Summary
GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor.
Abstract
Embriyonik medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve CGE) türetilen GABAerjik kortikal internöron, işlevsel ve morfolojik çeşitlidir. Yayılmakta farklı kortikal interneuron alt rollerini anlamada yapılmış, ancak, GABA farklı hücre tiplerinin gelişmesi ve olgunlaşması için katkıda bulunabilir çalışılması gerektiğini hala birçok mekanizma vardır. Ayrıca, değiştirilmiş GABA sinyal, otizm, şizofreni ve epilepsi fenotipleri katkıda bulunabilir. Spesifik Kre-sürücü hatları eşsiz interneuron alt fonksiyonlarını dışarı parsel başladı. Fare modellerinde ilerlemelere rağmen, verimli in vivo moleküler yaklaşımlar GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır çalışma genellikle zordur. Bu hücrelerin hücre özerk programlama incelemek için kullanılan önemli bir tekniktir konak korteks içine MGE hücrelerinin nakli olduğunu. Bu nakledilen hücrelerin ayırt, yoğun göç, birnd işlevsel entegre. Buna ek olarak, MGE hücreleri verimli bir şekilde moleküler yaklaşımlar çok sayıda imkan veren, transplantasyondan hemen önce lentivirüs ile transduse edilebilir. Burada mevcut Kre-sürücü hatları ve Kre-bağımlı ifade vektörleri kullanılarak, detay verimli in vivo analiz için transplantasyon öncesi MGE hücreleri nakletmek için bir protokol biz. Bu, in vivo olarak daha büyük bir hücre türüne özgü çözünürlüğe izin verecek şekilde nakli sonrası dağıtmak için bu hücrelerin yeteneği ile kesin genetik işleme birleştirir, bu yaklaşım, avantaj sağlamaktadır.
Introduction
Dinlenme, glutamaterjik temel nöronlar uyarıcı karşılık ise GABAerjik kortikal internöron, memeli neokorteks nöronların ~% 20-30 içermektedir. Internöron elektrofizyolojik özellikleri, akson ve dendrit morfolojisi ve 1 hedefleme sinaptik oldukça çeşitlidir, ve uyarıcı / inhibitör tonda dengesizlikler otizm, şizofreni ve epilepsi gibi nörolojik 2 / nöropsikiyatrik bozuklukların bazı fenotipleri altında yatan varsayılmaktadır. Burada açıklanan protokol genel amacı verimli genetik in vivo analizler için transplantasyon öncesi GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır değiştirmek için bir araç sağlamaktır.
Kortikal GABAerjik internöron medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve sırasıyla CGE) 3,4 yanı sıra preoptik alanda 5 doğarlar. Kortikal interneuron atalarıdır uzun mesafe teğet göç takip geçmesiradyal göç ederek nihai hedeflerine ulaşmak için. Hedeflerine varışta, bu kortikal internöron doğru mevcut nöronal ağ içine entegre olmalı, ve her benzersiz interneuron alt grup belirli şekillerde kortikal devre katkıda bulunacaktır. Dört ana alt gruplar moleküler belirteçlerin tarafından ayırt edilebilir: MGE-türetilmiş somatostatin (SST) + ve parvalbumin (PV) + alt gruplar ve CGE-türetilmiş vazoaktif intestinal peptid (VIP) + ve Reelin +; SST - alt grupları 6. Farklı kortikal interneuron alt grupları MGE ve CGE 7, 8 embriyonik gelişimi sırasında değişik zamanlarda doğar. Bu ve diğer kortikal GABAerjik interneuron işaretleri bu alt 9-11 çok özel Cre sürücü soyları meydana getirmek için kullanıldı.
MGE progenitörlerin nakli dengesizliklerinin neden olabilir bozuklukları tedavi etmek için potansiyel bir hücre bazlı terapi olarak ortaya çıkmıştır12-24 uyarma / inhibisyonu. Bunlar, tedavi edici yararları çok peri-somatik önleyici PV + hücreleri MGE elde edilir (ayırt etmek ve bir konakçı beyin entegre dağıtmak için), ya da potansiyel nedeniyle MGE progenitörlerinin eşsiz kabiliyetlerine bağlı olabilir. MGE hücreleri aynı zamanda genetik olarak in vitro olarak modifiye edilmiş hücreler, in vivo olarak incelenmesi gereken sağlayan hızlı ve verimli bir şekilde nakli 15 önce lentivirüsler ile transduse olabilir. Bu yaklaşım geliştirmek için gerekçe GABAerjik kortikal interneuron gelişimini ve olgunlaşmasını okuyan barikatlar üstesinden oldu. Özellikle, MGE transplantasyonu mutant fare başka türlü erken zaman noktasında öldü ne zaman araştırmacılar, in vivo, mutant hücrelerinin gelişimini çalışmalarına izin vermiştir. Ayrıca, transplantasyon öncesinde ilgi genlerin katılmasıyla, bir mutant fenotipe spesifik genlerin etkileri, eff olarak değerlendirilebiliricient şekilde.
Burada, biz transplantasyon öncesinde lentivirüsler MGE hücreleri nakletmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Buna ek olarak, bu teknik, Kre-bağlı sentezleme lentivirüsler ve veriler Cre sürücü fare hatları bir kombinasyonu kullanılarak, kortikal interneuron ön ait heterojen bir gruba belirli interneuron alt ilgi konusu bir geni ifade etmek üzere adapte edilebilir göstermektedir. Genetik benzersiz bir şekilde in vivo çalışmalar için GABAerjik kortikal interneuron öncülerini değiştirmek Üstelik, bu protokol teknikleri ve araştırmacılar için bir platform sunuyor. Diğer güncel yaklaşımlar üzerinde bu tekniğin bir avantajı nakledilen MGE hücreleri uzak enjeksiyon yerinde dağıtmak olacaktır. Ayrıca, fokal, viral enjeksiyondan farklı MGE hücreleri dağıtmak sonra morfoloji değerlendirmek kolaydır. Bu yaklaşım, belirli bir hücre tipi sokulması, vahşi tip veya mutant hücrelerine ilgi genleri verme etkisini incelemek için kullanılabilirmuhabir in vivo hastalık alel etkisini incelemek için potansiyel morfoloji değerlendirmek, ya da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik deyimi: Aşağıdaki prosedürleri kurum ve hayvan protokolü tarafından onaylanmıştır. Deneyler başlamadan önce hayatta kalma ameliyatları ile ilgili tüm işlemler için onay almak için emin olun ve tüm protokolleri güncel olduğunu doğrulamak.
