Abstract
中心体は、ゲノムの完全性を維持するか、または細胞中の感覚機能を容易にするための一次繊毛を組み立てるために紡錘体の極として機能し、小さいながらも重要な細胞小器官である。タンパク質のレベルは、他の.cellular場所でより中心体で異なって調節され得る、および細胞周期の異なる点でいくつかのタンパク質が中心体のレベルの変化は、中心小体アセンブリの適切な調節のために重要であると思われる。我々は、細胞周期の異なる段階において、または様々な試薬で処理した後、異なる試料からの固定された細胞における中心体におけるタンパク質のレベルの相対的変化を測定する定量的な蛍光顕微鏡アッセイを開発した。このアッセイの原理は、小さな領域でのタンパク質に対応するバックグラウンド補正後の蛍光強度を測定することにあり、そして選択された実験的なCの下で変化しない別のタンパク質のために同じに対してその測定値を正規化するondition。 BrdUのパルスと非摂動細胞周期を研究するチェイス戦略と組み合わせて、このアッセイを利用して、我々は定量的に明確に中心体でプロテアソームを介した分解による可能性が高いVDAC3の中心体のプールは細胞周期の間に中心体で規制されている我々の最近の観測を、検証しました。
Introduction
中心体は、中心体周辺物質（PCM）に囲まれた中心小体のペアで構成されています。哺乳動物細胞における主要な微小管組織化センター（MTOCs）なので、中心体は、分裂細胞における紡錘体の二つの極として機能するため、ゲノムの完全性1を維持するのを助ける。 （G0期の間、例えば 、）静止細胞では、中心体、すなわち母中心小体の二中心小体の一つは、一次繊毛、細胞表面2から突出する感覚細胞小器官を組み立てるために、基礎体に変換される。再入力する細胞周期細胞と、一次繊毛は分解され、各中心小体が徐々に成熟中心小体3を形成するために伸長するその近位端でprocentrioleの組み立てを指示する。 S期の開始時に、中心小体に9回対称性を提供する車輪のような構造は、既存の各中心小体の表面上に形成され、各procentrioleのベースとなる。 SAS6トン中心小体アセンブリは車輪4-6のハブを形成するために動員されるために帽子は不可欠である。その他centriolarタンパク質はその後、遠位方法7に高度に規制、近位側転上に組み立てられている。正確に中心小体の複製を完了した後、細胞がG2期8月末までに二つの機能の中心体を構築するために追加の中心体周辺材料を組み立てる。コアcentriolarコンポーネント9-11、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、足場成分は、膜結合タンパク質および分解機構を含むいくつかの他のタンパク質に加えて、細胞周期12-16の異なる時点で中心小体、基礎体とPCMと関連している。それは、多くの場合、多くのタンパク質の中心体のレベルが時間的に中心体標的化メカニズムおよび/または中心体におけるプロテアソーム分解によって調節されることに留意されたい。重要なことは、そのようなPLK4、MPS1、SAS6、およびCP110 A等のいくつかのタンパク質の中心体のレベルの変動細胞周期tの異なる点は、中心小体アセンブリ5,17-22を調節することが重要であると思われるが、この中心体の劣化を防止MPS1の場合には過剰な中心体19の形成につながる。一方で、いくつかのタンパク質の中心体画分は、細胞質のプールに比べて少なく不安定である。例えば、siRNA媒介ダウンレギュレーションセントリン2（Cetn2）のは、その全細胞レベル23で大幅な削減にもかかわらず、中心小体におけるタンパク質レベルの中程度の減少につながった。むしろ、それらの中心体の固有の機能を評価する際に、全細胞タンパク質レベルを測定するよりも、中心体における中心体タンパク質のレベルの変化を測定することが重要である。
本研究では、中心体でのタンパク質の相対レベルを定量化するために、間接免疫蛍光（IIF）を用いたアッセイを開発した。このアッセイは、特に、異なる試料に由来する細胞を分析するために開発されているしたがって、同時に撮像することができない。これらのサンプルは、異なる時点で採取異なる試薬（ すなわち 、薬物対コントロール）で処理した細胞であってもよい（ すなわち 、追跡対パルス）、または細胞周期の異なる段階にある。このアッセイの原理は、背景が小さな領域でタンパク質に対応する蛍光強度を補正し、そのレベルが選ばれた実験条件下で変化しない別のタンパク質に同じに対してその値を正規化するために測定することにある。中心体の生物学におけるいくつかの研究は、最近の候補タンパク質24-27の中心体の固有の機能を決定するために、両方の生細胞または固定細胞内の様々な定量的な顕微鏡技術を利用している。これらのアッセイと同様に、本技術は、試験タンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を測定する。しかし、このアッセイにおいて内部標準を使用して正規化を含めることは、おそらく大きな提供するであろう二つの異なるカバーガラス上で2つの異なるサンプルを分析の精度と信頼。また、中心体におけるタンパク質レベルを調べることに加えて、微調整して、この方法は、実験条件の多様なセットに、または他の細胞の部位に適用することができる。
