Summary
אבות interneuron קליפת המוח GABAergic לפזר, לפתח וsynaptically להשתלב קליפת מארח לאחר השתלה. ניתן transduced תאים אלה בקלות לפני ההשתלה ללימודי in vivo של מבשרי GABAergic מהונדסים גנטי. כאן, אנו מציגים טכניקות תיוג נגיפיות למקד תת-קבוצות interneuron ספציפיות באמצעות קווי Cre קיימים וכתבי Cre-תלויים.
Abstract
interneurons GABAergic קליפת המוח, הנגזרת מהמדיאלי העוברית והוד הזנב ganglionic (MGE וCGE), היא מבחינה תפקודית ומורפולוגית מגוונת. אחיזה נעשתה בהבנת התפקידים של תת-קבוצות שונות בקליפת המוח interneuron, עם זאת, עדיין יש מנגנונים רבים יש לעבד שעשויה לתרום להתפתחות והתבגרות סוגים שונים של תאי GABAergic של. יתר על כן, איתות GABAergic שינתה עשויה לתרום לפנוטיפים של אוטיזם, סכיזופרניה ואפילפסיה. קווי Cre-נהג ספציפיים החלו לעטוף את הפונקציות של תת-קבוצות interneuron ייחודיות. למרות ההתקדמות במודלים של עכברים, לעתים קרובות קשה ללמוד אבות interneuron קליפת המוח GABAergic ביעילות עם גישות מולקולריות in vivo. טכניקה חשובה אחד משמשת ללמוד תכנות האוטונומי התא של תאים אלה היא השתלה של תאי MGE לקליפת מוח מארח. תאים מושתלים אלו נעים בהרחבה, להבדיל,nd תפקודי לשלב. בנוסף, תאי MGE ניתן transduced ביעילות עם lentivirus מייד לפני ההשתלה, ומאפשרים למספר רב של גישות מולקולריות. כאן אנו פירוט פרוטוקול לtransduce תאי MGE ביעילות לפני ההשתלה לניתוח in vivo, באמצעות קווי Cre-נהג זמינים ווקטורי ביטוי Cre-תלויים. גישה זו יש יתרון משום שהוא משלב מניפולציה גנטית מדויקת עם היכולת של תאים אלה לפיזור לאחר השתלה, מאפשר רזולוציה מסוימת תאים מסוג גדולה יותר in vivo.
Introduction
interneurons קליפת המוח GABAergic מהווה ~ 20-30% מתאי עצב שבקליפת המוח של היונקים, ואילו השאר מתאים לגירוי, הנוירונים עיקריים glutamatergic. Interneurons מגוונת מאוד בנכסים, האקסון אלקטרו ומורפולוגיה דנדריט והסינפטי מיקוד 1, וחוסר איזון בטון מעכב / מעורר הם שיערו לבסיס כמה פנוטיפים של הפרעות נוירו-פסיכיאטריות / נוירולוגית כוללים אוטיזם, סכיזופרניה ואפילפסיה 2. המטרה הכוללת של הפרוטוקול המתואר במסמך זה היא לספק אמצעים לשנות ביעילות גנטית אבות interneuron קליפת המוח GABAergic לפני ההשתלה לin vivo ניתוחים.
interneurons קליפת המוח GABAergic נולדות בהוד המדיאלי וזנב ganglionic (MGE וCGE, בהתאמה) 3,4, כמו גם את אזור הקדם-האופטי התיכון 5. אבות interneuron קליפת המוח עוברים הגירה משיקה למרחקים ארוכים ואחריעל ידי הגירת רדיאלי להגיע ליעדים הסופיים שלהם. עם הגעה ליעדים שלהם, interneurons קליפת המוח אלה חייבת בצורה נכונה להשתלב ברשת העצבית הקיימת, וכל תת-קבוצה interneuron ייחודית תתרום למעגלים בקליפת המוח בדרכים מסוימות. ניתן להבחין בארבע קבוצות עיקריות על ידי סמנים מולקולריים: סומטוסטטין נגזר MGE (SST) + וparvalbumin (PV) + תת-קבוצות, ופפטיד נגזר CGE vasoactive מעיים (VIP) + וReelin +; SST - תת-קבוצות 6. תת-קבוצות שונות בקליפת המוח interneuron נולדות על זמנים שונים במהלך התפתחות עוברית ובMGE 7 CGE, 8. אלה וסמני interneuron אחרים בקליפת המוח GABAergic כבר השתמש כדי ליצור קווי Cre-נהג ספציפיים עבור רבים מתת-קבוצות אלה 9-11.
ההשתלה של תאי אב MGE התפתחה כטיפול מבוסס תאי פוטנציאל לטיפול בהפרעות שעלולות להיגרם על ידי חוסר איזוןבעירור / עיכוב 12-24. יתרונות טיפוליים אלה עשויים להיות נובעים בחלקו את היכולת הייחודית של אבות MGE (לפיזור, להבדיל ולהשתלב במוח מארח), או שעלול להיות בגלל פרי גופני רב PV + תאים מעכבים נגזרים מMGE. תאי MGE יכולים להיות גם transduced מהירות וביעילות עם lentiviruses לפני ההשתלה 15, המאפשרים לתאים שעברו שינוי גנטי במבחנה כדי להיחקר in vivo. הרציונל לפיתוח גישה זו היה להתגבר על מחסומים בלימוד פיתוח GABAergic קליפת המוח interneuron והתבגרות. בפרט, השתלת MGE אפשרה לחוקרים ללמוד את התפתחותם של תאים שעברו מוטציה in vivo, כאשר עכבר המוטציה אחרת היה מת בנקודת זמן מוקדמת. יתר על כן, על ידי החדרת גנים של עניין לפני ההשתלה, את ההשפעות של גנים ספציפיים על פנוטיפ מוטנטי יכולות להיות מוערכים בEFFאופן icient.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לtransduce תאי MGE עם lentiviruses לפני ההשתלה. בנוסף, אנו מראים כיצד טכניקה זו ניתן להתאים להביע גן של עניין בתת-קבוצות interneuron ספציפיות מקבוצה הטרוגנית של מבשרי interneuron קליפת המוח, באמצעות שילוב של lentiviruses הביטוי Cre תלוי וקווי עכבר Cre-נהג זמינים. יתר על כן, פרוטוקול זה מציג טכניקות ופלטפורמה לחוקרים לשנות גנטי מבשרי interneuron קליפת המוח GABAergic לin vivo מחקרים בדרך ייחודית. אחד יתרונות של שיטה זו על פני גישות שוטפות אחרות הוא שהתאים המושתלים MGE יתפזרו מאתר ההזרקה. כמו כן, בניגוד לזריקות נגיפיות מוקד, לאחר תאי MGE לפזר המורפולוגיה שלהם קלה יותר להעריך. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של החדרת גנים של עניין לסוג בר או תאים שעברו מוטציה, מציג סוג תא מסויםכתב להעריך מורפולוגיה, או שעלול להיות כדי לחקור את ההשפעה של אללים מחלה in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: ההליכים הבאים אושרו על ידי פרוטוקול המוסד ובעלי החיים שלנו. הקפד לקבל אישור לכל הנהלים הקשורים ניתוחי הישרדות לפני תחילת ניסויים ולאמת את כל הפרוטוקולים מעודכנים.
