Abstract
Rasterkraftspektroskopie ist ein ideales Werkzeug, um Moleküle an Oberflächen und Grenzflächen zu untersuchen. Eine experimentelle Protokoll zum Koppeln eine Vielzahl von Einzelmoleküle kovalent an einer AFM-Spitze dargestellt. Gleichzeitig die AFM-Spitze passiviert, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat, die eine Voraussetzung für die einzelnen Moleküle an die AFM-Spitze angebracht studieren verhindern. Analysen, um die Haftkraft, die Haftung der Länge, und die freie Energie dieser Moleküle auf festen Oberflächen und Bio-Schnittstellen werden in Kürze vorgestellt und externe Verweise auf weiterführende Literatur werden zur Verfügung gestellt zu bestimmen. Beispiel Moleküle sind die Poly (aminosäure) Polytyrosin das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Diese Moleküle werden von verschiedenen Oberflächen wie CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant desorbiert und unterstützten Lipiddoppelschichten unter verschiedenen Lösungsbedingungen. Schließlich wird dasVorteile der Kraft-spektroskopische Einzelmolekülexperimenten diskutiert Mittel zu entscheiden, ob wirklich ein einzelnes Molekül hat im Experiment untersucht.
Introduction
In den letzten 30 Jahren ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) sich als ein wertvolles Abbildungstechnik zur biologischen 1,2 und synthetische 3 Materialien und Oberflächen zu untersuchen, da sie Informationen über die Molekular räumliche Auflösung in allen drei Dimensionen und in verschiedenen Lösungsmittel betrieben werden kann Umgebungen. Außerdem AFM-Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS) ermöglicht, Kräfte, die von der pN-Regime uN messen und hat beispiellose Einblicke beispielsweise in der Proteinfaltung 4,5, Polymerphysik 6 angegeben - 8 und Einzelmolekül-Oberflächen-Wechselwirkung 9 - 12 .Die Gründe für einzelne Moleküle anstatt ein Ensemble von Molekülen ist die Vermeidung von durchschnittlich Effekte, die oft zu maskieren seltene Ereignisse oder versteckte Molekülzustände. Ferner kann eine Vielzahl von molekularen Parameter wie die Konturlänge, die Kuhn Länge der Haft freien Energie, etc.erhalten. Dies wird in den folgenden Beispielen beschrieben. In einem typischen AFM-SMFS-Experiment wird das Sondenmolekül zu einer sehr scharfen Spitze über ein Linkermolekül gekoppelt. Die Spitze selbst ist am Ende eines biegbaren Ausleger angeordnet. Wenn die Spitze in Berührung mit der Oberfläche gebracht wird das Sondenmolekül wird mit dieser Oberfläche in Wechselwirkung treten. Durch die Beobachtung der Auslenkung des Auslegers beim Zurückziehen der Spitze, die Kraft und damit die freie Energie, um das Molekül von der Oberfläche ablösen kann bestimmt werden. Um aussagekräftige Statistiken zu erhalten, wurde eine Vielzahl von so genannten Kraft-Weg-Kurven aufgenommen werden. Ferner sind echte Einzelmolekülexperimente (dh, mit ein und derselben Sonde Moleküls über die Dauer des gesamten Experiments) das Sondenmolekül sollte kovalent an die AFM-Spitze gekoppelt werden müssen. Hier wird ein Versuchsprotokoll für Cantilever Funktionalisierung mit einem einzelnen Molekül über eine kovalente Bindung dargestellt. Die einzigen Molekül kann entweder über eine Amino- oder eine Thio gekoppelt werdenl-Gruppe an die AFM-Spitze. Die Konjugation Verfahren kann in einer Vielzahl von Lösungsmitteln (organisch und wässrig), um für die Lösungseigenschaften der verwendeten Polymere Konto erfolgen.
Im ersten Teil, ein allgemeines Protokoll, um kovalent an ein einzelnes Molekül ("Sondenmolekül") über ein Linkermolekül an eine AFM-Spitze beschrieben. Zu diesem Zweck wird organischen NHS- oder Maleimid-Chemie verwendet 13. Zusammen mit dem Protokoll für die drei beispielhaften Molekülen, werden die Datenerfassung und Datenanalyseverfahren beschrieben, und Literaturhinweise sind. Die Beispiel-Moleküle sind: die (lineare) Polymer Tyrosin, das Pfropfpolymerisat PI- g -PS und die Lipid PAPST. Dies beinhaltet leichte Variationen des Protokolls, zum Beispiel kovalente Anbindung Cysteine. Zusätzlich ist ein Abschnitt, um die Herstellung von verschiedenen Oberflächen wie einer Diamantoberfläche, einer CH 3 -tafeln organisierte Monoschicht und Lipiddoppelschichten gewidmet. Diese Schnittstellen müssen proven, um gute Referenzen und Beispiele können.
