Abstract
Атомно-силовая спектроскопия является идеальным инструментом для изучения молекул на поверхностях и границах. Экспериментальный протокол для соединения большой выбор одиночных молекул ковалентно на иглой АСМ представлена. В то же время наконечник АСМ пассивируются для предотвращения неспецифических взаимодействий между зондом и подложкой, которая является необходимым условием для изучения одиночных молекул, прикрепленного к кончику АФМ. Анализы для определения силу адгезии, длина адгезию, и свободной энергии этих молекул на поверхности твердых тел и био-интерфейсов в ближайшее время представлены и внешние ссылки для дальнейшего чтения предусмотрены. Пример молекулы поли (аминокислоты) polytyrosine, привитой полимер PI-г -PS и фосфолипид POPE (1-пальмитоил-2-oleoyl- SN глицеро-3-фосфоэтаноламин). Эти молекулы десорбируются с различных поверхностей, таких как CH 3 -SAMs, водорода прекращается алмаза и поддерживается бислоев при различных условиях растворителя. И, наконец,Преимущества силовых спектроскопических отдельных экспериментов молекулы рассматриваются в том числе средства, чтобы решить, если действительно одна молекула была изучена в эксперименте.
Introduction
За последние 30 лет, атомно-силовая микроскопия (АСМ) оказалась ценным методом визуализации для изучения биологических 1,2 и синтетические 3 материалов и поверхностей, так как он обеспечивает молекулярную пространственное разрешение во всех трех измерениях и может эксплуатироваться в различных растворителя окружающая среда. Кроме того, АСМ-сингл сила молекула спектроскопии (ОВС) позволяет измерять силы, начиная от ПШ Мп режим и дал беспрецедентный понимание например в сворачивания белка 4,5, физике полимеров 6 - 8, и одного взаимодействия молекула-поверхность 9 - 12 .The обоснование изучения отдельными молекулами, а не ансамбля молекул, чтобы избежать среднем эффекты, которые часто маскируют редкие события или скрытые молекулярных состояний. Кроме того, множество молекулярных параметров, таких как длина контура, длина Кун, адгезии свободной энергии и т.д., могут бытьполучены. Это подробно описано в приведенных ниже примерах. В типичном эксперименте АСМ-ОВС, молекула зонда соединен с очень острым концом с помощью линкерной молекулы. Сам наконечник расположен в конце гибкой консоли. Если кончик приводится в контакт с поверхностью молекула зонда будут взаимодействовать с этой поверхностью. Наблюдая за отклонение кантилевера от втягивания зонда, силы, и, следовательно, свободной энергии, чтобы отделить молекулы с поверхности может быть определена. Чтобы получить значимые статистические данные, большое количество так называемых силовых кривых должны быть приобретены. Кроме того, чтобы иметь истинные эксперименты одной молекулы (т.е. с использованием одного и того же молекулы-зонда в течение продолжительности всего эксперимента) молекула зонда должна быть ковалентно соединенный с иглой АСМ. Здесь экспериментальный протокол для консольной функционализации с одной молекулой посредством ковалентной связи представлена. Одна молекула может быть либо в сочетании с помощью амино или тиол группы к кончику АФМ. Процесс сопряжения может быть выполнена в широком разнообразии растворителей (органической и водной) для учета сольватации свойств полимеров, используемых.
В первой части, общий протокол для ковалентного присоединения одной молекулы ("молекулы зонда") с помощью линкерной молекулы наконечником АСМ описан. С этой целью, органические NHS- или малеимид-химии используется 13. Наряду с протоколом в течение трех молекул, например, процессы сбора данных и анализа данных описана и ссылки для дальнейшего чтения предоставляются. Примерные молекулы: (линейный) полимер тирозин, привитой полимер PI-г -PS и липидов Папы Римского. Это включает в себя небольшие изменения протокола, например, ковалентно присоединить цистеина. Кроме того, раздел посвящен подготовке различных поверхностей, таких как поверхности алмаза, СН 3 -самосопряженных монослоя и липидного бислоя. Эти интерфейсы имеют прован быть хорошие ссылки и примеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены для обзора технологического потока, включающего подготовку, шаги сбора данных и анализа данных.
1. Настройка реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все химикаты должны быть обработаны с осторожностью, и, таким образом, лабораторный халат, следует использовать перчатки и защитные очки. Все операции должны быть выполнены в лабораторном шкафу. В частности, специальные перчатками в случае использования хлороформа.
