Abstract
원자 힘 분광법은 표면 및 계면의 분자를 연구하는 이상적인 도구입니다. 공유 AFM 팁 위에 몇 단일 분자의 큰 다양한 실험 프로토콜을 제시한다. 동시에 AFM 팁은 AFM 팁에 부착 된 단일 분자를 연구하기위한 필수 조건이다 팁과 기판 사이의 비특이적 인 상호 작용을 방지하기 위해 비활성화된다. 분석은 부착력, 접착 길이, 곧 발표되고 상기 판독을위한 외부 참조가 제공되는 고체 표면과 바이오 인터페이스에 대한 이들 분자의 자유 에너지를 결정한다. 예 분자는 폴리 (아미노산) polytyrosine이며, 그래프트 중합체 PI- g -PS 및 인지질 POPE (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine). 이 분자는 CH 3 -SAMs 같은 다른 표면, 수소 종료 다이아몬드로부터 탈착 다양한 용매 조건에서 지질 이중층을 지원합니다. 마지막으로,힘 분광 단일 분자 실험의 장점은 진정한 단일 분자 실험에서 연구 된 경우 수단이 결정을 포함하여 논의된다.
Introduction
지난 30 년간, 원자력 현미경 (AFM)은 그것이 모든 입체적 분자 공간 해상도를 제공하고, 다양한 용매에서 동작 할 수 있기 때문에 생체 1,2- 합성 3 재료 및 표면을 연구하는 귀중한 영상 법 것으로 밝혀졌다 환경. 또한, AFM-단일 분자 힘 분광법 (SMFS)이 정권을 μN하기 위해 PN에 이르기까지 힘을 측정 할 수있게하고 4,5 단백질 층으로 예를 들어 전례없는 통찰력, 고분자 물리학 6 주신 - 8 및 단일 분자 표면의 상호 작용 (9) - 단일 분자보다는 분자의 앙상블을 공부 뒤에 12 국지적 인의 이론적 근거는 종종 드문 사건이나 숨겨진 분자 상태를 마스크 효과를 평균 방지하는 것입니다. 또한, 등 윤곽 길이, 쿤 길이, 접착 자유 에너지, 분자 매개 변수의 다수가 될 수 있습니다를 얻을. 이것은 아래의 예에서 자세히 설명되어 있습니다. 전형적인 AFM-SMFS 실험에서, 프로브 분자는 링커 분자를 통해 매우 날카로운 팁에 연결된다. 팁 자체가 굴곡 외팔보의 단부에 위치한다. 팁이 표면에 접촉되는 경우, 프로브 분자가이 표면과 상호 작용한다. 표면으로부터 분자를 분리하기 위해, 팁, 힘, 따라서 자유 에너지의 후퇴시에 캔틸레버의 편향을 관찰함으로써 결정될 수있다. 의미있는 통계를 가져, 소위 힘 - 거리 곡선 다수 획득되어야한다. 또한, 프로브 분자가 AFM 팁에 공유 적으로 결합되어야한다 (즉, 하나의 전체 실험 기간에 걸쳐 동일한 프로브를 사용하는 분자) 진정한 단일 분자 실험을 갖도록. 여기서, 공유 결합을 통해 단일 분자로 기능화 캔틸레버 용 실험 프로토콜이 제시된다. 단일 분자가 하나 또는 아미노 티오 통해 연결될 수있다AFM 팁에 L 그룹. 접합 공정은 사용되는 중합체의 용 매화 특성에 대해 설명 할 (유기 및 수성) 용매의 광범위한 다양성으로 수행 될 수있다.
첫 번째 부분에서는 일반적인 프로토콜은 공유 설명 AFM 팁에 링커 분자를 통해 단일 분자 ( "프로브 분자")을 첨부합니다. 이를 위해, NHS- 유기 화학 또는 말레이 미드 13 사용된다. 세 개의 예시적인 분자 프로토콜과 함께, 데이터 수집 및 데이터 분석 프로세스를 설명하고 상기 판독 참조가 제공된다. 예 분자는 다음과 같습니다 (선형) 폴리머 티로신, 그라프 트 중합체 PI- g -PS 및 지질 교황. 예 공유 시스테인을 연결하는이 프로토콜의 약간의 변형을 포함한다. 또한, 섹션은 이러한 다이아몬드 표면, CH 3 - 자체 조립 단층 및 지질 이중층으로 다른 표면의 준비에 최선을 다하고 있습니다. 이러한 인터페이스는 잠을욕실은 좋은 참조 및 예제가 될 수 있습니다.