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Protocol
HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für einen Überblick über den Prozessablauf, das die Herstellung, die Datenerfassung und Datenanalyseschritte.
1. Setup-Reagenz
HINWEIS: Alle Chemikalien müssen mit Vorsicht behandelt werden, und damit eine Laborkittel, Schutzhandschuhe und Augenschutz zu verwenden. Alle Arbeiten müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden. Insbesondere sollten spezielle Handschuhe bei Chloroform Gebrauch abgenutzt werden.
- Verwenden Sie Chemikalien mit geringem Wassergehalt, wie trockenem Chloroform schnell und trocken lagern, aber nicht länger als eine Woche. Speichern sowohl Chemikalien als bei -20 ° C und unter Stickstoff- oder Argongas, weil APTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilan) (siehe Tabelle 1) und PEG (Polyethylenglykol) sind hygroskopisch und PEG unterliegt Oxidation in Luft.
- Um häufige Exposition der Aktie gegenüber Luftsauerstoff und Feuchtigkeit zu vermeiden, bereiten kleinere Teilmengen, im Idealfall in einem Handschuhfach-System mit einem Stickstoff Atmospre.
2. Geräte-Setup
HINWEIS: Um mögliche Kreuzkontamination zu vermeiden, verwenden Sie frische und saubere Gefäße für jeden Schritt.
- Gesäuberte Glas und Pinzette in Waschmittellösung für 30 min in einem Ultraschallbad bei 60 ° C.
- Spülen und beschallen Geräte aus Schritt 2.1 zweimal gründlich mit hochreinem Wasser.
- Wärmegeräte aus Schritt 2.1 in RCA-Lösung (Reinstwasser, Wasserstoffperoxid und Ammoniak (5: 1: 1)) bis 75 ° C in einem Ofen für 45 Minuten und anschließend Spülen sie mit Reinstwasser.
- Zum Schluß wird der Glaswaren und Pinzette unter einem Strom von trockenem Stickstoff oder in einem Ofen (100 ° C, 3 h).
3. Tipp Funktionalisierung
HINWEIS: Verwenden einer Pinzette, Behälter, usw. aus Edelstahl, PTFE, Glas oder anderen Materialien, die in organischen Lösungen ggf. chemisch stabil ist. Wenn nicht anders angegeben, die Durchführung aller Schritte bei RT. Die Höhe der Inkubationslösung benötigt wird, hängt von der Anzahl der Cantilever-Chips. Stellen Sie sicher, dass die Ausleger sind in den jeweiligen Lösungen zu jeder Zeit eingetaucht.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Kapuze, um das Einatmen von organischen Dämpfen zu vermeiden.
- Bildung von OH-Gruppen auf Auslegeroberfläche ("Aktivierung") (ca. 0,5 h):
- Verwenden einer Pinzette, an die frische Cantilever-Chips zu platzieren (Material: SiN, Federkonstante: 10-100 pN / nm) auf einer sauberen Glasobjektträger und legte sie in eine Plasmakammer (100 W).
- Evakuieren Kammer (~ 0,1 mbar).
- Flutkammer mit Sauerstoffgas und evakuieren Sie es erneut.
- Aktivieren Sie das Plasmaverfahren (Leistung: 20%, Dauer: 15 min, Prozessdruck: 0,25 mbar).
- Amino-Silanisierung von Auslegern (ca. 1 h):
- Bereiten Sie die 2,5 ml APTES-Lösung (siehe Tabelle 1) in einer Glaspetrischale - tun dies im Idealfall während des Plasmaprozesses.
- Immediately nach dem Plasmaverfahren, tauchen jeden Cantilever 1 Sekunde lang in Aceton und sie unmittelbar danach in der APTES Lösung.
- Inkubieren für 15 min bei RT.
- Die Cantilever-Chips vorsichtig zweimal in 10 ml Aceton und einmal in 10 ml Chloroform zu spülen.
- Optional letzte Schritt: Platzieren Cantilever-Chips aus dem vorhergehenden Schritt auf eine saubere Glasplatte und bäckt sie für 30 min bei 70 ° C. Beachte, dass es auch alternative Strategien zur Oberflächenaktivierung, beispielsweise UV-Behandlung 12.
- PEGylierung (ca. 2 h):
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.3.1-3.3.4 während Amino-Silanisierung. NHS und Maleimid Gruppen unterliegen einer Hydrolyse in wässrigen Umgebungen und PEG selbst wird einer Oxidation in Luft. Daher Timing (insbesondere zwischen den Stufen) ist ein kritischer Parameter. Siehe 13 für weitere Informationen.- Bereiten Sie die Chloroform-Lösung (siehe Tabelle 1).
