Abstract
Atomic force spectroscopie is een ideaal hulpmiddel om moleculen aan oppervlakken en interfaces te bestuderen. Een experimentele protocol te koppelen een grote verscheidenheid van afzonderlijke moleculen covalent op een AFM tip wordt gepresenteerd. Tegelijkertijd de AFM tip gepassiveerd om aspecifieke interacties tussen de tip en het substraat, hetgeen een vereiste om enkele moleculen aan de AFM tip bestuderen voorkomen. Analyses om de hechting van kracht, de hechting lengte, en de vrije energie van deze moleculen op vaste oppervlakken en bio-interfaces worden binnenkort gepresenteerd en externe verwijzingen voor verdere lectuur worden verricht. Voorbeeld moleculen zijn de poly (aminozuur) polytyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het fosfolipide POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine). Deze moleculen gedesorbeerd van verschillende oppervlakken, zoals CH3 -SAMs, waterstof beëindigd diamant en ondersteund lipide dubbellagen onder verschillende omstandigheden oplosmiddel. Ten slottevoordelen kracht spectroscopische single molecule experimenten besproken middelen omvat om te beslissen of werkelijk een enkel molecuul is onderzocht in het experiment.
Introduction
In de afgelopen 30 jaar heeft atomic force microscopie (AFM) bleek een waardevolle beeldvormingstechniek bestuderen biologische 1,2 en 3 synthetische materialen en oppervlakken aangezien het voorziet moleculaire ruimtelijke resolutie in alle drie dimensies en kan op verscheidene oplosmiddel worden bediend omgevingen. Daarnaast AFM-single molecule kracht spectroscopie (SMF) in staat stelt om de krachten variërend van de PN-regime μN meten en heeft ongekend inzicht bijvoorbeeld in eiwitvouwing 4,5, polymeerfysica 6 gegeven - 8, en single molecule-oppervlak interactie 9 - 12 .De gedachte achter het bestuderen van enkele moleculen in plaats van een ensemble van moleculen is om te voorkomen dat een gemiddelde effecten die vaak maskeren zeldzame gebeurtenissen of verborgen moleculaire toestanden. Bovendien kan een veelheid aan moleculaire parameters zoals het contour lengte, de lengte Kuhn, de hechting vrije energie, etc. zijnverkregen. Dit wordt in onderstaande voorbeelden. In een typische AFM-SMF experiment wordt de probe molecuul gekoppeld aan een zeer scherpe punt via een linker-molecule. De tip zelf is gelegen aan het einde van een buigzame cantilever. Als de punt in contact met het oppervlak wordt gebracht de probe molecuul interactie met dit oppervlak. Door het observeren van de doorbuiging van de cantilever bij het terugtrekken van de tip, de kracht en daardoor de vrije energie, aan het molecuul los te maken van het oppervlak worden bepaald. Om zinvolle statistiek, een groot aantal zogenaamde kracht-afstand curves moeten worden verworven. Bovendien true single molecule experimenten (bijv via een en dezelfde probe molecuul gedurende de duur van het gehele experiment) het probe-molecuul dient covalent gekoppeld aan de AFM tip bevatten. Hier wordt een experimenteel protocol voor cantilever functionalisering met een enkel molecuul via een covalente binding gepresenteerd. De single molecule kan ofwel gekoppeld via een amino- of thiol groep aan de AFM tip. De conjugatie werkwijze kan worden uitgevoerd in een grote verscheidenheid van oplosmiddelen (organisch en waterig) overeenkomt met het solvatatie eigenschappen van de gebruikte polymeren.
In het eerste deel, een algemeen protocol covalent een enkel molecuul ("probe molecule") te bevestigen via een linker-molecuul aan een AFM tip wordt beschreven. Hiertoe wordt organisch NHS- of maleïmide-chemie gebruikt 13. Samen met het protocol voor drie bijvoorbeeld moleculen, worden de data-acquisitie en data-analyse processen beschreven en referenties voor verdere lectuur zijn aanwezig. Het voorbeeld moleculen zijn: de (lineaire) polymeren tyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het lipide POPE. Dit omvat kleine variaties van het protocol, bijvoorbeeld om covalent cysteïnen. Daarnaast wordt een gedeelte gewijd aan de bereiding van diverse oppervlakken zoals een diamant oppervlak, een CH3--Self monolaag en lipide dubbellagen. Deze interfaces hebben proven zijn goede referenties en voorbeelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie figuur 2 voor een overzicht van de procesflow bestaande uit de voorbereiding, de data-acquisitie en data-analyse stappen.