- Используйте химических веществ с низким содержанием воды, такие как сухого хлороформа быстро и магазина сухой, но не дольше, чем на неделю. Хранить как химические вещества, при -20 ° С в атмосфере азота или аргона газа из-за APTES ((3-аминопропил) triethoxysilan) (таблица 1) и ПЭГ (полиэтиленгликоль) гигроскопичны и ПЭГ подлежит окислению на воздухе.
- Чтобы избежать частого воздействия на складе атмосферного кислорода и влаги, подготовить небольшие аликвоты, в идеале в системе перчаточный ящик с atmosphe азотаповторно.
2. Подготовка оборудования
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание возможного перекрестного загрязнения, используйте новые и чистые сосуды для каждого шага.
- Чистый посуда и пинцет в моющем растворе в течение 30 мин в ультразвуковой ванне при 60 ° С.
- Промыть и обработать ультразвуком оборудование, начиная с шага 2.1 в два раза тщательно сверхчистой воды.
- Тепло оборудование с шага 2,1 в растворе RCA (сверхчистой воды, перекиси водорода и аммиака (5: 1: 1)) до 75 ° С в сушильном шкафу в течение 45 мин, а затем промыть их сверхчистой водой.
- И, наконец, сушат в стеклянную посуду и пинцет в потоке сухого азота или в печи (100 ° C, 3 ч).
3. Совет Функционализация
Примечание: С помощью пинцета, сосуды и т.д., изготовленных из нержавеющей стали, PTFE, стекла или любого другого материала, который химически стабильны в органических растворах, если это применимо. Если не указано иное, выполнять все шаги на RТ. Количество инкубационный раствор необходимо, зависит от количества консольных чипов. Убедитесь, что кронштейны погружаются в соответствующих решений на протяжении всего времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте капюшон, чтобы избежать вдыхания органических паров.
- Формирование ОН-групп на поверхности кантилевера ("активации") (примерно 0,5 ч):
- Используйте пинцет, чтобы разместить новые фишки консольные (Материал: грех, пружины: 10-100 PN / нм) на чистую стеклянную пластину и положил их в плазменную камеру (100 Вт).
- Эвакуировать камеру (~ 0,1 мбар).
- Наводнение камера с газообразным кислородом и эвакуировать снова.
- Активировать процесс в плазме (мощности: 20%, продолжительность: 15 мин, давление процесса: 0,25 мбар).
- Амино-силанизация консолей (приблизительно 1 час):
- Подготовьте 2,5 мл раствора APTES (таблица 1) в стеклянной чашке Петри - сделать это в идеале в процессе плазмы.
- Immediatelу после плазменной обработки, окуните каждый консоль в течение 1 секунды в ацетоне и разместить их сразу после в решении APTES.
- Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Тщательно промойте консольные фишки дважды в 10 мл ацетона и один раз в 10 мл хлороформа.
- Дополнительные последний шаг: чипсы Место кантилевера на предыдущем шаге на чистую стеклянную пластину и испечь их в течение 30 мин при 70 ° С. Обратите внимание, что есть и альтернативные стратегии для активации поверхности, например, УФ лечения 12.
- ПЭГилирование (примерно 2 ч):
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.3.1-3.3.4 во время амино-силанизации. NHS и малеимидные группы могут быть гидролиза в водной среде и сам ПЭГ подлежит окислению на воздухе. Поэтому ГРМ (особенно в между стадиями) является критическим параметром. Обратитесь к 13 для получения дополнительной информации.- Подготовка раствора хлороформа (таблица 1).
- Чтобы избежать конденсации, Теплый PEG порошки до комнатной температуры перед открытием аликвоту и весом соответствующую сумму.
- Для соединения полимеров или липидов с аминогруппами, отдельно решить NHS-PEG-NHS (6 кДа) и метил-PEG-NHS (5 кДа) в растворе хлороформа при интенсивном перемешивании, пока они не будут полностью решена. В Таблице 1 для концентраций.
- Кроме того. для сцепления полимеров с тиоловых групп в отдельности решить MAL-PEG NHS- и метил-PEG-NHS в растворе хлороформа.