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Protocol
참고 제제, 데이터 수집 및 데이터 분석 단계를 포함하는 공정 흐름의 개요에 대해도 2 참조.
1. 시약 설치
참고 : 모든 화학 물질 취급시주의해야하며, 따라서 실험실 코트, 장갑과 눈 보호가 사용되어야한다. 모든 작업은 실험실 후드에서 수행해야합니다. 특히, 특수 장갑 클로로포름 사용의 경우 착용해야합니다.
- 드라이 빠르게 클로로포름 및 저장 건조하지만 일주일 이상 이상으로 낮은 수분 함량과 화학 물질을 사용합니다. APTES ((3- 아미노 프로필) triethoxysilan가) 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) (표 1 참조) 때문에 -20 ℃에서 질소 또는 아르곤 가스 양쪽에서 화학 물질을 저장 흡습성과 PEG는 공기에 산화 될 수 있습니다.
- 이상적으로 질소 atmosphe와 글러브 박스 시스템 내에서, 작은 분량을 준비, 대기 중 산소와 수분에 주식의 빈번한 노출을 방지하기 위해다시.
2. 장비 설치
주 : 가능한 교차 오염을 방지하기 위해, 각 단계에 대한 신선하고 깨끗한 혈관을 사용합니다.
- 면도 유리 및 60 ° C에서 초음파 조에서 30 분 동안 세제 용액 핀셋.
- 헹군 후 초순수로 2 회 철저 2.1 단계에서 초음파 처리 장비.
- RCA 용액 중의 단계 2.1로부터의 열의 장비 (초순수, 과산화수소 및 암모니아 (5 : 1 : 1))로 75 분 동안 45 ° C의 오븐이어서 초순수로 헹구고.
- 마지막으로, 건조 질소의 흐름에 따라 또는 오븐 (100 ℃, 3 시간)에 유리와 핀셋을 건조.
3. 팁 기능화
참고 : 핀셋, 선박 등은 스테인레스 스틸, PTFE, 유리 또는 해당되는 경우 유기 용액에서 화학적으로 안정되어 다른 물질로했다. 달리 명시되지 않는 한, R의 모든 단계를 수행배양 용액의 양이 필요 T. 캔틸레버 칩의 수에 의존한다. 캔틸레버는 모든 시간에 각각의 솔루션에 몰입되어 있는지 확인합니다.
참고 : 유기 증기의 흡입을 피하기 위해 후드를 사용합니다.
- 캔틸레버 표면 ( '활성화') (약 0.5 시간)에 OH-그룹의 형성 :
- 깨끗한 유리 슬라이드와 플라즈마 챔버 (100 W)에 넣어 (10 ~ 100 PN / 나노 : 죄 스프링 상수 재) 신선한 캔틸레버 칩을 배치 핀셋을 사용합니다.
- 챔버 (~ 0.1 밀리바)을 대피.
- 산소 가스와 홍수 챔버와 다시 대피.
- (20 %, 시험 시간 : 15 분, 프로세스 압력 : 0.25 밀리바 전력) 플라즈마 처리를 활성화.
- 캔틸레버의 아미노 실란 화 (약 1 시간) :
- 플라즈마 공정 동안 이상적 이렇게 - APTES의 용액 2.5 ml를 준비 유리 페트리 접시 (표 1 참조).
- Immediatel플라즈마 처리 후 Y는 아세톤에 1 초 동안 각 캔틸레버를 찍어 APTES 용액에 직후에 배치합니다.
- 실온에서 15 분 동안 품어.
- 조심스럽게 10 ml의 아세톤 한 번에 10 ml의 클로로포름에 두 번 캔틸레버 칩을 씻어.
- 옵션 마지막 단계 : 깨끗한 유리 슬라이드에 이전 단계에서 장소 캔틸레버 칩과는 70 ° C에서 30 분 동안을 굽는다. 표면 활성화, 예를 들어, UV 처리 (12)에 대한 대안 전략도있다합니다.