ここでは、異なる細胞周期段階の細胞を比較するためのBrdUパルスチェイス戦略我々の定量的顕微鏡アッセイを組み合わせる。代わりに、様々な細胞周期の時間点を研究するために非同期的に増殖している細胞を、標準的な細胞周期停止および放出技術を使用してのS期における細胞を標識するためにBrdUでインキュベートし、標識された細胞は、種々の時間（通常は4-6時間）のために追われている。標識された細胞のほとんどは、直ちにパルスの後にS期になります。チェイスした後、標識された細胞は、のnucに対する中心体の形態学的特徴などAS-位置によって確認することができる後期S、G2または有糸分裂になるように、チェースの長さが選択されるレイ、中心体の間の距離は、 その他の染色体の凝縮したがって、チェイスの長さはS、G2、および特定の細胞型のM相の平均持続時間に依存する。このアプローチは等ヒドロキシ、アフィジコリン、ノコダゾール、細胞周期阻害剤を回避するので、より生理学的に関連する細胞周期分析を可能にする。
従って、我々は、単独で、定量的蛍光顕微鏡アッセイ、またはBrdUのパルスチェイスアッセイと組み合わせて、正確に非摂動細胞周期の間に候補タンパク質の中心体のレベルの相対的変化を測定するためのシンプルかつ強力な技術であることをここで実証する。我々は、これらのアッセイを用いて、VDAC3の中心体レベル、我々は最近、ミトコンドリア16,28に加えて、中心体で同定されたタンパク質を測定した。結果はVDAC3の中心体のプールが劣化することによって調節されることを我々の以前の観察を確認し、ここで得られ、また、細胞周期dependenで変化トンの方法16は 、さらに、この方法の適用性を検証する。
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Protocol
1.細胞培養
- 逆転写酵素（hTERT）ヒトテロメラーゼを使用して網膜色素上皮細胞の不死化酵素（hTERT-RPE1は、RPE1としてここで呼ばれる）。
NOTE：RPE1細胞は一般に中心小体アセンブリと繊毛形成を研究するために使用される近二倍体、非形質転換ヒト細胞である。これらの細胞は、細胞周期調節と調整通常の中心小体複製サイクルに従ってください。 - 継代1においてRPE1細胞のほぼコンフルエント100ミリメートル細胞培養皿：10 mlを含む新鮮100mm皿に元の培養の5希釈DME / F-12（1：1）培地、10％ウシ胎児血清を補充した（FBS）、100 U / mlペニシリンGおよび100μg/ mlストレプトマイシン（完全培地をDME / F-12培地と呼ばれる）。 5％CO 2存在下、37℃で細胞を増殖させる。
- 水浴またはインキュベーター中で60℃で、振盪せずに覆われたガラスビーカー、O / Nでの1N HCl 50mlに12ミリメートルラウンドガラスカバースリップをインキュベートする。
- AF酸性溶液を廃棄terを、時々振とうしながら15分間インキュベートすることにより、蒸留水100mlに、カバースリップを3回洗浄する。 70％エタノールおよび95％エタノールで同様に洗浄を繰り返す。
- 個別に60分間紫外線照射による滅菌が続くバイオセーフティキャビネット内の実験室ブロッティングペーパー、上に広げることにより、カバースリップを乾かします。
- 35ミリメートルの細胞培養皿に2-4ドライカバースリップを置きます。細胞培養物をPBS中の25μg/ mlの濃度になるように操作された重合体（1 mg / mlのストック濃度）などのフィブロネクチンまたはフィブロネクチンの溶液を希釈する。
- 各カバースリップ上に希釈溶液の80〜100μLを置き、コーティングするために60分間カバースリップの上側をインキュベートする。完全培地を追加する前にPBSを用いて三度カバースリップを洗ってください。
2.成長する細胞とプロテアソーム阻害剤で処理する細胞
- 通路2×10 5非同期的に成長するカバースリップを含む各35mm皿にRPE1細胞るし、2mlの完全培地中で細胞を増殖させる。新鮮予め温めておいた完全培地で培養液を24時間毎に交換してください。
- 試験タンパク質が中心体のレベルでプロテアソーム阻害の効果を分析するために（ここでVDAC3またはγチューブリン）は、44時間、2つの35mm皿で細胞を増殖させる。完全培地で培養液を交換し、それぞれ5μm以上0.05％の最終濃度で制御溶媒としてMG115またはDMSOのいずれかを追加します。同時に、40μMの最終濃度で細胞にBrdUを追加し、4時間細胞をインキュベートする。
- 24ウェルプレートの各カバースリップを転送します。各ウェルに500μlの冷メタノールを加え、10分カバースリップ上で細胞を固定するために、-20℃でプレートをインキュベートする。すぐに500μlの洗浄緩衝液（0.5mMのMgCl 2および0.05％のTriton-X 100を含む1×PBS）を用いてカバースリップを3回洗浄する。
- 残留を収穫35mm皿と遠心分離機で5分間千xgで細胞から。ウェスタンブロッティング（ステップ6）、総タンパク質を分析するために細胞ペレットを使用する。
3. BrdUのパルスチェイスアッセイは、異なる細胞周期中のタンパク質レベルを分析するには