- Zur Vermeidung von Kondensation, Pulver warmen PEG bis zu RT vor dem Öffnen des aliquoten und einem Gewicht von den entsprechenden Betrag.
- Für die Kopplung von Polymeren oder Lipiden mit Aminogruppen, separat zu lösen NHS-PEG-NHS (6 kDa) und Methyl-PEG-NHS (5 kDa) in der Chloroformlösung durch Vortexen, bis sie vollständig gelöst sind. Siehe Tabelle 1 für die Konzentration.
- Alternativ. für die Kupplung von Polymeren mit Thiolgruppen getrennt lösen Mal-NHS- PEG und Methyl-PEG-NHS in der Chloroformlösung.
- Mischen der Lösungen, wie erforderlich, um eine bestimmte Anzahl Verhältnis zwischen der NHS- oder maleimide- und methyltermini PEG Moleküle (typischerweise 1: 500) einzustellen. Man beachte, dass das ideale Verhältnis ist iterativ in einer Reihe von Vorbereitungsexperiment Zyklen bestimmt werden.
- Inkubieren Ausleger Chips in der PEG-Lösung für 1 h in einem Chloroform gesättigte Atmosphäre um ein Verdampfen des Chloroforms zu verhindern.
- Sondenmolekül Konjugation(> 1 h):
HINWEIS: In der folgenden 3.4.1-3.4.3, sind drei Beispiele für die kovalente Kopplung von unterschiedlichen Sondenmolekülen auf die AFM-Spitze beschrieben. Für jedes Molekül das Protokoll angepasst werden muss. Ferner ist zu beachten, daß in Beispiel 1 und 3 NHS-Chemie, während in Beispiel 2 die Thiol funktionalisierten Polymers PI- g -PS an das PEG über Maleimid- Chemie gekoppelt verwendet. Details siehe 14.- Für Poly (aminosäure) Poly-D-Tyrosin (40-100 kDa)
- Lösen Sie die Polytyrosin konjugiert Sondenmolekül in 1 M NaOH. Die Konzentration ist anzupassen, um 1 mg / ml.
- Tauschen das NaOH für Natriumboratpuffer (pH 8,1) unter Verwendung von Spin-Entsalzungssäulen (7 kDa MWCO) unmittelbar vor der Funktionalisierung
- Zuerst mit 5 ml Chloroform und dann mit 5 ml Ethanol und schließlich mit 5 ml Boratpuffer spülen Auslegern.
- Inkubieren Sie die Cantilever-Chips für 1 Stunde in der Polytyrosin Boratpufferlösung und dann mit Boratpuffer spülenund Reinstwasser. Bewahren Sie in ultrareinem Wasser bis zur Messung.
- Für Polymere mit einem linearen Backbone (Polyisopren, 119 kDa) mit gepfropften Seitenketten (Polystyrol, 88 kDa) 14
- Lösen Sie die PI- g -PS in trockenem Chloroform. Einzustellen, die Konzentration des konjugierten Lösung auf 4 mg / ml.
- Spülen Sie die Ausleger mit 5 ml Chloroform und Inkubation für mindestens 1 Stunde in der Konjugation Lösung.
- Wieder spülen in 5 ml Chloroform und speichern in Chloroform in einer Chloroform-gesättigten Umgebung bis zur Messung (Chloroform Verdampfung zu verhindern).
- Für die Lipid PAPST
- Lösen Sie PAPST in trockenem Chloroform. Die Konzentration ist anzupassen, um 20 mM.
- Spüle die Cantilevern mit 5 ml Ethanol und 5 ml hochreinem Wasser vor der Inkubation der Ausleger für 1 h in der Lipidlösung.
- Nach Inkubation spülen Cantilever mit 5 ml Chloroform, 5 ml Ethanol und 5 ml warmem, Reinstwasser (in dieser Reihenfolge), um nicht gebundenen Sondenmoleküle zu entfernen und loszuwerden, Chloroform Rückstände zu bekommen. Verwenden funktionalisierten Spitzen sofort. Alternativ speichern sie in Chloroform, bis sie benötigt.
- Für Poly (aminosäure) Poly-D-Tyrosin (40-100 kDa)
Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung der Spitze Funktionalisierung am Beispiel der NHS-Chemie. (B) Die chemische Bindung verwendet, um ein Sondenmolekül an der Spitze über eine Aminogruppe zu befestigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
4. Oberflächenvorbereitung
- Selbstorganisierten Monoschicht (SAM)
HINWEIS: Wie Oberfläche zum ersten Beispiel eine selbstorganisierte Monoschicht gewählt. Siehe Literatur 15 - Saubere Glasobjektträger mit Reinigungslösung und dann zweimal in ultrareinem Wasser in einem Ultraschallbad für 30 Minuten jeweils. Dann, als zusätzliche Reinigungsstufe, legen Sie sie in der RCA-Lösung (siehe Punkt 2.3) bei 75 ° C für 15 min.