- PEG 화 (약 2 시간)
참고 : 아미노 실란 화 동안 단계를 3.3.1-3.3.4 수행합니다. NHS 및 말레이 미드 그룹은 수성 환경에서 가수 분해 될 수 있으며 PEG 자체가 공기에 산화 될 수 있습니다. 따라서 (특히 단계들 사이에서) 타이밍 중요한 파라미터이다. 자세한 내용은 13를 참조하십시오.- 클로로포름 용액 (표 1 참조)를 준비한다.
- 결로를 방지하려면따뜻한 PEG은 분취 량을 열고 적절한 양을 계량하기 전에 RT까지 분말.
- 폴리머 또는 아미노 그룹과 지질의 결합의 경우, 별도가 완전히 해결 될 때까지 그들을 텍싱하여 클로로포름 용액에 NHS-PEG-NHS (6 kDa의) 및 메틸 PEG-NHS (5 kDa의)를 해결한다. 농도는 표 1을 참조하십시오.
- 또한. 티올기를 갖는 중합체의 커플 링에 대해 개별적 클로로포름 용액 중에 부주의 NHS- PEG 및 메틸 - PEG-NHS를 해결한다.
- NHS- 또는 말레이 미드 및 메틸 아민 말단 PEG 분자 (: 500 전형적 1) 사이의 일정 수의 비율을 조정하기 위해 필요에 따라 솔루션을 섞는다. 이상적인 비율은 준비 - 실험 일련의 사이클에 반복적으로 결정되어야합니다.
- 클로로포름의 증발을 방지하기 위해 포화 클로로포름 분위기 내에서 1 시간 동안 PEG 용액에 캔틸레버 칩 부화.
- 분자 결합을 프로브(> 1 시간) :
참고 : 다음 3.4.1-3.4.3에서, AFM 팁에 서로 다른 프로브 분자의 공유 결합을위한 세 가지 예를 설명한다. 각각의 분자에 대한 프로토콜을 조정해야한다. 예 1 및 3-NHS 화학에서 실시 예 2에 티올 관능 화 된 중합체 PI- g의 -PS은 말레이 미드를 통해 화학 PEG에 결합되는 반면, 사용하는 것이 또한 참고. 세부 사항은 14를 참조하십시오.- 폴리 (아미노산), 폴리 D 티로신 (40 내지 100 kDa의) 미국
- 1 M의 NaOH의 polytyrosine 결합 프로브 분자를 녹인다. 1 ㎎ / ㎖의 농도를 조정합니다.
- 기능화 직전 스핀 탈염 칼럼 (7 kDa의 MWCO)를 사용 붕산 나트륨 완충액 (pH 8.1)에 대해 NaOH를 교환
- 에탄올 5 ㎖와 마지막 붕산 버퍼 5 ml의 클로로포름 5 ㎖, 먼저 캔틸레버를 씻어.
- polytyrosine 보레이트 완충액에 1 시간 동안 캔틸레버 칩 부화 후 보레이트 완충액으로 씻어초순수. 측정 할 때까지 초순수에 저장합니다.
- 선형 골격 (폴리 이소프렌, 119 kDa의)을 갖는 그래프트 측쇄 (폴리스티렌, 88 kDa의) 14 중합체
- 건조 클로로포름에 PI- g -PS을 녹여. 4 ㎎ / ㎖로 접합 용액의 농도를 조정.
- 클로로포름 5 ㎖와 캔틸레버를 헹구고 활용 솔루션에 적어도 1 시간 동안 배양한다.
- 클로로포름 5 ㎖에 다시 린스 클로로포름 포화 환경에서 클로로포름에서 측정까지 저장 (클로로포름 증발을 방지하기 위해).
- 지질 교황
- 건조 클로로포름에 교황을 녹이고. 20 mm로 농도를 조절합니다.
- 에탄올 5 ㎖ 및 지질 용액에서 1 시간 동안 인큐베이션 캔틸레버 전에 초순수 5 mL를 캔틸레버 헹군다.
- 배양 후, 클로로포름 5 ㎖, 5 ㎖ 에타와 캔틸레버 린스L (이 순서대로) 따뜻한, 초순수 5 ml의 언 바운드 프로브 분자를 제거하고 클로로포름 잔류 없애. 즉시 작용 팁을 사용합니다. 필요할 때까지 또는 클로로포름에 저장합니다.
