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Developmental Biology

के लिए वायरल की मध्यस्थता लेबल और औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता का ट्रांसप्लांटेशन MGE () प्रकोष्ठों Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52740
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Department of Psychiatry, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco

Summary

GABAergic कॉर्टिकल interneuron पूर्वज प्रत्यारोपण के बाद एक मेजबान के कोर्टेक्स में एकीकृत synaptically को विकसित करने और फैलाने। इन कोशिकाओं को आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित GABAergic व्यापारियों के vivo अध्ययन के लिए प्रत्यारोपण से पहले transduced किया जा सकता है। यहाँ, हम मौजूदा Cre लाइनों और रचनात्मक निर्भर संवाददाताओं का उपयोग कर विशिष्ट interneuron उपसमूहों लक्षित करने के लिए वायरल लेबलिंग तकनीक दिखा।

Abstract

भ्रूण औसत दर्जे का है और दुम ganglionic eminences MGE (और CGE) से ली गई GABAergic कॉर्टिकल interneurons, कार्यात्मक और आकृति विज्ञान के विविध रहे हैं। पैठ अलग कॉर्टिकल interneuron उपसमूहों की भूमिका को समझने में किया गया है, हालांकि, GABAergic कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के विकास और परिपक्वता के लिए योगदान कर सकते हैं कि बाहर काम किया जाना अभी भी कई यांत्रिकी हैं। इसके अलावा, बदल GABAergic संकेतन आत्मकेंद्रित, एक प्रकार का पागलपन और मिरगी के phenotypes के लिए योगदान कर सकते हैं। विशिष्ट रचनात्मक-चालक लाइनों अद्वितीय interneuron उपसमूहों के कार्यों बाहर पार्सल करने के लिए शुरू कर दिया है। माउस मॉडल के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, यह कुशलतापूर्वक विवो में आणविक दृष्टिकोण के साथ GABAergic कॉर्टिकल interneuron progenitors अध्ययन करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है। इन कोशिकाओं के सेल स्वायत्त प्रोग्रामिंग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक महत्वपूर्ण तकनीक मेजबान cortices में MGE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण है। ये प्रतिरोपित कोशिकाओं को अलग, बड़े पैमाने पर विस्थापित, एकएन डी कार्यात्मक एकीकृत। इसके अलावा, MGE कोशिकाओं कुशलतापूर्वक आणविक दृष्टिकोण की एक भीड़ के लिए अनुमति देता है, प्रत्यारोपण के लिए तुरंत पहले lentivirus के साथ transduced किया जा सकता है। यहाँ उपलब्ध Cre-चालक लाइनों और रचनात्मक निर्भर अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग, विस्तार कुशलता में विवो विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपण से पहले MGE कोशिकाओं transduce करने के लिए एक प्रोटोकॉल हम। यह विवो में अधिक से अधिक सेल प्रकार विशिष्ट संकल्प अनुमति प्रत्यारोपण के बाद फैलाने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता के साथ सटीक आनुवंशिक हेरफेर को जोड़ती है, क्योंकि यह दृष्टिकोण लाभदायक है।

Introduction

बाकी, glutamatergic प्रिंसिपल न्यूरॉन्स उत्तेजक के अनुरूप जबकि GABAergic कॉर्टिकल interneurons, स्तनधारी neocortex में न्यूरॉन्स की ~ 20-30% शामिल। Interneurons electrophysiological गुण, अक्षतंतु और dendrite आकृति विज्ञान और एक लक्षित कर अन्तर्ग्रथनी में अत्यधिक विविध रहे हैं, और उत्तेजक / निरोधात्मक स्वर में असंतुलन आत्मकेंद्रित, एक प्रकार का पागलपन और मिरगी 2 सहित न्यूरोलॉजिकल / neuropsychiatric विकारों के कुछ फेनोटाइप आबाद करने के लिए धारणा कर रहे हैं। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य कुशलता से आनुवंशिक रूप से इन विवो विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपण से पहले GABAergic कॉर्टिकल interneuron पूर्वज संशोधित करने के लिए एक साधन प्रदान करना है।