- 44時間カバーガラスを含む二つの35mm皿で細胞を増殖、細胞周期の異なる段階において中心体にタンパク質（ここでVDAC3、SAS6またはCep135）のレベルの変化を分析する。 40μMのBrdUを含む完全培地で培養液を交換し、細胞培養インキュベーター中で4時間細胞をインキュベート。
- 1皿から、ステップ2.1.2で説明したように冷メタノールを用いて細胞を固定し、24ウェルプレートにカバースリップを転送する。
- 4時間のBrdUのパルスの後、BrdUを含む培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄し、完全培地で1回、さまざまな時間（通常は別の4時間のBrdUの不在で細胞を新鮮な培地を追加し、成長するRPE1細胞）ステップ2.1.2で説明したように細胞を固定する前に。
注：RPE1細胞では、BrdU陽性細胞の大部分は、4時間のチェイスの後に遅れてSまたはG2期にある。これは、各細胞型のために独立して決定されなければならない。
4.免疫染色
- 30分間（1×PBS中の2％BSA、0.1％トリトンX-100）をブロッキング緩衝液200μl中のカバースリップ上に固定された細胞をインキュベートする。
- 加湿チャンバー内で4℃でバッファー·O / Nをブロックで希釈した一次抗体（ウサギやマウスで育ち別で育った、通常1）の組み合わせで細胞をインキュベートします。
- 加湿チャンバーを作るために、空の千μlのピペットチップボックスの下半分に湿ったペーパータオルを置く。ラック表面にパラフィルムのストリップを置き、インキュベートされる各カバースリップのためにパラフィルム上に抗体溶液の液滴（15〜20μl）を見つける。抗体溶液の液滴の上にカバースリップを反転（セルが浸漬されるように）とclose先端ボックスの蓋。
- 再びカバースリップを反転し、24ウェル皿に戻ってそれらを返す。カバースリップを洗浄した後、室温で1時間（緑色蛍光色素結合抗ウサギおよび赤色蛍光色素結合抗マウスブロッキング緩衝液で希釈したここに）150μlの二次抗体の混合物でそれらをインキュベートする。カバーガラスを3回洗浄します。
注：フォア結合二次抗体は、光に敏感である。ステップの間に光からサンプルを保護する4.1.3-5.1.2。
- ステップ2.1.2で説明したように、10分間-20℃で500μlの冷メタノールで再染色RPE1細胞を固定することにより抗BrdU染色のために準備します。三度カバースリップを洗ってください。
注：この固定は、次の工程において酸加水分解プロセスの間に、目的のタンパク質の一次および二次抗体標識を固定する。- 室温で30分間2 N HClを200μlの細胞をインキュベートする。 1MトリスClを300μlの、pHが8で中和洗浄緩衝液を用いて細胞を3回洗浄しdは。
- 再び室温で30分間ブロッキング緩衝液を200μl用いて細胞をブロックする。
- 加湿チャンバー中、37℃で45分間（ブロッキング緩衝液で希釈）、ラット抗BrdU抗体で細胞をインキュベートする。バック24ウェルディッシュにカバースリップを返し、それらを洗浄した後、室温で1時間24ウェルディッシュにブロッキング緩衝液150μlの希釈された青の蛍光色素結合抗ラット二次抗体（でインキュベートする。
- カバーガラスを3回洗浄します。ガラス顕微鏡スライド上に退色防止試薬を含むマウントソリューションの滴（約3-6μl）をスポット。取り付け溶液上に、細胞側を下にして、カバースリップを反転。優しくソフトなクリーニングティッシュを使用して、スライドに対してカバースリップを押すことにより、余分な液体を拭き取ります。顕微鏡スライド上にそれを密封するためにカバースリップのエッジに沿って透明なマニキュアを適用します。
5.免疫蛍光画像Acquisitionと分析
- 周囲温度で、BrdU陽性RPE1細胞の画像を取得する（1.4の開口数を有する）100Xプランアポ油浸対物レンズを使用する。
- デジタルイメージング可能なカメラを取り付けた顕微鏡（機器を参照）にスライドを置く。各蛍光団のために、手動での実験のすべてのサンプルを検査することによって（通常は300〜1,000ミリ秒の間）、適切な露光時間を決定する。細胞の画像を取得する前に、手動でZ軸（通常は0.2μmのステップサイズ）に沿って適切な上部と下部の焦点面を決定する。デジタル顕微鏡イメージング·ソフトウェア·パッケージを使用して、Z軸に沿った異なるフルオロフォアに対して同一の露光時間を用いて、別個のカバースリップ上にある異なる試料の画像を取得する。
- Z軸に沿って取得したすべての画像スタックの（無傍アルゴリズムを使用していないこれらの場合）デコンボリューションを行う。
- に沿った各画像スタックの全強度投影を取得するZ軸。
- 中心体は、（2中心体の間の距離が2μm未満である）近くにある細胞では、両方の中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。
- 最初の広場を囲む大きな平方（片側通常は24〜35ピクセル）を描き、大きな正方形の選択した領域をマーク。
- 領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を得る（Sは小箱を表し、Lは、大きなボックスである）。
