Abstract
التحليل الطيفي القوة الذرية هو أداة مثالية لدراسة الجزيئات في الأسطح والواجهات. ويرد بروتوكول تجريبي لزوجين مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجزيئات واحدة تساهميا على تلميح AFM. في نفس الوقت وتخمل طرف AFM لمنع التفاعلات غير محددة بين طرف والركيزة، الذي هو شرط أساسي لدراسة الجزيئات واحدة تعلق على طرف AFM. تحليلات لتحديد قوة التصاق، وطول التصاق، والطاقة الحرة من هذه الجزيئات على الأسطح الصلبة والحيوية واجهات يتم عرض قريبا ويتم توفير المراجع الخارجية لمزيد من القراءة. جزيئات سبيل المثال هي بولي (حمض أميني) polytyrosine، والكسب غير المشروع البوليمر PI- ز -PS والبابا فوسفورية (1-بالميتويل-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine). والمستوعبة هذه الجزيئات من الأسطح المختلفة مثل CH 3 -SAMs والهيدروجين إنهاء الماس وبدعم طبقات ثنائية الدهون في ظل ظروف المذيبات المختلفة. وأخيرا، فإنوتناقش مزايا القوة الطيفية التجارب جزيء واحد بما في ذلك وسيلة لتقرر ما إذا كان قد تم دراستها حقا جزيء واحد في التجربة.
Introduction
على مدى السنوات ال 30 الماضية، تحولت القوة الذرية المجهر (AFM) إلى أن تكون تقنية التصوير قيمة لدراسة البيولوجية 1،2 و 3 الاصطناعية المواد والأسطح لأنه يوفر القرار المكانية الجزيئي في جميع الأبعاد الثلاثة ويمكن تشغيلها في مختلف المذيبات البيئات. وبالإضافة إلى ذلك،-AFM واحد قوة جزيء الطيفي (SMFS) يتيح لقياس القوى بدءا من السندات الإذنية إلى μN النظام وأعطت نظرة غير مسبوقة على سبيل المثال إلى البروتين للطي 4،5، الفيزياء البوليمر 6-8، واحد التفاعل جزيء سطح 9 - 12. والأساس المنطقي وراء دراسة الجزيئات واحدة بدلا من الفرقة من الجزيئات هو تجنب آثار المتوسط والتي غالبا ما تحجب الأحداث النادرة أو الدول الجزيئية الخفية. وعلاوة على ذلك، العديد من المعلمات الجزيئية مثل طول كفاف، وطول كوهن، الطاقة الحرة التصاق، وما يمكن أن يكونالتي تم الحصول عليها. هو مفصل في هذه الأمثلة أدناه. في تجربة AFM-SMFS نموذجية، ويقترن جزيء التحقيق إلى طرف حاد جدا عن طريق جزيء رابط. يقع في الطرف نفسها في نهاية ناتئ قابل للانحناء. إذا تم إحضار طرف في اتصال مع سطح جزيء التحقيق سوف تتفاعل مع هذا السطح. من خلال مراقبة انحراف للناتئ على التراجع من طرف، والقوة، وبالتالي الطاقة الحرة، لفصل جزيء من السطح يمكن تحديده. الحصول على إحصائيات ذات معنى، لا بد من الحصول على عدد كبير من ما يسمى منحنيات قوة بعد. وعلاوة على ذلك، لدينا تجارب جزيء واحد صحيح (أي، وذلك باستخدام واحد ونفس جزيء التحقيق خلال مدة التجربة بأكملها) يجب أن يقترن جزيء التحقيق تساهميا إلى الطرف AFM. هنا، يتم تقديم بروتوكول تجريبي لناتئ functionalization مع جزيء واحد عن طريق الرابطة التساهمية. يمكن إما أن يقترن جزيء واحد عن طريق الأمينية أو ثيول مجموعة لغيض AFM. لا يمكن أن يؤديها عملية الاقتران في مجموعة واسعة من المذيبات (العضوية والمائية) لحساب خصائص انذياب من البوليمرات المستخدمة.
في الجزء الأول، وبروتوكول عام لنعلق تساهميا جزيء واحد ("جزيء التحقيق") عن طريق جزيء رابط إلى طرف AFM يوصف. تحقيقا لهذه الغاية، يتم استخدام NHS- العضوية أو maleimide الكيمياء 13. جنبا إلى جنب مع بروتوكول لمدة ثلاث جزيئات سبيل المثال، يتم وصف عمليات الحصول على البيانات وتحليل البيانات ويتم توفير المراجع لمزيد من القراءة. على سبيل المثال الجزيئات هي: (الخطية) التيروزين البوليمر، البوليمر الكسب غير المشروع PI- ز -PS والبابا الدهون. وهذا يشمل اختلافات طفيفة من البروتوكول، على سبيل المثال لنعلق تساهميا cysteines. وبالإضافة إلى ذلك، وهناك قسم مخصص لإعداد الأسطح المختلفة مثل سطح الماس، وCH 3-تجميعها المتمتعة بالحكم الذاتي أحادي الطبقة وطبقات ثنائية الدهون. هذه الواجهات لها الأقليمأون بمثابة إشارات جيدة والأمثلة على ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: انظر الشكل 2 لمحة عامة عن عملية تدفق تضم إعداد، والحصول على البيانات وتحليل البيانات الخطوات.