Cortical GABAergic interneurons औसत दर्जे का है और दुम ganglionic eminences MGE (और क्रमशः CGE) 3,4 और साथ ही preoptic क्षेत्र 5 में पैदा होते हैं। Cortical interneuron पूर्वज लंबी दूरी की स्पर्शरेखा प्रवास पीछा से गुजरनारेडियल प्रवास करके अपने अंतिम लक्ष्य तक पहुँचने के लिए। उनके गंतव्यों में आगमन पर, इन कॉर्टिकल interneurons सही ढंग से मौजूदा neuronal नेटवर्क में एकीकृत करना चाहिए, और प्रत्येक अद्वितीय interneuron उपसमूह विशिष्ट तरीके में cortical circuitry के लिए योगदान देगा। चार मुख्य उपसमूहों आणविक मार्कर द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है: MGE व्युत्पन्न सोमेटोस्टैटिन (एसएसटी) + और ​​parvalbumin (पीवी) + उपसमूहों, और CGE व्युत्पन्न vasoactive आंतों पेप्टाइड (वीआईपी) + और ​​Reelin +; एसएसटी - उपसमूहों 6। विभिन्न कॉर्टिकल interneuron उपसमूहों MGE और CGE 7, 8 में भ्रूण के विकास के दौरान अलग से अधिक बार पैदा होते हैं। ये और अन्य कॉर्टिकल GABAergic interneuron मार्करों इन उपसमूहों 9-11 से कई के लिए विशिष्ट रचनात्मक-चालक लाइनों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

MGE progenitors के प्रत्यारोपण के असंतुलन की वजह से हो सकता है कि विकारों के इलाज के लिए एक संभावित सेल आधारित चिकित्सा के रूप में उभरा है12-24 / उत्तेजना निषेध में। ये चिकित्सीय लाभ कई पेरी-दैहिक निरोधात्मक पीवी + कोशिकाओं MGE से निकाली गई है (अंतर और एक मेजबान के मस्तिष्क में एकीकृत, फैलाने के लिए), या संभवतः क्योंकि MGE progenitors के अद्वितीय क्षमता के कारण भाग में हो सकता है। MGE कोशिकाओं को भी आनुवंशिक रूप से इन विट्रो में संशोधित कर रहे हैं कि कोशिकाओं vivo में अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देता है, जल्दी से और कुशलता प्रत्यारोपण 15 से पहले lentiviruses साथ transduced किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को विकसित करने के लिए तर्क GABAergic कॉर्टिकल interneuron विकास और परिपक्वता का अध्ययन करने में बाधाओं पर काबू पाने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, MGE प्रत्यारोपण उत्परिवर्ती माउस अन्यथा एक प्रारंभिक समय बिंदु पर मर गया होगा जब शोधकर्ताओं विवो में उत्परिवर्ती कोशिकाओं के विकास का अध्ययन करने की अनुमति दी। इसके अलावा, प्रत्यारोपण से पहले ब्याज की जीन शुरू करने से, एक उत्परिवर्ती phenotype पर विशिष्ट जीन का प्रभाव एक eff में मूल्यांकन किया जा सकता हैicient तरीके से।