1. Lentivirus הכנה (שלב אופציונאלי)
- לפצל שלוש 10 צלחות סנטימטר של תאי HEK293T עבור כל lentivirus להתבצע, בנוכחות 10 מיליליטר DMEM / 10% FBS, ולגדול ל~ מפגש 60-70%. לגדל תאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- Transfect פלסמידים הבאים DNA (10 מיקרוגרם כולל) לכל צלחת שימוש בכל מגיב transfection: 6.4 מיקרוגרם וקטור lentiviral CAG-Flex-GFP (רצף וקטור DNA הניתנים בטבלה 1), 1.2 מיקרוגרם pMD2.G (מקודד VSV-ז), 1.2 מיקרוגרם pRSV-Rev, ו -1.2 מיקרוגרם pMDLg / pRRE. שלושה וקטורי אריזת lentiviral זמינים מסחרי (טבלה
הערה: גישה מסוימת זו משתמשת lentivir דור ה -3וקטורי וקטורי אל אבל דור 2 ופלסמידים הקשורים גם יעבדו. - הכן מיכל פסולת המכיל פתרון אקונומיקה 10% בתוך מכסה המנוע BSL2 מוסמך כדי להשבית כל פתרונות או מכשירים שיצרו קשר עם או מכילים lentivirus. בשלב הבא, להסיר לחלוטין את התקשורת 4-6 שעות לאחר transfection לפתרון אקונומיקה, להחליף עם אותו הנפח של המדיה חדשה, ולאפשר לתאים לגדול.
- לאחר 4 ימים, לאסוף מדיה לתוך צינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות חרוטי XG ב 1000 במשך 15 דקות עד גלולה כל פסולת תא. בשלב הבא, לסנן supernatant דרך קרום 0.45 מיקרומטר. כל מסנן מחייב חלבון נמוך, כמו PVDF, עובד היטב. זהירות: מקום שתי פסולת נגיפית מוצקה ונוזלית לתוך תמיסת אקונומיקה.
- 30 מיליליטר העומס מסונן supernatant לתוך צינורות ultracentrifuge ולultracentrifuge. צנטריפוגה ב100,000 XG במשך 2.5 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. פתח את צינורות צנטריפוגה בברדס BSL2 ולהסיר supernatant לBleach 10%. הוספה של PBS ~ 100 μl לPEllet, אשר מניב titers של 1x10 ^ 7-8 יחידות / מיליליטר זיהומיות. Aliquot היום והחנות הבאים ב -80 ºC. aliquots Lentivirus יציב ב -80 ° C לשישה חודשים לפחות.
- עכשיו יש לי רבות מוסדות ליבות ויראלי: שיקול חשוב. לרכוש נגיף מרוכז עם כייל מינימום של 1x10 7 מיליליטר / יחידות זיהומיות, לתוצאות אופטימליות.
2. עכברים תורמים לMGE Dissection
- ראשית, להגדיר את הזדווגות מתוזמן בין קו Cre להביע עניין וגם עכבר סוג בר (WT) או עכבר שיבטא כתב לאחר רקומבינציה בתיווך Cre.
הערה: קווי Cre-נהג רבים transgenics ומתוחזקים וגדלו במדינת hemizygous. לפיכך, רק מחצית מהעוברים תכיל את גן Cre. ניתן להכין DNA במהירות מהעוברים לPCR קצר כדי לזהות אלל Cre. אז יכולים להיות שנקטפו Cre + העוברים כך רקמות MGE רק של הגנוטיפ הרצוי משמשת. משתנvely, ניתן להשתמש בכתב Cre תלוי, כדי לבחור את העוברים לנתיחה MGE והשתלה. - לחשב באיזה יום יהיה מתאים לE13.5. אם בעלי החיים היו לזווג הערב לפני, ביום של התוספת הוא 0.5. עכברים להזמין בעתו בהריון או נשים WT עם גורי P1 כדי זמן שלאחר הלידה (P) 1 עכברים ביום הרקמות התורמות תהיה E13.5. לחלופין, להגדיר הזדווגויות אלה בבית בשבוע שלפני זיווג בעלי החיים תורם אחד.
הערה: האסטרטגיה לשעבר של יצירת שני E13.5 ועוברי P1 / גורים לאותו היום היא לעתים קרובות קשה לעשות באופן מהימן.
3. הכנת מדיה, כלים וציוד.
- הכן את חומרים כימיים וכלים להכנת MGE תא (טבלה 2).
- הכן משטח נקי ומניח את מלקחיים נקיים, מספריים וגם סכין מייקרו או מלקחיים עדינים (לנתיחה רקמה מדויקת) על פני השטח.
- הכן תמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS), fאו לנתיחה, ובינוני של הנשר שונה של Dulbeco (DMEM) עם 10% הסורם שור עוברי (FBS), עבור התמרה.
- Preincubate 20-30 מיליליטר DMEM / 10% FBS בתרבית רקמת חממת 37 ° C כ 1 שעה. המכסה צריך להיות משוחרר כדי לאפשר חילוף גזים ואיזון pH של התקשורת.
הערה: preincubation התקשורת יכול להיות מוכן רק לפני תחילת הניתוח.
4. תא MGE הכנה
- להקריב את העכבר בהריון על פי פרוטוקול שאושר על חיה ולהסיר את העוברים לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטרים המכילה HBSS קר כקרח.
- הסר את המוח מכל עובר באמצעות היקף ניתוחים (לעשות אחד בכל פעם, והשאיר את שאר העוברים בHBSS קר כקרח) ולאחר מכן להמשיך לחתוך את רקמת MGE.
