Abstract
Atomkrafts spektroskopi är ett idealiskt verktyg för att studera molekyler på ytor och gränssnitt. Ett försöksprotokoll för att koppla en stor variation av enstaka molekyler kovalent på en AFM spets presenteras. Samtidigt AFM spets är passiverad för att förhindra ospecifika interaktioner mellan spetsen och substratet, vilket är en förutsättning för att studera enstaka molekyler bundna till AFM spets. Analyser för att bestämma vidhäftningskraften, vidhäftningslängden, och den fria energin av dessa molekyler på fasta ytor och bio-gränssnitt inom kort presenteras och externa referenser för vidare läsning tillhandahålls. Exempel molekyler är poly (aminosyra) polytyrosine, ymppolymeren PI- g -PS och fosfolipiden POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfoetanolamin). Dessa molekyler desorberas från olika ytor som CH 3 -SAMs, vätgas avslutas diamant och stödde lipidbiskikt under olika lösningsmedels förhållanden. SlutligenFördelarna med kraft spektroskopiska enstaka molekyl experiment diskuteras fattande organ för att avgöra om verkligen en enda molekyl har studerats i experimentet.
Introduction
Under de senaste 30 åren, har atomkraftsmikroskopi (AFM) visade sig vara en värdefull bildteknik för att studera biologiska 1,2 och syntetiska 3 material och ytor, eftersom det ger molekylär rumslig upplösning i alla tre dimensioner och kan användas i olika lösningsmedel miljöer. Dessutom AFM-enda molekyl force spektroskopi (SMF) gör det möjligt att mäta krafter som sträcker sig från PN att μN regimen och har gett helt nya kunskaper till exempel till protein vika 4,5, polymerfysik 6 - 8, och enda molekyl-ytan interaktion 9 - 12 .Den logiken bakom att studera enstaka molekyler snarare än en ensemble av molekyler är att undvika genomsnitt effekter som ofta döljer sällsynta händelser eller dolda molekylära stater. Dessutom kan en mängd molekylära parametrar såsom konturlängden, den Kuhn längden, vidhäftningen fri energi, etc. varaerhålles. Detta beskrivs närmare i exemplen nedan. I en typisk AFM-SMF experimentet är sonden molekyl kopplad till en mycket vass spets via en länkmolekyl. Spetsen själv ligger vid slutet av en böjbar fribärande. Om spetsen bringas i kontakt med ytan av sondmolekylen kommer att interagera med denna yta. Genom att observera avböjningen av den fribärande vid tillbakadragning av spetsen, den kraft, och därmed den fria energin, att lösgöra molekylen från ytan kan bestämmas. För att erhålla meningsfull statistik, har förvärvas ett stort antal så kallade tvångsavståndskurvor. Dessutom att ha riktiga enda molekyl experiment (dvs, som använder en och samma sond molekyl under hela hela experimentet) sondmolekylen bör kopplas kovalent till AFM spets. Här är ett experimentellt protokoll för fribärande funktion med en enda molekyl via en kovalent bindning presenteras. Den enda molekyl kan antingen kopplas via en amino- eller en tio-l grupp till AFM spets. Konjugeringen Processen kan utföras i en bred variation av lösningsmedel (organiska och vattenhaltiga) redogöra för solvatisering egenskaperna hos de polymerer som används.
I den första delen, ett allmänt protokoll för att kovalent fästa en enda molekyl ("sond-molekyl") via en länkmolekyl till en AFM spets beskrivs. För detta ändamål är organisk NHS- eller maleimid-kemi används 13. Tillsammans med protokollet för tre exempel molekyler, är datainsamling och dataanalys processer beskrivs och referenser för vidare läsning finns. Exempel molekylerna är: (linjär) polymer tyrosin, ymppolymeren PI- g -PS och lipid påven. Detta innefattar små variationer i protokollet, till exempel för att kovalent fästa cysteiner. Dessutom är ett avsnitt om beredning av olika ytor såsom en diamant yta, en CH 3 själven-monterade monolager och lipidbiskikt. Dessa gränssnitt har provsv att vara goda referenser och exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se figur 2 för en översikt av processflödet omfattar förberedelse, datainsamling och dataanalys steg.