1. lentivirüs Hazırlık (İsteğe bağlı Adım)
- 10 ml DMEM /% 10 FBS varlığında yapılabilir her lentivirüs için HEK293T hücrelerinin üç adet 10 cm'lik tabak bölünmüş, ve •% 60-70 ortak akışa kadar büyümeye. % 5 CO2 ile 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde hücreler büyür.
- 1.2 ug pMD2.G (VSV-G kodlayan) 1,2 (Tablo 1 'de verilen DNA vektörü sekansı), 6.4 ug CAG-Flex-GFP lentiviral vektör, aşağıdaki herhangi bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak her plaka, DNA plazmidleri (10 ug toplam) transfekte ug pRSV-Rev, ve 1.2 ug pMDLg / pRRE. Üç Lentiviral ambalaj vektörler piyasada mevcuttur (Tablo
Not: Bu özel yaklaşım 3. nesil lentivir kullanırEl vektörleri ama 2. nesil vektörleri ve ilişkili plazmidler de çalışacaktır. - Temas veya lentivirüs içeren herhangi bir çözüm veya cihazları etkisiz hale getirmek için bir BSL2 sertifikalı kaput içinde% 10 çamaşır suyu çözeltisi içeren bir atık kabı hazırlayın. Sonraki tamamen, çamaşır suyu çözeltisi içine transfeksiyondan sonra Ortam 4-6 saat kaldırmak, yeni medyanın aynı hacimde ile değiştirin, ve hücrelerin büyümesine izin verir.
- 15 dakika herhangi bir hücre yıkıntıları pelet haline getirildi için 4 gün sonra, 1000 x g'de 50 ml konik tüp ve santrifüj Ortamı toplar. Daha sonra, bir 0.45 um membrandan filtre süpernatan. Herhangi bir düşük protein bağlama filtre, PVDF gibi, iyi çalışıyor. Dikkat: çamaşır suyu çözeltisi içine yer hem katı hem de sıvı viral atık.
- Yük 30 ml'lik bir ultra santrifüj tüpleri içine ve bir ultra santrifüj içine süpernatan süzülmüştür. 4 ° C 'de 2.5 saat boyunca 100.000 x g'de santrifüjleyin. Bir BSL2 kaputu santrifüj tüplerine açın ve% 10 Bleach içine süpernatant kaldırmak. Pe PBS ~ 100 ul ekle1x10 ^ 7-8 enfeksiyöz birim / ml titreleri elde edilir LLET. -80 ºC aşağıdaki gün ve mağaza bölmeyin. Lentivirüs alikotları, en az altı ay boyunca -80 ° C 'de stabildir.
- Önemli düşünce: Birçok kurum artık viral çekirdeğe sahip. En iyi sonuçlar için 1x10 7 enfeksiyöz birim / ml 'lik bir en az titresi, konsantre virüs elde edin.
MGE Diseksiyon 2. Verici Fareler
- İlk olarak, ilgi Kre-ifade hattı ve bir vahşi tip (WT) fare ya da Kre-aracılı rekombinasyon sonra bir muhabir ifade edecek bir fare arasında bir zamanlanmış çiftleşme kurmak.
Not: Birçok Kre-sürücü hatları transgenikler ve tutulan ve hemizigot devlet yetiştirilmektedir. Bu nedenle, embriyoların yarısı Cre transgeni içerecektir. DNA, hızlı bir şekilde Cre alel algılamak için kısa bir PCR için embriyo hazırlanabilir. İstenen genotip sadece MGE bir doku da kullanılabilir, böylece, Cre + embriyolar daha sonra hasat edilebilir. Alternatif, Cre-bağımlı haberci MGE diseksiyon ve nakli için embriyoları seçmek üzere, kullanılabilir. - E13.5 karşılık hangi gün hesaplayın. Hayvanlar akşam önce eşleşmiş olsaydı, fiş gün 0.5 olduğunu. Sipariş zamanlı gebe fareler ya da doğum sonrası (P) sahip zaman için P1 yavrular ile WT kadın donör doku E13.5 olacak gününde 1 fareler. Alternatif olarak, donör hayvanları eşleştirme önce bir hafta evinde bu çiftleşmesi kurmak.
Not: E13.5 ve P1 embriyolar hem üreten eski strateji / Aynı gün yavrular güvenilir yapmak çoğu zaman zordur.
Medya, Araçlar ve Ekipman 3. hazırlanması.
- MGE hücre preparasyonu (Tablo 2) için reaktifler ve araçları hazırlayın.
- Temiz bir yüzey hazırlayın ve yüzeyde temiz forseps, makas ve bir mikrocerrahi bıçak veya ince forseps ya (kesin doku diseksiyonu için) yerleştirin.
- Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS), Hazırlama fdiseksiyon ve dönüşüm kesme işlemleri için,% 10 fetal sığır surem (FBS) ile Dulbeco değiştirilmiş kartal ortamı (DMEM) veya.
- Yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde Kuluçkalama Öncesi, 20-30 mi, DMEM /% 10 FBS. Kapak ortamının gaz değişimi ve pH dengesini sağlamak için gevşetilmiş edilmelidir.
Not: Medya preinkübasyon sadece diseksiyonu başlamadan önce hazırlanabilir.
4. MGE Hücresinin Hazırlanması
- Onaylanmış hayvan protokolüne göre hamile bir fare kurban ve buzla soğutulmuş HBSS içeren 10 cm'lik bir petri kabına embriyolar çıkarın.
- (Bir seferde birini yapın buz gibi soğuk HBSS embriyoların kalanını bırakarak) diseksiyon kapsamı kullanarak her embriyo beyin çıkarın ve sonra MGE doku kesip devam edin.