यहाँ, हम प्रत्यारोपण करने से पहले lentiviruses साथ MGE कोशिकाओं transduce करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अलावा, हम इस तकनीक Cre निर्भर अभिव्यक्ति lentiviruses और उपलब्ध Cre-चालक माउस लाइनों के संयोजन का उपयोग, कोर्टिकल interneuron व्यापारियों का एक विषम समूह से विशिष्ट interneuron उपसमूहों में ब्याज की एक जीन व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे दिखा। आनुवंशिक रूप से एक अनोखा तरीका में vivo अध्ययन के लिए GABAergic कॉर्टिकल interneuron व्यापारियों को संशोधित करने के लिए इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल तकनीक और शोधकर्ताओं के लिए एक मंच का परिचय। अन्य वर्तमान दृष्टिकोण पर इस तकनीक का एक फायदा प्रत्यारोपित MGE कोशिकाओं दूर इंजेक्शन साइट से फैलाने जाएगा। इसके अलावा, फोकल वायरल इंजेक्शन के विपरीत, MGE कोशिकाओं को फैलाने के बाद उनकी आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए आसान है। यह दृष्टिकोण विशिष्ट एक सेल प्रकार शुरू करने, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती कोशिकाओं में ब्याज की जीन शुरू करने के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसंवाददाता विवो में रोग एलील के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संभावित आकृति विज्ञान का आकलन, या करने के लिए।

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Protocol

आचार बयान: निम्न कार्यविधियों हमारी संस्था और पशु प्रोटोकॉल के द्वारा अनुमोदित किया गया है। प्रयोगों की शुरुआत से पहले अस्तित्व सर्जरी से जुड़े सभी प्रक्रियाओं के लिए अनुमोदन प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें और सभी प्रोटोकॉल तारीख तक कर रहे हैं सत्यापित करें।

1. Lentivirus की तैयारी (वैकल्पिक कदम)

  1. 10 मिलीलीटर DMEM / 10% FBS की उपस्थिति में किए जाने के लिए प्रत्येक lentivirus के लिए HEK293T कोशिकाओं के तीन 10 सेमी प्लेटें विभाजित है, और ~ 60-70% संगम को बढ़ता है। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में कोशिकाओं को विकसित।
  2. 1.2 माइक्रोग्राम प्रति pMD2.G (VSV जी encodes) 1.2 (1 टेबल में प्रदान की डीएनए वेक्टर अनुक्रम) 6.4 माइक्रोग्राम प्रति कैग फ्लेक्स-GFP lentiviral वेक्टर, निम्नलिखित: किसी भी अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करते हुए प्रत्येक थाली में डीएनए plasmids (10 माइक्रोग्राम प्रति कुल) transfect माइक्रोग्राम प्रति pRSV-फिरना, और 1.2 माइक्रोग्राम प्रति pMDLg / pRRE। तीन lentiviral पैकेजिंग वैक्टर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (तालिका
    नोट: इस विशेष दृष्टिकोण 3 पीढ़ी lentivir का इस्तेमालअल वैक्टर लेकिन 2 पीढ़ी वैक्टर और एसोसिएटेड प्लास्मिड भी काम करेंगे।
  3. संपर्क किया या lentivirus के होते हैं कि किसी भी समाधान या उपकरणों को निष्क्रिय करने के लिए एक BSL2 प्रमाणित हुड के भीतर एक 10% ब्लीच समाधान युक्त बर्बादी कंटेनर तैयार करें। इसके बाद, पूरी तरह से, ब्लीच समाधान में अभिकर्मक के बाद मीडिया 4-6 घंटा हटाने के नए मीडिया का एक ही मात्रा के साथ की जगह है, और कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. 15 मिनट के लिए किसी भी सेल मलबे गोली के लिए चार दिनों के बाद, 1000 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में मीडिया इकट्ठा। इसके बाद, एक .45 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर। कोई कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर, PVDF की तरह, अच्छी तरह से काम करता है। सावधानी: ब्लीच समाधान में जगह दोनों ठोस और तरल वायरल बेकार।
  5. लोड 30 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूबों में और एक ultracentrifuge में सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर किया। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए एक लाख XG पर अपकेंद्रित्र। एक BSL2 हुड में अपकेंद्रित्र ट्यूब खोलें और 10% ब्लीच में सतह पर तैरनेवाला हटा दें। पीई के लिए पीबीएस के ~ 100 μl जोड़ें1x10 ^ 7-8 संक्रामक इकाइयों / मिलीलीटर की titers जो पैदावार llet,। -80 डिग्री सेल्सियस पर अगले दिन और दुकान विभाज्य। Lentivirus aliquots के कम से कम छह महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहे हैं।
  6. महत्वपूर्ण विचार: कई संस्थानों अब वायरल कोर है। इष्टतम परिणामों के लिए 1x10 7 संक्रामक इकाइयों / मिलीलीटर की एक न्यूनतम अनुमापांक, साथ केंद्रित वायरस मोल।