- Bestreichen Sie die Objektträger mit 10 nm Chrom-Nickel und 100 nm Gold in einer Vakuumbeschichtungsvorrichtung. Dann lagern im Kühlschrank und sauber wieder in der RCA-Lösung unmittelbar vor dem nächsten Schritt.
- Die Folien von dem vorherigen Schritt Inkubieren in 2 mM 1-Dodecanthiol / Ethanollösung für 12 h. Die Thiolgruppen an der Goldoberfläche zu binden, und eine hydrophobe Monoschicht selbst montiert. Spülen Sie die Folien mit Ethanol und Reinstwasser und dann trocken mit einem Strom von Stickstoffgas. Bestätigen die Hydrophobizität der vorbereiteten Oberfläche mit statischen Kontaktwinkelmessungen in einem Goniometer mit einer CCD-Kamera 10.
HINWEIS: In der Fläche für das zweite Beispiel ein Wasserstoff terminiert Diamant gewählt. Die Vorbereitung der Oberfläche wurde wie zuvor 16 beschrieben durchgeführt.
Hinweis: Im letzten Beispiel wurde eine Oberflächengestützten Lipiddoppelschicht (SLB) als Fläche verwendet. Um eine solche Oberfläche zu erhalten, wurde eine Lösung (0,1 mg / ml) von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs), bestehend aus Phospholipid POPC durch das Extrusionsverfahren gebildet. Dann wurden 50 ul der Lösung auf ein LUV frisch gespaltene Glimmerfolie (A = 1 cm²) gegeben und für 30 min inkubiert. Schließlich wurde die Lösung mit 20 ml ultrareinem Wasser gespült. Siehe 17,18 für eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von SLBs.
5. Datenerfassung
HINWEIS: Für die Versuche, verwenden Sie ein AFM, die in der Lage, in Flüssigkeiten zu messen bietet. Die Datenerfassung und Datenanalyseverfahren gelten, unabhängig von der verwendeten AFM-Modell. Weiterhin kann in einigen Experimenten ist es vorteilhaft, die Möglichkeit, die Temperatursteuerung aufweisene in der Flüssigzelle. Cantileverauslenkung wurde über die Laserstrahlablenkung Verfahren 19 erkannt. Federkonstanten wurden mit dem thermischen Rauschen Methode 20 bestimmt.
- Legen Sie die funktionalisierten Cantilever in eine AFM-Cantilever-Halter, der für die Messung in Flüssigkeiten ist.
- Setzen Sie die Oberfläche (Vorbereitung siehe oben), um in die AFM abgetastet werden und decken Sie es mit Flüssigkeit. Sowohl Cantilever und Oberfläche sollte nun in der Flüssigkeit mit dem Auslegerspitzen auf die Fläche eingetaucht werden. Man beachte, dass in vielen Fällen ein Flüssigkeitstropfen genügt. In jedem Fall der Verdampfung des Fluids vermieden werden sollte, beispielsweise durch die Verwendung eines geschlossenen Fluidzelle.
- Gegebenenfalls einstellen gewünschte Temperatur auf der Steuerung.
- Lassen Sie das System ins Gleichgewicht kommen für mindestens eine halbe Stunde.
- Aufnehmen eines thermischen Rauschspektrum des Auslegers mit dem Ausleger weit weg von der Oberfläche, um jegliche Oberflächendämpfungseffekte auszuschließen. Beachten Sie, dass in der Regel 10 oder mehr Spektren müssen akkumuliert werden, um ein ausreichendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
- Nähern Sie sich dem Oberfläche. Beachten Sie, dass, um die Geometrie der Spitze und Spitze sparen Funktionalisierung der Ansatz Prozess muss sorgfältig durchgeführt werden. Dies kann erreicht werden, zum Beispiel, nähert im intermittierenden Kontaktmodus.
- Bestimmen Sie die inverse optische Hebelempfindlichkeit (InvOLS) in nm / Volt gemessen. Tun Sie dies, indem Sie die Cantileverspitze gegen eine harte Oberfläche.
- Bestimmen die InvOLS durch Messen der Steigung der piezo Wegstrecke gegen die Änderung der Photodiodenspannung. Setzen Sie eine Linie zum Teil der Kraft-Weg-Kurve, wo die Blattfederspitze ist in Kontakt mit der Oberfläche. In Experimenten mit einer weichen Oberfläche wie Lipid-Doppelschichten, führen Sie diesen Schritt auf Bereiche, die nicht mit einer Lipid-Doppelschicht ("Mangel spots ') abgedeckt sind.