הערה: מפורט להלן, ובאיור 1, הם שלבים עיקריים המראים כיצד להסיר את MGE. בנוסף, איור 2 הוא סרט המציג את כל הנתיחההליך.- מקם את המוח עם צד הגחוני פונה כלפי מעלה (איורים 1 א, '). הערה: זה גם בסדר שיהיה לי היבט הגב פונה כלפי מעלה. חותך את המוח במחצית לאורך מטוס saggital ליצור שתי חתיכות. מוח דוגמא התפצלה לפתע מוצג (1B דמויות, ב '), שם לב שגב (הקליפה שמעליה) והיבטי הגחון של כיסוי המוח ומקיף את רקמת רוממות ganglionic (GE).
- בשלב הבא, עם יד דומיננטית, להחזיק או מלקחיים עדינים מאוד או stabknife (טבלה 2), ואילו לשתק חצי הכדור עם מלקחיים שנערכו על ידי יד הלא דומיננטית. (ההיבט המדיאלי של האונה צריך לפנות כלפי מעלה). פתח את הגב ורקמת הגחון עם מלקחיים וסכין לדקור כדי לחשוף את הרקמה הבסיסית GE (איור 1 ג ונתח באיור 1 ג ').
הערה: הסרת חלק מאמצעי תקשורת מצלחת פטרי לנתיחה יכולה לעשות את זה קל יותר לייצב את הרקמות תוך PErforming נתיחת MGE. - לבצע חתכים ישרים עם stabknife או מלקחיים בסדר להפריד CGE, LGE ורקמות במחיצה (חתכי דוגמא לראות כונה על ידי אדום קווים מקווקווים, איורים 1D ו- D "). קיצוצים אלה יכולים להתבצע בכל סדר.
הערה: תארו לעצמכם MGE כ'תיבה 'שנחתכה מהרקמה הסובבת. בכך אעזור לreproducibly לבצע קיצוצים דומים לכל נתיחה, ובכך להקטין שונות ובניתוחי רקמה. - לבסוף, להפוך את MGE על צידו וחתוך את החלק התחתון (מה שהיה הצד הלטרלי של המוח). זה מסיר את אזור המעטפת של MGE (להשליך ב1E דמויות ו1E ') משאר MGE. ההיבט הנותר של MGE מכיל אזור בעיקר חדרית ומנות אזור subventricular של MGE, המכיל כמעט את כל התאים MGE. להמשיך ברקמה זו.
- שיקול חשוב: התוספת של ג'ל סיליקון לתחתית ca צלחת פטריn לשמש כמשטח לנתיחה מעולה כפי שהוא מגן על טיפים העדינים של מלקחיים ומספק משטח רך לתולה רקמה עם מלקחיים.
4.3 אסטרטגיות נוספות לMGE Dissection.
- חותך את העור של העובר באמצעות מלקחיים כמו מספריים כדי להסיר את המוח במהירות. כעובר מניח בצד שלה, מחזיק את הרקמה בבסיס של הראש עם המלקחיים המשמשים לעגן את הרקמה. ראשית, לחתוך קדמי הגחון למוח והאחורי הגחון למוח, ולאחר מכן לחבר את שני חתכים לאורך הצד של העובר. אז לתפוס את קפל עור ולמשוך אותו מעל החלק העליון של המוח. המוח אז יכול להיות גזור משם במהירות מהרקמות שנותרו.
- לחלופין, לעגן את החלק האחורי של המוח כולו מאחורי הקליפה. בינתיים, לתפוס כל חצי הכדור בהיבט הזנב הגב ביותר של קליפת המוח ולקרוע את הקליפה מן הרקמה המעוגנת בכיוון קדמי. בדרך זו, שני גortices ניתן להסיר והוד ganglionic דו-צדדי מתגלה, עדיין מחובר לשאר רקמות שמירה על האנטומיה המדיאלי-הצדדית.
- החלף ל דקירת הסכין לבצע חתכים מדויקים סביב MGE בכל חצי הכדור. השתמש באחת סט נפרד נקי של מלקחיים כדי לאסוף את MGE או פיפטה עם טיפ גדול (כלומר., P1000).
הערה: שמור על הרקמות שנאספו מכל החומר האחר הגזור, כחלק מאמצעי התקשורת היא בלתי נמנעת כאשר הועברה MGE נאסף. - לאסוף את MGE ולשים את הרקמה לתוך 1.5 מיליליטר צינור אוסף המכיל FBS / 10% DMEM, (נפח של 500 μl מספיק כדי לאסוף את MGEs). חזור על פעולה עבור חץ הכדור השני והמקום באותו צינור האיסוף. שמור על דגימות קרח עד שכל הרקמה שנאספו.
5. תיוג lentiviral והשתלות
- הזז את הצינורות של רקמת MGE למכסה מנוע BSL2 מוסמכת ולהסיר את המדיה.
הערה:רקמת MGE היא גדולה מספיק כדי להיות גלוי לעין, ויישב לחלק התחתון של הצינור המאפשר התקשורת הקרה להיות להסיר בקלות ובעדינות. - להוסיף ~ 500 ul של תקשורת DMEM / 10% FBS, שהיה preincubated בחממה תרבות 37 ° C רקמות. לאחר מכן, להוסיף polybrene כדי להקל על התמרה על צינור אחד בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מיליליטר. Triturate רקמות MGE ליצור השעיה תא בודדת, באמצעות קצה פיפטה P1000. לבסוף, להוסיף ~ 15-20 μl של lentivirus המרוכז לכל צינור.
- שיקול חשוב: טחינה דקה של 10-12 פעמים היא מספיק כדי לשבור את רקמת MGE מעובר אחד, אבל יותר triturations עשוי להידרש אם MGEs מרובה הם אספו יחד. נסה את תנאי טחינה דקה שונים כדי לקבוע מה עובד הכי טוב.
- באופן מאובטח לסגור צינור אחד, להפוך לערבב, מאשר מקום כל הצינורות בחממה 37 ° C. דגירה התאים בlentivirus לפחות 30 דקות ועד שעה 1. פעמים יותר הביאו לדהכדאיות תא מקומטות. להפוך את הצינורות כל 10 דקות עד שהזמן הוא למעלה.
- לאחר הדגרה עם lentivirus, להסיר את הצינורות מהחממה וצנטריפוגות ב ~ 700 XG במשך 3 דקות עד גלולה התאים. בשכונה BSL2, להסיר את supernatant וזורקים לאקונומיקת 10%. לאחר מכן, להוסיף 1 FBS / 10% מיליליטר DMEM וtriturate גלולה 2-3 פעמים כדי לשטוף, אז צנטריפוגות שוב באותה המהירות לגלולת התאים. חזור על לשטוף את הצעד הזה 2-3 פעמים יותר כדי להסיר וירוס עודף.