Aşağıda Ayrıntılı ve Şekil 1'de, MGE kaldırmak için nasıl gösteren önemli adımlar şunlardır: Not. Buna ek olarak, Şekil 2, tüm diseksiyonu gösteren bir filmprosedür.- (Şekil 1A, A ') yukarı bakacak ventral tarafı beyin yerleştirin. Not: dorsal boy yukarı bakacak olması da iyidir. İki adet üretmek için saggital düzlemi boyunca yarısında beyin kesin. Bir örnek hemisected beyin (Şekil 1B, B '), dorsal (üstte korteks) beyin kapak ventral açıdan fark ve ganglionik tepe (GE) doku çevreleyen gösterilmiştir.
- Bir baskın olmayan elle tutulan forseps ile yarımkürede hareketsizleştirir ederken Sonraki, bir dominant elin ile, çok ince forseps veya stabknife (Tablo 2) basılı tutun. (Hemisphere en medial yukarı dönük olmalıdır). Altta yatan GE doku (Şekil 1C ve Şekil 1C 'de diagrammed) ortaya dorsal ve ventral doku forseps ile ve bir bıçak bıçak açın.
Not: Diseksiyon petri bazı medya Çıkarma kolay pe ise doku stabilize yapabilirsinizMGE diseksiyonu rforming. - CGE, LGE'yi ve septal dokuları ayırmak için stabknife veya ince forseps ile düz kesimler olun (kırmızı ile gösterilen bkz örnek keser kesikli çizgiler, '1D ve D Rakamlar). Bu kesikler herhangi bir sırada yapılabilir.
Not: çevreleyen doku kesip bir 'kutu' olarak MGE düşünün. Bunu yapmak tekrarlanabilir, böylece doku disseksiyonlarında değişkenliği azaltarak, her diseksiyon için benzer kesim yapmak yardımcı olur. - Son olarak, yan MGE açmak ve alt (beynin yan yönü neydi) keserek. Bu MGE geri kalanından MGE manto bölgesini (Şekil 1E ve 1E'de atmak ') kaldırır. MGE kalan yönü öncelikle ventriküler bölge ve neredeyse tüm MGE progenitör hücreleri içeren MGE, subventrikuler bölge bölümlerini içeriyor. Bu doku ile devam edin.
- Önemli düşünce: Bir petri ca altına silikon jel eklenmesiBu forseps hassas ipuçları korur ve forseps ile doku çivileme için yumuşak bir yüzey temin n mükemmel bir diseksiyon yüzeyi olarak hizmet etmektedir.
MGE Diseksiyon için 4.3 Ek stratejiler.
- Hızlı beyin kaldırmak için makas gibi forseps kullanarak embriyo cilt kesin. Embriyo yan bırakır gibi, doku demirlemek için kullanılan forseps ile baş dibinde doku tutun. İlk olarak, beyne beyne ve posterior ventral anterior ventral kesmek, ve sonra embriyonun kenarı boyunca iki kesim bağlayın. Sonra cilt kapağı kapmak ve beynin üstünden çekin. Beyin sonra hızla geriye kalan dokudan uzak disseke edilebilir.
- Alternatif olarak, korteks arkasında bütün beynin posterior yönünü çapa. Bu arada, korteks en dorsal kaudal yönü her yarımkürede kavramak ve anterior yönde uzak demirlemiş dokudan korteksi gözyaşı. Bu şekilde, her iki Cortices çıkarılabilir ve ikili ganglion eminences hala orta yanal anatomisinin koruyucu dokunun geri kalanına bağlanmış, ortaya çıkar.
- Delinmeye bıçak Switch, her yarımkürede MGE çevresindeki hassas kesimler yapmak. MGE veya büyük bir ucu olan bir pipet (yani., P1000) toplamak için forseps ayrı bir temiz seti kullanın.
Not: MGE tahsil edildiğinde bazı medya kaçınılmaz transfer olarak, tüm diğer Diseke malzemeden uzak toplanan doku tutun. - MGE toplamak ve DMEM /% 10 FBS (500 ul kadar bir hacim MGES toplamak için yeterlidir) ihtiva eden 1.5 ml'lik bir tüp içine doku koydu. Aynı toplama tüpüne diğer yarımkürede ve yer tekrarlayın. Tüm doku toplanır kadar buz üzerinde örneklerin tutun.
5. Lentiviral etiketleme ve Transplantasyon
- Bir BSL2 sertifikalı kaput içine MGE doku tüpleri taşıyın ve ortamı çıkarın.
Not:MGE doku gözle görünür olmasını ve soğuk medya kolayca ve nazikçe kaldırılır olması için izin tüpün dibine razı olacak kadar büyük. - , DMEM /% 10 FBS ortamı ~ 500 ul ekle, bir 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde önceden inkübe edildi. Daha sonra, 8 ug / ml lik bir nihai konsantrasyonda her bir tüpe transdüksiyonunu kolaylaştırmak için polybrene ekleyin. P1000 pipet kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için MGE doku çiğnemek. Son olarak, her tüpe ~ konsantre lentivirüs 15-20 ul ekle.
- Önemli değerlendirme: 10-12 kez bir toz haline getirme, tek bir embriyodan MGE doku parçalanması için yeterli olmakla birlikte, çok sayıda MGES bir araya toplanmış ise daha fazla toz haline getirilmesini gerekebilir. En iyi olanı belirlemek için farklı trituration koşullarını deneyin.
- Güvenli bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir yerde daha karıştırmak için ters, tüm tüpler her tüp kapatın. En az 30 dakika ve 1 saat kadar lentivirüs hücreleri inkübe edin. Daha uzun kez de sonuçlandıkıvrımlı hücre canlılığı. Süre doluncaya kadar boruları her 10 dakikada bir ters çevirin.
- Lentivirüs ile kuluçkalamadan sonra, hücreler topak haline getirilip, 3 dakika süreyle ~ 700 x g kuvöz ve santrifüj tüpleri çıkarın. BSL2 kaput, süpernatant kaldırmak ve% 10 çamaşır suyu içine atın. Daha sonra, 1 ml DMEM /% 10 FBS ekleyin ve daha sonra, yıkama, hücreleri topaklamak üzere aynı hızda yeniden santrifüj ile pelet 2-3 kez çiğnemek. Aşırı virüs kaldırmak için bu yıkama-adımı 2-3 kez daha tekrarlayın.