1. Reagens Setup
OPMERKING: Alle chemicaliën moeten met zorg worden behandeld, en dus een lab jas, handschoenen en een bescherming voor de ogen zou moeten worden gebruikt. Alle bewerkingen moeten worden uitgevoerd in een laboratorium kap. In het bijzonder moet handschoenen te dragen bij chloroform gebruikt.
- Gebruik chemische stoffen met een laag watergehalte zoals droge chloroform snel en op te slaan droog, maar niet langer dan een week. Bewaar beide stoffen bij -20 ° C onder stikstof of argon gas omdat APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (zie tabel 1) en PEG (polyethyleenglycol) zijn hygroscopisch en PEG is onderworpen aan oxidatie in lucht.
- Frequente blootstelling van de voorraad aan zuurstof in de lucht en vocht te voorkomen, bereiden kleinere porties, idealiter binnen een dashboardkastje systeem met een stikstof atmosphere.
2. Apparatuur Setup
OPMERKING: Om mogelijke kruisbesmetting te vermijden, gebruiken verse en schone schepen voor elke stap.
- Schoon glaswerk en pincet reinigingsoplossing gedurende 30 minuten in een ultrasoon bad bij 60 ° C.
- Spoel en ultrasone trillingen apparatuur uit stap 2.1 twee keer grondig met ultrapuur water.
- Warmte machines van stap 2.1 in RCA-oplossing (ultrazuiver water, waterstofperoxide en ammoniak (5: 1: 1)) tot 75 ° C in een oven gedurende 45 min en vervolgens spoelen met ultrapuur water.
- Tenslotte wordt het glaswerk en pincet onder een stroom van droge stikstof of in een oven (100 ° C, 3 uur).
3. Tip Functionalisering
OPMERKING: pincet, schepen, etc. gemaakt van roestvrij staal, PTFE, glas of elk ander materiaal dat chemisch stabiel in organische oplossingen als toepasselijk. Tenzij anders vermeld, het uitvoeren van alle stappen op RT. De hoeveelheid incubatieoplossing nodig afhankelijk van het aantal cantilever chips. Zorg ervoor dat de uitkragingen worden ondergedompeld in de respectieve oplossingen te allen tijde.
OPMERKING: Gebruik een kap om inademing van organische dampen te voorkomen.
- Vorming van OH-groepen op cantilever oppervlak ('activering') (ongeveer 0,5 uur):
- Gebruik een pincet om verse cantilever chips plaatsen (materiaal: zonde, veerconstante: 10-100 pN / nm) op een schoon glasplaatje en leg ze in een plasma kamer (100 W).
- Evacueren kamer (~ 0,1 mbar).
- Overstroming kamer met zuurstofgas en evacueren opnieuw.
- Activeer de plasma-proces (power: 20%, duur: 15 min, proces druk: 0,25 mbar).
- Amino-silanisatie van cantilevers (ongeveer 1 uur):
- Bereid de 2,5 ml APTES oplossing (zie tabel 1) in een glazen petrischaal - doe dit ideaal tijdens het plasma proces.
- Immediately na het plasma proces, dompel elke cantilever voor 1 sec in aceton en leg ze direct daarna in de APTES oplossing.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel voorzichtig de cantilever chips tweemaal in 10 ml aceton en eenmaal in 10 ml chloroform.
- Optioneel laatste stap: Plaats cantilever chips uit de vorige stap op een schoon glasplaatje en bak ze gedurende 30 minuten bij 70 ° C. Merk op dat er ook alternatieve strategieën voor oppervlakte-activering, bijvoorbeeld, UV-behandeling 12.
- PEGylatie (ongeveer 2 uur):
OPMERKING: Voer de stappen 3.3.1-3.3.4 tijdens amino-silanisatie. NHS en maleïmide groepen onderworpen aan hydrolyse in waterige milieus en PEG op zich aan oxidatie in lucht. Daarom timing (vooral tussen de stappen) is een kritische parameter. Zie 13 voor meer informatie.- Bereid de chloroformoplossing (zie tabel 1).