- Смешайте решения, чтобы отрегулировать определенном соотношении число между NHS- или maleimide- и метильных концевыми молекул ПЭГ (как правило, 1: 500). Следует отметить, что идеальное соотношение должно быть определено итеративно в серии циклов подготовки-эксперимента.
- Инкубируйте консольные фишки в растворе ПЭГ в течение 1 часа в смеси хлороформ насыщенной атмосфере, чтобы предотвратить испарение хлороформа.
- Зонд сопряжение молекулу(> 1 ч):
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем 3.4.1-3.4.3, три примера для ковалентного связывания различных молекул зонда для АСМ зондом описаны. Для каждой молекулы протокол должен быть отрегулирован. Кроме того обратите внимание, что в примере 1, и 3-NHS химии используется, тогда как в примере 2 тиол функционализованный полимер PI-г -PS соединен с ПЭГ с помощью малеимид-химии. Более подробную информацию см 14.- Для поли (аминокислоты) поли-D-тирозина (40-100 кДа)
- Растворите polytyrosine конъюгированный молекулы-зонда в 1 М NaOH. Регулировка концентрации 1 мг / мл.
- Заменить NaOH для натриевоборатной буфера (рН 8,1) с использованием спин обессоливания колонки (7 кДа MWCO) непосредственно перед функционализации
- Промыть консолей сначала 5 мл хлороформа, а затем с 5 мл этанола и, наконец, 5 мл боратного буфера.
- Выдержите кантилевера фишки в течение 1 ч в буферном растворе polytyrosine бората и затем промыть боратного буфераи сверхчистой водой. Храните в сверхчистой водой до измерения.
- Для полимеров с линейной главной цепи (полиизопрен, 119 кДа), имеющих привитые боковыми цепями (полистирол, 88 кДа) 14
- Растворите Пи г -ps в сухом хлороформе. Регулировка концентрации сопряжения раствора до 4 мг / мл.
- Промыть консолей с 5 мл хлороформа и инкубировать в течение по крайней мере 1 часа в растворе сопряжения.
- Промыть раз в 5 мл хлороформа и хранить в хлороформе в хлороформе насыщенного среды (чтобы предотвратить испарение хлороформ) до измерения.
- Для липидного ПАПЫ РИМСКОГО
- Растворите Папа в сухом хлороформе. Регулировка концентрации до 20 мМ.
- Промыть консолей с 5 мл этанола и 5 мл сверхчистой воды до инкубации консолей в течение 1 часа в растворе липидной.
- После инкубации, промыть консолей с 5 мл хлороформа, 5 мл этанол и 5 мл теплой, сверхчистой воды (в этом порядке) для удаления несвязанных молекул зонда и, чтобы избавиться от хлороформа остатков. Использовать немедленно функциональными советы. Кроме того, хранить их в хлороформе до тех пор, пока это необходимо.
- Для поли (аминокислоты) поли-D-тирозина (40-100 кДа)
Рисунок 1. (А) Схематическое изображение процесса функционализации наконечника на примере NHS химии. (B) Химическая связь используется для присоединения молекулы-зонда до кончика через аминогруппу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Подготовка 4. Поверхность
- Самоорганизующихся монослоя (SAM)
Примечание: В поверхности для первого примера, собранного монослой был выбран. Обратитесь к литературе 15 - Чистые предметные стекла с раствором моющего средства, а затем два раза в особо чистой воды в ультразвуковой ванне в течение 30 минут каждый. Тогда, в качестве дополнительного стадии очистки, поместите их в растворе RCA (см шаг 2,3) при 75 ° С в течение 15 мин.
- Пальто слайды с 10 нм никель хрома и 100 нм золота в вакуумного напыления. Затем хранить в холодильнике и чист в растворе RCA непосредственно перед следующей стадии.
- Инкубируйте слайды на предыдущем шаге 2 мм 1-додекантиола / раствора этанола в течение 12 часов. В тиольные группы связываться с поверхностью золота и гидрофобный монослой самоассоциируется. Промыть слайды с этанолом и сверхчистой воды и затем сухим потоком газообразного азота. Подтвердите гидрофобность подготовленную поверхность статических измерений краевого угла в гониометре с ПЗС-камеры 10.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве поверхности для второго примера, водород прекращается алмаз был выбран, Подготовка поверхности проводили, как описано ранее 16.