Not: Kısa spin oda sıcaklığında gerçekleştirildiğinde, 4 ° C'de santrifüj adımları Bununla birlikte, indirgenmiş canlılığı gözlenmemiştir. - Son yıkamadan sonra, mümkün olduğu kadar çok ortamını çıkarın ve buz üzerinde her tüp koydu. Nedeniyle tüp yanlarındaki artık medyaya, ~ medya 2-3 ul nakli prosedürü başladı zaman hücre pelet kapsayan sona erecek.
6. Nakli ve Doğrulama
- Ev sahibi P1 yavrular Edinme ve prosedürü hazırlamak% 70 etanol ile aşağı püskürtülerek alan. İşlem sırasında sterilite korumak için bir özel, temiz işlem odasında bu işlemleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Buna ek olarak, kullanmak ya da otoklavlanmış cerrahi aletler yavruların% 70 etanol ile temas halinde olacak yüzeylere sterilize edin. Nakli ve temsili prosedür alanı yapmak için gerekli olan temsili ekipmanın bir örneği, Şekil 3'te gösterilmiştir.
Not: Bu yordam bir küçük hacimli enjeksiyon, değil bir kesi, açık yara ya da sütür gerektirecek bir cerrahi işlem olmasına rağmen, hala her fare enjekte edilecek yeni bir mikropipet kullanılması tavsiye edilir. mikropipetler çekilmiş ve% 70 etanol, kapalı bir kap içinde depolanan püskürtüldü bir yüzey üzerinde eğimli zaman ısıyla sterilize edilmiş bulunmaktadır.
- 40-80 um arasında ucunda bir çapa sahip mikropipetler oluşturur. Bu boyutlar ardından optimum verecekSonuçlar. Isı çekildiğinde mikropipetler sterilize ve bir yüzey üzerinde kesik ve kapalı bir kapta mikropipetler saklamadan önce% 70 etanol ile sprey.
Not: (Tablo 2), bu iğneler oluşturmak için gereken cihazlara erişimi sınırlama Alternatif olarak, başka bir enjeksiyon cihazı kullanın. Bununla birlikte, bu değişik çaplarına bağlı mikropipetler gibi uygun olmayabilir. - 1 ml şırınganın içine mineral yağ çizin, ve 30 1/2 G iğne ile, mineral yağ ile tamamen cam pipet doldurun. Sonraki, piston üzerine stereotaksik cihaz ve yük cam pipet eklemek sonra, stereotaksik cihaz üzerine monte pistonu. Hidrolik sürücü kullanarak, temiz temiz bir kağıt havlu ile saçılan mineral yağ çıkarma, cam pipet içine yarısına kadar pistonu hareket ettirin.
- Alternatif olarak, bir şırınga kullanarak, mineral yağ içinde pipet arka uç daldırın ve kapiler etkiyle doldurulmuştur. Pipett hava kabarcıklarını önlemek için,e, cam pipet tamamen kadar şırınga pozitif basıncı korumak.
Not: Diğer cihazlar başarıyla MGE hücreleri 14 nakli kullanılabilir. Veya daha bu prosedür için de 100 nl eserler yakın bir hacim az sunabilen herhangi bir cihaz.
- Alternatif olarak, bir şırınga kullanarak, mineral yağ içinde pipet arka uç daldırın ve kapiler etkiyle doldurulmuştur. Pipett hava kabarcıklarını önlemek için,e, cam pipet tamamen kadar şırınga pozitif basıncı korumak.
- Ince noktaya içine bükülmüş köşe ince MGE hücre pelet üzerinde aşırı ortamı çıkarmak için sonraki, bir steril kağıt havlu, ya da herhangi bir emici malzeme kullanın. Bu adım, daha küçük enjeksiyon hacimleri elde edilebilir, böylece hücre yoğunluğu yoğunlaşmaktadır. Sonraki, yavaş yavaş hücre pelet hazırlamak ve bir hidrofobik yüzeye hücre süspansiyonu geçmeden önce 1-2 kez çiğnemek için (P2 tercih edilir) pipet düşük hacim kullanın. hacim hemen altında 1 ul olmalıdır. Hücre süspansiyonu içine iğne ucu hareket ettirin ve hidrolik sürücü kullanarak, pipet içine hücre süspansiyonu hazırlamak.
- Hipotermi yoluyla P1 yavru uyuşturan (bir lateks eldiven sarın ve ~ buz üzerinde 2-4 dakika koymak).Bir zararlı uyaran ile anestezi etkinliği için kontrol edin. Ince forseps ile ayak parmakları arasında cilt Pinch: sıkışmak durumunda yavru tepkisiz olmalıdır. Sonraki, enjeksiyon cihazının altında bir kalıp üzerine yavru koyun, sonra kafasına cilt geri çekerek ve standart laboratuar bant ile güvence gergin cilt yapmak.
Not: hipotermi yenidoğan farelerde ve düşük mortalite oranı sonuçları çok etkili iken yavrular 10 dakika altında kurtarmak için başlayacak gibi, prosedürler, çabuk yapılmalıdır. Buna ek olarak, buz üzerinde 4 dakika tolere edilebilir ne bir üst sının teşkil eder. Uzun bir zaman enjeksiyonlar için gerekli ise, sadece bir kez hipotermi ikna etmek için çalışın. Bir yavru erken kurtarır Ancak, ilk yavru tekrar tam hipotermi oluşturulmadan önce kurtarmak için izin verir. Ayrıca, sadece hipotermi bir enjeksiyonları gerçekleştirmek için daha fazla zaman neden. Yavrular hipotermi 5-10 dakika içinde iyileşir. Bu çöp ve anne ile yavrular yerleştirerek veya sıcak bir yüzeye uygulamaktadır üzerinde yavru koyarak kolaylaştırılabilirE kurtarmak için. - Bir stereotaksik cihazı kullanarak, baş yüzeyine dik, yavru kafasına yüzeyinde cam pipet ucu yerleştirin. Pipet kafası ile temas halinde olduğu zaman, "0" olarak düşünün. Sonraki eklemek sonra, korteks içine deri ve kafatası yüzeyi ile pipet itin ve durdurmadan önce ~ 2 kez pipet geri çekin. Mikropipet 0.1 mm'lik bir derinlikte olduğu zaman neokorteks içine hücre hedefleme optimum için enjeksiyonlar yapılmaktadır. Ancak, bu kullanıcı tarafından optimize edilmelidir (aşağıdaki nota bakınız).