- Om condensatie te voorkomen, Warme PEG poeders tot RT vóór het openen van de hoeveelheid en het gewicht van de juiste hoeveelheid.
- Voor de koppeling van polymeren of lipiden met aminogroepen, afzonderlijk oplossen NHS-PEG-NHS (6 kDa) en methyl-PEG-NHS (5 kDa) in chloroform oplossing door vortexen totdat ze volledig zijn opgelost. Zie tabel 1 voor de concentraties.
- Als alternatief. voor de koppeling van polymeren met thiolgroepen afzonderlijk oplossen Mal-NHS- PEG en methyl-PEG-NHS in de chloroformoplossing.
- Meng de oplossingen zoals vereist om een bepaald aantal verhouding tussen de NHS- of maleimide- en methyl beëindigde PEG-moleculen (gewoonlijk 1: 500) aan te passen. Merk op dat de ideale verhouding moet iteratief worden bepaald in een reeks preparaat-experiment cycli.
- Incubeer cantilever chips in de PEG-oplossing gedurende 1 uur in een verzadigde atmosfeer chloroform verdamping van het chloroform voorkomen.
- Probemolecuul vervoeging(> 1 uur):
Opmerking: In de volgende 3.4.1-3.4.3 worden drie voorbeelden van de covalente koppeling van verschillende probe-moleculen de AFM tip beschreven. Voor elk molecuul het protocol moet worden aangepast. Merk verder op, dat in voorbeeld 1 en 3 NHS-chemie wordt gebruikt terwijl in voorbeeld 2 de thiol gefunctionaliseerde polymeer PI g-PS is gekoppeld met de PEG via maleïmide-chemie. Voor details zie 14.- Voor poly (aminozuur) poly-D-tyrosine (40-100 kDa)
- Los de polytyrosine geconjugeerd probemolecuul in 1 M NaOH. Stel de concentratie 1 mg / ml.
- Wisselen de NaOH voor natriumboraatbuffer (pH 8,1) gebruik makend van spin ontzouten kolommen (7 kDa MWCO) onmiddellijk vóór de functionalisering
- Spoel de cantilevers eerst met 5 ml chloroform, gevolgd door 5 ml ethanol en tenslotte met 5 ml boraatbuffer.
- Incubeer de cantilever chips voor 1 uur in de polytyrosine boraatbufferoplossing en spoel na met boraatbufferen ultrapuur water. Opslaan in ultrapuur water totdat de meting.
- Voor polymeren met een lineaire hoofdketen (polyisopreen, 119 kDa) met geënte zijketens (polystyreen, 88 kDa) 14
- Ontbinding van de PI-g -PS in droge chloroform. Stel de concentratie van de conjugatie oplossing van 4 mg / ml.
- Spoel de cantilevers met 5 ml chloroform en incubeer gedurende ten minste 1 uur in de conjugatie oplossing.
- Spoel opnieuw in 5 ml chloroform en opslaan in chloroform in een chloroform-verzadigde omgeving tot de meting (chloroform verdamping te voorkomen).
- Voor de lipide POPE
- Ontbinden PAUS in droge chloroform. Stel de concentratie 20 mM.
- Spoel de cantilevers met 5 ml ethanol en 5 ml ultrazuiver water voor de incubatie van de cantilevers gedurende 1 uur in de lipideoplossing.
- Na incubatie, spoelen cantilevers met 5 ml chloroform, 5 ml ethanol en 5 ml warm, ultrapuur water (in deze volgorde) om ongebonden probemoleculen te verwijderen en om zich te ontdoen van chloroform resten te krijgen. Gebruik gefunctionaliseerde tips onmiddellijk. Als alternatief, bewaar ze in chloroform totdat het nodig is.