1. إعداد الكاشف
ملاحظة: يجب أن يتم التعامل مع جميع المواد الكيميائية مع الرعاية، وبالتالي معطف المختبر، والقفازات وحماية العين يجب استخدامها. يجب إجراء جميع العمليات في غطاء المختبر. على وجه الخصوص، وينبغي ارتداء قفازات خاصة في حالة استخدام الكلوروفورم.
- استخدام المواد الكيميائية مع نسبة منخفضة من المياه مثل الكلوروفورم الجافة بسرعة وتخزين الجاف ولكن ليس لفترة أطول من أسبوع. تخزين كل المواد الكيميائية في -20 ° C وتحت النيتروجين أو الأرجون الغاز بسبب APTES ((3-أمينو) triethoxysilan) (انظر الجدول 1) وPEG (polyethylenglycol) هي استرطابي وPEG يخضع للأكسدة في الهواء.
- لتجنب التعرض المتكرر من المخزون في الأكسجين في الغلاف الجوي والرطوبة، وإعداد مأخوذة أصغر، من الناحية المثالية ضمن نظام صندوق قفازات مع atmosphe النيتروجينإعادة.
2. معدات إعداد
ملاحظة: لتجنب احتمال انتقال التلوث، واستخدام سفن جديدة ونظيفة لكل خطوة.
- الأواني الزجاجية وملاقط في حل المنظفات لمدة 30 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 60 ° C نظيفة.
- شطف والمعدات يصوتن من الخطوة 2.1 مرتين جيدا بالماء عالى النقاء.
- المعدات الحرارة من الخطوة 2.1 في حل RCA (الماء عالى النقاء، بيروكسيد الهيدروجين والأمونيا (5: 1: 1)) إلى 75 درجة مئوية في الفرن لمدة 45 دقيقة وبعد ذلك شطف لهم مع الماء عالى النقاء.
- وأخيرا، تجفيف الأواني الزجاجية وملاقط تحت سيل من النيتروجين الجاف أو في الفرن (100 درجة مئوية، 3 ساعة).
3. تلميح Functionalization
ملاحظة: استخدام ملاقط، السفن، الخ مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، PTFE، الزجاج أو أي مادة أخرى الذي هو مستقر كيميائيا في المحاليل العضوية إن وجدت. ما لم ينص على خلاف ذلك، تنفيذ جميع الخطوات في RT. ويتعين على كمية من محلول الحضانة يعتمد على عدد من رقائق ناتئ. تأكد من أن الكابولي مغمورة في الحلول منها في كل وقت.
ملاحظة: استخدم غطاء محرك السيارة لتجنب استنشاق الأبخرة العضوية.
- تشكيل OH-مجموعات على سطح ناتئ ('تفعيل') (حوالي 0.5 ساعة):
- استخدام ملاقط لوضع رقائق جديدة ناتئ (المواد: الخطيئة، ربيع ثابت: 10-100 السندات الإذنية / نانومتر) على شريحة زجاجية نظيفة ووضعها في غرفة البلازما (100 W).
- إخلاء الغرفة (~ 0.1 م بار).
- غرفة الفيضانات مع غاز الأكسجين وإجلاء مرة أخرى.
- تفعيل عملية البلازما (الطاقة: 20٪، والمدة: 15 دقيقة، وضغط العملية: 0.25 م بار).
- الأمينية silanization من الكابولي (حوالي 1 ساعة):
- إعداد 2.5 مل من محلول APTES (انظر الجدول 1) في طبق بتري الزجاج - قيام بذلك بشكل مثالي أثناء عملية البلازما.
- فوراذ بعد عملية البلازما، وتراجع كل ناتئ ل1 ثانية في الأسيتون ووضعها بعد ذلك على الفور في الحل APTES.
- احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- شطف بعناية رقائق ناتئ مرتين في 10 مل الأسيتون ومرة واحدة في 10 مل الكلوروفورم.
- اختياري النهائية الخطوة: رقائق مكان ناتئ من الخطوة السابقة على شريحة زجاجية نظيفة وخبز لهم لمدة 30 دقيقة في 70 ° C. لاحظ أن هناك أيضا استراتيجيات بديلة لتفعيل السطح، على سبيل المثال، العلاج بالأشعة فوق البنفسجية (12).