Not: Bu derinlik güvenilir, yukarıda tarif edilen cihazları ile derin neokortikal katmanları hedef ise, birkaç derinlikleri ampirik bir şekilde tespit test edilmelidir. Buna ek olarak, farklı postero-kaudal ve iç-dış pozisyonda derinliklerinde bir dizi her yerinde en iyi ne derinlik belirlemek için test edilmelidir. Neokorteks içine yavaş nüfuz c yeteneği azalır olarak da, ilk delinme, hızlı olmalıleanly dokuya nüfuz. Birinci en iyi olanı bulmak için bu prosedürü başlatırken farklı hızlarda deneyin. Boyalar pozisyon belirtmek için güvenilmez olmuştur Buna ek olarak, test koordinatlar için, etiketli hücreleri kullanarak gerçek yerini yoktur. - İğne pozisyonunda sonra, korteks içine hücre süspansiyonu bir dizi hacmi iterek, cam pipet içine pistonu ilerlemek için hidrolik cihazı döndürün. Site başına 50-70 NLS enjekte edilir. Gol neokorteksin boyunca hücrelerin geniş bir dağılım elde etmek ise farklı rostral-kaudal seviyelerde 3-6 farklı sitelerde bu işlemi tekrarlayın.
Not: 100 nl veya daha büyük birimler lezyonlara neden ve verimli bir şekilde enjeksiyon yerinde dışarı göç başarısız enjekte edilen hücrelerin büyük topaklar yol açabilir. Böylece, küçük enjeksiyon hacimleri (~ 70 nl veya daha az) zaman yeterse daha fazla siteler üzerinde, optimal. - Enjeksiyonlar tamamlandığında, ayak kırpma s tanımlamak için güvenilir bir yoludur (aşamasından yavru çıkarmak ve onu işaretleyinups sonra). Yavru kurtarıldı ve kendi başına hareket edebilir sonra, anne ve çöp ile geri koymak (bu aşamada onları kaldırma dakika içinde ortaya çıkar).
Not: Bu minimal invaziv bir işlem olduğundan yavru serbestçe hareket ve ısıtılır sonra hiçbir cerrahi sonrası prosedürler vardır. Ancak, yavrular sadece prosedür değil, aynı zamanda sağlamak için ertesi gün sonra onlar sağlığı bozulan emaresi var kontrol edilmelidir. - Bir sonraki yavru prosedürü başlamadan önce, steril çalışma alanı korumak için% 70 etanol ile bölgeyi sprey. Enjekte yavrular geliştirmek ve daha sonra uygun gelişim aşamasında (ler) de doku değerlendirmek için izin verin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MGE hücreleri göç ve bir konak neokorteks 16 nakledilen zaman entegre benzersiz yeteneği olduğundan, onlar vivo çalışmalar öncesi genetik manipülasyon için mükemmel bir model sistemi sağlar. Burada, tek bir E 13.5 embriyolardan MGE doku izole nasıl kullanılabileceğini gösterir (Şekil 1 ve 2), daha sonra in vitro veya in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce hızlı bir şekilde ya da lentivirüs ile transduse edilebilir. Lentivirüsler üzerinden Etiketleme MGE GABA'erjik nöronlar 15 GFP sürüş bir arttırıcı kullanmadan önce yapılmıştır. Transplantasyonu büyük ölçüde bu hücrelerin dağılma ve entegrasyon çalışmaları yardımcı olabilir Ancak, önce yetenek heterojen bir nüfus belirli alt gruplar genleri ifade etmek. Bu yazıda, belirli bir interneuron alt, (SST) + somatostatin ifade olanlara bir floresan protein ifadesini hedef için bir araç geliştirmek için çalıştı.
Biz fiilk bir lentiviral omurgasına bir ticari olarak temin edilebilir Kre-bağımlı GFP raportör (vektör bilgileri, Tablo 2) alt-klonlanmıştır. Vektör (kaset sadece CAG promoterinin içeriyordu) ilk AAV vektöründen loxP mevkileri ile eteklenmektedir GFP içeren kaseti alt klonlama ve Xbal ve PflMI sınırlandırma alanları kullanarak bir lentiviral vektör omurgası 15 içine bağlanması ile elde edilmiştir. Daha sonra, CAG promoterinin kalan Spel ve Xbal siteleri ile bir pCAGGs memeli ekspresyon vektöründen kesilmiş ve randımanlı-CAG-Flex-GFP oluşturmak için lentiviral vektör Xbal mevkisine lige edilmiştir. 5 'ucu Spel sitesi Xbal etme ve böylece 5 tahrip' 3 'Xbal sitesi muhafaza edilirken, sitesi. Elde edilen vektör (şema Şekil 4A, vektör dizisi Tablo 1) birinci Cre (in vitro deney şeması, Şekil 4B) varlığında ya da yokluğunda in vitro olarak test edilmiştir. MGE Ai14 Flox / + 13.5 embriyolar birincil nöronlar kültürlenmiş ve lentivirüs bir kombinasyonu ile transduse edildi. Herhangi bir GFP + veya tdTomato + hücreleri için birkaç CAG-Flex-GFP lentivirüs (Şekil 4C, 4F ve 4i) yalnızca transdüksiyonu ile gözlendi. TdTomato floresan, bir CMV Cre lentivirüs, Cre ifade gösterge (Şekil 4D, 4G ve 4J) ile transduse edilmiş, MGE hücrelerde mevcuttu. Son olarak, MGE hücrelerinin ko-transdüksiyon CAG-Flex-GFP lentivirüs beklenen (Şekil 4E, 4H ve 4K) olarak görev belirten de GFP ifade birçok tdTomato + hücrelerinde elde edilmiştir. Bazı nadir GFP + hücreler gözlemlenmiştir ve bu da değildi tdTomato + kalıt raportör aşağıdaki hepsi GFP + hücrelerinin <% 2'sini bir kuvvetli bir promoter ile birleştiren potansiyel nedeniyle.