- Voor poly (aminozuur) poly-D-tyrosine (40-100 kDa)
Figuur 1. (A) Schematische tentoonstelling het topje functionalizering proces met behulp van het voorbeeld van de NHS chemie. (B) Chemische binding gebruikt om een sonde molecuul aan de tip hechten via een aminogroep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
4. Voorbereiding van de oppervlakte
- Zelf-geassembleerde monolaag (SAM)
OPMERKING: oppervlak voor het eerste voorbeeld, werd een zelf samengestelde monolaag gekozen. Verwijzen naar literatuur 15 - Schoon objectglaasjes met een reinigingsmiddel en vervolgens tweemaal in ultrazuiver water in een ultrasoon bad gedurende 30 minuten elk. Dan, als een extra reinigingsstap, plaats ze in de RCA-oplossing (zie stap 2.3) bij 75 ° C gedurende 15 min.
- De vacht van de dia's met 10 nm chroom nikkel en 100 nm goud in een vacuüm coater. Bewaar vervolgens in de koelkast en schoon weer de RCA oplossing onmiddellijk voor de volgende stap.
- Incubeer de glaasjes van de voorgaande stap in 2 mM 1-dodecanthiol / ethanol oplossing gedurende 12 uur. De thiolgroepen binden aan het gouden oppervlak en een hydrofobe monolaag zelf assembleert. De dia's met ethanol en ultrapuur water en daarna droog te spoelen door een stroom van stikstofgas. Bevestig de hydrofobiciteit van het voorbereide oppervlak met statische contacthoek metingen in een goniometer met een CCD-camera 10.
OPMERKING: als oppervlak voor het tweede voorbeeld werd een waterstof beëindigd diamant gekozen. De voorbehandeling werd uitgevoerd zoals eerder 16 beschreven.
Opmerking: In het laatste voorbeeld een oppervlak ondersteunde lipide dubbellaag (SLB) werd gebruikt als een oppervlak. Om zo'n oppervlak te verkrijgen, een oplossing (0,1 mg / ml) van grote unilamellaire vesicles (LUV), bestaande uit het fosfolipide POPC werden gevormd door de extrusiewerkwijze. Dan 50 ul van de LUV oplossing werd op een vers gekliefd micablad (A = 1 cm²) gebracht en gedurende 30 min. Tenslotte wordt de oplossing werd gespoeld met 20 ml ultrazuiver water. Zie 17,18 voor een uitgebreide beschrijving van de voorbereiding van SLBs.
5. Data Acquisition
OPMERKING: Voor de experimenten, gebruik een AFM, die de mogelijkheid om te meten in vloeistoffen biedt. De data-acquisitie en data-analyse procedures zijn van toepassing ongeacht de AFM gebruikte model. Voorts zijn op experimenten is het voordelig om de mogelijkheid om de temperatuur te regelene in de vloeistof cel. Cantilever doorbuiging werd ontdekt via de laserstraal doorbuiging methode 19. Veerconstanten werden bepaald met de thermische ruis methode 20.
- Plaats de gefunctionaliseerde cantilever in een AFM cantilever houder die geschikt is voor het meten in fluïda.
- Zet het oppervlak (bereiding zie hierboven) te bemonsteren in de AFM en bedek het met vloeistof. Beide, cantilever en oppervlak moet nu worden ondergedompeld in de vloeistof met de cantilever tip wees naar het oppervlak. Merk op dat in veel gevallen een druppel vloeistof voldoende. In elk geval verdamping van de vloeistof moet worden vermeden, bijvoorbeeld door het gebruik van een gesloten fluïdumcel.
- Indien van toepassing, de gewenste temperatuur op de controller.
- Laat het systeem in evenwicht komen voor ten minste een half uur.
- Neem een thermische ruis spectrum van de cantilever met cantilever ver van het vlak zodat elk oppervlak demping sluiten. Merk op dat gewoonlijk 10 of meer spectra moeten worden verzameld om een voldoende signaal-ruisverhouding te verkrijgen.
- Benader het oppervlak. Merk op dat om tipgeometrie en tip functionalisering instandhouding aanpak proces moet zorgvuldig worden uitgevoerd. Dit kan worden bereikt door bijvoorbeeld benaderen intermitterende contact mode.
- Bepaal de inverse optische hendel gevoeligheid (InvOLS) gemeten in nm / volt. Doe dit door op de cantilever tip tegen een hard oppervlak.