MGE विच्छेदन के लिए 2. दाता चूहों

  1. सबसे पहले, ब्याज की एक रचनात्मक व्यक्त लाइन और एक जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) माउस या रचनात्मक की मध्यस्थता पुनर्संयोजन के बाद एक संवाददाता व्यक्त करेंगे कि एक माउस के बीच एक समय पर संभोग की स्थापना की।
    नोट: कई रचनात्मक-चालक लाइनों ट्रांसजेनिक्स कर रहे हैं और बनाए रखा और hemizygous राज्य में पैदा कर रहे हैं। इस प्रकार, भ्रूण का केवल आधा Cre transgene शामिल होंगे। डीएनए जल्दी Cre एलील का पता लगाने के लिए एक छोटी पीसीआर के लिए भ्रूण से तैयार किया जा सकता है। वांछित जीनोटाइप के ही MGE ऊतक प्रयोग किया जाता है इतना है कि रचनात्मक + भ्रूण तो काटा जा सकता है। Alternatively, एक रचनात्मक निर्भर रिपोर्टर MGE विच्छेदन और प्रत्यारोपण के लिए भ्रूण का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. E13.5 के अनुरूप होगा, जो दिन की गणना करें। जानवरों से पहले शाम को रखा गया है, तो प्लग के दिन 0.5 है। आदेश समय गर्भवती चूहों या प्रसव के बाद (पी) होने के समय के क्रम में P1 के पिल्ले के साथ एक गुम्मट महिला दाता ऊतक E13.5 हो जाएगा दिन पर एक चूहों। वैकल्पिक रूप से, दाता जानवरों बाँधना करने से पहले एक सप्ताह के घर में इन matings की स्थापना की।
    नोट: E13.5 और P1 भ्रूण दोनों पैदा करने के पूर्व रणनीति / एक ही दिन के लिए पिल्ले मज़बूती से ऐसा करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है।

मीडिया, उपकरण और उपकरणों की 3. तैयार करना।

  1. MGE सेल तैयारी (तालिका 2) के लिए अभिकर्मकों और उपकरण तैयार करें।
    1. एक साफ सतह तैयार है और सतह पर साफ संदंश, कैंची और एक microsurgical चाकू या ठीक संदंश या तो (सटीक ऊतक विच्छेदन के लिए) रखें।
    2. हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) तैयार करें, चविच्छेदन, और पारगमन के लिए 10% भ्रूण गोजातीय surem (एफ बी एस) के साथ Dulbeco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), या।
    3. के बारे में एक घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में Preincubate 20-30 मिलीलीटर DMEM / 10% FBS के। ढक्कन मीडिया की गैस मुद्रा और पीएच संतुलन के लिए अनुमति देने के लिए ढीला किया जाना चाहिए।
      नोट: मीडिया preincubation सिर्फ विच्छेदन शुरू करने से पहले तैयार किया जा सकता है।