1. Reagens Setup
OBS: Alla kemikalier skall hanteras med omsorg, och därmed en labbrock, bör skyddshandskar och ögonskydd användas. All verksamhet måste utföras i ett laboratorium huva. I synnerhet bör speciella handskar bäras i händelse av kloroform användning.
- Använd kemikalier med låg vattenhalt, såsom torr kloroform snabbt och lagra torrt men inte längre än en vecka. Förvara både kemikalier vid -20 ° C och under kväve eller argongas, därför APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (se tabell 1) och PEG (polyetylenglykol) är hygroskopiska och PEG är utsatt för oxidation i luft.
- För att undvika frekvent exponering av beståndet till atmosfäriskt syre och fukt, förbereda mindre portioner, helst inom ett handskfack system med en kväve atmosphere.
2. Utrustning Setup
OBS: För att undvika eventuell korskontamination, använda färska och rena kärl för varje steg.
- Rent glas och pincett i rengöringsmedel i 30 minuter i ett ultraljudsbad vid 60 ° C.
- Skölj och låt ligga utrustning från steg 2,1 två gånger noggrant med ultrarent vatten.
- Värmeutrustning från steg 2,1 i RCA-lösning (ultrarent vatten, väteperoxid och ammoniak (5: 1: 1)) till 75 ° C i en ugn i 45 minuter och därefter skölja dem med ultrarent vatten.
- Torka slutligen glasvaror och pincett under en ström av torr kvävgas eller i en ugn (100 ° C, 3 h).
3. Tips Funktion
OBS: Använd pincett, fartyg, etc. tillverkade av rostfritt stål, PTFE, glas eller något annat material som är kemiskt stabil i organiska lösningar om tillämpligt. Om inget annat anges, genomföra alla steg vid RT. Mängden inkuberingslösning behövs beror på antalet fribärande marker. Se till att utliggare är nedsänkta i respektive lösningar i alla tider.
OBS: Använd en huva för att undvika inandning av organiska ångor.
- Bildandet av OH-grupper på fribärande ytan ("aktivering") (ca 0,5 tim):
- Använd pincett för att placera nya fribärande chips (material: SiN, fjäderkonstant: 10-100 pN / nm) på en ren glasskiva och lägg dem i en plasmakammare (100 W).
- Evakuera kammare (~ 0,1 mbar).
- Dränk kammare med syrgas och evakuera igen.
- Aktivera plasmaprocess (ström: 20%, längd: 15 min, processtryck: 0,25 mbar).
- Amino-silanisering av konsoler (ca 1 tim):
- Förbered 2,5 ml av APTES lösning (se tabell 1) i ett glas petriskål - gör detta idealiskt under plasmaprocessen.
- Immediately efter plasmaprocess, doppa varje konsol 1 sek i aceton och placera dem direkt efteråt i APTES lösningen.
- Inkubera under 15 min vid RT.
- Skölj försiktigt fribärande marker två gånger i 10 ml aceton och en gång i 10 ml kloroform.
- Valfria slutliga steget: Placera grenflis från föregående steg på en ren glasskiva och grädda dem i 30 minuter vid 70 ° C. Observera att det även finns alternativa strategier ytaktivering, t.ex. UV behandling 12.
- PEGylering (ca 2 tim):
OBS: Utför steg 3.3.1-3.3.4 under amino-silanisering. NHS och maleimidgrupper är föremål för hydrolys i vattenmiljöerna och PEG själv är föremål för oxidation i luft. Därför timing (speciellt i mellan stegen) är en kritisk parameter. Se 13 för ytterligare information.- Bered kloroformlösningen (se tabell 1).
- För att undvika kondens, Varma PEG pudrar upp till RT innan du öppnar alikvot och väga lämplig mängd.
- För koppling av polymerer eller lipider med aminogrupper, separat lösa NHS-PEG-NHS (6 kDa) och metyl-PEG-NHS (5 kDa) i kloroformlösning genom vortexning dem tills de är helt löst. Se tabell 1 för koncentrationer.
- Alternativt. för koppling av polymerer med tiolgrupper separat lösa Mal-NHS- PEG och metyl-PEG-NHS i kloroformlösningen.
- Blanda såsom krävs för att justera ett visst antal förhållandet mellan NHS- eller maleimide- och metyl--terminerad PEG-molekyler (vanligen en: 500) lösningarna. Observera att det ideala förhållandet måste bestämmas iterativt i en serie av förberedelse-experimentcykler.