- 背景ハウエルらによって記載の式を用いて、各フルオロフォアの蛍光強度を補正し、分析29：F = F S - [（F L - F S）はS /（ - S L）×]。
- そのflのバックグラウンド補正された蛍光強度の比を計算することにより、目的のタンパク質（ここでVDAC3またはSAS6）の正規化された蛍光強度を得る（ここでγチューブリン、SAS6またはCep135）選択した内部標準用に使用される蛍光団のものとuorophore。
- 中心体が十分に分離された細胞を分析する場合には（二中心体の間の距離が2μm以上である）、箱の二つの別々のセットを描くことによって個別に中心体を分析する。各中心体の周りに小さな正方形（辺あたり通常は15〜25ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。最初の広場を囲む大きな平方（辺あたり20〜30ピクセル）を描画し、選択した領域をマーク。
- 領域（A）と、各ボックスの各蛍光体の総蛍光強度（F）を取得し、ステップ5.3.3で説明したように、それぞれの中心体に別々に、各蛍光体のバックグラウンド補正された蛍光強度を算出する。
- そのセル内のそのタンパク質の合計中心体のレベルを得るために、2つの中心体からそれぞれのタンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を組み合わせる。
- 入手する内部標準の合計中心体の強度、その合計中心体の強度の比を計算することにより、目的のタンパク質のための正規化強度。
- 各実験条件のために、少なくとも15〜25の細胞を分析し、スプレッドシートのグラフをプロットします。
6.ウェスタンブロッティングを使用して総タンパク質の分析
- 50mMトリス - 塩酸pHが8、150mMのNaCl、1％ノニデットP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む（RIPA）緩衝放射免疫沈降アッセイで細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする細胞を溶解する。
- 遠心分離機で10分間、10,000×gで混合、ペレット画分から溶解物を分離し、ビシンコニン酸（BCA）アッセイキットを使用して、各溶解物の総タンパク質濃度を測定する。
- 4×SDS-PAGEローディング緩衝液（50mMのトリス-Cl、pHは6.8、2％SDS、10％グリセロール、100mMのジチオスレイトール、0.1％ブロムで溶解物40μgのを混ぜるophenol青）。
- 10分間サンプルを沸騰し、200Vの定電圧でSDS-PAGEを変性12.5％でサンプルを実行する
- （低温で1時間、90 Vの定電圧で）ウェスタンブロッティング技術を使用してニトロセルロース膜にSDS-PAGE上で分離したタンパク質を移す。
- 1×PBS中3％脱脂乳で膜をブロックし、次いで1のため（この場合はウサギ抗VDAC3、ウサギ抗γチューブリンおよびマウス抗αチューブリン）に希釈した一次抗体の溶液で膜をインキュベートするRTで時間。
- PBS-T緩衝液（1×PBSおよび0.2％のTween-20）を用いて膜を3回（振盪下で各5分間のインキュベーション）を洗浄した後、近赤外（IR）の混合物で膜をインキュベートする蛍光色素結合抗ウサギおよび1時間（PBS-Tで希釈した）IR蛍光色素結合抗マウス二次抗体。
- 膜を3回洗浄した後、赤外線を使用してfのバンドを分析するために、膜をスキャンイムノブロット検出に適しluorescence撮像システム。
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Representative Results
我々の最近の研究ではVDAC3、ミトコンドリアのポリン16,28の1の新規中心体の局在と機能を同定した。 VDAC3特異的抗体を用いたRPE1細胞を含むいくつかの哺乳動物細胞の免疫染色は顕著な中心体染色および比較的弱いミトコンドリアの染色を示した。また、中心体VDAC3が優先母中心小体、および内因性の両方の中心体のプールに関連し、異所性にVDAC3が劣化16によって調節されて発現されることが示された。定量IIFアッセイを確認するために、我々は、S期にある細胞における中心体関連VDAC3プール内の変化を調べた。
ここでは、非同期的に成長RPE1細胞はプロテアソーム阻害剤MG115または4時間制御の溶媒DMSOのいずれかで処理した。 S相と中心体アセンブリを受けている細胞への我々の分析を制限するために、我々は唯一のBrdUデュを組み込まれた細胞を調べた同じ4時間を鳴らすと、（お互いの2ミクロン内間隔）2近接した中心体を持っていた。私たちは、MG115の簡単な治療はBrdUの取り込み治療を制御するために比較した（約58％）に影響しなかったと結論することの両方を制御し、MG115処理（ 図1A）からのBrdUのために染色された細胞および核の複数のランダムフィールドを検査し（およそ56％） RPE1細胞における。私たちは（お互いの2程度の範囲内に離間2γチューブリン病巣の存在によって判断されるように）、S期にあった細胞のみを比較したように、我々は正規化のための潜在的な内部標準としてγチューブリンを検討した。 BrdU陽性細胞における中心体γチューブリンレベルはプロテアソーム阻害すると変わる場合にはこのように、我々は最初に検討した。