Примечание: В последнем примере, поверхность поддерживается липидный бислой (SLB) был использован в качестве поверхности. Чтобы получить такую поверхность, раствор (0,1 мг / мл) большие однослойные везикулы (БУВ), состоящий из фосфолипидов РОРС были сформированы методом экструзии. Тогда 50 мкл LUV решения были поставлены на свежесколотой слюды листа (= 1 см²) и инкубировали в течение 30 мин. Наконец раствор промывали 20 мл ультрачистой воды. См 17,18 за подробным описанием подготовки SLBS.
5. Сбор данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов используют АСМ, которая обеспечивает возможность измерения в жидкостях. Процедуры сбора данных и анализа данных применяются независимо от модели АСМ используется. Кроме того, в некоторых экспериментах это выгодно иметь возможность контролировать TEMPERATURе в жидкой клетки. Кантилевера была обнаружена с помощью лазерного луча методом отклонения 19. Жесткости пружины были определены с помощью метода 20 теплового шума.
- Вставьте функционализированного кантилевера в держатель кантилевера АСМ, который пригоден для измерения в жидкостях.
- Положите на поверхность (получение см выше), которые будут отбираться в АСМ и покрыть ее жидкостью. И, консольные и поверхность теперь должен быть погружен в жидкость с кончика кантилевера указывая на поверхности. Следует отметить, что во многих случаях капли жидкости достаточно. В любом случае испарения жидкости следует избегать, например, с помощью закрытого жидкости клетки.
- При необходимости, отрегулируйте желаемую температуру на контроллере.
- Пусть система уравновешивания, по крайней мере полчаса.
- Запишите тепловой спектр шума кантилевера с консоли далеко от поверхности, чтобы исключить любую поверхность эффекты затухания. Обратите внимание, что, как правило, 10 или более спектры должны быть накоплены для получения достаточной отношение сигнал-шум.
- Подойдите к поверхности. Обратите внимание, что в целях сохранения геометрии зонда и иглы функционализацию процессный подход должен осуществляться осторожно. Это может быть достигнуто, например, приближается в прерывистом режиме контактной.
- Определить обратный оптический чувствительность рычаг (InvOLS), измеренное в нм / вольт. Сделайте это, нажав на кончик кантилевера по твердой поверхности.
- Определить InvOLS путем измерения наклона расстояния перемещения пьезоэлектрический против изменения напряжения фотодиода. Установите линию к части форс-расстояние кривой, где острие кантилевера находится в контакте с поверхностью. В экспериментах с участием мягкую поверхность, например липидного бислоя, выполнять этот шаг на областях, которые не покрыты липидной двухслойной («дефектных точек»).
- Определить жесткость пружины (PN / нм) путем установки гармонического осциллятора спектру теплового шума. Использованиеавтоматизированная программная функция для весеннего постоянной определения; в противном случае обратитесь литературы 20.
- Начать эксперимент.
- Запись кривые многочисленные форс-расстояние в каждой экспериментальной состоянии. Как правило, используются следующие значения для параметров эксперимента: Частота дискретизации 5 кГц, скорость кончика 1 мкм / сек, отказаться расстояние 1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, в зависимости от динамики изучаемого эксперимента, это может быть необходимо подождать определенное количество времени с наконечником в контакте с поверхностью («время задержки»).
ПРИМЕЧАНИЕ: эксперимент конкретные параметры могут существенно отличаться от значений, приведенных выше. - В длительных измерений, ноль положение лазера на фотодиод, время от времени путем перестановки фотодиод.
- Дополнительно: После каждой кривой силы, переместите АСМ-наконечник на другую должность ху.
- В конце эксперимента, определяют чувствительность и пружину Constaнт снова, чтобы проверить на последовательность и стабильность системы.
Примечание: Сравнение жесткости пружины и чувствительность до и после эксперимента также является средством, чтобы гарантировать, что свойства системы и свойства оконечности осталась неизменной в течение всего эксперимента. Если разность жесткости пружины не слишком велико (<= 15%), они могут быть усреднены, так как внутренняя неопределенность пружины определения также около 15%. Для больших различий, желательно сначала найти и устранить причину меняющейся видимой постоянной пружины перед продолжением дальнейших экспериментов.
- Запись кривые многочисленные форс-расстояние в каждой экспериментальной состоянии. Как правило, используются следующие значения для параметров эксперимента: Частота дискретизации 5 кГц, скорость кончика 1 мкм / сек, отказаться расстояние 1 мкм.