- Bepaal de InvOLS door meting van de helling van de piëzo reisafstand versus verandering fotodiode spanning. Breng een lijn naar het gedeelte van de kracht-afstand curve waar de cantilever tip in contact is met het oppervlak. In experimenten met een zachte ondergrond, zoals lipidendubbellagen uitvoeren van deze stap op gebieden die niet zijn bedekt met een lipide dubbellaag ('defect spots').
- Bepaal de veerconstante (PN / nm) door het aanbrengen van een harmonische oscillator naar de thermische ruis spectrum. Gebruikgeautomatiseerde software-functie voor veerconstante bepalen; literatuur 20 anders te raadplegen.
- Start het experiment.
- Record tal van kracht-afstand curves bij elke experimentele conditie. Typisch, gebruikt u de volgende waarden voor de experimentele parameters: sampling rate van 5 kHz, tip snelheid van 1 um / sec, intrekken afstand van 1 micrometer.
OPMERKING: Soms, afhankelijk van de dynamiek van de onderzochte experiment, kan het nodig zijn om een bepaalde tijd wacht met de punt in contact met het oppervlak ('dwell time).
OPMERKING: Het experiment specifieke parameters kunnen aanzienlijk afwijken van de hierboven gegeven waarden. - Bij langdurige metingen op nul laser positie op de fotodiode van tijd tot tijd door herpositionering van de fotodiode.
- Optioneel: Na elke kracht curve, verplaats de AFM-tip naar een andere xy positie.
- Aan het einde van het experiment, bepalen de gevoeligheid en de veer CONSTAnt nogmaals te controleren op consistentie en stabiliteit van het systeem.
Opmerking: Het vergelijken van de veerconstante en de gevoeligheid voor en na het experiment ook worden gewaarborgd dat de eigenschappen van het systeem en de eigenschappen van de punt bleef onveranderd in de loop van het experiment. Als het verschil van de veerconstanten niet te groot (<= 15%), kunnen zij worden gemiddeld aangezien de intrinsieke onzekerheid van veerconstante bepaling is ongeveer 15%. Voor grotere verschillen, is het raadzaam om eerst vinden en het probleem op de veranderende schijnbare veerconstante daarna door met verdere experimenten.
- Record tal van kracht-afstand curves bij elke experimentele conditie. Typisch, gebruikt u de volgende waarden voor de experimentele parameters: sampling rate van 5 kHz, tip snelheid van 1 um / sec, intrekken afstand van 1 micrometer.
6. Gegevens Voorbereiding
Opmerking: In deze sectie algemene gegevens bereidingsstappen die kenmerkend worden uitgevoerd onafhankelijk van het specifieke type experiment eenheden omschakelen Newton en nanometer alsmede corrigeren gegevens worden beschreven. Het experiment specifieke data analyses zijn briefly hieronder verder beschreven in de desbetreffende vertegenwoordiger voorbeeldsectie.
- Gewoonlijk voert alle data en analyse stappen automatisch een huis geschreven algoritme, bijvoorbeeld op basis van de software IGOR Pro 6.
- Zetten de rauwe doorbuiging signaal (Defl) [V] in werking door deze te vermenigvuldigen met de InvOLS [nm / V] en de veerconstante [nN / nm].
- Offset de kracht zodanig dat de kracht op de cantilever voldoende afstand van het oppervlak (ongeladen cantilever) wordt 0 nN.
- Bereken de actuele positie uiteinde (ook wel scheiding gemeten ten opzichte van het oppervlak) z *, die het buigen van de vrijdragende rekening houdt:
- Offset z * zodanig dat z * = 0 overeenkomt met de Z-positie van het oppervlak.
LET OP: Hier, F is de kracht die inwerkt op de punt en dus bochts de cantilever (vastgesteld in punt 6.2.), z is de gemeten z-sensor positie (rechtstreeks gegeven door het instrument) en k staat voor de veerconstante (vastgesteld in punt 5.8).
Figuur 2. Proces stroomdiagram waarop het monster voorbereiding, de data-acquisitie en data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hieronder zijn de resultaten voor de bovengenoemde voorbeeld moleculen, namelijk de polymeren poly (aminozuur) polytyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het fosfolipide POPE, gepresenteerd. Eerst voor elk voorbeeld, experimenteren specifieke details voor de data-acquisitie en data voorbereiding zijn aanwezig. Vervolgens de illustratieve resultaten voor experimenten waarbij deze moleculen werden gedesorbeerd uit verschillende oppervlakken (CH3 -SAMs, waterstof beëindigd diamant en lipide dubbellagen) getoond. Bepaling van de adhesiekracht, de hechting lengte en de vrije energie geïntroduceerd.