- Inkubera fribärande chips i PEG-lösningen under 1 h i en kloroform mättad atmosfär för att förhindra avdunstning av kloroformen.
- Probmolekylen konjugering(> 1 timme):
OBS: I följande 3.4.1-3.4.3, är tre exempel för kovalent koppling av olika probmolekyler till AFM spets beskrivs. För varje molekyl protokollet måste justeras. Ytterligare anmärkning, som i exempel 1 och 3 NHS-kemi används, medan i exempel 2 tiolen funktionaliserade polymeren PI g -PS är kopplad till PEG via maleimid-kemi. För mer information se 14.- För poly (aminosyra) poly-D-tyrosin (40-100 kDa)
- Lös polytyrosine konjugerad sondmolekyl i 1 M NaOH. Justera koncentrationen till 1 mg / ml.
- Byt ut NaOH för natriumboratbuffert (pH 8,1) med hjälp av spinnavsaltningskolonner (7 kDa MWCO) omedelbart före funktion
- Skölj utliggare först med 5 ml kloroform, sedan med 5 ml etanol och slutligen med 5 ml boratbuffert.
- Inkubera fribärande marker för en timme i polytyrosine boratbuffertlösning och skölj sedan med boratbuffertoch ultrarent vatten. Förvara i ultrarent vatten tills mätningen.
- För polymerer med en linjär ryggrad (polyisopren, 119 kDa) med ympade sidokedjor (polystyren, 88 kDa) 14
- Lös PI- g -PS i torr kloroform. Justera koncentrationen av konjugering lösningen till 4 mg / ml.
- Skölj utliggare med 5 ml kloroform och inkubera i minst 1 timme i konjugering lösningen.
- Skölj igen i 5 ml kloroform och förvara i kloroform i en kloroform mättad miljö (för att förhindra kloroform avdunstning) tills mätningen.
- För lipiden POPE
- Lös POPE i torr kloroform. Justera koncentrationen till 20 mM.
- Skölj utliggare med 5 ml etanol och 5 ml ultrarent vatten före inkubering av utliggare för ett h i lipidlösningen.
- Efter inkubation, skölj utliggare med 5 ml kloroform, 5 ml etanol och 5 ml varmt, ultrarent vatten (i denna ordning) för att avlägsna obundna probmolekyler och att bli av kloroform rester. Använd funktion tips omedelbart. Alternativt, lagra dem i kloroform tills det behövs.
- För poly (aminosyra) poly-D-tyrosin (40-100 kDa)
Figur 1. (A) Schematisk visar spetsen funktionprocessen med hjälp av exempel på NHS kemi. (B) Kemisk bindning används för att fästa en sond molekyl till spetsen via en aminogrupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Ytbehandling
- Själv monterade monolager (SAM)
OBS: Eftersom ytan för det första exemplet, var en själv monterade monolager valt. Se litteratur 15 - Rena objektsglas med rengöringslösning och därefter två gånger i ultrarent vatten i ett ultraljudsbad under 30 min vardera. Sedan, som en ytterligare rengöringssteg, placera dem i RCA-lösning (se steg 2.3) vid 75 ° C under 15 min.
- Coat glasen med 10 nm krom nickel och 100 nm guld i en vakuumbeläggnings. Sedan lagra i kylskåpet och ren igen i RCA lösningen direkt före nästa steg.
- Inkubera objektglasen i det föregående steget i 2 mM 1-dodecanthiol / etanollösning i 12 h. Tiolgrupperna binder till guldytan och en hydrofob monolager själv monterar. Skölj objektglasen med etanol och ultrarent vatten och därefter torka genom en ström av kvävgas. Bekräfta hydrofobiciteten hos den förbehandlade ytan med statiska mätningar av kontaktvinkeln i en goniometer med en CCD-kamera 10.
NOTERA: Som en yta för det andra exemplet, var en väte terminerad diamant valt. Ytan preparatet utfördes som beskrivits tidigare 16.
OBS: I det sista exemplet, fick en yta som stöds lipiddubbelskikt (SLB) används som underlag. För att erhålla en sådan yta, var en lösning (0,1 mg / ml) av stora unilamellära vesiklar (LUV) som består av fosfolipiden POPC bildad genom strängsprutningsmetod. Därefter 50 ul av LUV lösningen sattes på en nyligen klyvs glimmerblad (A = 1 cm ^) och inkuberades under 30 min. Slutligen lösningen sköljdes med 20 ml ultrarent vatten. Se 17,18 för en detaljerad beskrivning av beredningen av SLBs.