- Bestimmen Sie die Federkonstante (pN / nm) durch den Einbau eines harmonischen Oszillators der thermischen Rauschspektrum. Verwendungautomatisierte Software-Funktion für Federkonstante Bestimmung; sonst Rücksprache Literatur 20.
- Starten Sie das Experiment.
- Nehmen Sie zahlreiche Kraft-Weg-Kurven an jeder Versuchsbedingung. In der Regel verwenden Sie die folgenden Werte für die Versuchsparameter: Abtastrate von 5 kHz, Spitzengeschwindigkeit von 1 & mgr; m / sec, zurückzuziehen Abstand von 1 um.
HINWEIS: manchmal, abhängig von der Dynamik der untersuchten Experiment könnte es notwendig sein, eine gewisse Zeit mit der Spitze in Kontakt mit der Oberfläche zu warten ("Verweilzeit").
HINWEIS: Das Experiment spezifische Parameter können erheblich von den oben angegebenen Werten abweichen. - Während einer Langzeitmessungen auf Null der Laserposition auf die Fotodiode von Zeit zu Zeit durch Umpositionieren der Photodiode.
- Optional: Nach jedem Kraftkurve, den Standort der AFM-Spitze auf eine andere XY-Position.
- Am Ende des Experiments bestimmen die Empfindlichkeit und die Feder constant wieder auf Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen.
HINWEIS: Der Vergleich der Federkonstante und der Empfindlichkeit vor und nach dem Experiment ist auch ein Mittel, um sicherzustellen, dass die Eigenschaften des Systems, und die Eigenschaften der Spitze blieb über den Verlauf des Experiments unverändert. Wenn die Differenz der Federkonstanten nicht zu groß ist (<= 15%), können sie gemittelt werden, da die Eigenunsicherheit von Federkonstanten-Bestimmungs ebenfalls etwa 15%. Für größere Unterschiede, ist es ratsam, zuerst finden und die Ursache für die Veränderung offensichtlich Federkonstante zu beseitigen, bevor Sie mit weiteren Experimenten.
- Nehmen Sie zahlreiche Kraft-Weg-Kurven an jeder Versuchsbedingung. In der Regel verwenden Sie die folgenden Werte für die Versuchsparameter: Abtastrate von 5 kHz, Spitzengeschwindigkeit von 1 & mgr; m / sec, zurückzuziehen Abstand von 1 um.
6. Datenaufbereitung
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden allgemeine Daten Vorbereitungsschritte, die üblicherweise unabhängig von der spezifischen Art von Experiment durchgeführt, um Einheiten umzurechnen, um Newton und Nanometerbereich sowie zur Korrektur werden die Daten beschrieben werden. Die Versuchsspezifischen Daten Analysen briefly wie weiter unten beschrieben in die jeweiligen repräsentativen Beispielteil.
- Typischerweise führen alle Datenaufbereitung und Analyse die Schritte automatisch von einem haus geschrieben Algorithmus, zum Beispiel auf der Basis der Software IGOR Pro 6.
- Konvertieren Sie die rohen Ablenksignal (Defl) [V] in Kraft, durch Multiplikation mit den InvOLS [nm / V] und die Federkonstante [nN / nm].
- Versetzt die Kraft in einer Weise, dass die Kraft auf den Ausleger in ausreichendem Abstand von der Oberfläche (entladen Cantilever) zu 0 nN.
- Berechnen der tatsächlichen Position der Spitze (auch genannt Trenn wenn es relativ zu der Oberfläche gemessen) z *, die die Verbiegung des Cantilevers berücksichtigt:
- Offset z * in der Weise, dass z * = 0 entspricht der z-Position der Oberfläche.
Anmerkung: Dabei ist F die Kraft, die an der Spitze und somit Biegung wirkts der Ausleger (im Schritt 6.2 bestimmt.), z die gemessene Z-Position des Sensors (vom Gerät direkt angegeben) und k die Federkonstante (im Schritt 5.8 bestimmt).
Abbildung 2: Prozessflussdiagramm, das die Probenvorbereitung, die Datenerfassung und der Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Representative Results
Im Folgenden wird beschrieben, die Ergebnisse für das obige Beispiel Moleküle, nämlich die Polymere Poly (Aminosäure), Polytyrosin, das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE, werden vorgestellt. Zunächst für jedes Beispiel, experimentieren spezifischen Details für die Datenerfassung und Datenaufbereitung zur Verfügung. Dann werden die Ausführungsergebnisse für Versuche, bei denen diese Moleküle wurden aus verschiedenen Oberflächen desorbiert (CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant und Lipiddoppelschichten) gezeigt. Bestimmung der Haftkraft, die Haftung der Länge und der freien Energie vorgestellt.