הערה: בצע את השלבים צנטריפוגה ב 4 ° C, לעומת זאת, כדאיות מופחתת לא נצפתה כאשר ספינים קצרים מבוצעים בRT. - לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר תקשורת האפשרית ולשים את כל צינור על קרח. עקב תקשורת שיורית על הצדדים של הצינור, ~ 2-3 μl של תקשורת יהיה בסופו מכסה את התא גלולה בזמן הליך ההשתלה החל.
6. השתלה ואישור ב
- לרכוש גורי P1 מארח ולהכין את ההליךאזור על ידי ריסוס למטה עם 70% אתנול. כדי לשמור על סטריליות במהלך ההליך מומלץ לבצע הליכים אלה בחדר הליך נקי ייעודי. בנוסף, השתמש באחד כלים כירורגיים autoclaved לעקר משטחים שהגורים יהיו במגע עם שימוש באתנול 70%. דוגמא של ציוד נציג הדרושים לביצוע ההשתלות ואזור הליך נציג מוצגת באיור 3.
שים לב: בעוד הליך זה הוא הזרקה של כמויות קטנות, ולא הליך כירורגי שיחייב חתך, פצע או תפרים פתוחים, הוא עדיין מומלץ שmicropipette חדש משמש עבור כל עכבר להיות מוזרק. Micropipettes הוא חום מעוקר כאשר משכו ומשופע על משטח שרוסס עם אתנול 70% מאוחסנים במכל אטום.
- צור micropipettes יש קוטר בקצה בין 40-80 מיקרומטר. בעקבות הממדים הללו יניבו אופטימלייםתוצאות. חום לעקר את micropipettes כאשר משך ומשופע על משטח ולרסס עם אתנול 70% לפני אחסון micropipettes במכל אטום.
הערה: לחלופין, אם גישה להתקנים הדרושים כדי ליצור המחטים האלה (טבלה 2) מגבילה, להשתמש בכל מכשיר הזרקה אחר. עם זאת, אלה לא יכולים להיות גם מתאימים כמו micropipettes בשל קטרים שונים. - צייר את שמן מינרלים לתוך מזרק 1 מיליליטר, ועם מחט G 30 1/2, למלא את פיפטה הזכוכית לחלוטין עם שמן מינרלים. בשלב הבא, הר הבוכנה על מכשיר stereotaxic, לאחר מכן לצרף את פיפטה הזכוכית למכשיר ועומס stereotaxic על הבוכנה. שימוש בכונן ההידראולי, להזיז את הבוכנה בערך באמצע הדרך לתוך פיפטה הזכוכית, הסרת שמן מינרלים שנשפך החוצה עם מגבת נייר נקייה נקייה.
- לחלופין לבאמצעות מזרק, להטביע את הקצה האחורי של פיפטה בשמן מינרלים ומלאים על ידי פעולת נימים. כדי למנוע בועות אוויר בpipettדואר, לשמור על לחץ חיובי על המזרק עד לחלוטין מחוץ לפיפטה הזכוכית.
הערה: התקנים אחרים יכולים לשמש להשתלה בהצלחה תאי MGE 14. כל מכשיר שיכול לספק נפח קטן או ליד 100 עבודות nl גם להליך זה.
- לחלופין לבאמצעות מזרק, להטביע את הקצה האחורי של פיפטה בשמן מינרלים ומלאים על ידי פעולת נימים. כדי למנוע בועות אוויר בpipettדואר, לשמור על לחץ חיובי על המזרק עד לחלוטין מחוץ לפיפטה הזכוכית.
- בשלב הבא, להשתמש במגבת סטרילית נייר, או כל חומר סופג, עם הפינה התעקמה נקודה עדינה כדי להסיר בעדינות תקשורת עודפת מעל התא גלולה MGE. צעד זה מרכז את צפיפות התאים, כך שיכולים להיות מושגת כרכי הזרקה קטנות יותר. בשלב הבא, להשתמש בנפח נמוך (P2 הוא מועדף) פיפטה לצייר לאט התא גלולה וtriturate 1-2 פעמים לפני שעברת את ההשעיה התא על גבי משטח הידרופובי. הנפח צריך להיות ממש מתחת 1 μl. הזז את קצה המחט לתוך ההשעיה התא ושימוש בכונן ההידראולי, להכין את ההשעיה התא לתוך פיפטה.
- לטשטש גור P1 באמצעות היפותרמיה (לעטוף בכפפות לטקס ולשים על קרח ~ 2-4 דקות).בדוק ליעילות של הרדמה עם גירוי מזיק. לצבוט את העור בין האצבעות עם מלקחיים בסדר: הגור צריך להיות מגיב אם צבט. לאחר מכן, למקם את הגור על עובש שהוא תחת מכשיר ההזרקה, אז להפוך את העור המתוח על ידי משיכת בחזרה את העור על הראש והאבטחה עם קלטת מעבדה סטנדרטית.
שים לב: בעוד היפותרמיה היא יעילה מאוד בעכברים ותוצאות בשיעור תמותה נמוך בילוד, חייבים להיעשות במהירות נהלים, כגורים יתחילו להתאושש בתחת 10 דקות. בנוסף, 4 דקות על קרח היא גבול עליון של מה שיכול להיות נסבל. נסה לגרום להיפותרמיה רק פעם אחת אם נדרש זמן רב יותר לזריקות. עם זאת, אם גור מתאושש מוקדם, תאפשר ראשון הגור להתאושש באופן מלא לפני גרימת היפותרמיה שוב. יתר על כן, רק לגרום להיפותרמיה עוד פעם אחת כדי לבצע זריקות. גורים יתאוששו בתוך 5-10 דקות של היפותרמיה. זה ניתן להקל על ידי הצבת את הגורים עם המלטה ואמא או על ידי הצבת את הגור בsurfac חםדואר להתאושש. - שימוש במכשיר stereotaxic, מקם את קצה פיפטה הזכוכית על פני השטח על ראשו של הגור, בניצב למשטח של הראש. כאשר פיפטה היא במגע עם הראש, לשקול את זה כ'0 '. בשלב הבא, לדחוף את פיפטה דרך פני השטח של העור והגולגולת לתוך הקליפה, לאחר מכן הכנס ולחזור פיפטה ~ 2 פעמים לפני הפסקה. לאופטימלי מיקוד של תאים לתוך הניאוקורטקס, זריקות מבוצעות כאשר micropipette הוא בעומק של 0.1 מ"מ. עם זאת, זה צריך להיות מותאם על ידי המשתמש (ראה הערה בהמשך).
