población equivalenteciones de células en fase S.
La estrategia de pulso-caza BrdU para estudiar los puntos de tiempo del ciclo celular va a ser muy útil en muchos ensayos funcionales que requieren un ciclo celular imperturbable. Este es un ensayo más biológicamente significativo que pudiera ser capaz de reemplazar las técnicas de detención del ciclo celular utilizando diversos inhibidores del ciclo celular. El uso de estos inhibidores a menudo puede causar diferentes tipos de estrés fisiológico en las células resultantes en cambios aberrantes en los fenotipos del ciclo celular. El uso del enfoque de pulso y persecución nos permitió demostrar que el agotamiento de Cetn2 sólo retrasó asamblea centríolo 39 en lugar de causar un bloqueo completo según lo sugerido por estudios previos 23. La detección de células BrdU-positivas requiere la hidrólisis ácida de las muestras. Nosotros y muchos otros investigadores están utilizando una técnica que re-fija las células después de la tinción de primaria y secundaria de las proteínas de la prueba, antes de la hidrólisis ácida, con una pérdida insignificante de intensidad de la tinción para diferent proteínas centrosoma 40. Sin embargo, una alternativa potencial podría ser el uso de 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU), otro análogo de la timidina que es, similar a la BrdU, que se incorpora de manera eficiente en la replicación de ADN 41. Visualización de EdU usando 'click química "no requiere la hidrólisis ácida de 42 años, y puede por lo tanto más adecuado para algunos anticuerpos.
Además, este ensayo se puede utilizar fácilmente para medir el cambio en las modificaciones post-traduccionales de una proteína particular en los centrosomas. Por ejemplo, el nivel centrosomal de la fosforilación se puede normalizar con respecto al nivel total de la propia proteína, siempre que existan anticuerpos específicos del sitio de fosforilación. Este ensayo podría aplicarse inmediatamente para evaluar los niveles relativos de fosforilación entre las condiciones experimentales o fases del ciclo celular, pero potencialmente podría ser adaptado para evaluar los niveles totales de fosforilación si los parámetros críticos de affin anticuerpodades son conocidos o se pueden determinar. Este ensayo también debe ser aplicable para el estudio de las proteínas en cualquier otro sitio en las células, aunque la región de interés no debería ser demasiado grande. El ensayo será particularmente útil para medir la modulación específica de la ubicación de una proteína que se localiza en múltiples sitios celulares.
Hay un puñado de parámetros técnicos tales como fotoblanqueo diferencial, el efecto de la imagen digital, la linealidad de las intensidades de fluorescencia de los fluoróforos, ruido de fondo, etc. que se debe tomar en consideración para maximizar la precisión de la medida 43. Por ejemplo, se puede conmutar el fluorocromo asociado con cada anticuerpo secundario para evaluar la contribución de photobleaching. Muchos otros parámetros pueden ser bien controlados si uno utiliza las mismas condiciones por imágenes (tiempo de exposición, ganancia, tamaño de paso, número de Z-pilas, etc.) y el mismo software de imagen en cada serie de imágenes. Aunque hemos utilizadoel algoritmo de No-vecino a lo largo de nuestro ensayo para llevar a cabo la imagen de deconvolución, este ensayo se puede combinar con otro algoritmo de deconvolución tal como limitada iterativo. También observamos que debería ser fácil de adaptar este ensayo a cualquier número de diferentes paquetes de software de imagen, como el software de análisis de imágenes más comúnmente disponibles dispone de herramientas para el análisis de la intensidad de fluorescencia y distancias.
Este ensayo debe ser aplicable a cualquier tipo de célula, y nuestra elección de células aquí está puramente basado en su relevancia en la investigación en biología centrosoma, y su uso en nuestros exámenes anteriores de la función VDAC3 centrosomal 16,28. Sin embargo, la validez de las normas internas y momentos adecuados para pulso-caza para identificar las células en la fase S, G2, o mitosis caso se debe determinar para cada tipo de célula. En general, nuestra técnica de fluorescencia cuantitativa de nuevo desarrollo en combinación con el ensayo de pulso-caza BrdU será un método muy útil para resolver varios intrincadamecanismos de la biología del centrosoma y en muchos aspectos más amplios de la biología celular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
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