İçerik "konak neocortex, olgun dağıtmak ve ev sahibi neokorteks 16 E13.5 SST-IRES-Cre + entegre bir vahşi tip nakledilen> MGE hücreleri;. Ai14 flox / + MGE hücreleri P1 WT neocortices içine transplante edildi (şema, Şekil 5A) ve dağılımı 7 ve 35 gün sonrası nakli (DPT). Her iki yaşlarda, tdTomato + hücreleri neokorteks (Şekil 5B ve 5C) boyunca görülebilir incelenmiştir. Şekil 5B ve 5C görüntüler MGE kullanan temsili nakli olan . Tek bir embriyo hücreleri SST-IRES-Cre + 'dan, burada MGE hücreleri açıklanan protokol ile etiketlenmiş olabilir ne kadar etkin MGE hücreler test etmek için, Ai14 Flox / + embriyolar CAG-Flex-GFP lentivirüs ile transdüksiyonlu ve aktarılmıştır conce aynı şekilde. Bu deneyler için, ~ 15 ulntrated lentivirüs (~ 1x10 7 enfeksiyöz birim / ml), her bir nakil için bir embriyodan Birleştirilen MGES ile kullanılmıştır. Hücreler daha sonra, P1 WT ana korteks içine aktarılmış ve 7 DPT (Şekil 5D-5F) ile analiz edilmiştir. Nakledilen hücreler (tdTomato +), yaklaşık olarak% 20 CAG-Flex-GFP lentivirüs (Şekil 5G) transdüksiyona gösteren, GFP + idi. Bu veriler, lentivirüs miktarı ve titre, yukarıda tarif edilen ile ~ nakledilen MGE hücrelerin% 20 sokulabileceği göstermektedir. virüs miktarı ya da azalmış ya da artmış ya da viral inkübasyon süresi gibi potansiyel olarak diğer değişkenler, seyrek veya yoğun hücre etiketleme elde etmek için, değiştirilebilir olabilir.CAG-Flex-GFP lentivirüs ile birlikte bir Kre-bağımlı haberci fare hattından MGE doku kullanılarak, bağışıklık fluorışımasıyla için problanabilir ilave belirteç sayısını sınırlandırabilir. Bu nedenle, SST-IRES-Cre + < / Sup> E13.5 MGE dokusu toplandı ve Cre ifade olanlar nakledilen MGE hücreleri görselleştirmek için CAG-Flex-GFP lentivirüs ile iletildi (GFP + olacaktır). Bu hücreler, P1 WT korteks içine aktarılmış ve 35 (DPT deney tasarımı, Şekil 6A, bakınız), olgun interneuron belirteçleri olarak ifade edilmiştir, bir zaman noktasında incelendi. 35 DPT'de, ~ GFP + hücrelerin% 85 SST-koeksprime, ancak ~% 4 PV (Şekil 6B-6H) dile getirdi. Bu sayılar haritalar da kader SST-IRES-Cre fare hattının soy analizleri, tutarlı oldukları ~ PV + hücreler 9 (Vogt ve Rubenstein, yayınlanmamış sonuçlar)% 5-10. Bu veriler, MGE viral etiketleme etkilidir ve in vivo analiz edilmeden önce, bir raportör veya potansiyel ilgi konusu bir genin bir geçerli bir yaklaşım olabilir göstermektedir.
740fig1.jpg "/>
Primer kültürlerinde veya transplantasyonların biri için MGE doku E13.5 MGE doku. Örnek diseksiyon diseksiyon için Şekil 1. Temsilcisi prosedür. E 13.5 beyin diseksiyonlarının (AE) Görüntüler ve (A'-E ') yapıları vurgulamak için şemaları ve prosedür. (A, A ') Temsilcisi E 13.5 beyin önemli adımlar ventral açıdan inceledi. Kırmızı çizgi, iki adet. (B, B ') bir beyin hemisection Açısından içine beyin Hemisect olacaktır yapılan ilk kesim, ifade eder. medial aşağı yan yönü ile, görünür. Dorsal korteksin (mavi renk) doku ganglion eminences örter. Ayrıca, silinecektir ventral doku turuncu gösterilmiştir. (C, C ') Resmi ve doku örten sonra maruz ganglion eminences ve illüstrasyon uzakta soyulmuş olmuştur. (D, D') maruz ganglion emi Aynı görünüm (C, C '), ama kırmızı olarak gösterilen detaylı kesim siteleri gibi nences kesikli çizgiler. MGE (D, D ')' de belirtilen hatlara göre kesip sonra (doku yan E, E) açık 've yanal yönü kapalı kesilmiş ve atılır. MGE doku diseksiyonu ve izole Temsilcisi adımlar. Kısaltmalar: (JMO) kaudal ganglionik eminens, (LGE) yanal ganglionik eminens, (MGE), medial ganglionice eminenste. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Film E13.5 MGE diseksiyonu gösteren. Film sonraki açılımı ve örten doku çıkarılması ardından E13.5 beyin kaldırılmasını göstermektedir. MGE etiketli ve çevredeki dokuyu çıkarmak için yapılan kesintileri kademeli sırayla göstermek vardır edilir.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Örnek prosedür alanı ve yeni doğan nakli için bir iğne örneği. (A, A '), neonatal farelere nakli gerçekleştirmek için bir örnek kuruluş gösteren resimler. Mikroskop, (1), yeni doğan fare (5) ve tutan steryotaksik bir cihazla bölgesini gösteren bir stereotaksik cihazı (2). (A ')' in genişletilmiş bir görüntüsü (A) sahip bir kalıp ihtiva eden bir sahne üzerinde konumlandırılmış Yerleştirilen bir piston ile cam enjeksiyon iğnesi (6) (7). piston (4) iyi bir hidrolik sürücü tarafından kontrol edilir ve iğneden akış içeri ve dışarı doğru aracılık cam iğne içinde mineral yağ hareket eder. Bir cam enjeksiyon iğnesinin (B) örnek olarak eğimli bir ucu ile. Cetvel (B), her büyük sınır = 100 mikron için. Gösterilen kalemlerin (C) Envanter listesi (A, A '). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. in vitro testler Cre mevcudiyetinde bir CAG-Flex-GFP lentivirüs gelen GFP ekspresyonunu göstermektedir. Lentiviral CAG-Flex-GFP vektör Cre varlığında nasıl (A) şema. (B) Şema Lentiviral CAG-Flex-GFP Cre ifade ile bu hücrelerde GFP ifade ediyorum, eğer birincil MGE hücre kültürü deney değerlendirmek için. Kısaca, bir Kre-bağımlı muhabir MGE hücreleri Ai14 (Cr mevcudiyetinde tdTomato ifadee) in vitro olarak yetiştirilmiş ve Cre ve / veya Flex-GFP lentivirüslerdir. (CK), bir CMV-Kre, CAG-Flex-GFP ya da her ikisi ile transduse edilmiş 13.5 MGE primer kültürlerin immünofloresan görüntüleri ile transdüse edilmiştir. Kültürler yerli tdTomato ifade, GFP ve DAPI için görüntülendi. (K) Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