- 폴리 (아미노산), 폴리 D 티로신 (40 내지 100 kDa의) 미국
도 1. (A) 회로도 NHS 화학의 예를 사용하여 팁 기능화 과정을 도시. 아미노기를 통해 팁 프로브 분자를 부착하기 위해 사용 (B) 화학 결합이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 표면 처리
- 자기 조립 단분자막 (SAM)
주 : 제로서, 예를 들면면, 자기 조립 단분자막이 선택되었다. 문학 (15)을 참조하십시오 - 각 30 분간 초음파 조에서 초순수 회 후 세제와 함께 청소 유리 슬라이드. 그런 다음, 추가 세척 단계로, 15 분 동안 75 ° C에서 RCA 솔루션 (단계 2.3 참조)에 배치합니다.
- 코트 10 nm의 니켈 및 크롬 진공 코팅기 100 nm의 금 슬라이드. 그리고 바로 다음 단계로 넘어 가기 전에 RCA 용액에 다시 냉장고 청소에 저장합니다.
- 12 시간 동안 2 mM의 1- 도데 칸 티올 / 에탄올 용액을 이전 단계에서의 슬라이드를 배양한다. 티올 그룹은 금 표면에 결합하여 소수성 단층 자기 조립. 질소 가스 스트림에 의해 에탄올과 초순수로 건조한 후 슬라이드를 헹군다. CCD 카메라 (10)와 각도계 정적 접촉각 측정과 준비된 표면의 소수성을 확인한다.
참고 : 예를 들어 두 번째 표면은, 수소 종단 된 다이아몬드 선정. 앞서 설명한 바와 같이 16 같은 표면 처리가 수행되었다.
주 : 마지막 예에서,지지 표면 지질 이중층 (SLB)이 표면으로 사용 하였다. 이러한 표면을 얻기 위해 POPC 인지질로 이루어진 대형 단층 라멜라 소포 (LUVs)의 용액 (0.1 ㎎ / ㎖) 압출 법에 의해 형성 하였다. 이어서 LUV 용액 50 μL 갓 절단 운모 시트 (A = 1 cm² 이상)에 넣어 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 최종적으로 용액을 초순수 20 ㎖로 세정 하였다. SLB 수의 준비에 대한 자세한 설명은 17, 18를 참조하십시오.
5. 데이터 수집
주 : 실험을 위해, 액체에서 측정 할 수있는 기능을 제공 AFM을 사용한다. 데이터 수집 및 데이터 분석 절차에 관계없이 사용 AFM 모델을 적용 할 수있다. 또한, 일부 실험에서 그것을 그리고 온도를 제어 할 수있을 것이 유리하다액체 셀 내의 전자. 캔틸레버 휨은 레이저 빔 (19)에있어서의 편향을 통해 검출 하였다. 스프링 상수는 열잡음 방법 (20)로 측정 하였다.
- 유체의 측정에 적합 AFM 캔틸레버 홀더에 작용 캔틸레버를 삽입합니다.
- (준비 위 참조) 표면을 넣어 AFM으로 샘플링하고 액체로 커버. 모두, 캔틸레버 표면은 이제 캔틸레버 팁이 표면을 향해 가리키는 액체에 몰두해야한다. 많은 경우에 액체의 드롭이 충분합니다. 임의의 경우 유체의 증발에 유체 밀폐 셀을 사용하여, 예를 들면, 피해야한다.
- 해당되는 경우, 컨트롤러에 원하는 온도를 조정합니다.
- 시스템은 적어도 반 시간 동안 평형하자.
- 제동 효과를 어떤 표면을 배제하기 위해 멀리 표면으로부터 캔틸레버와, 캔틸레버의 열 잡음 스펙트럼을 기록한다. 참고 일반적으로 1 그0 이상의 스펙트럼은 충분한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 축적되어야한다.
- 표면에 접근. 팁 선단 형상 및 작용을 절약하기 위해 접근 방법이 신중하게 수행되어야 함을 유념. 이 들뜨는 모드에 접근, 예를 들어,에 의해 달성 될 수있다.
- 나노 / 볼트에서 측정 된 역 광 레버 감도 (InvOLS)를 결정합니다. 하드 표면에 캔틸레버 끝을 눌러이 작업을 수행합니다.