- من مضاد (حوالي 2 ساعة):
ملاحظة: إجراء الخطوات 3.3.1-3.3.4 خلال الأمينية silanization. NHS والجماعات maleimide تخضع لالتحلل في البيئات المائية وPEG نفسه يخضع للأكسدة في الهواء. لذا توقيت (وخاصة في فترة ما بين الخطوات) معلمة حرجة. الرجوع إلى (13) لمزيد من المعلومات.- إعداد الحل الكلوروفورم (انظر الجدول 1).
- لتجنب تكاثفودافئة PEG المسحوق حتى RT قبل فتح قسامة وزنها المبلغ المناسب.
- لاقتران البوليمرات أو الدهون مع جماعات الأمينية، حل على حدة NHS-PEG-NHS (6 كيلو دالتون) وميثيل-PEG-NHS (5 كيلو دالتون) في حل الكلوروفورم قبل vortexing لهم حتى يتم حلها أنهم تماما. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لتركيزات.
- بدلا من ذلك. لاقتران البوليمرات مع مجموعات ثيول حل منفصل المال-NHS- PEG وميثيل-PEG-NHS في حل الكلوروفورم.
- مزيج من الحلول على النحو المطلوب لضبط نسبة عدد معينة بين NHS- أو maleimide- والجزيئات PEG منتهية الميثيل (عادة 1: 500). لاحظ أن النسبة المثالية لابد من تحديد تكرارا في سلسلة من دورات إعداد-التجربة.
- احتضان رقائق ناتئ في حل PEG لمدة 1 ساعة ضمن الكلوروفورم المشبعة الغلاف الجوي لمنع التبخر من الكلوروفورم.
- بحث اقتران جزيء(> 1 ساعة):
ملاحظة: في 3.4.1-3.4.3 التالية، وصفت ثلاثة أمثلة لاقتران التساهمية من الجزيئات التحقيق المختلفة لطرف AFM. لكل جزيء بروتوكول لابد من تعديلها. مزيد من المذكرة، التي يتم استخدامها في المثال 1 و 3 NHS الكيمياء بينما في المثال 2 يقترن ثيول بين functionalized البوليمر PI- ز -PS إلى PEG عبر maleimide الكيمياء. لمزيد من التفاصيل انظر 14.- للبولي (حمض أميني) بولي-D-التيروزين (40-100 كيلو دالتون)
- حل polytyrosine مترافق جزيء التحقيق في 1 M هيدروكسيد الصوديوم. ضبط تركيز إلى 1 ملغ / مل.
- تبادل هيدروكسيد الصوديوم لعازلة بورات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.1) باستخدام الأعمدة تدور تحلية (7 كيلو دالتون MWCO) مباشرة قبل functionalization
- شطف الكابولي لأول مرة مع 5 مل من الكلوروفورم، ثم مع 5 مل من الايثانول وأخيرا مع 5 مل من العازلة بورات.
- احتضان رقائق ناتئ لمدة 1 ساعة في حل العازلة polytyrosine بورات ثم شطف مع العازلة بوراتوالماء عالى النقاء. تخزين في الماء عالى النقاء حتى القياس.
- للبوليمرات مع العمود الفقري الخطي (polyisoprene، 119 كيلو دالتون) وجود السلاسل الجانبية المطعمة (البوليسترين، 88 كيلو دالتون) 14
- حل PI- ز -PS في الكلوروفورم الجاف. ضبط تركيز المحلول الاقتران إلى 4 ملغ / مل.
- شطف الكابولي مع 5 مل من الكلوروفورم واحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في الحل الاقتران.
- شطف مرة أخرى في 5 مل من الكلوروفورم وتخزين في الكلوروفورم في بيئة مشبعة الكلوروفورم (لمنع التبخر الكلوروفورم) حتى القياس.
- لPOPE الدهون
- حل البابا في الكلوروفورم الجاف. ضبط تركيز إلى 20 ملم.
- شطف الكابولي مع 5 مل من الايثانول و 5 مل من الماء عالى النقاء قبل الحضانة من الكابولي لمدة 1 ساعة في الحل الدهون.
- بعد مرور فترة الحضانة، وشطف الكابولي مع 5 مل من الكلوروفورم، 5 مل من ethanoلتر و 5 مل من المياه الدافئة وعالى النقاء (في هذا النظام) لإزالة جزيئات التحقيق غير منضم وللتخلص من بقايا الكلوروفورم. استخدام النصائح بين functionalized على الفور. بدلا من ذلك، وتخزينها في الكلوروفورم لحين الحاجة إليها.