+ Nakledilen ve transdüse,-Cre SST-IRES Şekil 5. Temsilcisi görüntüleri; Ai14 Flox / + MGE hücreleri. (A) deneysel tasarım şema tek başına veya bir vahşi tip içine lentiviral transdüksiyon (WT) ev sahibi, (DPT) gün sonra MGE hücreleri ya nakli nakil sonrası. Kısaca, E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ve Ai14 Flox / + MGE hücreleri ya nakledilen veya WT neocortices içine transplantasyon öncesi CAG-Flex-GFP lentivirüs ile transdük ve 7 DPT'de değerlendirildi (B, C) Immunofluorescent görüntüleri Örnek MGE nakledilen hücreler (tdTomato +) gösteren 7 ya da 35 DPT ile neocortices. (DF) 7 DPT değerlendirildi CAG-Flex-GFP lentivirüs ile transduse MGE hücrelerinin immünofloresan ve görüntüler. (G) tdTomato + hücrelerinin oranı miktarının belirlenmesi bu 7 DPT'de GFP ifade eder. (C) ve (F) = 100 mikron ölçekli barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2740fig6.jpg "/>
E 13.5 ve CAG-Flex-GFP lentivirüsünün Şekil 6. Temsilcisi görüntüleri SST-IRES-Cre MGE-türetilmiş interneuron alt grubu belirteçleri-express co + MGE nakli, transdüse. (A) Şema SST-IRES-Cre + MGE hücre hasat ve 35 DPT'de tarhiyat öncesi P1 WT ana neokorteks bir CAG-Flex-GFP lentivirüs ve nakli ile iletimi. Esnek vektörü (B, D) için GFP ekspresyonu gösteren nakledilen ana neokorteks gelen temsili görüntüleri, (D, G). Somatostatin (SST) (C) veya parvalbumin (PV), (F) ya da eş-lekeli Birleştirilmiş ve görüntüler ortak lekeli DAPI ile. birlikte ifade SST veya PV GFP hücrelerinin oranı (H) belirlenmesi. Veriler ortalama ± SEM (n), 3. Ölçeği (G) 'de bar = 100 um = temsil etmektedir./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
PLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA vektörü Tablo 1. FASTA dosyası.
| MGE hücre hazırlama ve dönüşüm kesme işlemleri için Reaktifler ve cihazlar | Katalog # | Şirket | ||||||
| 1) | Yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı, | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Isı ile inaktive fetal sığır serumu | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS), herhangi bir kalsiyum ya da magnezyum | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri (veya başka birkapaklı toplama tüpleri) | 3810X | Eppendorf Uluslararası | |||||
| 5) | Polybrene | sc-134220 | SantaCruz Biyoteknoloji | |||||
| 6) | Stab bıçak düz 22.5 ° (isteğe bağlı) | REF 72-2201 | Cerrahi uzmanlık şirketi | |||||
| 7) | Doku diseksiyonu için Petri kabı (10 cm), | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | Dumont # 5 gibi 2 ince uçlu forseps, | 11254-20 | Güzel Bilimsel Araçları | |||||
| 9) | % 5 CO 2 girişi ile 37 ° C doku kültürü inkübatör | C150 | Cilt | |||||
| 10) | 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri spin olabilir Masaüstü santrifüj | |||||||
| 11) | Hücre Öğütme için kullanılabilecek herhangi bir P1000 pipet | |||||||
| 12) | Biyogüvenlik düzeyi 2 başlık | |||||||
| In vitro olarak MGE primer kültürler için Reaktifler ve cihazlar | Katalog # | Şirket | ||||||
| 1) | Lab-TekII de kapak 8 ile chamberslides | 154.941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | Poli-L-lisin,% 0.1 ağırlık / hacim | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Fare laminin, 0.5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Neuro temelli vasat | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | B27 serum serbest takviyesi | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, 100x stok | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penisilin-Streptomisin, 100x stok | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glikoz, (su içinde% 25'lik bir çözelti hazırlamak) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| MGE hücre transplantasyonu için ayıraçlar ve ekipmanlar | Katalog # | Şirket | ||||||
| 1) | 1 ml'lik bir enjektör | REF 309.602 | BD, Becton Dickinson ve şirket | |||||
| 2) | 30 1/2 G iğne | 305.106 | BD, Becton Dickinson ve şirket | |||||
| 3) | Öneksizyondur delik 5 ul sunmak için (pistonu ile birlikte gelir) | 5-000-1005 | Drummond bilimsel şirketi | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Boomstand Stereo mikroskop | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Sadece farelerde steryotaksik enstrüman için Dijital | 51725D | Stoelting şirketi | |||||
| 7) ** | Tek eksenli hidrolik yağ ince mikromanipülatör | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Elmas kaplı döner beveler | na | Evde yapılan | |||||
| 9) | İğne pipette çektirmenin | 730 | Kopf aletleri | |||||
| 10) | Mineral yağ | na | Herhangi bir ilaç deposu veya eczane | |||||
| 11) | Önlem hacminin 1 ul reliaby herhangi bir pipet ve ipuçları | |||||||
| ** Bu kullandığımız belirli modeller, ama birçok diğer kurulumları çalışması gerekir | ||||||||
| Optiona(lentiviruses yapmak için) l Reaktifler | Katalog # | Şirket | ||||||
| 1) | 25 mm, 0.45 um'lik bir filtre | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Ultra net santrifüj tüpleri (25 x 89 mm) | 344.058 | Beckman Coulter® | |||||
| 3) | Lipofektamin 2000 | (1.5 mi boyut) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Piyasada mevcut diğer malzemeleri | Katalog # | Şirket | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE plazmid kodlayan gag / pol | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev, plazmid kodlayan Rev | 12.253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G plazmid kodlayan VSVG | 12.259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28.304 | Addgene | |||||