- 포토 다이오드 전압의 변화 대 피에조 이동량의 기울기를 측정함으로써 InvOLS를 결정한다. 캔틸레버 팁이 표면과 접촉하는 힘 - 거리 곡선의 부분에 줄을 장착한다. 지질 이중층 같은 부드러운 표면을 포함하는 실험에서, 지질 이중층 ( '결함 반점')에 적용되지 않는 지역에서이 단계를 수행한다.
- 열 잡음 스펙트럼에 고조파 발진기를 끼워 맞춤으로써 스프링 정수 (PN / 나노 미터)를 결정. 용도스프링 정수 결정을위한 자동화 된 소프트웨어 기능; 그렇지 않으면 문학 (20)를 참조하십시오.
- 실험을 시작합니다.
- 각 실험 조건에서 녹음 다수의 힘 - 거리 곡선. 1 ㎛의 거리를 철회, 5 kHz에서, 1 ㎛ / 초 팁 속도의 샘플링 속도 : 일반적으로, 실험 매개 변수에 대해 다음 값을 사용합니다.
주 : 때로는 실험 연구의 역학에 따라, ( '드웰 시간') 표면과 접촉 팁과 일정 시간을 기다려야 할 필요가있을 수도있다.
참고 : 실험은 특정 매개 변수는 위의 값에서 실질적으로 벗어날 수 있습니다. - 장기 측정시, 포토 다이오드의 위치를 바꾸 때때로 포토 다이오드상의 레이저 위치를 제로.
- 선택 사항 : 모든 힘 곡선 후, 다른 XY 위치로 AFM 팁을 변경합니다.
- 실험의 끝에, 감도 및 스프링을 결정 정전류 회로시스템의 일관성과 안정성을 확인하기 위해 다시 NT.
주 : 실험 전 및 후에 스프링 정수와 감도를 비교하는 것은 상기 시스템의 특성 및 팁의 특성이 실험에 걸쳐 변하지 않도록하는 수단이다. 스프링 상수의 차이 (<= 15 %)가 너무 크지 않으면 스프링 정수 결정 극한 불확실성은 또한 약 15 %이기 때문에, 그것들은 평균화 될 수있다. 큰 차이를 먼저 발견하고 추가 실험을 계속하기 전에 변경 명백한 스프링 정수에 대한 원인을 제거하는 것이 좋습니다.
- 각 실험 조건에서 녹음 다수의 힘 - 거리 곡선. 1 ㎛의 거리를 철회, 5 kHz에서, 1 ㎛ / 초 팁 속도의 샘플링 속도 : 일반적으로, 실험 매개 변수에 대해 다음 값을 사용합니다.
6. 데이터 준비
참고 : 일반적으로 뉴턴과 나노 미터뿐만 아니라 데이터가 설명되어 있습니다 해결하기 위해 단위를 변환 실험의 특정 유형의 독립적 수행이 절 일반 데이터 준비 단계에서. 실험 특정 데이터 분석은 BR 있습니다iefly는 각각의 대표적인 예 절에서보다 상세히 설명했다.
- 통상적으로, 모든 데이터 준비를 수행하고 분석 소프트웨어 IGOR 프로 6에 기초하여, 예를 들면 홈 기록 알고리즘에 의해 자동 단계.
- InvOLS [나노 / V]와 스프링 정수 [윈 / 나노]로 곱하여 발효 원료 편향 신호 (Defl를) [V]로 변환합니다.
- 표면 (언로드 캔틸레버)로부터 충분한 거리에서 캔틸레버에 힘이 0이되는 윈하는 방식으로 힘을 상쇄.
- 실제의 선단 위치 고려 캔틸레버의 휘어짐을 얻어의 Z *, (표면에 대해 측정라고도 분리)을 계산한다 :
- * Z = 0면의 Z 방향 위치에 대응하는 방식으로 * Z의 오프셋.
참고 : 여기에서, F는 팁 때문에 굽힘에 작용하는 힘이다캔틸레버 (단계 6.2에서 결정.), z는 (직접 악기에 의해 주어진) k는 스프링 상수 (단계 5.8에서 결정)을 나타내는 측정 된 Z-센서 위치입니다이야.
샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석을 보여주는 그림 2. 공정 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
이하, 상술의 결과는, 예를 분자, 즉 중합체 폴리 (아미노산)을 설명 polytyrosine, 그래프트 중합체 PI- g -PS 및 인지질 POPE가 제시된다. 우선 각 실시 예에 대해, 제공되는 데이터 수집 및 데이터 준비에 대한 특정 세부 사항을 실험. 그런 다음, 이러한 분자가 다른 표면에서 탈착 된 실험 실시 결과 (CH 3 -SAMs, 수소 종료 다이아몬드 및 지질 이중층)가 표시됩니다. 접착력, 접착 길이 및 자유 에너지의 측정이 도입된다.
예 1 : 자기 조립 단분자막에서 polytyrosine의 탈착
에탄올의 함량이 변화하는 다른 솔루션 소수성 polytyrosine SAM에서의 탈착을 측정 하였다. 위에 적어도 300 구동력 D 바와 같이 각 용액 중의 캔틸레버 InvOLS 스프링 상수를 측정 하였다istance 흔적은 각 솔루션을 남겼습니다. 한 실험 장치의 모든 실험은 하나의 동일한 단일 폴리 (아미노산)을 측정 하였다을 보장하기 위해 하루에 하나의 캔틸레버 수행 하였다. 캔틸레버의 확장 / 수축 속도는 0.5 μm의 / 초이었고, 표면상의 체류 시간은 1 초였다. 힘 거리 트레이스는 일정한 힘의 고원을 보였다. 각 고원 S 자형 곡선과 원력뿐만 아니라 고원 길이가 결정되고, 히스토그램 플롯 하였다 장착 하였다. 히스토그램 분포를 추출 하였다 가우스 피크 값뿐만 아니라 표준 편차 (오차)를 장착 하였다. 힘 고원의 끝까지, 시스템이 평형 상태에 있고 고원 아래 영역 따라서 중합체 길이 당 자유 에너지 같다. 고원의 단부에서만 분리 공정 자체는 비평 형이다. 이 때문에, 일반적인 실험 고원 길이보다 길다 equilibri 음 길이 (약 30 %)와 시그 모이 아래 영역 밀착성 자유 에너지 (21) 상부 추정치를 맞는다.
(빨간색으로 표시) 순수한 물에 메틸 SAM에 polytyrosine 그림 3. (A) 강제 거리 추적 (후퇴). 단지 하나의 분자는 기준 (영 힘)에 힘의 단일 단계 강하에서 알 수있는 바와 같이 탈착. S 자형 맞는 검정에 나타내어지고, 상기 추출 된 고원 길이와 원력은 화살표로 표시된다. 순수와 상이한 몰 에탄올 함량 물 / 에탄올 혼합물에서의 측정 용 추출 원력의 (B) 히스토그램. 같은 실험 장치의 (C) 고원 길이 히스토그램. (D) 피크 원력 대 피크 고원 길이. "456 / 52456fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3a는 순수한 물에서 측정 polytyrosine의 하나의 힘 - 거리 추적을 보여줍니다. 원력과 고원 길이가 추출된다. SAM로부터 탈착되는 팁 하나만 분자가 존재하는 경우, 고원 길이 히스토그램이 좁고 단일 형태 인 분포를 나타낸다 (통상적 실험을 길이 히스토그램 가우스 착용감의 표준 편차가 약 인 5 내지 20 nm). 고원 길이 히스토그램에서 하나의 좁은 피크가 있다면 부사장은 반대, 하나는 전체 실험 세트는 하나의 동일한 폴리머 함께 할 것을 상대적으로 확신 할 수 있습니다. 이 이유는 polytyrosines 크기 (kDa의 50~100)에서 매우 polydispersive 점이다. 따라서, 정확히 같은 길이의 두 고분자는 매우 황당한 있습니다. 에탄올을 추가 polytyrosine 표면 10,22 사이의 소수성 상호 작용을 약화도 3b에 도시 된 다른 용매 조건 원력 분포도에서 알 수있는 바와 같이 하부 원력에 따라서 하부 흡착 자유 에너지에 이르게. 지금은 하나의 polytyrosine의 고원 길이가 다른 흡착 자유 에너지에 대한 변경하는 방법을 조사 할 수 있습니다. 도 3c에서 알 수있는 바와 같이 길이 고원 에탄올 첨가로 감소한다. 동시에 원력 감소한다 (도 3d).
탈착 공정의 모든 관련 파라미터 즉 윤곽 길이 쿤 길이 흡착 자유 에너지 및 극한 단량체 탈착 속도를 얻기 위해, 하나는 일정한 거리 실험으로 전술 한 측정을 조합한다. 세부 사항은 21를 참조하십시오.