Beispiel 1: Die Desorption Polytyrosin von selbstorganisierten Mono
Die Desorption Polytyrosin aus einem hydrophoben SAM in verschiedenen Lösungen mit einer variierenden Gehalt an Ethanol wurde gemessen. In jeder Lösung die Ausleger InvOLS und Federkonstanten bestimmt, wie oben und mindestens 300 Kraft d beschriebenistance Spuren jeder Lösung wurden aufgezeichnet. Alle Versuche eines Versuchs wurden mit einer einzelnen Ausleger an einem einzigen Tag durchgeführt, um ein und dieselbe einzige Poly (Aminosäure) wurde gemessen gewährleisten. Die Verlängerung / Rückzugsgeschwindigkeit des Auslegers betrug 0,5 um / s und die Verweilzeit auf der Oberfläche war 1 Sekunde. Die Kraft Abstand Spuren zeigten Plateaus mit konstanter Kraft. Jedes Plateau wurde mit einer sigmoidalen Kurve und die Plateaukraft sowie die Plateaulänge wurden bestimmt und in einem Histogramm aufgetragen ausgestattet. Die Histogramme wurden mit einem Gauß- und den Spitzenwert als auch der Standard-Abweichung (Fehler) von der Verteilung wurde extrahiert ausgestattet. Bis zum Ende des Kraftplateau ist das System im Gleichgewicht und der Bereich unterhalb des Plateaus entspricht daher die freie Energie pro Polymerlänge. Nur der Ablöseprozeß selbst am Ende des Plateaus ist in Nicht-Gleichgewichts. Wegen dieses zur typischen Experimenten die Plateaulänge länger als die Gleichgewichte ist um Länge (ca. 30%) und der Bereich unterhalb des S-förmigen passt eine obere Schätzung für die Haftung der freien Energie 21.
Abbildung 3. (A) Kraft Abstand trace (Rückzug) des Polytyrosin auf einem Methyl-SAM in reinem Wasser (rot). Nur ein einzelnes Molekül desorbiert wie in der einzigen Schritt Tropfen der Kraft auf die Grundlinie (Null-Kraft) ersichtlich. Die sigmoidale fit ist in schwarz dargestellt und die extrahierte Plateaulänge und Plateaukraft sind durch Pfeile angezeigt. (B) Histogramme der extrahierten Plateau Kraft für Messungen in reinem Wasser und in Wasser / Ethanol-Mischungen mit unterschiedlichen molaren Ethanolgehalt. (C) Plateau Länge Histogramme der gleichen Versuchsanordnung. (D) Spitze Plateaulänge vs. Gipfelplateau Kraft. "456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
3A zeigt eine einzige Kraft-Weg-Spur Polytyrosin in reinem Wasser gemessen. Plateau Kraft und Plateaulänge extrahiert. Wenn es nur ein Molekül auf der Spitze, die von der SAM desorbiert wird, die Plateaulänge Histogramm zeigt eine schmale und monomodale Verteilung (typischerweise in Versuchen die Standardabweichung in einem Gauß-Anpassung der Länge Histogramm etwa 5-20 nm). Umgekehrt, wenn es nur einen schmalen Peak in der Plateaulänge Histogramm kann man relativ sicher sein, dass die gesamte Versuchsanordnung wurde mit ein- und demselben Polymer erfolgen. Der Grund dafür ist, dass die polytyrosines sind hoch polydispersen groß (50 bis 100 kDa). Daher sind zwei Polymere von exakt der gleichen Länge höchst unwahrscheinlich. Zugabe von Ethanol schwächt die hydrophobe Wechselwirkung zwischen Polytyrosin und der Oberfläche 10,22 undführt zu einem geringeren Adsorptions- freie Energie und damit zu einer niedrigeren Plateaukraft wie in den Plateaukraft Histogramme für die in 3B gezeigt verschiedenen Lösungsmittelbedingungen gesehen werden. Jetzt können untersucht werden, wie sich die Plateaulänge eines einzelnen Polytyrosin ändert für unterschiedliche Adsorption freien Energien. Wie in 3C zu sehen ist die Plateaulänge nimmt mit der Zugabe von Ethanol. Gleichzeitig die Plateaukraft ab (Figur 3D).
Um alle relevanten Parameter des Desorptionsprozess nämlich die Konturlänge, die Kuhn-Länge, die Adsorption der freien Energie und die Eigen monomeren Desorptionsrate zu erhalten, muss man die oben beschriebenen Messungen mit konstantem Abstand Experimenten zu kombinieren. Details siehe 21.