5. Data Acquisition
NOTERA: För experimenten, använda ett AFM, som ger möjlighet att mäta i vätskor. De datainsamling och dataanalys tillvägagångssätt gäller oavsett AFM modell som används. Vidare är det fördelaktigt i vissa experiment för att ha möjlighet att styra Temperature inuti vätske cellen. Gren nedböjning upptäcktes via laserstrålen deformationen metod 19. Fjäderkonstant bestämdes med termiskt brus metoden 20.
- Sätt den funktion fribärande i en AFM fribärande hållare som är lämplig för mätning i vätskor.
- Sätt ytan (framställning se ovan) som ska provtas i AFM och täck den med vätska. Båda bör fribärande och ytan nu nedsänkt i vätskan med fribärande spetsen pekar mot ytan. Notera att i många fall en droppe vätska är tillräckligt. I varje fall förångning av vätskan bör undvikas, t.ex., genom användning av en sluten fluidcell.
- Om tillämpligt, justerar önskad temperatur på styrenheten.
- Låt systemet jämvikt under åtminstone en halvtimme.
- Spela en termisk brusspektrum av fribärande med fribärande långt bort från ytan för att utesluta alla ytor dämpande effekter. Notera att vanligtvis en0 eller flera spektra måste ackumuleras för att erhålla en tillräcklig signal-till-brusförhållandet.
- Närma ytan. Observera att för att bevara spetsgeometri och dricks funktion tillvägagångssätt processen måste genomföras noggrant. Detta kan åstadkommas genom, till exempel, närmar i intermittent kontakt läge.
- Bestäm inversen optiska spaken känslighet (InvOLS) mätt i nm / volt. Gör detta genom att trycka på fribärande spetsen mot en hård yta.
- Bestäm InvOLS genom att mäta lutningen på piezo reseavståndet kontra förändringen i fotodioden spänning. Montera till en rad i den del av kurvan för kraft-avstånd där den fribärande spets är i kontakt med ytan. I försök med en mjuk yta som lipidbiskikt, utföra det här steget på områden som inte är täckta med ett lipidbiskikt ("defekta fläckar").
- Bestäm fjäderkonstanten (pN / nm) genom att montera en harmonisk oscillator till den termiska brusspektrumet. Användningautomatiserad mjukvara funktion för fjäderkonstant bestämning; annars konsul litteratur 20.
- Starta experimentet.
- Rekord många kraftdistanskurvor vid varje experimentell skick. Normalt använder följande värden för de experimentella parametrar: samplingshastighet på 5 kHz, spetshastighet på 1 um / sek, dra avstånd av 1 pm.
OBS: Ibland, beroende på dynamiken i den studerade experimentet, kan det bli nödvändigt att vänta en viss tid med spetsen i kontakt med ytan ("uppehållstid").
OBS: Experimentet specifika parametrar kan avvika väsentligt från de angivna värdena ovan. - Under mätningarna långsiktiga, noll laser position på fotodioden från tid till annan genom att flytta fotodioden.
- Tillval: Efter varje kraftkurva, flytta AFM-tips till en annan xy läge.
- Vid slutet av experimentet, bestämmer känsligheten och fjädern CONSTAnt igen för att kontrollera konsekvens och stabilitet i systemet.
OBS: Jämförande fjäderkonstanten och känslighet före och efter försöket är också ett medel för att säkerställa att systemets egenskaper och egenskaperna hos spetsen förblev oförändrad under loppet av experimentet. Om skillnaden av fjäderkonstanterna inte är för stor (<= 15%), de kan medelvärdesbildas, eftersom den inneboende osäkerheten i fjäderkonstant bestämning är också omkring 15%. För större skillnader, är det lämpligt att först hitta och eliminera orsaken till det förändrade uppenbara fjäderkonstant innan du fortsätter med ytterligare experiment.
- Rekord många kraftdistanskurvor vid varje experimentell skick. Normalt använder följande värden för de experimentella parametrar: samplingshastighet på 5 kHz, spetshastighet på 1 um / sek, dra avstånd av 1 pm.