실시 예 2 : 소수성 다이아몬드의 그래프트 중합체 PI- g -PS 탈착
도 4a에 g -PS 얻을 4B 전형적인 힘 - 거리 곡선이 표시됩니다. 표면상의 체류 시간은 1 초이었고, 캔틸레버의 속도 / 초의 1 ㎛이었다. 일정한 힘 (그림 4A) 또는 파열 사건의 어느 고원 (그림 4B)이 관찰되었다. 일정한 힘의 고원 들어 고원의 높이가 S 자형 피트로 측정하고, 값이 히스토그램 (도 4C)으로 플롯되었다. 표면 (도 4b에 힘 - 거리 곡선에서의 제 1 피크)와 팁의 직접적인 상호 작용에 의해 발생하는 비특이적 부착 피크를 배제하기 위해, 표면으로부터 일정 거리에서 최대의 힘을 측정 하였다. 이 파열 이벤트 얻어진 값은 히스토그램 (그림 4D)에 그려졌다. 추가 분석을 위해 가우시안 히스토그램 장착하고, 최대 높이에 대한 평균값으로 선정 하였다데이터 포인트. 실험 이런 종류의 측쇄 그들의 아키텍처의 존재의 영향을 조사 하였다 (14).
도 4. 포스 거리 후퇴 폴리스티렌 측쇄로 그래프트 선형 폴리 이소프렌 골격 (PI- g -PS) 수행 곡선. 어느 일정한 힘 (A) 또는 파열 이벤트 (B)의 고원 관찰된다. 일정한 힘의 고원를 들어, 고원의 높이가 S 자형 착용감 결정되며, 히스토그램 파열 이벤트, 최대 파열 힘이 결정되는 반면, (C) (D)에 꾸몄다. 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림.
예 3 : 하나의 포의 추출지질 이중층에서 spholipid (교황)
도 5a는 단일 분자 추출 공정의 개략도. 추출 측정치가 수직지지 지질 이중층 향해 POPE 기능화 AFM 팁에 접근하여 수행 하였다 (도시 생략). POPC 이중층와 팁의 접촉시, 작은 힘 (PN ~ 100)은 약 4 초 동안의 피드백 루프에 의해 일정하게 유지된다. 교황 분자이 지속 시간 동안 이중층에 삽입 경우, 인출 또는 이중층에서 AFM 팁을 후퇴에 이중층에서 '추출'. 이 특성 힘 - 거리 곡선을 초래한다. 엉성한 기본적 PEG 링커 연신 탄성에 의해 결정되며 wormlike 쇄 (WLC) 모델 (23)에 의해 장착 할 수있다. 50 개 이상의 곡선의 중첩은도 5b에 도시된다. 트루 단일 분자 이벤트는 단일 정점 힘 히스토그램 (도 5C에 의해 인식 될 수 옹>). 특정 분자 매개 변수의 크기에 추가 통찰력을 얻기 위해 그주의 (예를 들어, 지질 이중층의 평균 수명 시간)은, 상이한 로딩 력 속도로 측정을 수행 할 필요가있다. 단일 지질의 추가 분석을 위해 추출 실험 (24)을 참조하십시오.
지질 이중층에서 단일 분자의 추출도 5 (A) 회로도. 지질 분자가 공유 결합 팁 유의. 따라서, 힘 - 추출 사이클 많은 수백 또는 심지어 수천 하나의 동일한 분자로 수행 될 수있다. (B) 50 개 이상의 추출 곡선 (9)의 중첩. (B)에 도시 된 실시 예의 추출 힘의 분포의 (C) 히스토그램..JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | 목적 | 용질 | 용제 | 일반적인 비율 또는 농도 |
| 실란 화 | 캔틸레버 표면에 아미노기 만들기 | APTES (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (예 Vectabond ™) | 건조 아세톤 | 1시 50분 (V / V) - 1 : 100 (v / v)로 |
| PEG 화 | 아미노 또는 티올 그룹과 반응성 캔틸레버 표면을 제공 | NHS-PEG-NHS 또는 말-PEG-NHS | 건조 클로로포름 | 0.25-25 mM의 |
| PEG 화 | 보호막을 캔틸레버 표면 | 메틸 PEG-NHS | 건조 클로로포름 | 25 mM의 |
| 프로브 분자의 활용 | 양방향 기능 PEG에 아미노 또는 티올 그룹을 통해 커플 프로브 분자 | 프로브 분자 (중합체, 지질 등) | 건조 클로로포름 또는 붕산 버퍼 | 0.1 mM의 |
표 1. 솔루션 팁 작용에 필요한.