- للبولي (حمض أميني) بولي-D-التيروزين (40-100 كيلو دالتون)
الشكل 1. (A) تخطيطي يظهر عملية functionalization طرف باستخدام المثال من NHS الكيمياء. الرابطة (B) الكيميائية المستخدمة لإرفاق جزيء التحقيق الى معلومات سرية عبر مجموعة الأمينية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. إعداد السطح
- أحادي الطبقة الذاتي تجميعها (SAM)
ملاحظة: كما السطح لأول مثال، تم اختيار أحادي الطبقة الذاتي تجميعها. الرجوع إلى الأدب 15 - شرائح زجاجية نظيفة بمحلول منظف ثم مرتين في الماء عالى النقاء في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة لكل منهما. ثم، باعتباره خطوة التنظيف الإضافية، ووضعها في حل RCA (راجع الخطوة 2.3) في 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- معطف الشرائح مع 10 نانومتر النيكل والكروم والذهب 100 نانومتر في المغطي فراغ. ثم تخزينها في الثلاجة ونظيفة مرة أخرى في حل RCA مباشرة قبل الخطوة التالية.
- احتضان الشرائح من الخطوة السابقة في 2 ملي حل 1-dodecanthiol / الإيثانول لمدة 12 ساعة. المجموعات ثيول ربط إلى السطح الذهب ويجمع أحادي الطبقة النفس مسعور. شطف الشرائح مع الايثانول والماء عالى النقاء وجاف ثم من قبل تيار من غاز النيتروجين. تأكيد للا مائية من سطح استعداد مع القياسات زاوية الاتصال ثابتة في مقياس الزوايا مع كاميرا CCD 10.
ملاحظة: كما سطح للمثال الثاني، تم اختيار الهيدروجين إنهاء الماس. تم إجراء إعداد السطح كما هو موضح سابقا (16).
ملاحظة: في المثال الأخير، تم استخدام سطح بدعم الدهون طبقة ثنائية (SLB) كسطح. للحصول على مثل هذا السطح، وتم تشكيل حل (0.1 ملغ / مل) من الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs)، ويتألف من POPC فسفوليبيد بواسطة طريقة قذف. ثم وضعت 50 ميكرولتر من الحل LUV على ورقة الميكا المشقوق حديثا (A = 1 سم مربع) وحضنت لمدة 30 دقيقة. وأخيرا تم تشطف الحل مع 20 مل من الماء عالى النقاء. انظر 17،18 للحصول على وصف مفصل لإعداد SLBs.
5. الحصول على البيانات
ملاحظة: للحصول على هذه التجارب، استخدم AFM، والذي يوفر القدرة على قياس في السوائل. إجراءات الحصول على البيانات وتحليل البيانات قابلة للتطبيق بغض النظر عن نموذج AFM المستخدمة. وعلاوة على ذلك، في بعض التجارب أنه من المفيد أن يكون لديك إمكانية للسيطرة على درجة حرارةالبريد داخل الخلية السائلة. تم الكشف عن ناتئ انحراف عن طريق شعاع الليزر طريقة انحراف 19. تم تحديد الثوابت الربيع مع أسلوب الضوضاء الحرارية 20.
- أدخل ناتئ بين functionalized إلى حامل ناتئ AFM الذي هو مناسبة لقياس في السوائل.
- وضع السطحية (إعداد انظر أعلاه) لأخذ عينات في AFM وتغطية ذلك مع السائل. كلا، الآن يجب أن تكون مغمورة ناتئ والسطحية في السائل مع طرف ناتئ مشيرا نحو السطح. لاحظ أنه في كثير من الحالات قطرة من السائل بما فيه الكفاية. في أي حال تبخر السائل ينبغي تجنبها، على سبيل المثال، باستخدام خلية السوائل مغلقة.
- إذا كان ذلك ممكنا، وضبط درجة الحرارة المطلوبة على وحدة تحكم.
- السماح للنظام تتوازن لمدة ساعة ونصف على الأقل.
- تسجيل الطيف الضوضاء الحرارية للتعزية مع ناتئ بعيدا عن السطح من أجل استبعاد أي سطح التخميد الآثار. لاحظ أن عادة 10 أو أكثر أطياف يجب أن المتراكمة في الحصول على نسبة كافية إشارة إلى الضوضاء.
- الاقتراب من السطح. لاحظ أنه من أجل الحفاظ على الهندسة طرف وطرف functionalization عملية النهج يجب أن تنفذ بعناية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال، على سبيل المثال، وتقترب في وضع الاتصال على فترات متقطعة.
- تحديد حساسية عكسية البصرية رافعة (InvOLS) تقاس نانومتر / فولت. القيام بذلك عن طريق الضغط على طرف ناتئ ضد سطح صلب.
- تحديد InvOLS عن طريق قياس المنحدر من مسافة السفر بيزو مقابل التغير في الجهد الثنائي الضوئي. تناسب سطر إلى جزء من منحنى القوة لمسافات حيث رأس ناتئ على اتصال مع السطح. في التجارب التي تنطوي على سطح ناعم مثل طبقات ثنائية الدهون، تنفيذ هذه الخطوة على المناطق التي لا تغطيها مع طبقة ثنائية الدهون (المواقع عيب ').