6. Data Preparation
OBS: I detta avsnitt allmänna uppgifter beredningssteg som normalt utförs oberoende av den specifika typ av experiment för att omvandla enheter för att Newton och nanometer samt att korrigera uppgifterna beskrivs. De experiment specifika dataanalyser är briefly beskrivs vidare nedan i respektive representativt exempel sektion.
- Normalt utför all databeredning och analys steg automatiskt av ett hem skrivna algoritm, t.ex. baserat på programvaran IGOR Pro 6.
- Konvertera rå nedböjning signalen (DEFL) [V] i kraft genom att multiplicera den med InvOLS [nm / V] och fjäderkonstanten [NN / nm].
- Offset kraften på ett sådant sätt att den kraft den fribärande tillräckligt avstånd från ytan (obelastad fribärande) blir 0 NN.
- Beräkna den verkliga spetspositionen (även kallad separering mätt relativt ytan) z *, som tar böjningen av konsolen i beaktande:
- Offset z * på ett sådant sätt att z * = 0 motsvarar läget Z av ytan.
OBS: Här, F är kraften som verkar på spetsen och därmed böjas konsolen (bestämd i steg 6.2.) är z uppmätta z-sensor läge (direkt från instrumentet) och k representerar fjäderkonstanten (bestämd i steg 5,8).
Figur 2. Processflödesdiagram som visar förberedelserna provet, datainsamling och dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det följande resultaten för de ovan beskrivna exempel molekyler, nämligen polymerer poly (aminosyra) polytyrosine, ymppolymeren PI- g -PS och fosfolipid POPE, presenteras. Först för varje exempel experimentera specifika detaljer för förvärv och data förberedelse tillhandahålls. Därefter är de föredömliga resultat för experiment där dessa molekyler desorberas från olika ytor (CH 3 -SAMs, väte avslutas diamant och lipidbiskikt) visas. Bestämning av vidhäftningskraft, vidhäftningslängden och den fria energin introduceras.
Exempel 1: Desorption av polytyrosine från själv monterade monolager
Desorptionen av polytyrosine från en hydrofob SAM i olika lösningar med en varierande halt av etanol mättes. I varje lösning konsol InvOLS och fjäderkonstanter bestämdes såsom beskrivits ovan och åtminstone 300 kraft distance spår registrerades för varje lösning. Alla experiment av en experimentell uppsättning gjordes med en enda fribärande på en enda dag för att säkerställa att en och samma enda poly (aminosyra) mättes. Förlängningen / indragningshastigheten av fribärande var 0,5 pm / sek och uppehållstid på ytan var 1 sek. De force avstånds spår visade platåer av konstant kraft. Varje platå försågs med en sigmoidal kurva och platåkraft liksom platålängden bestämdes och plottades i ett histogram. Histogrammen utrustades med en Gauss och toppvärdet liksom den standardvariationen (fel) av distributionen extraherades. Fram till slutet av kraften platån, är systemet i jämvikt och området nedanför platån lika därför den fria energin per polymerlängd. Endast den lösgörprocessen i sig vid slutet av platån är i icke-jämvikt. På grund av detta, för typiska experiment platån längden är längre än equilibri um längd (ca 30%) och området under sigmoidal passar en övre uppskattning för vidhäftning fri energi 21.
Figur 3. (A) Kraft avståndet trace (retraktion) i polytyrosine på en metyl-SAM i rent vatten (visas i rött). Endast en enda molekyl desorberar som kan ses i enda steg droppe av kraften till baslinjen (noll kraft). Den sigmoidala passning visas i svart och det extraherade platålängden och platåkraft anges med pilar. (B) histogram av den extraherade platå kraften för mätningar i rent vatten och i vatten / etanolblandningar med olika molar innehåll etanol. (C) platålängden histogram av samma experimentella uppsättning. (D) Peak platå längd kontra topp platå kraft. "456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3A visar en enda kraft-avstånd spår av polytyrosine mätt i rent vatten. Plateau kraft och platålängd utvinns. Om det bara finns en molekyl på spetsen som desorberas från SAM visar platålängden histogrammet en smal och monomodal fördelning (typiskt i experiment standardavvikelsen i en gauss passning av längden histogram är omkring 5-20 nm). Vice versa, om det bara finns en smal topp i platålängden histogrammet, kan man vara relativt säker på att hela försöksuppställningen var klar med en och samma polymer. Anledningen till detta är att de polytyrosines är mycket polydispersive i storlek (50 till 100 kDa). Därför två polymerer av exakt samma längd är högst osannolikt. Lägga etanol försvagar den hydrofoba växelverkan mellan polytyrosine och ytan 10,22 ochleder till ett lägre adsorption fri energi och därmed till en lägre platå kraft såsom kan ses i platåkraft histogram för de olika lösningsmedelsbetingelser som visas i figur 3B. Nu kan utredas hur platålängden av en enda polytyrosine förändras för olika adsorption fria energier. Såsom kan ses i figur 3C på platålängden minskar med tillsats av etanol. Samtidigt de platå kraften minskar (figur 3D).