驚くことではないが、そこに一つの細胞から別のγチューブリン蛍光強度のかなりの細胞から細胞への変化があって、私たちはこの変化が利用可能な最善の全体として設定されたデータを提示する箱ひげ図の中で提示されたことがわかった。私n個の箱ひげ図は、箱が下限と上限四分位を表し、ボックス内のマーカーは、各シリーズの中央値を示し、ウィスカーは（常にではないが）多くの場合、異常値である最小値と最大値を表す。 図1Dに見られるように、中心体γチューブリンレベルは、このように、この実験のための内部標準としてγチューブリンを検証し、MG115またはDMSOのいずれかで処理したBrdU陽性細胞の間に有意差はなかった。チューブリンをγとは対照的に、中心体VDAC3に対応するバックグラウンド補正された蛍光強度は、対照細胞（ 図1C）よりMG115処理細胞において高い2.5倍おおよそた。我々はγチューブリンのそれに対する全VDAC3蛍光を規格化したときに、倍の増加がおよそ2倍にします（ 図1E）にわずかに低下した。倍の変化は、正規化せずに大きかったが、我々は我々がBett製を感じる正規化されたデータの精度に自信を持っている小胞体MG115処理の任意の一般的な効果のための対照、ならびにによるサンプル処理のばらつき。非中心体の部位（ 図1B）またはVDAC3（ 図1F）の合計細胞レベルでVDAC3染色は、プロテアソーム阻害により影響を受けなかった。従って、我々は定量的にVDAC3の中心体のプールはプロテアソームを介した分解によって調節されている私たちの以前の観察を確認する。
細胞周期の間に中心体VDAC3の変化を測定するために、我々は、標識された細胞の4時間の追跡に続く4時間のBrdUのパルスを用いて細胞を標識している。唯一のS期細胞は（2の中心体間の平均距離は1.35±0.16程度である）パルス中のBrdUを組み込むますので、BrdU陽性RPE1細胞の大部分は、4時間のチェイスは、後期S期または早期G2期のいずれかになります後に（ 2の中心体間の平均距離はセントロ遅くG2期でのマイナー人口は、1.55±0.22μm）であるいくつかのペアはかなり30（>2μmの2の中心体間の平均距離）を分離している。 γチューブリン、主要なPCM成分が大きくG2期31,32で行われ、この増加が他の中心体タンパク質の細胞周期の変化を評価するための貧しい内部標準となる中心体の成熟中に中心体に蓄積されて。一方、SAS6は側転4,5,7のアセンブリを刺激するために初期のS期の間にprocentriolesに動員され、それは（ 図2に分解し始めたときに、細胞が有糸分裂に入るまで、新たに形成された中心小体のベースのままでおよび参照5）。細胞がG2期5にS相から進行するにつれてしかし、HeLa細胞またはU2OS細胞では、SAS6のcentriolarレベルが徐々に増加する。したがって、我々はまずCep135、中心小体の近位端を通してに局在する別のコアcentriolarタンパク質のものに対して中心体SAS6レベルを測定細胞周期33。私たちは、 図3A-D（中心体が近接して配置されている場合、パルスまたはチェイスからBrdU陽性RPE1細胞におけるCep135またはSAS6のバックグラウンド補正総蛍光強度の有意差は見られなかった; '近い'細胞どこ2間の平均距離中心体）2μm未満である。したがって、正規化されたSAS6レベルは、これらの細胞（ 図3E）に類似したままであった。しかし、我々はSAS6の全体的な蛍光強度値の適度な増加と（; '遠い」細胞2の中心体>2μmの間の距離）中心体が十分に分離された細胞でのCep135ための同じのわずかな増加を観察した。したがって、2つのよく分離中心体をもつ細胞における正規総中心体SAS6レベルは少しでしたが、狭い間隔中心体を持つ細胞に比べて統計学的に有意に高い。これは、SAS6レベルのウィットの固有の規制に起因する可能性が高い時間の細胞周期の進行5。しかし、わずかな増加は（これ以下で統計的有意性の）狭い間隔の中心体を有する細胞に同時に2つの中心体を分析に比較して、別々に分析された2つの中心体の蛍光強度を追加することに起因することも可能である。 VDAC3の蛍光強度は、単独SAS6のように正規化したときにそれにもかかわらず、互いに間隔が接近した二つの中心体でVDAC3レベルが初期のS期と比較して、後期S- /早期G2期にある細胞ではおよそ1.5倍に増加した細胞（ 図4A-C、F; '近い'細胞）。これらの細胞は、後期G2期へと進行する場合、2つの中心体における規格VDAC3レベルは、後期S期（ 図4C、F）のものと比較して2.4倍減少した。