4. MGE सेल तैयार

  1. एक अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार गर्भवती माउस बलिदान और बर्फ ठंड HBSS युक्त एक 10 सेमी पेट्री डिश में भ्रूण को हटा दें।
  2. (एक समय में एक ऐसा ठंडा HBSS में भ्रूण के आराम छोड़कर) एक विदारक गुंजाइश का उपयोग कर प्रत्येक भ्रूण से मस्तिष्क निकालें और फिर MGE ऊतक बाहर कटौती करने के लिए आगे बढ़ें।
    नीचे विस्तृत, और चित्रा 1 में, MGE निकालने के लिए कैसे दिखा महत्वपूर्ण कदम हैं: ध्यान दें। इसके अलावा, चित्रा 2 पूरे विच्छेदन दिखा एक फिल्म हैप्रक्रिया।
    1. (आंकड़े 1 ए, ए ') का सामना करना पड़ उदर पक्ष के साथ मस्तिष्क स्थिति। नोट: यह पृष्ठीय पहलू सामना करना पड़ रहा है करने के लिए भी ठीक है। दो टुकड़े उत्पन्न करने के लिए saggital विमान के साथ आधे में मस्तिष्क कट। एक उदाहरण hemisected मस्तिष्क (आंकड़े 1 बी, बी '), कि पृष्ठीय (overlying प्रांतस्था) और मस्तिष्क कवर के उदर पहलुओं नोटिस और ganglionic श्रेष्ठता (जीई) ऊतक के चारों ओर दिखाया गया है।
    2. एक गैर प्रमुख हाथ से आयोजित संदंश के साथ गोलार्द्ध immobilizing जबकि अगले, एक प्रमुख हाथ के साथ, बहुत ठीक संदंश या एक stabknife (तालिका 2) या तो पकड़। (गोलार्द्ध के औसत दर्जे का पहलू का सामना करना पड़ जाना चाहिए)। अंतर्निहित जीई ऊतक (चित्रा 1C और चित्रा 1C 'में diagrammed) प्रकट करने के लिए पृष्ठीय और उदर ऊतक संदंश के साथ और एक चाकू चाकू प्रकट करना।
      नोट: विच्छेदन पेट्री डिश से कुछ मीडिया को हटाने के लिए यह आसान पीई जबकि ऊतक को स्थिर करने के लिए कर सकते हैंMGE विच्छेदन rforming।
    3. CGE, LGE और वंशीय ऊतकों को अलग करने के stabknife या ठीक संदंश के साथ सीधे कटौती बनाओ (लाल से चिह्नित देखें उदाहरण कटौती लाइनें धराशायी, '-1 और डी आंकड़े)। ये कटौती किसी भी क्रम में किया जा सकता है।
      नोट: आसपास के ऊतकों से बाहर कट जाता है कि एक 'बॉक्स' के रूप में MGE कल्पना करो। ऐसा करने से reproducibly इस प्रकार ऊतक dissections में परिवर्तनशीलता को कम करने, प्रत्येक विच्छेदन के लिए इसी तरह की कटौती करने में मदद करता है।
    4. अंत में, अपने पक्ष पर MGE बारी और नीचे (मस्तिष्क के पार्श्व पहलू क्या था) बंद ट्रिम। इस MGE के बाकी हिस्सों से MGE की विरासत जोन (आंकड़े 1E और 1E में त्यागें ') को हटा। MGE के शेष पहलू मुख्य रूप से निलय क्षेत्र और लगभग सभी MGE पूर्वज सेल शामिल हैं जो MGE के subventricular क्षेत्र अंश होता है। इस ऊतक के साथ आगे बढ़ें।
  3. महत्वपूर्ण विचार: एक पेट्री डिश सीए की तह तक सिलिकॉन जेल के अलावायह संदंश की नाजुक सुझावों की रक्षा करता है और संदंश के साथ ऊतक लगाए लिए एक नरम सतह प्रदान करता है के रूप में N एक उत्कृष्ट विच्छेदन सतह के रूप में सेवा करते हैं।