- تحديد ثابت الربيع (السندات الإذنية / نانومتر) من خلال تركيب مذبذب التوافقي لطيف الضوضاء الحرارية. استعمالوظيفة البرنامج الآلي لفصل الربيع تقرير المستمر. استشارة خلاف ذلك الأدب 20.
- بدء التجربة.
- تسجيل منحنيات العديد من القوة لمسافات في كل حالة تجريبية. عادة، استخدم القيم التالية للمعلمات التجريبية: أخذ العينات بمعدل 5 كيلو هرتز، سرعة غيض من 1 ميكرون / ثانية، والتراجع مسافة 1 ميكرون.
ملاحظة: في بعض الأحيان، وهذا يتوقف على ديناميات التجربة التي تمت دراستها، قد يكون من الضروري الانتظار لفترة معينة من الوقت مع طرف على اتصال مع سطح ('يسكن الوقت').
ملاحظة: التجربة معايير محددة يمكن أن تنحرف كثيرا عن القيم المذكورة أعلاه. - خلال القياسات على المدى الطويل، الصفر موقف الليزر على الثنائي الضوئي من وقت لآخر تغيير موضع الضوئي.
- اختياري: بعد كل منحنى القوة، انتقال وAFM طرف لموقف س ص آخر.
- في نهاية التجربة، وتحديد حساسية وربيع constaالإقليم الشمالي مرة أخرى للتحقق من الاتساق واستقرار النظام.
ملاحظة: مقارنة ثابت الربيع وحساسية قبل وبعد التجربة هو أيضا وسيلة للتأكد من أن خصائص النظام وخصائص الطرف لم تتغير على مدى التجربة. إذا كان الفرق من الثوابت الربيع ليست كبيرة جدا (<= 15٪)، ويمكن في المتوسط، منذ اليقين لا يتجزأ من الربيع تقرير المستمر هو أيضا حوالي 15٪. الاختلافات الكبيرة، فإنه من المستحسن أن تجد أولا، والقضاء على سبب لتغيير ثابت الربيع واضح قبل الاستمرار مع مزيد من التجارب.
- تسجيل منحنيات العديد من القوة لمسافات في كل حالة تجريبية. عادة، استخدم القيم التالية للمعلمات التجريبية: أخذ العينات بمعدل 5 كيلو هرتز، سرعة غيض من 1 ميكرون / ثانية، والتراجع مسافة 1 ميكرون.
6. إعداد البيانات
ملاحظة: في هذا القسم العام خطوات إعداد البيانات التي عادة ما تنفذ مستقلة عن نوع معين من تجربة لتحويل وحدات لنيوتن ونانومتر وكذلك لتصحيح وصفها البيانات. تحليلات بيانات محددة التجربة هي غرفة واحدةوصف iefly مزيد من أدناه في المثال ممثل القسم المعني.
- عادة، القيام بجميع إعداد البيانات وتحليلها الخطوات تلقائيا باستخدام خوارزمية مكتوبة بخط المنزل، على سبيل المثال، على أساس برنامج ايغور برو 6.
- تحويل إشارة انحراف الخام (Defl) [V] حيز التنفيذ بضرب ذلك مع InvOLS [نانومتر / V] وربيع دائم [ن ن / نانومتر].
- معادلة القوة في مثل هذه الطريقة أن القوة على ناتئ في مسافة كافية من على سطح الأرض (ناتئ تفريغ) تصبح 0 ن ن.
- حساب موقف الطرف الفعلي (وتسمى أيضا الفصل عند قياسها بالنسبة لسطح) Z *، والتي تأخذ الانحناء للتعزية في الاعتبار:
- تعويض ض * في مثل هذه الطريقة التي ض * = 0 يتوافق مع موقف ض من السطح.
ملاحظة: وهنا، F هي القوة التي تعمل على طرف، وبالتالي منحنىليالي ناتئ (تحديدها في الخطوة 6.2.)، ض هو موقف ض استشعار قياس (بالنظر مباشرة من قبل الصك) و k يمثل ثابت الربيع (تحديدها في الخطوة 5.8).
الشكل 2. عملية الرسم البياني لسير العمليات يبين إعداد العينات، والحصول على البيانات وتحليل البيانات. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في ما يلي، نتائج ما سبق ووصفت جزيئات سبيل المثال، وهي بوليمرات بولي (حمض أميني) polytyrosine، والكسب غير المشروع البوليمر PI- ز -PS والبابا فوسفورية، وتعرض. أولا لكل سبيل المثال، تجربة تفاصيل محددة للحصول على البيانات وإعداد البيانات يتم توفيرها. ثم، يتم عرض نتائج نموذجية للتجارب حيث تم المستوعبة هذه الجزيئات من السطوح المختلفة (CH 3 -SAMs والهيدروجين إنهاء الماس والدهون طبقات ثنائية). يتم تقديم تقرير من قوة التصاق، وطول التصاق والطاقة الحرة.