Voorbeeld 1: desorptie van polytyrosine van zelf-geassembleerde monolaag
De desorptie van polytyrosine uit een hydrofobe SAM in verschillende oplossingen met een variërend gehalte ethanol werd gemeten. In elke oplossing de cantilever InvOLS en veerconstanten werden bepaald zoals hierboven beschreven en ten minste 300 kracht d beschrevenistance sporen werden geregistreerd voor elke oplossing. Alle proeven van een experimentele werden uitgevoerd met een enkele cantilever op dezelfde dag dat eenzelfde enkele poly (aminozuur) gemeten waarborgen. De uitbreiding / intrekken snelheid van de cantilever was 0,5 um / sec en de verblijftijd op het oppervlak was 1 sec. De kracht afstand sporen toonde plateaus van constante kracht. Elk plateau is voorzien van een sigmoïdale curve en het plateau kracht en de plateaulengte bepaald en uitgezet in een histogram. De histogrammen werden uitgerust met een Gauss en de piekwaarde en de standaard afwijking (fout) van de distributie werd geëxtraheerd. Tot het einde van de kracht plateau, het systeem in evenwicht en het gebied onder het plateau is dus gelijk aan de vrije energie per polymeerlengte. Alleen het losmaken zelf aan het einde van het plateau in niet-evenwicht. Hierdoor voor typische experimenten het plateau langer is dan de equilibri um lengte (ongeveer 30%) en het gebied onder de sigmoïdale past een bovenste schatting voor de benodigde vrije energie 21.
Figuur 3. (A) Force afstand trace (intrekken) van polytyrosine op een methyl-SAM in zuiver water (in rood aangegeven). Slechts een enkel molecuul desorbeert zoals te zien in de stap daling van de kracht op de basislijn (nul kracht). De sigmoidale fit wordt in zwart en de uitgepakte plateau lengte en het plateau van kracht zijn aangegeven met pijlen. (B) Histogrammen van het gewonnen plateau kracht voor metingen in zuiver water en in water / ethanol mengsels met verschillende molaire ethanol inhoud. (C) Plateau lengte histogrammen van dezelfde experimentele set. (D) Peak plateau lengte vs. piek plateau van kracht. "456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3A toont een enkele kracht-afstand spoor van polytyrosine gemeten in zuiver water. Plateau kracht en plateau lengte worden gewonnen. Als er slechts één molecuul op de tip die wordt gedesorbeerd uit de SAM, de plateaulengte histogram toont een smalle monomodale verdeling (typisch in experimenten de standaarddeviatie in een gauss pasvorm van de lengte histogram is ongeveer 5-20 nm). Vice versa, als er slechts één smalle piek in het plateau lengte histogram, kan men relatief zeker van zijn dat de hele experimentele set werd gedaan met een en hetzelfde polymeer. De reden hiervoor is dat de polytyrosines zeer polydispersieve grootte (50 tot 100 kDa). Derhalve twee polymeren van dezelfde lengte zijn hoogst onwaarschijnlijk. Het toevoegen van ethanol verzwakt de hydrofobe wisselwerking tussen polytyrosine en het oppervlak 10,22 enleidt tot een lagere adsorptie vrije energie en dus een lager plateau kracht zoals te zien in het plateau kracht histogrammen voor de verschillende oplosmiddelcondities figuur 3B. Nu kan worden onderzocht hoe het plateau lengte van een enkele polytyrosine verandert voor verschillende adsorptie gratis energieën. Zoals te zien in figuur 3C de plateaulengte afneemt met de toevoeging van ethanol. Tegelijkertijd het plateau kracht afneemt (Figuur 3D).
Om alle relevante parameters van het desorptieproces namelijk de contour lengte, de lengte Kuhn, de adsorptie vrije energie en de intrinsieke monomere desorptie te verkrijgen en men de hierboven beschreven metingen combineren met constante afstand experimenten. Voor details zie 21.