MGE विच्छेदन के लिए 4.3 अतिरिक्त रणनीतियों।

  1. जल्दी से मस्तिष्क को हटाने के लिए कैंची की तरह संदंश का उपयोग भ्रूण की त्वचा में कटौती। भ्रूण को अपने पक्ष पर देता है के रूप में, ऊतक लंगर के लिए इस्तेमाल किया संदंश के साथ सिर के आधार पर ऊतक पकड़। सबसे पहले, मस्तिष्क को मस्तिष्क और पीछे उदर के लिए पूर्वकाल उदर में कटौती, और फिर भ्रूण के पक्ष के साथ दो कटौती कनेक्ट। फिर त्वचा के फ्लैप हड़पने के लिए और मस्तिष्क के शीर्ष पर उसे खींच। मस्तिष्क तो जल्दी से शेष ऊतक से दूर विच्छेदित किया जा सकता है।
  2. वैकल्पिक रूप से, कॉर्टेक्स के पीछे पूरे दिमाग के पीछे पहलू लंगर। इस बीच, कॉर्टेक्स के सबसे पृष्ठीय दुम पहलू पर प्रत्येक गोलार्द्ध समझ और एक पूर्वकाल दिशा में दूर लंगर ऊतक से कॉर्टेक्स आंसू। इस रास्ते में, दोनों गortices हटाया जा सकता है और द्विपक्षीय ganglionic eminences अभी भी औसत दर्जे का पार्श्व शरीर रचना विज्ञान के संरक्षण के ऊतकों के आराम करने के लिए संलग्न है, पता चला रहे हैं।
  3. चाकू-चाकू करने के लिए स्विच प्रत्येक गोलार्द्ध पर MGE के आसपास सटीक कटौती करने के लिए। MGE या एक बड़ी टिप के साथ एक विंदुक (यानी।, P1000) इकट्ठा करने के लिए संदंश की एक अलग स्वच्छ सेट या तो उपयोग करें।
    नोट: MGE एकत्र किया जाता है, जब कुछ मीडिया अनिवार्यत: स्थानांतरित कर रहा है, के रूप में अन्य सभी विच्छेदित सामग्री से दूर एकत्र ऊतक रखें।
  4. MGE लीजिए और DMEM / 10% FBS के, (500 μl की एक मात्रा MGEs इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त है) युक्त एक 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में ऊतक डाल दिया। एक ही संग्रह ट्यूब में अन्य गोलार्द्ध और जगह के लिए दोहराएँ। सभी ऊतक एकत्र किया जाता है जब तक बर्फ पर नमूने रखें।

5. Lentiviral लेबलिंग और ट्रांसप्लांटेशन

  1. एक BSL2 प्रमाणित हुड में MGE ऊतक की ट्यूब ले जाएँ और मीडिया को हटा दें।
    ध्यान दें:MGE ऊतक आंखों को दिखाई हो सकता है और ठंड मीडिया को आसानी से और धीरे से हटाया जा करने की अनुमति के लिए ट्यूब के नीचे करने के आदी हो जाएगा काफी बड़ा है।
  2. DMEM / 10% FBS के मीडिया के ~ 500 उल जोड़ें, कि एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में preincubated गया था। अगला, 8 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में प्रत्येक ट्यूब पारगमन की सुविधा के लिए polybrene जोड़ें। एक P1000 विंदुक टिप का उपयोग कर, एक एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए MGE ऊतक Triturate। अंत में, प्रत्येक ट्यूब ~ केंद्रित lentivirus के 15-20 μl जोड़ें।
  3. महत्वपूर्ण विचार: 10-12 बार बार विचूर्णन एक एकल भ्रूण से MGE ऊतक को तोड़ने के लिए पर्याप्त है, लेकिन कई MGEs एक साथ जमा कर रहे हैं और अधिक triturations आवश्यक हो सकता है। सबसे अच्छा क्या काम करता है निर्धारित करने के लिए विभिन्न विचूर्णन शर्तों बाहर की कोशिश करो।
  4. सुरक्षित रूप से एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह की तुलना में, मिश्रण को पलटना, सभी ट्यूबों प्रत्येक ट्यूब बंद करें। कम से कम 30 मिनट के लिए और एक घंटा तक का lentivirus में कोशिकाओं को सेते हैं। अब समय डे में हुई हैबढ़ सेल व्यवहार्यता। समय नहीं है जब तक ट्यूबों हर 10 मिनट पलटना।
  5. Lentivirus के साथ ऊष्मायन के बाद, गोली कोशिकाओं के लिए 3 मिनट के लिए ~ 700 XG पर इनक्यूबेटर और अपकेंद्रित्र से ट्यूबों निकालें। BSL2 हुड में, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 10% ब्लीच में त्यागें। इसके बाद, एक मिलीलीटर DMEM / 10% FBS के जोड़ने और फिर धो लें गोली कोशिकाओं के लिए एक ही रफ्तार से फिर से अपकेंद्रित्र को गोली 2-3 बार triturate। अतिरिक्त वायरस को दूर करने के लिए इस धोने कदम 2-3 बार दोहराएँ।
    नोट: कम spins के आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं जब 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation चरणों को पूरा करें, हालांकि, कम व्यवहार्यता नहीं देखा गया है।
  6. अंतिम धोने के बाद, जितना संभव हो उतना मीडिया को हटाने और बर्फ पर प्रत्येक ट्यूब डाल दिया। कारण ट्यूब के पक्षों पर अवशिष्ट मीडिया के लिए, ~ मीडिया के 2-3 μl प्रत्यारोपण प्रक्रिया शुरू हो गया है समय से सेल गोली को कवर खत्म हो जाएगा।