För att få alla relevanta parametrar i desorptionsprocessen nämligen konturlängden, den Kuhn längd, adsorption fri energi och den inneboende mono desorption ränta, måste man kombinera de ovan beskrivna mätningarna med konstant avstånd experiment. För mer information se 21.
Exempel 2: Desorption av ymppolymeren PI- g -PS från en hydrofob diamant
I fig 4A 4B typiska tvångsavståndskurvor erhållna med PI- g -PS på hydro diamant i vatten vid RT visas. Uppehållstiden på ytan var en sekund och hastigheten för den fribärande var 1 | im / sek. Antingen platåer av konstant kraft (Figur 4A) eller brott händelser observerades (Figur 4B). För platåer av konstant kraft, var höjden av platåer bestäms med en sigmoidal passform och värdena plottades i ett histogram (Figur 4C). För att utesluta den ospecifika vidhäftning toppen orsakas av direkt interaktion av spetsen med ytan (första toppen i kraft avstånd kurvan i figur 4B), var den maximala kraften på något avstånd från ytan bestäms. De erhållna värdena för dessa brotthändelser sedan plottas i ett histogram (Figur 4D). För ytterligare analys histogrammen var utrustade med en Gauss och maximal höjd valdes som ett medelvärde fördatapunkt. Med denna typ av experiment påverkan av förekomsten av sidokedjor och deras arkitektur undersöktes 14.
Figur 4. Force-distans indragningskurvor som utförs med en linjär polyisopren ryggrad ympade med polystyren sidokedjor (PI g -PS). Antingen platåer av konstant kraft (A) eller brista händelser (B) observeras. För platåer av konstant kraft, är höjden av platåer bestäms med en sigmoidal passform och plottas i ett histogram (C) medan för brotthändelser, är den maximala brottkraften bestäms (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Exempel 3: Extraktion av en enda phospholipid (POPE) från ett lipiddubbelskikt
Figur 5A visar en schematisk representation av den enda molekyl extraktionsprocessen. Extraction mätningar utfördes genom vertikal närmar påven-funktion AFM spets mot stöds lipidbiskiktet (visas ej). Vid kontakt av spetsen med POPC biskikt, är en liten kraft (~ 100 pN) hålls konstant genom en återkopplingsslinga för ca 4 sek. Om påven molekylen införs i dubbelskiktet under denna uppehållstid, det dras ut eller "extraherade" från dubbelskiktet vid indragning AFM spets från dubbelskiktet. Detta resulterar i karakteristiska kraft avstånd kurvor. Deras form är i grunden bestäms av stretching elasticitet PEG länken och kan monteras med en ormlika kedja (WLC) modell 23. En överlagring av mer än 50 kurvor visas i figur 5B. Sanna enstaka molekyl händelser kan kännas igen av enskilda spetsiga kraft histogram (Figur 5C ong>). Observera att för att få ökad insikt i storleken av vissa molekylära parameter (t.ex. medellivstiden av lipider i dubbelskikt), är det nödvändigt att utföra mätningar med olika kraft belastningshastigheter. För ytterligare analys av enstaka lipidextraktion experiment se 24.