Voorbeeld 2: desorptie van het entpolymeer PI- g-PS uit een hydrofoob diamant
In Figuur 4A 4B typische kracht-afstand curves verkregen met PI g -PS op gehydrogeneerde diamant in water bij kamertemperatuur worden getoond. De verblijftijd van het oppervlak was 1 sec en de snelheid van de cantilever is 1 um / sec. Ofwel plateaus van constante kracht (Figuur 4A) of scheuren werden waargenomen (Figuur 4B). Voor de plateaus van constante kracht, de hoogte van de plateaus werd bepaald met een sigmoïdale fit en de waarden in een histogram (Figuur 4C) uitgezet. Om de aspecifieke hechting piek veroorzaakt door directe interactie van de tip met het oppervlak (eerste piek in de kracht-afstand curve in Figuur 4B) bij geen van de maximale kracht in enige afstand van het oppervlak bepaald. De verkregen waarden voor deze breuk evenementen werden vervolgens uitgezet in een histogram (figuur 4D). Voor verdere analyse van de histogrammen werden uitgerust met een Gauss en de maximale hoogte werd gekozen als een gemiddelde waarde voor dedatapunt. Met dit soort experimenten de invloed van de aanwezigheid van zijketens en hun architectuur onderzocht 14.
Figuur 4. Kracht afstand terugtrekken curves uitgevoerd met een lineaire polyisopreen hoofdketen geënt met polystyreen zijketens (PI- g-PS). Beide plateaus constante kracht (A) of breuk events (B) worden waargenomen. Voor plateaus van constante kracht, wordt de hoogte van de plateaus bepaald met een sigmoidale fit en uitgezet in een histogram (C), terwijl voor de breuk gebeurtenissen, wordt de maximale breuk kracht bepaald (D). Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Voorbeeld 3: Extractie van een enkele phospholipid (PAUS) uit een lipidebilaag
Figuur 5A toont een schematische weergave van de individuele moleculen extractieproces. Extractie metingen werden uitgevoerd door verticaal naderen de POPE-gefunctionaliseerde AFM tip naar de ondersteunde lipide dubbellaag (niet getoond). Bij contact van de tip met de POPC bilaag, is een kleine kracht (~ 100 pN) constant gehouden door een terugkoppellus ongeveer 4 sec. Als de paus molecuul voegt in de dubbellaag tijdens deze wachttijd wordt uitgetrokken of 'gewonnen' van de dubbellaag na het terugtrekken van de AFM tip van de dubbellaag. Dit resulteert in karakteristieke kracht-afstand curves. De vorm wordt grotendeels bepaald door het strekken elasticiteit van de PEG-linker kan worden aangebracht door een wormachtige keten (WLC) model 23. Een superpositie van meer dan 50 curven in figuur 5B. True enkel molecuul gebeurtenissen kunnen worden herkend door enkele piek kracht histogrammen (figuur 5C ong>). Merk op dat om verder inzicht te krijgen in de omvang van bepaalde moleculaire parameter (bijvoorbeeld de gemiddelde levensduur van lipiden in bilagen), is het noodzakelijk om metingen met verschillende kracht beladingspercentages voeren. Voor verdere analyse van enkele vetextractie experimenten zie 24.