שים לב: בעוד עומק זה אמין מטרות שכבות neocortical עמוק יותר עם המכשירים שתוארו לעיל, כמה עומקים צריכים להיבדק נקבעו באופן אמפירי. בנוסף, מגוון רחב של מעמקים בעמדת rostro- הזנב וMedio-הרוחב שונה צריך להיבדק כדי לקבוע מה עומק הוא אופטימלי בכל אתר. כמו כן, לנקב הראשוני צריך להיות מהיר, כמו חדירה איטית להניאוקורטקס מפחיתה את יכולת גleanly לחדור את הרקמה. נסה מהירויות שונות בעת ההפעלה הראשונה בהליך זה כדי למצוא את מה שעובד הכי טוב. בנוסף, לקואורדינטות בדיקות, אין תחליף אמיתי לשימוש בתאים שכותרתו, כמו צבעים היו לא אמינים כדי לציין מיקום. - ברגע שהמחט נמצאת בעמדה, לסובב את המכשיר ההידראולי לקדם את הבוכנה לתוך פיפטה הזכוכית, דוחף סט נפח של השעיה תא לתוך הקליפה. הזרק 50-70 NLS לכל אתר. חזור על תהליך זה ב3-6 אתרים שונים ברמות מקורי, הזנב שונים אם המטרה היא להשיג פריסה רחבה של תאים בכל הניאוקורטקס.
הערה: כרכים של 100 NL או יותר יכולים לגרום לנגעים ולהוביל לגושים גדולים של תאים מוזרקים שאינם מצליחין להעביר ביעילות מאתר ההזרקה. לפיכך, כרכי הזרקה קטנים יותר (~ 70 NL או פחות) הם אופטימליים, על אתרים נוספים, אם היתרי זמן. - כאשר זריקות הושלמו, להסיר את הגור מהבמה ולסמן אותו (גזיר בוהן הוא דרך אמינה כדי לזהות את pעליות בהמשך). ברגע שהגור התאושש והוא מסוגל לנוע בכוחות עצמו (זה מתרחש תוך דקות של הסרת אותם מהבמה), החזיר אותו עם אמא וגורים.
הערה: מכיוון שמדובר בהליך זעיר-פולשני אין נהלים לאחר ניתוח פעם אחת את הגור נע בחופשיות וחימם. עם זאת, יש לבדוק גורים לא רק לאחר ההליך, אלא גם ביום שלמחרת כדי להבטיח שאין להם סימנים של הידרדרות במצב בריאות. - לפני שתתחיל בהליך על הגור הבא, לרסס את האזור עם 70% אתנול כדי לשמור על אזור עבודה סטרילית. לאפשר לגורים מוזרקים לפתח ולאחר מכן להעריך את הרקמה בשלב התפתחותי המתאים (ים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאז יש לי תאי MGE היכולת הייחודית להעביר ולשלב כאשר הושתלו הניאוקורטקס מארח 16, שהם מספקים מערכת מודל מצוינת למניפולציה גנטית לפני מחקרי in vivo. במסמך זה, אנו מראים כיצד ניתן לבודד את רקמת MGE מעוברי E13.5 (איורים 1 ו -2), אשר לאחר מכן ניתן transduced עם lentiviruses או במבחנה או בצורה מהירה לפני ההשתלה ללימודי in vivo. MGE תיוג באמצעות lentiviruses בוצע לפני השימוש משפר נהיגה GFP בתאי עצב GABAergic 15. עם זאת, היכולת לבטא גנים בתת-קבוצות ספציפיות מאוכלוסייה הטרוגנית לפני השתלה עשויה לסייע מאוד מחקרים של הפיזור והאינטגרציה של תאים אלה. בזאת, אנו ביקשנו לפתח אמצעי למקד ביטוי של חלבון פלואורסצנטי לתת קבוצת interneuron ספציפית, אלה המבטאים סומטוסטטין + (SST).
אנו Fiהראשון subcloned כתב זמין מסחרי Cre תלוי GFP (מידע וקטור, טבלה 2) לשדרת lentiviral. הווקטור נוצר על ידי subcloning הראשון הקלטת המכילה GFP מוקף אתרי loxP מוקטור AAV וligating אותו לשדרת lentiviral וקטור 15 בשימוש באתרי הגבלת XbaI וPflMI, (קלטת זו הכילה רק חלק מאמרגן CAG). בשלב הבא, את השארית של אמרגן CAG הייתה נכרתה מוקטור ביטוי יונקים pCAGGS עם אתרי SpeI וXbaI וligated לאתר XbaI של וקטור lentiviral ליצור pLenti-CAG-Flex-GFP. 5 'אתר SpeI של הכנס הוא ללא תשלום לXbaI ובכך הרס את 5' האתר, ואילו אתר 3 'XbaI היה נשמרת. וקטור התוצאה (4A סכימת איור, טבלת רצף וקטור 1) נבדק ראשון במבחנה בנוכחותו או היעדריו של Cre (סכימה של assay במבחנה, איור 4). MGE הנוירונים עיקריים מAi14 Flox / + E13.5 עוברים היו בתרבית וtransduced עם שילוב של lentiviruses. כמה ללא GFP + או tdTomato + תאים נצפו רק עם התמרה של CAG-Flex-GFP lentivirus (4C דמויות, 4F ו4I). הקרינה tdTomato הייתה נוכחת בתאי MGE transduced עם lentivirus CMV-Cre, (4D דמויות, 4G ו4J) מעיד על ביטוי Cre. לבסוף, שיתוף התמרה של תאי MGE הביאה רבים tdTomato תאים + שגם הביעו GFP, המציין כי lentivirus CAG-Flex-GFP עבד כצפוי (4E דמויות, 4H ו4K). כמה תאי GFP + נדירים נצפו שלא היו tdTomato +, שעלול להיות בשל לכתב transduced שילוב ליד אמרגן חזק, אשר היווה <2% מכל GFP + התאים.