مثال 1: الامتزاز من polytyrosine من أحادي الطبقة الذاتي تجميعها
تم قياس الامتزاز من polytyrosine من SAM مسعور في حلول مختلفة مع محتوى متفاوتة من الايثانول. في كل حل تم تحديد InvOLS ناتئ والثوابت الربيع كما هو موضح أعلاه وقوة 300 د على الأقلوسجلت آثار istance لكل حل. وقد أجريت جميع التجارب من مجموعة تجريبية واحدة مع ناتئ واحد في يوم واحد لضمان واحد ونفس واحد بولي (حمض أميني) وقد تم قياس. وكانت سرعة تمديد / تراجع من 0.5 ميكرون ناتئ / ثانية وكان زمن السكون على سطح 1 ثانية. وأظهرت آثار المسافة القوة الهضاب من قوة ثابتة. تم تجهيز كل هضبة مع وتم تحديد منحنى السيني والقوة هضبة فضلا عن طول الهضبة وتآمر في الرسم البياني. تم تركيب رسوم بيانية مع التمويه وقيمة الذروة فضلا عن معيار الاختلاف (خطأ) من تم استخراج التوزيع. حتى النهاية من الهضبة القوة، فإن هذا النظام في حالة توازن، وبالتالي فإن منطقة تحت هضبة يساوي الطاقة الحرة في طول البوليمر. فقط عملية مفرزة نفسها في نهاية الهضبة هي في عدم التوازن. وبسبب هذا، لإجراء التجارب النموذجية طول هضبة أطول من equilibri أم طول (حوالي 30٪) ومنطقة تحت السيني يناسب لتقديرات عليا للالتصاق الطاقة الحرة 21.
الشكل 3. (A) قوة المسافة أثر (سحب) من polytyrosine على ميثيل SAM في الماء النقي (كما هو موضح باللون الأحمر). فقط جزيء واحد desorbs كما يمكن أن يرى في انخفاض خطوة واحدة من القوة إلى خط الأساس (قوة صفر). يظهر صالح السيني بالأسود ويشار إلى طول هضبة استخراج وقوة الهضبة التي كتبها السهام. (B) المدرج الإحصائي للقوة هضبة المستخرجة للقياسات في الماء النقي والخلائط المياه / الإيثانول مع مختلف محتوى الإيثانول المولي. (C) هضبة رسوم بيانية طول نفس المجموعة التجريبية. (D) طول قمة الهضبة مقابل قوة هضبة الذروة ".456 / 52456fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبين الشكل 3A واحد أثر قوة مسافة polytyrosine قياس في الماء النقي. يتم استخراج قوة الهضبة وطول الهضبة. إذا كان هناك جزيء واحد فقط على الطرف الذي المستوعبة من SAM، يظهر طول هضبة الرسم البياني توزيع الضيق وmonomodal (عادة في التجارب الانحراف المعياري في نوبة غاوس من طول المدرج حوالي 5-20 نانومتر). بالعكس، إذا كان هناك ذروة الضيقة واحدة فقط في طول هضبة الرسم البياني، يمكن للمرء أن يكون متأكدا نسبيا والتي تم القيام به مجموعة التجريبية كله مع واحد ونفس البوليمر. والسبب في ذلك هو أن polytyrosines هي polydispersive جدا في الحجم (50 إلى 100 كيلو دالتون). ولذلك، اثنين من البوليمرات لازالت بنفس طول واردا للغاية. إضافة الإيثانول يضعف التفاعل بين مسعور polytyrosine وسطح 10،22 ويؤدي إلى خفض الطاقة الحرة الامتزاز وبالتالي إلى قوة الهضبة السفلى كما يمكن أن يرى في رسوم بيانية قوة الهضبة لظروف المذيبات المختلفة هو مبين في الشكل 3B. الآن يمكن أن يتم التحقيق كيف أن طول الهضبة من polytyrosine احد يتغير لمختلف الطاقات المجانية الامتزاز. كما يمكن أن يرى في الشكل 3C يقلل من طول الهضبة مع إضافة الإيثانول. في الوقت نفسه انخفاض القوة الهضبة (الشكل 3D).
من أجل الحصول على جميع المعلمات ذات الصلة في عملية الامتزاز وهي طول كفاف، وطول كوهن، الطاقة الحرة الامتزاز ومعدل الامتزاز أحادى جوهري، على المرء أن الجمع بين القياسات المذكورة أعلاه مع التجارب مسافة ثابتة. لمزيد من التفاصيل انظر 21.