SAS6レベルが遅れてS期からG2にわずかに増加するので、内部標準としてSAS6を使用すると、12月のわずかな過大評価につながる後期のG2期の細胞におけるVDAC3レベルのrease（中心体が2μm以下で区切られます）。我々のデータはCep135は、細胞周期の変動を評価するための内部標準として、より良い選択であることを示唆している間、私たちに利用できるVDAC3とCep135抗体は両方のウサギからのものであるので、我々はVDAC3のためにそれを使用することはできません。しかし、Cep135正規化SAS6の中央値によってSAS6正規化VDAC3（F VDAC3 / F SAS6）のための中央値を掛けると、（F VDAC3 / F SAS6）×（F SAS6 / [私たちにCep135正規化VDAC3の概算値を与えるF Cep135）= F VDAC3 / F Cep135]。私たちはこの分析を実施した場合、後半のS /早期G2と後期G2間VDAC3レベルの変化が2倍に、わずかに低下します。凝縮した染色体および弱いSAS6染色により判断されるように、有糸分裂のどの段階にあるのBrdU陽性細胞はSAS6レベルの劇的な低下に起因し、この分析から除外されている。しかし、我々は、中心体VDAC3レベルの再ことに注意有糸分裂の間に低mained（データは示さず）。 Cep135レベルは、有糸分裂の間に落下しないので（データは示していない）は、原則的に、有糸分裂にCep135正規VDAC3レベルを推定するための再正規化手順を繰り返すことができる。しかし、実際には、有糸分裂における中心体SAS6レベルはそもそもSAS6正規VDAC3レベルの正確な決定を可能にするにはばらつきがあった。いずれにしても、全体的な、我々のデータは、VDAC3の中心体プールは、細胞周期の間に中心体で調節されていることを確認した。
非同期成長RPE1細胞を4時間BrdUおよびMG115（MG）またはDMSO（DM）とインキュベートした図1（A）に示さDMSOまたはMG115のランダムフィールドは、抗BrdU抗体で染色した細胞（赤）およびヘキストの（処理されるDNA;青）。ここでは、他のすべての画像にバーが5ミクロンを表す。（BE）DMSOまたはMG115は、細胞がVDAC3、γチューブリンとBrdUに対する抗体で染色した処理した。 BrdU陽性細胞は、同一の撮像条件（;グリーン蛍光団/ VDAC3ための500ミリ秒、青フォア/ BrdUのための400ミリ秒times-露出赤フォア/γチューブリンのために300ミリ秒）の下で画像化し、そして背景がVDAC3の蛍光強度を補正し、 γチューブリンを測定した。 VDAC3を示す代表的な画像（VD3、緑）、γチューブリン（γ-浴槽、赤色）およびBrdU（青）（B）に示されている。四角で示されるように、ここでは、他のすべての画像では、インセットは、デジタル拡大中心体を示している。バックグラウンド補正された蛍光強度（F;任意の単位）二十五細胞からVDAC3およびγチューブリンに対応するそれぞれ箱ひげ（C）において図及び（D）にプロットされている。ここでは、他のすべてのケースでは、ボックスは、MAを下と上四分位を表す（ - ）ボックス内rkerは、各シリーズの中央値を表し、ウィスカーは、最小値と最大値を表す。それら二十から五細胞からVDAC3の正規化された蛍光強度値（E）にプロットされている。 （CE）は、p値は対応のないT検定に由来する。 *** P 0.05 <10 -5、およびNSは、pを示している>を示している。 （F）αチューブリン（α-浴槽は）コントロールをロードしているVDAC3（VDAC3aとVDAC3b 16の両方）とγチューブリン（γ-タブ）の全細胞レベルを示すイムノブロット。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。
図2.非同期4時間のBrで標識したRPE1細胞を増殖させる（γ-浴槽;赤色）のdUパルスおよびBrdUの非存在下でさらに4時間追跡したが、SAS6（緑）、γチューブリンに対する抗体で染色した。代表的な画像は、近接する2本で（（A）、S期の間SAS6染色を示すSAS6病巣）、（B）、中期（極で2弱いSAS6病巣）と（C）終期（SAS6病巣がポールから失われている）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.非同期成長RPE1細胞は、4時間のBrdUのパルスで標識し、BrdUの非存在下での別の4時間に追われた。Cep135とSAS6について染色BrdU陽性細胞は、同一の撮像条件の下で画像化した（400ミリ秒times-暴露青フォア/ BrdUのための。グリーンフォア/ Cep135ための400ミリ秒。赤色のフルオロフォア/ SAS6）、及びSAS6とCep135のバックグラウンド補正された蛍光強度は500ミリ秒を決定した。 2中心体の間の距離は、全ての細胞において測定した。 2中心体の間の距離が2μm未満であるセルは、「近い」と考えられていたと値が2μmのが「遠く」に分類されたよりも多くのです。 （AB）Cep135（C135、緑）を示す代表的な画像は、SAS6（赤）およびBrdU（青）が示されている。 （B）において、C1及びC2は、代表的な「離れた」セルの2つの中心体である。 （CD）、バックグラウンド補正された蛍光強度（F;任意の単位）の各カテゴリの15細胞からSAS6（C）及びCep135（D）に対応する箱ひげ図にプロットされている。 （E）あちこちSAS6の正規化強度mは、これらの細胞は、箱ひげ図にプロットされている。 （CE）は、p値は対応のないT検定に由来する。 * 0.001 <P <0.05を示し、NSは、p> 0.05を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