6. Подготовка данных
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе Общая подготовка данных шагов, которые, как правило, проведенных зависит от конкретного типа эксперимента для перевода единиц Ньютон и нанометровых а также для коррекции описаны данные. Конкретные данные анализов эксперимента шiefly описано ниже в соответствующем разделе типичный пример.
- Как правило, выполнять все подготовки данных и анализ шаги автоматически домашней написан алгоритм, например, на базе программного обеспечения ИГОРЬ Pro 6.
- Преобразование исходного сигнала отклонения (Defl) [V] в силу путем умножения его с InvOLS [нм / V] и пружины [NN / нм].
- Смещение усилие таким образом, что сила, действующая на кантилевера в достаточном удалении от поверхности (без нагрузки консольной) становится 0 NN.
- Рассчитать действительное положение наконечника (также называемый разделение, когда измеренное по отношению к поверхности) Z *, который принимает изгиб кантилевера с учетом:
- Смещение г * таким образом, что Z * = 0 соответствует положению г поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь F является силой, которая действует на верхушке и, следовательно, изгибаš консольные (определено на этапе 6.2.), г является измеренное положение г-сенсор (непосредственно данное прибором) и к представляет жесткость пружины (определяется на этапе 5.8).
Рисунок 2. Процесс схема, показывающая подготовку образца, сбор данных и анализ данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В дальнейшем, результаты описанных выше примеров молекул, а именно полимеры поли (аминокислоты) polytyrosine, привитой полимер PI-г -PS и фосфолипидов папы, представлены. Во-первых для каждого, например, опыт конкретные детали для сбора данных и подготовки данных предоставляются. Тогда, примерные результаты экспериментов, в которых эти молекулы были десорбированных с различных поверхностей (CH 3 -SAMs, водородные прекращается алмазные и липидного бислоя) показаны. Определение силы адгезии, длина сцепления и свободной энергии вводятся.
Пример 1: десорбция polytyrosine из самоорганизующихся монослоя
Десорбция polytyrosine из гидрофобного SAM в различных растворов с различным содержанием этанола измеряли. В каждом растворе определяли консольные InvOLS и константы пружины, как описано выше, и, по меньшей мере 300 г силыistance следы были записаны для каждого решения. Все эксперименты один экспериментальный набор были сделаны с одной консоли на один день, чтобы гарантировать, что один и тот же единый поли (аминокислоты) была измерена. Скорость расширения / втягивания кантилевера составляла 0,5 мкм / сек и время выдержки на поверхности составляла 1 сек. Дистанционные сила следы показали плато постоянной силы. Каждый плато был оснащен сигмовидной кривой и сила плато, а также длина плато были определены и приведены на гистограмме. Гистограммы были оснащены Гаусса и пикового значения, а также в качестве стандартного отклонения (ошибки) в распределение добытого. До самого конца силы плато, система не находится в равновесии и площадь под плато поэтому равна свободной энергии на единицу длины полимера. Только отряд сам процесс в конце плато в неравновесных. Из-за этого, для типичных экспериментов длина плато больше, чем equilibri мкм Длина (около 30%) и площадь под сигмоидальных подходит верхнюю оценку для адгезии свободной энергии 21.
Рисунок 3. () Force расстояние след (отвод) из polytyrosine на метил-SAM в чистой воде (показаны красным цветом). Только одна молекула десорбируется, как можно видеть в одном шаге капли силы к базовой (нулевой силы). Сигмовидной форме показано в черно-длина экстрагируют плато и плато силы показаны стрелками. (B) Гистограммы добытого силу плато для измерений в чистой воде и в воде / этанола смесей с различным молярным содержанием этанола. (C) Плато длина гистограммы же экспериментальной установке. (D) длина Пик плато против силы плато пика ".456 / 52456fig3large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
3А показан один силовой расстояние след polytyrosine измеренный в чистой воде. Плато сила и длина плато извлекаются. Если имеется только одна молекула на кончике, что десорбируют из SAM, гистограмма показывает длину плато узкое распределение и мономодальную (как правило, в экспериментах стандартное отклонение в гаусс подгонки длины гистограммы составляет около 5-20 нм). И наоборот, если существует только один узкий пик на гистограмме длина плато, один может быть относительно уверен, что весь экспериментальный набор было сделано с одной и той же полимера. Причина этого заключается в том, что очень polytyrosines полидисперсной по размеру (от 50 до 100 кДа). Таким образом, две полимеры точно такой же длины, очень маловероятно. Добавление этанола ослабляет гидрофобное взаимодействие между polytyrosine и поверхностью 10,22 иприводит к снижению адсорбции свободной энергии, и, таким образом, к более низкому плато силы, как можно видеть на плато силы гистограмм для различных растворителей услови х, показанных на фиг.3В. Теперь он может быть исследована как длина плато одной polytyrosine изменения для различных адсорбционных свободных энергий. Как видно на фиг.3С длина плато уменьшается с добавлением этанола. В то же время снижается сила плато (рис 3D).