Figuur 5 (A) Schema voor de winning van een enkel molecuul van een lipide dubbellaag. Merk op dat de lipide covalent is gekoppeld aan het uiteinde. Daarom vele honderden of zelfs duizenden kracht-extractiecycli kunnen worden met één en hetzelfde molecuul uitgevoerd is. (B) Superpositie van meer dan 50 extractie curves 9. (C) Histogram van de winning krachtverdeling van de in (B) voorbeeld..jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Stap | Doel | Opgeloste stof | Solvent | Typische verhouding of concentratie |
| Silanisatie | Maak aminogroepen op cantilever oppervlak | APTES (3-aminopropyl) tri-ethoxysilaan (bijv Vectabond ™) | droge aceton | 01:50 (v / v) - 1: 100 (v / v) |
| PEGylering | Geef cantilever oppervlak met amino of thiol reactieve groepen | NHS-PEG-NHS of Mal-PEG-NHS | droog chloroform | 0,25-25 mM |
| PEGylering | Passiveren cantilever oppervlak | methyl-PEG-NHS | droog chloroform | 25 mM |
| Vervoeging van probemolecuul | Paar probemolecuul via een amino of thiol groep om bi-functionele PEG | probe molecule (polymeer, lipide, etc.) | droog chloroform of boraatbuffer | 0,1-10 mM |
Tabel 1. Oplossingen die nodig zijn voor de tip functionalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de laatste decennia hebben enkel molecuul experimenten ongekende inzichten in de moleculaire mechanismen en bleek een aanpak van onschatbare waarde in de life science en daarbuiten. Om een goede en zinvolle statistieken van SMF experimenten idealiter een en hetzelfde molecuul wordt gebruikt over de gehele loop van het experiment te bereiken. In tegenstelling tot experimenten met ensembles van moleculen, SMF's experimenten zijn in staat om zeldzame gebeurtenissen en verborgen moleculaire toestanden te detecteren. Een ander voordeel van één molecule experimenten is dat ze kunnen worden gemodelleerd met behulp van moleculaire dynamica simulaties 24,25.
De cantilever functionalisatie hierboven beschreven protocol is een aangepaste versie van procedures eerder gepubliceerd 26-28. Na activatie en silaneren, wordt de AFM cantilever gefunctionaliseerd met een mengsel van twee verschillende soorten polyethyleen-glycol (PEG) moleculen (linkermoleculen).
N- hydroxysuccinimide (NHS) groep (of een thiol reactieve maleïmidegroep), waarbij later de probe molecuul is geconjugeerd ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). Zie Figuur 1 voor een schematische weergave van de tip functionalisering. Het doel van de PEG is drieledig: Ten eerste passiveert het uiteinde oppervlak en voorkomt derhalve niet-specifieke adsorptie. Ten tweede, met een zekere methyl-PEG / NHS-PEG ratio maakt het instellen van de NHS-PEG concentratie op het tipoppervlak. En ten derde, het scheidt de tip van de sonde molecuul en zorgt daarom voor de kwantificering van de interactie molecuul-oppervlak zonder inmenging van de directe interactie tip-oppervlak. Vervolgens wordt de probe-molecuul covalent gekoppeld aan het uiteinde via de NHS-PEG (of Mal-PEG).
Dit protocol zorgt ervoor dat alle obligaties (*) in de & #8220; koppeling keten "tip * OH * silaan * PEG * probemolecuul zijn covalente bindingen en daardoor zeer sterk. Dit op zijn beurt, maakt dat een en dezelfde probe-molecuul wordt gemeten over de gehele duur van het experiment. Dit is hierboven toegelicht in de resultaten representatief gedeelte toont echte single molecule kracht spectroscopie.
Hoe kan worden geverifieerd dat echt een enkel molecuul wordt gemeten? Voor enkele sporen met plateaus van constante kracht, een enkele druppel op de basislijn is voldoende. Indien meer dan één polymeer wordt gedesorbeerd tegelijkertijd de kracht tot nul daalt in meerdere discrete stappen, zoals elk polymeer los op een ander punt. Moeilijker is om te beslissen of het is elke keer hetzelfde enkel molecuul. Daarom is de verdeling van onthechting lengten te worden geëvalueerd. Een smalle verdeling met een enkele piek is een goede indicatie dat één en dezelfde enkel molecuul werd gesondeerd in elke kracht-extensie trace. Voor enkele sporen met ruptUre gebeurtenissen, de superpositie van alle sporen is de beste methode om te beslissen of (eenzelfde) enkel molecuul werd gemeten. Als alternatief kan elk spoor worden voorzien van een (WLC) model en daarna zowel de persistentielengte en breuk lengtes bij een gedefinieerde kracht worden uitgezet. De verdeling van deze twee parameters heeft smalle en enkele piek te zijn.
Concluderend heeft bereidingsprocedure voor de bevestiging van een grote verscheidenheid van afzonderlijke moleculen AFM tips gepresenteerd. De AFM kleine tip (straal ~ 10 nm), zijn laterale positionering mogelijkheden en de kracht gevoeligheid maken het de ideale tool om de hechting eigenschappen van enkele moleculen op biologische en niet-biologische oppervlakken studeren in bijna elke vloeistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