תוכן "> תאי MGE הושתלו סוג בר הניאוקורטקס מארח לפזר, בוגר ולהשתלב בהניאוקורטקס המארח 16 E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE תאים הושתלו neocortices WT בP1 (סכימה, איור 5A) וההפצה שלהם בדקו בשעה 7 ו- 35 ימים שלאחר ההשתלה (DPT). בשני הגילים, tdTomato + תאים נצפו בהניאוקורטקס (5 דמויות ו -5 ג). התמונות ב5B דמויות ו5C הן השתלות נציג ניצול MGE . תאים מעובר אחד כדי לבדוק את מידת היעילות MGE תאים יכולים להיות מתויגים עם הפרוטוקול המתואר במסמך זה, תאי MGE מSST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + עוברים היו transduced עם lentivirus CAG-Flex-GFP ומושתל ב אותו אופן. בניסויים אלה, ~ 15 ul של concelentivirus ntrated (~ 1x10 7 יחידות זיהומיות / ml) נוצל עם MGEs המשולב מעובר אחד לכל השתלה. התאים הושתלו מכן לתוך קליפת מארח P1 WT ונותחו בשעה 7 DPT (איורים 5D-5F). של התאים המושתלים (tdTomato +), כ -20% היו + GFP, המצביעים על התמרה עם CAG-Flex-GFP lentivirus (איור 5G). נתונים אלה מצביעים על כך שעם הכמות וכייל של lentivirus שתוארו לעיל, ~ 20% של תאים מושתלים MGE יכולים להיות מתויגים. כמות הנגיף או יכולה להיות ירידה או עלייה, או משתנה פוטנציאלי אחרים כמו משך הדגירה נגיפית ניתן לשנות, כדי להשיג תיוג תא דליל או צפוף.שימוש ברקמת MGE מקו עכבר כתב Cre תלוי בשיתוף עם lentivirus CAG-Flex-GFP יכול להגביל את מספר סמנים נוספים שיכול להיות נחקר על ידי immunofluorescence. לכן, SST-IRES-Cre + < / Sup> רקמת E13.5 MGE נאספה וtransduced עם lentivirus CAG-Flex-GFP כדי להמחיש את התאים מושתלים MGE שהביעו Cre (יהיה + GFP). תאים אלה הושתלו קליפת P1 WT והעריכו ב 35 DPT (ראה תכנון ניסוי, איור 6 א), נקודת זמן שבו סמני interneuron בוגרים באים לידי ביטוי. בגיל 35 DPT, ~ 85% של תאי GFP + שיתוף הביע SST, אבל רק ~ 4% הביעו PV (6B-6H איורים). מספרים אלה עולים בקנה אחד עם ניתוח השושלת של קו עכבר SST-IRES-Cre, שגם גורל מפות ל~ 5-10% של PV + תאים 9 (וגט ורובינשטיין, תוצאות לא פורסמו). נתונים אלה מראים כי תיוג ויראלי של MGE הוא יעיל ויכול להיות גישה החלים על החדרת כתב או שעלול להיות גן של עניין לפני ניתוח in vivo.
740fig1.jpg "/>
איור 1. הליך נציג לנתיחה של נתיחת דוגמא E13.5 MGE רקמה. רקמת MGE לשתי תרבויות או השתלות עיקריות. תמונות (AE) של ניתוחי מוח E13.5, ו( A'-E ') שרטוטים כדי להדגיש מבנים וצעדים חשובים בהליך. (, ") מוח הנציג E13.5 נצפו מהיבט הגחון. קו אדום מציין את החתך הראשון שנעשה, אשר hemisect המוח לשני חלקים. (B, B ') צפה בhemisection מוח אחד. ההיבט המדיאלי גלוי, עם היבט לרוחב למטה. רקמה מהקליפה הגבי (צבע כחול) overlies הוד ganglionic. בנוסף, רקמת הגחון שיוסרה מוצגת בכתום. (C, C ") צפה ובאיור של הוד ganglionic נחשף לאחר שמעל הרקמה כבר התקלף. (D, D") באותו מבט של ganglionic נחשף emi nences כמו ב( C, C "), אבל עם אתרי חתך מפורטים מוצגים כקווים מקווקווים אדומים. לאחר MGE הוא לגזור לפי הקווים מסומנים ב( D, D "), הרקמה מופעלת על צידו (E, E ') וההיבט לרוחב חיתוך ומזנוח. צעדי נציג בנתיחה והבידוד של רקמת MGE. קיצורים: (CGE) רוממות ganglionic הזנב, (LGE) רוממות ganglionic לרוחב, (MGE) המדיאלי ganglionice רוממות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. סרט מראה נתיחת E13.5 MGE. סרט מתאר את הסרת מוח E13.5 ואחריו עוקבת התגלגלות והסרת הרקמות שמעליה. MGE מסומן והחתכים שנעשו להסרת רקמה שמסביב הם תכנית בצו בשלבים.. "Target =" MGEdissect movie.mov _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
איור 3. אזור נציג הליך ודוגמא של מחט זריקה להשתלות בילוד. (, ") תמונות מראה התקנת דוגמא לבצע השתלות לעכברים בילוד. מיקרוסקופ (1) ממוקם מעל במה המכיל עובש שיכול להכיל עכבר בילוד (5) ומכשיר stereotaxic (2). (א ') תמונה מוגדלת של (A) מראה את האזור של מכשיר stereotaxic שמחזיק (7) את מחט זריקת זכוכית (6) עם בוכנה שהוכנסה. הבוכנה נשלטת על ידי כונן הידראולי קנס (4) ונעה שמן מינרלים בתוך מחט הזכוכית שמתווכת לזרום פנימה והחוצה מהמחט. (ב) דוגמא של מחט זריקת כוס עם קצה משופע. לשליט ב( B), כל תיחום גדול = 100 מיקרומטר. רשימת מצאי (C) של פריטים המוצגים ב(, '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בדיקות איור 4. במבחנה להדגים את הביטוי של ה- GFP מlentivirus CAG-Flex-GFP בנוכחות Cre. () סכמה של איך וקטור CAG-Flex-GFP lentiviral עובד בנוכחות Cre. סכימה (B) ניסוי תרבית תאי MGE העיקרי להעריך אם CAG-Flex-GFP lentiviral יבטא GFP באותם תאים עם ביטוי Cre. בקצרה, תאי MGE מכתב Cre תלוי, Ai14 (מבטא tdTomato בנוכחות Crה), גדלו במבחנה וtransduced עם Cre ו / או Flex-GFP lentiviruses. (CK) תמונות Immunofluorescent של תרבויות העיקריות E13.5 MGE שהיו transduced עם CMV-Cre, CAG-Flex-GFP או שניהם. תרבויות הם צילמו עבור ביטוי tdTomato ילידים, GFP וDAPI. בר סולם ב( K) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. נציגי תמונות של מושתל וtransduced, SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + MGE תאים. () סכימה של תכנון ניסוי להשתלה או תאי MGE לבד או לאחר התמרה lentiviral לסוג בר מארח, ימים (WT) (DPT) לאחר השתלה. בקצרה, E13.5 SST-IRES-Cre +; תמונות Immunofluorescent Ai14 Flox / + MGE תאים הושתלו או או transduced עם lentivirus CAG-Flex-GFP לפני ההשתלה לneocortices WT והעריכו בשעה 7 DPT (B, C) של. neocortices בשעה 7 או 35 DPT מראה תאי נציג MGE מושתלים (tdTomato +). (DF) תמונות Immunofluorescent של תאי MGE transduced עם lentivirus CAG-Flex-GFP הוערך ב -7 DPT. (G) כימות שיעור tdTomato + תאים ש להביע GFP בשעה 7 DPT. ברים בקנה מידה (C) ו- (F) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2740fig6.jpg "/>
קציר תא סכימת איור 6. נציגי תמונות של lentivirus CAG-Flex-GFP transduced, SST-IRES-Cre + MGE השתלות שתשתפנה מפורש סמנים תת-interneuron נגזר MGE. (א) לE13.5 SST-IRES-Cre + MGE ותמרה עם lentivirus CAG-Flex-GFP והשתלה להניאוקורטקס של מארחי P1 WT לפני ההערכה בגיל 35 DPT. נציג תמונות מהניאוקורטקס של מארחים מושתלים מראים ביטוי של ה- GFP, מוקטור Flex (B, E), שיתוף מוכתם עבור שני סומטוסטטין (SST) (C) או parvalbumin (PV) (F). (D, G) מוזגו תמונות עם DAPI מוכתם במשותף. כימות (H) של חלקם של תאי GFP שישתף מפורש SST או PV. הנתונים מייצגים ± SEM, (n) = בר 3. Scale ב( G) = 100 מיקרומטר."Target =" /52740fig6large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1. קובץ FASTA של וקטור pLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA.