グリーンフォア/ SAS6ための500ミリ秒、VDAC3とSAS6について染色上記のBrdUパルスチェイスアッセイからの図4. BrdU陽性細胞（図3）は、同一の撮像条件（青蛍光団/ BrdUのための400ミリ秒times-暴露下に画像化した。千赤色フルオロフォア/ VDAC3用ミリ秒）、及びSAS6とVDAC3のバックグラウンド補正された蛍光強度は、2つの中心体との間の距離は、全ての細胞中で測定し、細胞を'cと分類された。測定されたBrdUのパルス（A）に近い「セル」の代表的な画像（AC）。図3のように、 '<（2ミクロン2中心体の間の距離）（二中心体と2μmの間の距離）'遠い> 'を失い、内VDAC3について染色BrdUの追跡（C）におけるBrdU追跡（B）、および「遠い」セル（VD3;緑色）、SAS6（赤色）およびBrdU（青色）が示されている。 （C）において、C1及びC2は、2つの中心体である。 [DE]バックグラウンド補正された蛍光強度（F;任意の単位）の各カテゴリの15細胞からVDAC3（D）及びSAS6（E）に対応する箱ひげ図にプロットされている。これらの細胞からVDAC3の（F）正規化強度は箱ひげ図にプロットされている。 （DF）は、p値は対応のないT検定に由来する。 ***はp <10 -5、**を示す10 -5 <P <0.001を示し、NSは、p> 0.05を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
細胞生物学における定量的な顕微鏡は、一般的に固定するための別の定量的顕微鏡アッセイを開発細胞生物の成長の例がある。しかし、 等 、（FRAP）光退色後にそのような蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、蛍光の回復などの生細胞イメージングアッセイに関連している近年の細胞27,34-36。重要なことは、中心体生物学を理解する上での進歩は、多くの場合、中心体のプールは異なる他のプールよりも調整することができるタンパク質の中心体固有の機能を理解する必要があります。従って、我々は、具体的に2つの異なって処理されたサンプル中のタンパク質の相対的な中心体のレベルを分析するための定量的なIIFアッセイを開発した。これは、細胞を別々のカバースリップ上に固定され、処理されている必要があるため、私たちはそのため2 experimeを取り扱う必要性に起因する可能性アーティファクトのためのよりよい制御に、正規化の目的のための内部標準を導入しましたNTALセルを個別に集団、およびアッセイの精度を高める。試験タンパク質の相対的な蛍光強度を測定するために、内部標準を使用して、いくつかの以前の研究37にのみ存在する。
内部標準を選択すると、私たちのアッセイの正確さのために重要であるが、それは間違いなく最も困難な側面です。 2成熟した中心体は紡錘体の極になることができるように理想的には、S期の間に中心小体ペア重複、重複中心小体はその後G2の間、γチューブリンを含む追加のPCMコンポーネントを蓄積。したがって、我々は、γチューブリンの中心体のレベルは、S期に厳密にある細胞では顕著に変化しないことを前提としています。これは、S期細胞は、短時間のBrdU標識によりマークされRPE1細胞におけるケースであると思われる。しかし、内部標準の有効性は、各細胞型および実験条件について試験されなければならない。たとえば、中にバックグラウンド·カレCTED VDAC3蛍光は（S相が逮捕）アフィディコリン治療にプロテアソーム阻害に応答して、U2OS細胞を2倍以上に増加、中心体γチューブリンで統計的に小さいが重要な（0.001 <p値<0.05）増加（補足もあった図）。したがって、γチューブリンさえ細胞周期で逮捕されたセルに対して、常に適切な内部統制ではありません。
他のすべてのIIF顕微鏡アッセイと同様に、このアッセイの欠点の一つは、試験タンパク質および内部標準に対する抗体が異なる宿主種に上げなければならないことである。我々のデータはCep135がSAS6よりも優れた内部標準であることを示唆しているが、我々は両方のウサギで提起されたこれらのタンパク質に対する利用可能な抗体としてCep135に対してVDAC3のレベルを正常化できませんでした。後期S期とG2の間VDAC3レベルの減少の過大評価を引き起こしSAS6に対するそこで、代わりに標準化した。 INTE状況で外部標準は1つが、その変動を考慮して、別の正規化因子を導入することができ、緩やかに変化します。例えば、SAS6のばらつきを補正するために、我々はCep135正規化SAS6強度によってSAS6正規VDAC3強度を掛けた。
適切な内部標準を選択することが困難な場合では、蛍光染料、コーティングされたミクロスフェア（0.02~0.04ミクロン直径）は別の戦略を提供してもよい。目的の細胞と同じフィールドに存在する蛍光ミクロスフェアの信号は、目的のタンパク質に対応する蛍光シグナルを正規化するために使用することができる。試験および対照細胞が一緒に画像化される一方、1は正規化のためのこのような内部標準を必要としない場合があります。私たち以前に20 DEGRを19のを防ぐまたは促進どちらサイクリン19またはアンチザイム20、のいずれかを過剰発現する細胞にMPS1の中心体のレベルを比較するために、このアッセイのバージョンを使用していた同時に画像化され、隣接する非トランスフェクト細胞のものとそれぞれ中心体でMPS1のadation、、。