Reaktif ve araçları Tablo 2. Envanter listesi. Transplantasyon ve DNA vektörleri için medya, diseksiyon araçları, temsili ekipman dahil piyasada mevcut reaktif bir envanter. (Na) mevcuttur veya Uygulanamaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre bazlı tedaviler için embriyonik ganglion eminences (GEs) den GABAerjik kortikal interneuron öncülerinin kullanımı birçok koşulları 12 -1 4 için umut gösteriyor. Hassas moleküler teknikler etiket ve belirli interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için ihtiyaç vardır. Burada transplantasyonundan önce lentivirüsler embriyonik MGE hücrelerin etiketlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar ve bu yöntem, in vivo analiz için özel kortikal interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Burada tarif edilen protokol güvenilir süre, optimal olarak yeniden üretilebilirlik için birkaç kritik aşamalara dikkate alınmalıdır, kullanılabilir. Viral transdüksiyon verimli olması için ilk, fizyolojik sıcaklık ve pH gereklidir. Bu parametreler yerine getirilmesi MGE'ye hücreler, 30 dakika içinde kalıt edilebilir. İkincisi, devam etmeden önce yoğun bir MGE pelet olduğundan emin olunBir nakli yapmak. Sadece sınırlı bir hacim zarar neden olmadan her yerinde küçük neonatal bir fare beyin içine enjekte edilebilir ve hücreler, uzak enjeksiyon bölgesinden geçirmek, böylece nakli sırasında yoğunlukları olabilir daha az bir endişe nedeni, bu önemlidir beklenen. Son olarak, derinlikleri optimum ne enjeksiyon belirlemek için bir floresan muhabiri ifade MGE hücreleri ile bazı test koşullarını çalıştırın. Bu protokol MGE hücreleri kullanılır iken, CGE hücreler de aynı şekilde kullanılabilir. Tek dezavantajı, tüm CGE veya CGE-türetilmiş internöronlar belirli alt gruplara ifade özgürlüğünü kısıtlamaya birçok Kre-sürücü hatları yoktur olmasıdır. Bununla birlikte, vazoaktif intestinal peptid (VIP) 9 CGE türetilen bu hücre alt-grubunu ayırmak için kullanılabilir güvenilir Cre hattıdır. Yeni hatlar kullanılabilir hale gibi, daha genetik hassasiyet ile bu protokolü kullanılması mümkün olacaktır.
Daha önce, ve diğerleri göstermiştirBu teknikler, in vivo analiz için genlerin katılmasıyla etkili iken. elektroporasyon ile ya da lentivirüs 15, 17, transplantasyon öncesi MGE hücreler arasında gen aktarımı faydası, MGE doku heterojen olup, birden fazla interneuron alt yol olarak nöronal-olmayan hücreleri verir 4. Ayrıca, sadece belirli bir interneuron alt ilgi konusu bir geni ifade etmek zor olmuştur. Büyük adımlar dahil olmak üzere birçok kortikal interneuron alt, salgılanma modellerini özetlemek transgenik hatları oluşturmak için yapılan, ancak bir d VIP-Cre 9 SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre, bunlarla sınırlı olmamak edilmiştir -11 ve yeni hatların gelişi gelecekte ek olası popülasyonları aydınlatmak yardımcı olacaktır. Ayrıca, Kre-bağımlı muhabir ve burada kullanılan Kre-bağımlı haberci vektörleri de dahil olmak üzere ekspresyon vektörlerinin üretimi ile, ilgi konusu gen, daha kesin bir anlatım elde edilebilir.
Bu tekniğe bir sınırlama, bir güvenilir bir lentiviral vektör içine paketi olabilir fragmanın büyüklüğü olabilir. Ayrıca, bu yaklaşım henüz AAVS ile test edilmemiştir. Bu teknik, bir birey tarafından optimum bir kez, ancak bu yaklaşım çok varyasyon kullanılabilir. İlk olarak, yaklaşım, araştırmacılar, belirli Cre sürücü hatları MGE donör hücreleri ile birlikte bir Kre-bağımlı haberci lentivirüs kullanarak raportörleri eksprese sağlayacak anlatılacaktır. Bu teknik, tek tek MGE hücrelerin morfolojisi değerlendirmek için kullanılabilir ya da ikinci bir gen vektörü içine klonlanır, potansiyel olarak farklı alt ilgi konusu bir geni ifade etmek. İkinci olarak, aynı zamanda, raportör MGE verici hücreleri veya potentia Kre-bağımlı bir Cre ifade virüs için uygun olabilirlly oluşan heterojen bir topluluk hücrelerin farklı popülasyonlarda ekspresyonunu tahrik etmek için korunan DNA elemanları, promotör ve arttırıcılar, gelişen kullanmaktadır.
Insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücreleri ya da embriyonik kök hücreleri etiketlenmesi olacak aşmak için bir gelecek engel potansiyel arındırmak ve / veya belirli bir hücre grubu çalışma. İlginç bir şekilde, korunan DNA arttırıcı maddeler aynı zamanda, korteks içine enjeksiyondan sonra, primer kültürlerinde GABAerjik nöronlar hedef viral ekspresyon sistemleri kullanılabilir, ve MGE hücrelerinin transplantasyonundan önce 15, 18, 19. Güçlendiriciler Bu engel bir cevap olabilir ve olacaktır Yeni teknikler tedavide bu hücrelerin kullanımını incelemek için gerekli olan moleküler araçları gibi ilgi. Nitekim, keşfetme arttırıcılar için yayılmakta potansiyel glutamaterjik nöronlar 21 olmak üzere, GABAerjik internöronlardan 20 veya diğer nöronal alt tipi ya etiket olabilir, sürüyor. Bu buluşta, viral etiketleme yöntemi kullanarak,transplantasyondan önce ve in vivo analizlerde ilgi farklı hücreleri etiketlemek için, hücre tipi özel güçlendiriciler ile farklılaştırılmış insandan türetilmiş kök hücreleri nakletmek için mümkün olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma dan JLRR hibe ile desteklenmiştir: Otizm Konuşuyor, Nina İrlanda, Weston Havens Vakfı, NIMH R01 MH081880 ve NIMH R37 MH049428. Prw Tayvan Ulusal Bilim Konseyi bir burs ile desteklenmiştir. SFS F32 (MH103003) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