| חומרים כימיים וציוד להכנת תא MGE ותמרה | # קטלוג | חברה | ||||||
| 1) | הנשר בינוני השתנה Dulbecco, עם גלוקוז גבוה | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | סרום שור העוברי חום מומת | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | תמיסת מלח מאוזנת הנקס (HBSS), אין סידן או מגנזיום | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (או אחרצינורות איסוף עם מכסים) | 3810X | אפנדורף הבינלאומי | |||||
| 5) | Polybrene | sc-134,220 | ביוטכנולוגיה Santacruz | |||||
| 6) | סכין דקירה ישר 22.5 מעלות (לא חובה) | REF 72-2201 | תאגיד התמחויות כירורגי | |||||
| 7) | צלחת פטרי (10 סנטימטרים), ולניתוחי רקמה | FB0875713 | פישר סיינטיפיק | |||||
| 8) | 2 מלקחיים טיפ נאה, כמו דומון # 5 | 11,254-20 | כלים מדעיים פיין | |||||
| 9) | תרבית רקמת חממת 37 ° C עם 5% CO 2 קלט | C150 | בינדר | |||||
| 10) | צנטריפוגה שולחן שיכול לסובב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge | |||||||
| 11) | כל פיפטה P1000 שיכול לשמש לטחינה דקה תא | |||||||
| 12) | רמת בטיחות ביולוגית 2 מכסה המנוע | |||||||
| חומרים כימיים וציוד במבחנת תרבויות עיקריות MGE | # קטלוג | חברה | ||||||
| 1) | Lab-TekII chamberslides עם כיסוי, 8 גם | 154,941 | תרמו פישר | |||||
| 2) | 0.1% במשקל / נפח פולי-L ליזין | P8920 | סיגמא אולדריץ ' | |||||
| 3) | העכבר Laminin, 0.5-2 מ"ג / מיליליטר | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | בינוני Neurobasal | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | סרום B27 תוספת תשלום | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, מניית 100x | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | פניצילין, סטרפטומיצין, מניית 100x | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | גלוקוז, (להכין פתרון של 25% במים) | G5400 | סיגמא אולדריץ ' | |||||
| חומרים כימיים וציוד להשתלת תאי MGE | # קטלוג | חברה | ||||||
| 1) | מזרק 1 מיליליטר | REF 309,602 | BD, בקטון דיקינסון וחברה | |||||
| 2) | 30 1/2 מחט G | 305,106 | BD, בקטון דיקינסון וחברה | |||||
| 3) | Preנשא cision לספק 5 μl (מגיע עם בוכנה) | 5-000-1005 | חברה מדעית דראמונד | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc | |||||
| 5) ** | מיקרוסקופ סטריאו עם boomstand | MZ6 | לייקה | |||||
| 6) ** | דיגיטלי רק למכשיר stereotaxic עכברים | 51725D | חברת Stoelting | |||||
| 7) ** | שמן Single-ציר micromanipulator בסדר ההידראולי | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | beveler הסיבובי מצופה היהלומים | na | עשה בבית | |||||
| 9) | pipet מחטחולץ te | 730 | מכשירי קופף | |||||
| 10) | שמן מינרלים | na | כל חנות סמים או בית מרקחת | |||||
| 11) | כל טפטפת וטיפים שיכולים reliaby מידה 1 μl של נפח | |||||||
| ** אלו הם דגמים מסוימים אנו משתמשים, אך רב setups האחר צריך לעבוד | ||||||||
| Optionaריאגנטים l (להכנת Lentiviruses) | # קטלוג | חברה | ||||||
| 1) | 25 מ"מ, 0.45 מיקרומטר מסנן | 09-719B | פישר סיינטיפיק | |||||
| 2) | צינורות צנטריפוגה Ultra-ברור (25 x 89 מ"מ) | 344,058 | בקמן Coulter® | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1.5 מיליליטר גודל) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| אספקה זמינה מסחרי אחרת | # קטלוג | חברה | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE איסור פרסום קידוד פלסמיד / pol | 12,251 | Addgene | |||||
| 2) | Rev קידוד פלסמיד pRSV-Rev | 12,253 | Addgene | |||||
| 3) | VSVG קידוד פלסמיד pMD2.G | 12,259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28,304 | Addgene | |||||
טבלת 2. רשימה מלאי של חומרים כימיים וכלים. מלאי של חומרים כימיים זמינים מסחרי כולל תקשורת, כלים לנתיחה, ציוד נציג לוקטורי השתלה וDNA. (Na) לא זמין או ישים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש של מבשרי interneuron קליפת המוח GABAergic מהוד ganglionic העוברי (GES) לטיפולים בתאים מבוססים מראה הבטחה למצבים רבים 12 -1 4. יש צורך בטכניקות מולקולריות מדויקות כדי לעקוב אחר, ולהביע את הגנים של עניין בתת-קבוצות interneuron ספציפיות. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתיוג תאים עובריים MGE עם lentiviruses לפני ההשתלה ולהראות כיצד טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבטא את הגנים של עניין בתת-קבוצות interneuron קליפת המוח ספציפיות לניתוח in vivo.
ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר במסמך זה באופן מהימן, עם זאת, לשחזור אופטימלי הוא חיוני לדבוק כמה שלבים קריטיים. ראשית, לתמרה ויראלית להיות יעילה, טמפרטורה ו- pH פיזיולוגית נחוצות. אם פרמטרים אלה מתקיימים, ניתן transduced תאי MGE 30 ~ דקות. שנית, לוודא שיש גלולה MGE צפופה לפני שימשיכולעשות השתלה. זה חשוב כי רק כמות מוגבלת ניתן להזריק לתוך מוח עכבר בילוד בכל אתר ללא גביית נזק, והתאים יעברו מאתר ההזרקה, כך הצפיפות שלהם בעת ההשתלה היא פחות דאגה מיכולה להיות צפוי. לבסוף, להריץ כמה תנאי בדיקה עם תאי MGE שמבטאים כתב ניאון כדי לקבוע מה הזרקת מעמקים הם אופטימליים. בעוד פרוטוקול זה משמש תאי MGE, תאי CGE יכולים לשמש גם באותו אופן. חסרון אחד הוא שאין קווי Cre-נהג רבים המגבילים את ביטוי לכל CGE או לקבוצות משנה מסוימות של interneurons נגזרת CGE. עם זאת, פפטיד vasoactive המעיים (VIP) 9 הוא אונליין Cre אמין שיכול לשמש כדי להפריד את תת-קבוצה זו של תאים שמקורם-CGE. כקווים חדשים הופכים לזמינים, ניתן יהיה להעסיק פרוטוקול זה עם דיוק גנטי יותר.
בעבר, אנחנו ואחרים הראינו השירות של החדרת גנים לתאי MGE לפני ההשתלה באמצעות electroporation או עם lentivirus 15, 17. בעוד טכניקות אלה היו יעילות בהחדרת גנים לניתוח in vivo, רקמת MGE הוא הטרוגנית ומולידה תת-קבוצות interneuron מרובות, כמו גם תאים שאינם עצביים 4. יתר על כן, זה כבר קשה להביע את הגן של עניין רק בתת-קבוצת interneuron ספציפית. צעדים גדולים נעשו כדי ליצור קווים מהונדסים כי לשחזר דפוסי הביטוי של תת-קבוצות רבות interneuron קליפת המוח, ובכלל זה, אך לא רק, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre ד VIP-Cre 9 -11, וכניסתו של קווים חדשים תסייע להבהיר אוכלוסיות אפשריות נוספות בעתיד. יתר על כן, עם הדור של עיתונאים Cre תלויים ווקטורי ביטוי, כוללים וקטורי כתב Cre תלויים בשימוש במסמך זה, ביטוי מדויק יותר של גנים של עניין יכול להיות מושגת.
ילדה = "jove_content"> בעוד הזרקה של וירוסי כתב Cre תלויים במוחם של עכברים להביע Cre בתאים מוגבלים היא שיטה חזקה, וירוסים אינם מתפשטים הרחק מאתר הזרקה. זה עלול להוביל לאזור צפוף של תאים חופפים ולכן קשה ללמוד את תאי transduced באופנה בודדת או מאתרי ההזרקה. בניגוד לכך, יש לי תאי MGE היכולת הייחודית להגר מאתר ההזרקה, ומאפשר להערכה נקיה של הנכסים של תאים בודדים. חסרון של הזרקת תאים להניאוקורטקס הוא שהם לא חוצים את מסלולי נדידה המשיקים נורמלים. אפשרות אחת כדי לחקור הגירה משיקה באמצעות assay זה הוא להכין את התאים באותו אופן, אבל להזריק אותם לMGE לפי גילים של עובר מארח WT במקום גור בילוד. בניסוי זה, התאים המושתלים היו לעבור מסלולים משיקים נורמלים. על ידי שילוב של השתלת MGE עם מרחבית-מוגבל, Cre תלויביטוי של עיתונאי, אנו מראים את הכדאיות של להביע גן של עניין או כתב בתוך תת-קבוצה מסוימת של תאים שהם בעצמם מתאימים לבחינה מורפולוגית.
מגבלה אחת לטכניקה זו יכולה להיות בגודל של הבר שאחד מהימנה יכול חבילה לתוך וקטור lentiviral. בנוסף, גישה זו עדיין לא נבדקה עם AAVs. עם זאת, ברגע שטכניקה זו היא מותאמת על ידי יחיד, וריאציות רבות של גישה זו עשויות לשמש. ראשית, הגישה המתוארת כאן תאפשר לחוקרים להביע כתבים באמצעות lentivirus כתב Cre תלוי בשיתוף עם תאי תורם MGE של קווי Cre-נהג ספציפיים. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את המורפולוגיה של תאי MGE בודדים או פוטנציאלי להביע גן של עניין בתת-קבוצות שונות אם גן שני הוא משובט לתוך הווקטור. שנית, היא עשויה גם להיות ריאלי להשתמש וירוס Cre להביע עם Cre תלוי תאי תורם MGE כתב או potentially לנצל מתפתחים אלמנטים נשמרו DNA, יזמים משפרי, לנהוג ביטוי באוכלוסיות שונות של תאים מאוכלוסייה הטרוגנית.
משוכת עתיד להתגבר יהיה תיוג תאי גזע pluripotent מושרה אדם נגזר או תאי גזע עוברי לפוטנציאל לטהר ו / או ללמוד קבוצה מסוימת של תאים. מעניין, משפרי DNA נשמרו עשויים לשמש גם במערכות ביטוי נגיפיות למקד נוירונים GABAergic בתרבויות עיקריות, לאחר הזרקה לתוך הקליפה, ולפני השתלת תאי MGE 15, 18, 19. משפרי עשויים להיות תשובה למכשול הזה ויהיה ריבית ככלים מולקולריים, כמו טכניקות חדשות נדרשות ללמוד את התועלת של תאים אלה בטיפול. ואכן, אחיזה למשפרים מגלים שעלולה לתייג או interneurons GABAergic 20 או תת עצביים אחרים, כולל נוירונים glutamatergic 21, נמצא בעיצומם. תוך שימוש בשיטת התיוג הנגיפית במסמך זה,ייתכן שניתן לtransduce תאי גזע מובחנים אדם נגזר עם משפרי ספציפיים תא מסוג תווית תאים שונים של עניין לפני השתלה ובניתוח vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לJLRR מ: אוטיזם ספיקס, נינה אירלנד, ווסטון נמלי קרן, NIMH R01 MH081880, וNIMH R37 MH049428. PRW נתמכה על ידי מענק מהמועצה הלאומית למדע של טייוואן. SFS נתמכה על ידי F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