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Discussion
지난 수십 년 동안, 단일 분자 실험은 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하는 생명 과학 이후에 매우 중요한 접근 방법 드러났다. SMFS 실험 이상적으로 하나의 동일한 분자 실험의 전체 과정에 걸쳐 사용하고 의미에서 좋은 통계를 달성했다. 앙상블 분자의 실험과 대조적으로, 실험 SMFS 희귀 이벤트 및 숨겨진 분자 상태를 감지 할 수있다. 단일 분자 실험의 또 다른 장점은 분자 동력학 시뮬레이션 (24, 25)에 의해 모델링 될 수 있다는 것이다.
(28) - 상기 캔틸레버 작용 프로토콜은 이전에 발행 절차 26의 수정 된 버전이다. 활성화 및 실란 화 후에 AFM 캔틸레버는 폴리에틸렌 글리콜의 두 가지 유형 (PEG) 분자 (링커 분자)의 혼합물로 작용 화된다.
N- 히드 록시 숙신이 미드에 의해 제 2 (NHS) 그룹 (또는 티올 반응성 말레이 미드 기)에 의해 종료되고, 여기서 이후, 프로브 분자상의는 ( "말-PEG", "NHS-PEG")에 접합된다. 팁 작용의 개략도는 그림 1을 참조하십시오. PEG의 목적은 삼중 적이다 : 첫째, 팁 표면을 부동화 때문에 비특이적 흡착을 방지한다. 둘째, 특정 메틸 PEG / NHS-PEG 비를 사용하는 것은 팁 표면에 NHS-PEG 농도를 조정한다. 그리고 셋째, 프로브 분자로부터 팁을 분리하므로 직접 팁 - 표면 상호 작용의 간섭없이 표면 분자의 상호 작용의 정량을 허용한다. 이어서, 프로브 분자에 공유 NHS-PEG (또는 말-PEG)를 통해 팁에 연결된다.
이 프로토콜은 확실하게 그 & #의 모든 채권 (*)8220; 커플 링 체인 "팁 * OH * 실란 * PEG * 프로브 분자가 공유 결합을하기 때문에 매우 강하다. 이것은 차례로, 동일한 하나의 프로브 분자는 실험 전체 기간에 걸쳐 측정되는 것을 허용한다. 이것은 사실이 단일 분자 힘 분광법을 보여주는 대표적인 결과 섹션에서 상기 예시하고있다.
어떻게 진정한 단일 분자 측정되는 것을 확인할 수있다? 일정한 힘의 고원 단일 트레이스를 들어,베이스 라인에 한 방울 충분하다. 둘 이상의 중합체가 동시에 탈착되면 각 중합체가 다른 지점에서 분리 같이, 힘은 여러 단계 씩 제로로 떨어진다. 쉬운 게 동일한 단일 분자마다인지를 결정하는 것이다. 따라서 분리 길이의 분포를 평가해야한다. 하나의 피크 좁은 분포는 하나의 동일한 단일 분자마다 강제 확장 추적에서 프로빙 된 좋은 표시입니다. rupt 단일 흔적우레 이벤트는, 모든 흔적의 중첩는 (하나의 동일한) 단일 분자 측정 여부를 결정하는 가장 좋은 방법입니다. 대안 적으로, 각각의 트레이스 (WLC) 모델에 장착 될 수 있고, 그 다음 지속 길이와 정의 힘에서 파단 길이 모두 나타내 어질 수있다. 두 매개 변수의 분포가 좁고 뾰족 하나이어야한다.
결론적으로, AFM 팁에 단일 분자의 많은 종류의 부착을위한 준비 절차가 제시되었다. AFM의 작은 팁 (반경 ~ 10 ㎚), 그것의 측면 위치 능력과 힘 감도가 거의 모든 액체 생물학적 및 비 생물학적 표면에 단일 분자의 접착 특성을 연구 할 수있는 이상적인 툴입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
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