مثال 2: الامتزاز من الكسب غير المشروع البوليمر PI- ز -PS من الماس مسعور
في الشكل 4A 4B منحنيات القوة لمسافات نموذجية تم الحصول عليها مع PI- ز -PS على الماس المهدرجة في الماء عند RT. كان زمن السكون على سطح 1 ثانية، وكانت سرعة ناتئ 1 ميكرون / ثانية. وقد لوحظت إما الهضاب من قوة ثابتة (الشكل 4A) أو الأحداث تمزق (الشكل 4B). لالهضاب من قوة ثابتة، تم تحديد ارتفاع الهضاب مع نوبة السيني وتم رسم القيم في الرسم البياني (الشكل 4C). استبعاد الذروة التصاق غير محددة الناجمة عن التفاعل المباشر من طرف مع سطح (الذروة الأولى في منحنى القوة لمسافات في الشكل 4B)، تم تحديد القوة القصوى في بعض المسافة من السطح. ثم تم رسم القيم التي تم الحصول عليها لهذه الأحداث تمزق في الرسم البياني (الشكل 4D). لمزيد من التحليل تم تركيب رسوم بيانية مع التمويه واختار من ذروة القصوى كمتوسط قيمة للنقطة بيانات. مع هذا النوع من التجربة والتحقيق في تأثير وجود السلاسل الجانبية وعمارتها 14.
ويلاحظ الشكل 4. قوة لمسافات منحنيات تراجع أداؤها مع العمود الفقري polyisoprene الخطي المطعمة مع سلاسل الجانب البوليسترين (PI- ز -PS). اما الهضاب من قوة ثابتة (A) أو الأحداث تمزق (B). لالهضاب من قوة ثابتة، يتم تحديد ارتفاع الهضاب مع نوبة السيني وتآمر في الرسم البياني (C) في حين لأحداث تمزق، يتم تحديد قوة تمزق القصوى (D). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
مثال 3: إزالة هواتف واحدspholipid (البابا) من طبقة ثنائية الدهون
ويبين الشكل 5A التمثيل التخطيطي لعملية استخراج جزيء واحد. أجريت القياسات الاستخراج عن طريق الاقتراب عموديا طرف AFM البابا بين functionalized نحو طبقة ثنائية الدهون دعمت (لا يظهر). بناء على اتصال من طرف مع طبقة ثنائية POPC، يتم الاحتفاظ قوة صغيرة (~ 100 السندات الإذنية) ثابتة من قبل حلقة التغذية المرتدة لمدة 4 ثانية. إذا إدراج جزيء البابا في طبقة ثنائية خلال هذا الوقت يسكن، يتم سحبها بها أو "المستخرج" من طبقة ثنائية على التراجع غيض AFM من طبقة ثنائية. هذه النتائج في منحنيات مميزة قوة بعد. يتم تحديد شكلها أساسا من مرونة تمتد من رابط PEG ويمكن تركيبها من قبل سلسلة wormlike (WLC) نموذج 23. ويرد تراكب أكثر من 50 المنحنيات في الشكل 5B. ويمكن التعرف على الأحداث الحقيقية جزيء واحد عن طريق رسوم بيانية واحدة القوة بلغت ذروتها (الشكل 5C اونج>). لاحظ أنه من أجل كسب مزيد من التبصر في حجم بعض المعلمة الجزيئية (على سبيل المثال، في الوقت نفسه حياة الدهون في طبقات ثنائية)، فمن الضروري إجراء قياسات مختلفة مع معدلات القوة التحميل. لمزيد من التحليل من الدهون واحد التجارب استخراج يرى 24.
الشكل 5. (A) تخطيطي لاستخراج جزيء واحد من طبقة ثنائية الدهون. لاحظ أن جزيء الدهون ويقترن تساهميا إلى الحافة. لذلك، فإن العديد من مئات أو حتى آلاف من دورات قوة استخراج يمكن القيام بها مع واحد ونفس الجزيء. (B) تراكب أكثر من 50 منحنيات استخراج 9. (C) الرسم البياني لتوزيع قوة استخراج المثال المعروض في (B)..JPG "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خطوة | هدف | المذاب | مذيب | نسبة نموذجية أو تركيز |
| Silanization | إنشاء مجموعات الأمينية على سطح ناتئ | APTES (3-أمينو) ثلاثي ethoxysilane (على سبيل المثال، Vectabond ™) | الأسيتون الجاف | 01:50 (ت / ت) - 1: 100 (V / V) |
| من مضاد | توفير سطح ناتئ مع الأمينية أو مجموعات رد الفعل ثيول | NHS-PEG-NHS أو المال-PEG-NHS | الكلوروفورم الجاف | ،25-25 ملي |
| من مضاد | إيقاف فاعلية سطح ناتئ | الميثيل-PEG-NHS | الكلوروفورم الجاف | 25 ملي |
| الإقتران من جزيء التحقيق | زوجين جزيء التحقيق عبر مجموعة الأمينية أو ثيول إلى PEG ثنائية وظيفية | جزيء التحقيق (البوليمر، الدهون، الخ) | الكلوروفورم الجاف أو عازلة بورات | ،1-10 ملي |
الجدول 1. الحلول اللازمة لfunctionalization طرف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلال العقود الماضية، قدمت التجارب جزيء واحد رؤى غير مسبوقة في الآليات الجزيئية وتبين أن هذا النهج لا تقدر بثمن في علوم الحياة وخارجها. لتحقيق إحصاءات جيدة وذات مغزى من التجارب SMFS، من الناحية المثالية واحد ويتم استخدام نفس الجزيء على مدى كاملة من التجربة. وعلى النقيض من التجارب مع مجموعات من الجزيئات، والتجارب SMFS قادرة على كشف الأحداث النادرة والدول الجزيئية الخفية. ميزة أخرى من التجارب جزيء واحد هو أنها يمكن أن تكون على غرار عن طريق ديناميات المحاكاة الجزيئية 24،25.