Beispiel 2: Desorption des Pfropfpolymerisats PI- g -PS aus einem hydrophoben Diamant
In 4A 4B typische Kraft-Weg-Kurven mit PI- g -PS von gehärtetem Diamant in Wasser bei Raumtemperatur erhalten werden angezeigt. Die Verweilzeit auf der Oberfläche war 1 Sekunde und die Geschwindigkeit des Auslegers betrug 1 um / sec. Entweder Plateaus mit konstanter Kraft (4A) oder Ruptur Ereignisse beobachtet (4B). Für den Hochebenen der konstanten Kraft, wurde die Höhe des Plateaus mit einer S-förmigen Passform bestimmt und die Werte wurden in einem Histogramm (4C) aufgetragen. Um die unspezifische Ablagerung Peak durch direkte Interaktion der Spitze mit der Oberfläche (erste Spitze in der Kraft-Weg-Kurve in 4B) verursacht auszuschließen, wurde die maximale Kraft in einem gewissen Abstand von der Oberfläche bestimmt. Die erhaltenen Werte für diese Abrisse wurden dann in einem Histogramm (Figur 4D) aufgetragen. Für die weitere Auswertung wurden die Histogramme mit einer Gaußschen eingesetzt und die maximale Höhe wurde als ein Mittelwert für die gewählteDatenpunkt. Mit dieser Art von Experiment ist der Einfluß des Vorhandenseins von Seitenketten und ihre Architektur wurde 14 untersucht.
Abbildung 4: Kraft-Weg-Kurven Rückzug mit einem linearen Rückgrat Polyisopren mit Polystyrol-Seitenketten gepfropft (PI- g -PS) durchgeführt. So oder Hochebenen mit konstanter Kraft (A) oder Ruptur Ereignisse (B) werden eingehalten. Für Hochebenen konstanter Kraft wird die Höhe des Plateaus mit einer S-förmigen Passform ermittelt und aufgetragen in einem Histogramm (C), während für Standveranstaltungen, die maximale Bruchkraft bestimmt wird (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
Beispiel 3: Extraktion eines einzelnen phospholipid (POPE) aus einer Lipid-Doppelschicht
5A zeigt eine schematische Darstellung der Einzelmolekül-Extraktionsverfahren. Extraction Messungen wurden durch vertikal nähert sich der Papst-funktionalisierte AFM-Spitze in Richtung der unterstützten Lipiddoppelschicht durchgeführt (nicht dargestellt). Bei Kontakt der Spitze mit der POPC Doppelschicht eine geringe Kraft (~ 100 pN) konstant durch eine Rückkopplungsschleife für etwa 4 sec gehalten. Wenn der Papst Molekül fügt in die Doppelschicht während dieser Verweilzeit wird herausgezogen oder 'extrahiert' aus der Doppelschicht auf das Zurückziehen der AFM-Spitze aus der Doppelschicht. Dies führt zu charakteristischen Kraft-Weg-Kurven. Ihre Form ist im wesentlichen durch die Dehnung Elastizität des PEG-Linker bestimmt und kann durch eine wurmartige Kette (WLC) Modell 23 eingesetzt werden. Eine Überlagerung von mehr als 50 Kurven ist in 5B gezeigt. Echte Einzelmolekülereignisse können durch einzelne Schirmkraft Histogramme (5C zu erkennen ong>). Beachten Sie, dass, um einen tieferen Einblick in die Größe bestimmter molekularer Parameter zu gewinnen (zB die mittlere Lebensdauer von Lipiden in Doppelschichten), ist es notwendig, die Durchführung von Messungen mit unterschiedlichen Kraftbelastung Raten. Zur weiteren Analyse der einzelnen Lipidextraktionsversuche sehen 24.
Figur 5 (A) Schematische für die Extraktion eines einzelnen Moleküls von einer Lipid-Doppelschicht. Man beachte, dass das Lipid-Molekül kovalent an die Spitze gekoppelt ist. Daher können viele Hundert oder sogar Tausende von Kraftextraktionszyklen mit ein und demselben Molekül durchgeführt werden. (B) Überlagerung von mehr als 50 Extraktionskurven 9. (C) Histogramm der Extraktionskraftverteilung des in (B) gezeigten Beispiel..jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| Schritt | Zweck | Solute | Lösungsmittel | Typische Verhältnis oder Konzentration |
| Silanisierung | Erstelle Aminogruppen auf Kragfläche | APTES (3-Aminopropyl) tri-ethoxysilan (zB Vectabond ™) | trockenem Aceton | 1.50 (v / v) - 1: 100 (v / v) |
| PEGylierung | Bereitzustellen Kragfläche mit Amino- oder Thiol reaktiven Gruppen | NHS-PEG-NHS und Mal-PEG-NHS | trockenem Chloroform | 0,25-25 mM |
| PEGylierung | Passivieren Kragfläche | Methyl-PEG-NHS | trockenem Chloroform | 25 mM |
| Konjugation von Sondenmolekül | Paar Sondenmoleküls über eine Amino- oder Thiolgruppe an bifunktionellen PEG | Sondenmolekül (Polymer, Lipid, etc.) | trockenem Chloroform oder Boratpuffer | 0,1 bis 10 mM |
Tabelle 1 Lösungen für den Tipp Funktionalisierung erforderlich.