プロテアソーム阻害時に中心体VDAC3の効果を調べるために、我々は、S期にある細胞を同定し、比較するためにBrdU標識を使用する。 MG115処理は、細胞周期の進行を阻害することができるが、この阻害は、本研究で使用したものよりも有意に高い濃度38を必要とする。ここで使用される濃度でMG115は、細胞周期チェックポイントとトランジションをブロックすることができるが、細胞周期の進行をブロックしない。我々はMG115をDMSOに比べてBrdU陽性細胞の割合を変化させなかったことを示すことにより、ここで行ったようにしかし、それは、それぞれの細胞型のために検証する必要があります。しかし、アフィジコリンまたはヒドロキシウレア（HU）を用いて、または「オフを振る」とリリースまたは二重チミジンブロックと放出が同等Populaのを生成する代替的なアプローチとして使用することができる有糸を用いて細胞を同期S期における細胞を制止S期にある細胞のン。
細胞周期の時間点を研究するためのBrdUパルスチェイス戦略は非摂動細胞周期を必要とする多くの機能的アッセイにおいて非常に有用であろう。これは、様々な細胞周期阻害剤を使用して、細胞周期停止技術を置き換えることができるかもしれない生物学的に、より重要なアッセイである。これらの阻害剤の使用は、しばしば、細胞周期表現型における異常な変化をもたらす細胞内の生理的ストレスの異なるタイプを引き起こすことがある。パルスチェイスアプローチの使用は、これまでの研究23で示唆したように完全なブロックの原因とは対照的に中心小体アセンブリ39を遅延Cetn2の枯渇を実証することができました。 BrdU陽性細胞の検出は、サンプルの酸加水分解を必要とする。私たちや他の多くの研究者がdifferenための染色強度のわずかな損失で、酸加水分解に先立って試験タンパク質、のプライマリおよびセカンダリ染色後の細胞を、修正、再技法を使用している中心体タンパク質40トン。しかし、潜在的な代替は、5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EDUの）、DNA を複製41に効率的に取り込まれたBrdUに類似している別のチミジン類似体を使用することができる。 EDUのは、クリック化学」を使用しての可視化は、「酸加水分解42を必要とし、いくつかの抗体のためかもしれないので、より適していません。
さらに、このアッセイは、容易に中心体における特定のタンパク質の翻訳後修飾の変化を測定するために使用することができる。例えば、リン酸化の中心体のレベルは、リン酸化部位特異的抗体が存在することを条件とする、タンパク質自体の全レベルに対して正規化することができる。このアッセイは、直ちに実験条件または細胞周期相間のリン酸化の相対レベルを評価することに適用することができるが、潜在的リン酸化の総レベルを評価することに適合させることができるかの重要なパラメータの抗体のアフィンITIESが知られているかを決定することができる。関心領域が大きすぎてはならないが、このアッセイはまた、細胞内の他の部位でのタンパク質の研究のために適用可能であるべきである。アッセイは、複数の細胞の部位に局在するタンパク質の位置特異的調節を測定するために特に有用であろう。
測定43の精度を最大化するために考慮に注意しなければならないなど 、差動光退色、デジタルイメージングの効果、フルオロフォアの蛍光強度の直線性、背景雑音のような技術的パラメータの握りがある。例えば、当業者は、退色の寄与を評価するために、各二次抗体に関連付けられた蛍光色素を切り替えることができる。他の多くのパラメータが1つのウェルが同一の撮像条件（露光時間、ゲイン、ステップサイズ、Z-スタックの数など ）と、各撮像実行中の同一のイメージングソフトウェアを使用している場合に制御することができる。私たちは使用しましたが画像復元を実行するために本発明者らのアッセイを通して無傍アルゴリズム、このアッセイは、このような制約の反復のような他のデコンボリューションアルゴリズムと組み合わせることができる。また、最も一般的に利用可能な画像解析ソフトウェアは、蛍光強度と距離の分析のためのツールを持っているように、異なるイメージングソフトウェアパッケージの任意の数にこのアッセイを適合させることが容易であるべきであることに注意。
このアッセイは、任意の細胞型に適用可能であるべきである、とここでは、細胞の私達の選択は純粋に中心体生物学研究における彼らの妥当性、及び中心体VDAC3機能16,28の私達の前の検査での使用に基づいています。しかし、S期、G2または有糸分裂中の細胞を同定するためのパルス追跡のための内部標準と適切な時間の妥当性は、各細胞タイプについて決定しなければならない。全体的に、BrdUのパルスチェイスアッセイと組み合わせた新開発の定量的な蛍光技術は、いくつかの複雑なを解決するために非常に有用な方法となります中心体生物学及び細胞生物学の多くのより広い態様において、メカニズム。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10,000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
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