بروتوكول ناتئ functionalization المذكورة أعلاه هو نسخة معدلة من الإجراءات التي تم نشرها مسبقا 26 - 28. بعد التنشيط وsilanization، وبين functionalized ناتئ AFM مع خليط من نوعين مختلفين من البولي ايثلين جليكول-(PEG) جزيئات (جزيئات رابط).
الصورة = "jove_content"> يتم إنهاء أول رابط-PEG من قبل مجموعة الميثيل الخاملة ("الميثيل-PEG")، والثانية من قبل hydroxysuccinimide N--الأمينية رد الفعل (NHS) المجموعة (أو مجموعة maleimide رد الفعل ثيول)، حيث في وقت لاحق على جزيء التحقيق هو مترافق ("NHS-PEG"، "المال-PEG"). انظر الشكل 1 لالتخطيطي لfunctionalization طرف. الغرض من PEG هو ثلاثة أضعاف: أولا، passivates سطح طرف، وبالتالي يمنع امتصاص غير محددة. الثانية، وذلك باستخدام بعض نسبة الميثيل-PEG / NHS-PEG يسمح لضبط تركيز NHS-PEG على سطح الحافة. وثالثا، أنه يفصل غيض من جزيء التحقيق، وبالتالي يسمح لتقدير حجم التفاعل جزيء سطح دون تدخل من التفاعل طرف سطح المباشر. ثم يقترن جزيء التحقيق تساهميا إلى طرف عبر NHS-PEG (أو المال-PEG).
هذا البروتوكول يتأكد أن جميع السندات (*) في & #8220، سلسلة اقتران "غيض * OH * سيلاني * PEG * جزيء التحقيق وروابط تساهمية، وبالتالي قوية جدا. وهذا بدوره، يسمح أن يتم قياس واحد ونفس جزيء التحقيق خلال كامل مدة التجربة. وقد تجسدت هذه أعلاه في قسم النتائج تمثيلي يظهر صحيح واحد قوة جزيء التحليل الطيفي.
كيف يمكن التحقق من أن يقاس حقا جزيء واحد؟ للآثار واحدة مع الهضاب من قوة ثابتة، قطرة واحدة إلى خط الأساس كافية. إذا تم المستوعبة أكثر من البوليمر في نفس الوقت، تنخفض قوة إلى الصفر في العديد من الخطوات منفصلة، ويفصل كل البوليمر في نقطة مختلفة. من الصعب هو الذي يقرر إذا كان في كل مرة نفس جزيء واحد. وبالتالي توزيع أطوال مفرزة لابد من تقييمها. وتوزيع ضيق مع ذروة واحدة يعتبر مؤشرا جيدا تم بحثها أن واحد ونفس جزيء واحد في كل أثر قوة التمديد. للآثار واحدة مع روبتالأحداث لدى عودتهم، تراكب كل آثار هو أفضل طريقة لتقرر ما إذا تم قياس (واحد ونفس) جزيء واحد. بدلا من ذلك، يمكن تركيبها كل أثر مع (WLC) نموذج ومن ثم كل من طول استمرار وأطوال تمزق في قوة محددة يمكن رسم. توزيع هذه المعلمتين يجب أن يكون ضيقا واحد بلغت ذروتها.
وفي الختام، تم عرض إجراء التحضير للمرفق من مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجزيئات واحدة لنصائح AFM. غيض من AFM الصغير (نصف قطر ~ 10 نانومتر)، وقدرات تحديد المواقع الجانبي وحساسية قوتها جعلها أداة مثالية لدراسة خصائص التصاق جزيئات واحدة على الأسطح البيولوجية وغير البيولوجية في أي السائل تقريبا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