Для того, чтобы получить все соответствующие параметры процесса десорбции именно контурная длина, длина Кун, адсорбции свободной энергии и внутренней мономерный скорости десорбции, нужно объединить описанные выше измерения с постоянными экспериментами расстояния. Более подробную информацию см 21.
Пример 2: десорбции привитого полимера PI-г -ps из гидрофобного алмаза
В фиг.4А 4B типичные кривые силы-расстояния, полученные с PI-г -PS на гидрированного алмаза в воде при комнатной температуре показаны. Время пребывания на поверхности было 1 сек, а скорость кантилевера была 1 мкм / сек. Либо плато постоянной силы (рис 4а) или разрыв событий наблюдались (4В). Для плато постоянной силы, высота плато был определен с сигмоидальной посадки и величины были нанесены в виде гистограммы (фиг.4С). Чтобы исключить неспецифическую адгезию пика, вызванного прямого взаимодействия наконечника с поверхностью (первый пик в силу расстояния кривой на фиг.4В), максимальная сила в некотором расстоянии от поверхности была определена. Полученные значения для этих разрывных событий, то были построены в виде гистограммы (рис 4D). Для дальнейшего анализа гистограммы были оснащены Гаусса и максимальная высота была выбрана в качестве средней величины дляТочка данных. При таком эксперименте влияние присутствия боковых цепей и их архитектуры была исследована 14.
Рисунок 4. Форс-расстояние кривые отвода, выполненные с линейной полиизопренового позвоночника с привитым полистиролом боковых цепей (PI-г -PS). Либо плато постоянной силы (А) или разрыва событий (б) наблюдалось. Для плато постоянной силы, высота плато определяется с сигмоидальной форме и представлены на гистограмме (C), тогда как для разрыва событий, максимальный разрыв сила определяется (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное фигура.
Пример 3: Добыча одной фоspholipid (ПАПА) из липидного бислоя
5А показывает схематическое представление одной молекулы процесса экстракции. Измерения Добыча были выполнены вертикально приближается Папа-функционализированную иглы АСМ к поддерживаемой липидного бислоя (не показано). При контакте наконечника с бислой POPC, небольшой силой (~ 100 PN) остается постоянным с помощью цепи обратной связи в течение примерно 4 сек. Если молекула ПАПА вставляет в бислой в течение этого времени задержки, он вытащил или "извлекается" из двойного слоя на втягивании иглы АСМ от бислоя. Это приводит к характерным кривых сила-расстояния. Их форма определяется в основном растяжения эластичности ПЭГ линкер и могут быть установлены на червеобразный цепь (WLC) модели 23. Суперпозиция более 50 кривых показано на рис 5B. Правда единичные события молекула может быть признан Песня продержалась силы гистограмм (рис 5C Онг>). Следует отметить, что для того, чтобы получить дальнейшее понимание размера определенного молекулярного параметра (например, среднее время жизни липидов в бислоев), необходимо провести измерения с различными скоростями распределении нагрузки. Для дальнейшего анализа одного Добыча липидов эксперименты см 24.