Figur 5. (A) Schematisk för utvinning av en enda molekyl från ett lipiddubbelskikt. Observera att lipidmolekylen är kovalent kopplad till spetsen. Därför kan många hundra eller till och med tusentals tvångs extraktion cykler utföras med en och samma molekyl. (B) Överlagring av mer än 50 utsugs kurvorna 9. (C) Histogram av utvinningen kraftfördelningen av anordningen som visas i (B) exempel..jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Syfte | Solute | Lösningsmedel | Typisk förhållande eller koncentration |
| Silanisering | Skapa aminogrupper på fribärande yta | APTES (3-aminopropyl) tri-etoxisilan (t.ex. Vectabond ™) | torr aceton | 01:50 (v / v) - 1: 100 (volym / volym) |
| PEGylering | Ge fribärande yta med amino eller tiolreaktiva grupper | NHS-PEG-NHS eller Mal-PEG-NHS | torr kloroform | 0,25-25 mM |
| PEGylering | Passivera fribärande yta | metyl-PEG-NHS | torr kloroform | 25 mM |
| Konjugering av probmolekyl | Par sondmolekyl via en amino- eller tiolgrupp till bi-funktionella PEG | sondmolekyl (polymer, lipid, etc) | torr kloroform eller boratbuffert | 0,1-10 mM |
Tabell 1. Lösningar behövs för tipset funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste decennierna har enstaka molekyl experiment tillhandahålls oanade insikter i molekylära mekanismer och visade sig vara en ovärderlig förhållningssätt inom life science och utanför. För att uppnå goda och meningsfull statistik från SMF experiment, helst en och samma molekyl används över hela experimentets. I motsats till experiment med ensembler av molekyler, SMF experiment kan upptäcka sällsynta händelser och dolda molekylära stater. En annan fördel med enda molekyl experiment är att de kan modelleras med hjälp av molekylära dynamiksimuleringar 24,25.
Den cantilever funktion protokoll som beskrivits ovan är en modifierad version av förfaranden som tidigare publicerats 26 - 28. Efter aktivering och silanisering, är AFM fribärande funktionaliserad med en blandning av två olika typer av polyetylen-glykol (PEG) molekyler (linkermolekyler).
N-hydroxisuccinimid (NHS) grupp (eller en tiol reaktiv maleimidgrupp), där senare på sondmolekylen är konjugerad ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). Se figur 1 för en schematisk av spetsfunktion. Syftet med PEG är trefaldigt: Först, passiverar det spetsytan och förhindrar därför ospecifik adsorption. För det andra, med användning av en viss metyl-PEG / NHS-PEG-förhållande medger justering av NHS-PEG-koncentration på spetsytan. Och för det tredje, separerar det spetsen från sondmolekylen och därmed möjliggör kvantifiering av interaktionen molekylen-yta utan störning från den direkta interaktionen spetsen-yta. Då sonden molekylen är kovalent kopplad till spetsen via NHS-PEG (eller Mal-PEG).
Detta protokoll ser till att alla obligationer (*) i & #8220; kopplingskedja "spets * OH * silan * PEG * sondmolekyl är kovalenta bindningar och därför mycket stark. Detta tillåter i sin tur att en och samma probmolekyl mäts över hela försökets varaktighet. Detta har exemplifierats ovan i resultat avsnittet företrädaren visar sanna enda molekyl kraft spektroskopi.
Hur kan verifieras som verkligen en enda molekyl mäts? För enstaka spår med platåer av konstant kraft, räcker det med en enda droppe till baslinjen. Om mer än en polymer desorberas samtidigt, kraften sjunker till noll i flera diskreta steg, eftersom varje polymer lossnar vid en annan punkt. Svårare är att avgöra om det är varje gång samma enda molekyl. Fördelningen av lösgör längder Därför måste utvärderas. En snäv fördelning med en enda topp är en god indikation på att en och samma enda molekyl sonderades i varje kraft-förlängning spår. För enstaka spår med konkursure händelser är överlagring av alla spår den bästa metoden för att bestämma om (en och samma) enda molekyl mättes. Alternativt kan varje spår förses med en (WLC) modell och sedan kan ritas både uthållighet längd och brott längderna på en definierad kraft. Fördelningen av dessa två parametrar måste vara smal och singel toppig.
Sammanfattningsvis har ett preparat förfarande för fastsättning av ett stort utbud av enstaka molekyler till AFM tips presenterats. AFM: s litet tips (radie ~ 10 nm), dess sidopositioneringsfunktioner och dess kraft känslighet gör den det perfekta verktyget för att studera vidhäftningsegenskaper enstaka molekyler på biologiska och icke-biologiska ytor i nästan alla vätska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