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Discussion
In den letzten Jahrzehnten haben die Einzelmolekül-Experimente beispiellose Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zur Verfügung gestellt und erwies sich als ein wertvolles Vorgehen im Bereich Life Science und darüber hinaus. Um eine gute und sinn Statistiken EMKS Experimenten idealer ein und dasselbe Molekül wird über den gesamten Verlauf des Experiments verwendet erzielen. Im Gegensatz zu den Experimenten mit Ensembles von Molekülen sind SMFS Experimente in der Lage, seltene Ereignisse und versteckt Molekülzustände zu erkennen. Ein weiterer Vorteil der Einzelmolekül-Experimente ist, dass sie mit Hilfe von Moleküldynamiksimulationen 24,25 modelliert werden.
Der oben beschriebene Ausleger Funktionalisierung Protokoll ist eine modifizierte Version von Verfahren vorveröffentlichten 26-28. Nach Aktivierung und Silanisierung wird das AFM Cantilever mit einer Mischung aus zwei verschiedenen Typen von Polyethylen-Glykol (PEG) Moleküle (Linkermoleküle) funktionalisiert.
N- Hydroxysuccinimid (NHS) -Gruppe (oder ein Thiol reaktive Maleimidgruppe) beendet wird, wenn später auf dem Sondenmolekül konjugiert ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). In Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung der Spitze Funktionalisierung. Der Zweck des PEG ist dreifach: Erstens, passiviert die Spitzenfläche und verhindert unspezifische Adsorption. Zweitens, unter Verwendung eines bestimmten methyl-PEG / NHS-PEG-Verhältnis ermöglicht zum Einstellen des NHS-PEG-Konzentration auf der Oberfläche der Spitze. Und drittens, trennt es die Spitze aus dem Sondenmolekül und ermöglicht somit eine Quantifizierung der Molekül-Oberflächen-Wechselwirkung ohne Störung durch den Gleich Spitze-Oberflächenwechselwirkung. Dann wird das Sondenmolekül kovalent an die Spitze über den NHS-PEG (oder Mal-PEG) gekoppelt ist.
Dieses Protokoll stellt sicher, dass alle Anleihen (*) in der & #8220; Kupplung Kette "tip * OH * Silan * * PEG-Sondenmolekül sind kovalente Bindungen und damit sehr stark. Dies wiederum ermöglicht es, dass ein und dasselbe Sondenmolekül wird über die gesamte Versuchsdauer gemessen. Dies wurde oben in der repräsentative Ergebnisse Schnitt, der wahre Einzelmolekülkraftspektroskopie exemplifiziert worden.
Wie kann überprüft werden, dass wirklich ein einzelnes Molekül wird gemessen? Für einzelne Spuren mit Plateaus mit konstanter Kraft, ist ein Tropfen auf die Grundlinie aus. Wenn mehr als ein Polymer gleichzeitig desorbiert wird, fällt die Kraft auf Null in mehreren diskreten Schritten, als jedes Polymer löst an einer anderen Stelle. Schwieriger ist die Entscheidung, ob es sich jedes Mal das gleiche Einzelmolekül. Deshalb ist die Verteilung des Ablöselängen muss ausgewertet werden. Eine enge Verteilung mit einem einzelnen Peak ist ein guter Hinweis darauf, dass ein und dasselbe Einzelmolekül wurde in jedem Kraftausdehnungskurve sondiert. Für einzelne Spuren mit rupture Veranstaltungen ist die Überlagerung aller Spuren die beste Methode, um zu entscheiden, ob (ein und dasselbe) Einzelmolekül gemessen. Alternativ kann jede Kurve mit einem (WLC) Modell eingebaut werden und dann sowohl die Persistenzlänge und die Bruchlänge bei einer definierten Kraft kann aufgetragen werden. Die Verteilung dieser beiden Parameter hat schmale und Einzelschirm sein.
Im Ergebnis hat ein Herstellungsverfahren für das Anbringen einer Vielzahl von einzelnen Molekülen zu AFM-Spitzen präsentiert. Die AFM kleines Trinkgeld (Radius ~ 10 nm), dessen seitliche Positionierung Fähigkeiten und seine Kraftempfindlichkeit machen ihn zum idealen Werkzeug, um die Hafteigenschaften von Einzelmolekülen zu biologischen und nicht-biologischen Oberflächen in nahezu jeder Flüssigkeit zu studieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
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