Рисунок 5. () Схематическое для извлечения одной молекулы из липидного бислоя. Следует отметить, что молекула липида ковалентно соединен с наконечником. Таким образом, многие сто или даже тысячи циклов силой экстракции может быть проведена с одной и той же молекуле. (B) наложение более 50 кривых добычи 9. (С) Гистограмма распределения растягивающей силой примера, показанного в позиции (В)..jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Шаг | Цель | Растворенное вещество | Растворитель | Типичное отношение или концентрация |
| Силанизация | Создать аминогруппы на консольной поверхности | APTES (3-аминопропил) три-этоксисилан (например, Vectabond ™) | в сухом ацетоне | 1:50 (об / об) - 1: 100 (об / об) |
| ПЭГилирование | Обеспечение кантилевера поверхность амино или тиольной реакционноспособных групп | NHS-PEG-NHS или Мал-ПЭГ-NHS | сухого хлороформа | 0.25-25 мМ |
| ПЭГилирование | Пассивировать плоскости кантилевера | метил-ПЭГ-NHS | сухого хлороформа | 25 мм |
| Сопряжение молекулы-зонда | Пара молекула зонда с помощью аминогруппы или тиольной к би-функционального PEG | Молекула зонда (полимер, липидов и т.д.) | сухой хлороформ или боратный буфер | 0,1-10 мМ |
Таблица 1. Решения, необходимые для наконечника функционализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В течение последних десятилетий, одиночные эксперименты молекулы обеспечили беспрецедентный понимание молекулярных механизмов и оказалось бесценным подход в области наук о жизни и за ее пределами. Для достижения хороших и значимой статистики из ОВС экспериментов, в идеале один и тот же молекула используется в течение всего курса эксперимента. В отличие от экспериментов с ансамблями молекул, SMF, эксперименты могут обнаружить редкие события и скрытые молекулярных состояний. Еще одно преимущество отдельных экспериментах молекулы, что они могут быть смоделированы с помощью молекулярной динамики 24,25.
Протокол консольные функционализации описано выше, представляет собой модифицированный вариант процедуры, опубликованных ранее 26 - 28. После активации и силанизацией, консольные АСМ функционализированный смесью двух различных типов полиэтилена-гликоль (ПЭГ) молекулы (молекул линкера).
N- гидроксисукцинимида (NHS) группа (или тиольной группы реакционноспособного малеимид), где дальнейшем молекулы зонда конъюгируют ("NHS-ПЭГ", "Мал-ПЭГ"). На рисунке 1 изображена схема наконечника функционализации. Цель ПЭГ состоит из трех частей: во-первых, это пассивирует поверхность наконечника и, следовательно, предотвращает неспецифическую адсорбцию. Во-вторых, с использованием определенного коэффициента метил-ПЭГ / NHS-PEG позволяет регулировать концентрацию NHS-PEG на поверхности наконечника. И в-третьих, она отделяет наконечник от молекулы зонда и, следовательно, позволяет для количественного взаимодействия молекула-поверхность без вмешательства со стороны непосредственного взаимодействия зонд-поверхность. Затем молекула зонда ковалентно соединен с наконечником через NHS-PEG (или Мал-PEG).
Этот протокол гарантирует, что все облигации (*) в & #8220 Соединительная цепочка "Совет * OH * силан * PEG * молекула зонда ковалентные связи и, следовательно, очень сильный. Это, в свою очередь, допускает, что одно и то же молекула зонда измеряется по всей продолжительности эксперимента. Это было приведено в примере выше в разделе результатов репрезентативного показывает истинную единую силу молекулы спектроскопии.
Как можно проверить, что действительно одна молекула измеряется? Для одиночных следов с плато постоянной силы, ни капли к базовой достаточно. Если более чем один полимер десорбируется в то же время, сила падает до нуля в течение нескольких дискретных стадий, поскольку каждый полимер отделяется в другой точке. Сложнее решить, если это каждый раз, когда же одна молекула. Поэтому распределение отряда длины должен быть оценен. Узкое распределение с одним пиком является хорошим показателем того, что один и тот же одна молекула зондировали в каждом сила-расширения следа. Для одиночных следов с RuptЮр события, суперпозиция всех следов является лучшим способом решить, если (одно и то же) одна молекула измерялась. В качестве альтернативы, каждый след могут быть снабжены (WLC) модели, а затем и длина настойчивость и длины разрыв при определенной силы могут быть построены. Распределение этих двух параметров должна быть узкой и один пика.
В заключение, процедура подготовки к присоединению большим разнообразием отдельных молекул в АСМ зондов был представлен. Небольшой совет АСМ (в радиусе ~ 10 нм), его возможности бокового позиционирования и чувствительность сила делают его идеальным инструментом для изучения адгезии свойства отдельных молекул на биологических и небиологических поверхностей практически в любой жидкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