6. ट्रांसप्लांटेशन और विधिमान्यकरण

  1. मेजबान P1 के पिल्ले मोल और प्रक्रिया को तैयार70% इथेनॉल के साथ नीचे छिड़काव द्वारा क्षेत्र। प्रक्रिया के दौरान बाँझपन बनाए रखने के लिए यह एक समर्पित स्वच्छ प्रक्रिया कमरे में इन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा, उपयोग या तो autoclaved शल्य चिकित्सा उपकरण पिल्ले 70% इथेनॉल का उपयोग के साथ संपर्क में हो जाएगा कि सतहों बाँझ। प्रत्यारोपण और एक प्रतिनिधि प्रक्रिया के क्षेत्र में प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक प्रतिनिधि उपकरण का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है।

नोट: इस प्रक्रिया के एक छोटे संस्करणों के इंजेक्शन, और नहीं एक चीरा, खुले घाव या टांके की आवश्यकता होगी कि एक शल्य प्रक्रिया है, यह अभी भी एक माउस इंजेक्ट किया जा करने के लिए एक नया micropipette का प्रयोग किया जाता है कि सिफारिश की है। micropipettes खींच लिया और 70% इथेनॉल के एक मोहरबंद कंटेनर में संग्रहित किया जा रहा साथ छिड़काव किया गया था कि एक सतह पर beveled जब निष्फल गर्मी कर रहे हैं।

  1. 40-80 माइक्रोन के बीच नोक पर एक व्यास है micropipettes उत्पन्न करता है। इन आयाम निम्नलिखित इष्टतम निकलेगापरिणाम है। हीट खींच लिया जब micropipettes बाँझ और एक सतह पर beveled और एक मोहरबंद कंटेनर में micropipettes भंडारण से पहले 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे।
    नोट: (तालिका 2) इन सुइयों बनाने के लिए आवश्यक उपकरणों के लिए उपयोग सीमित है अगर वैकल्पिक रूप से, किसी भी अन्य इंजेक्शन डिवाइस का उपयोग करें। हालांकि, इन अलग व्यास के कारण micropipettes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हो सकता।
  2. 1 मिलीलीटर सिरिंज में खनिज तेल ड्रा, और एक 30 1/2 जी सुई के साथ, खनिज तेल के साथ पूरी तरह से कांच पिपेट भरें। अगला, सवार पर stereotaxic डिवाइस और लोड करने के लिए कांच पिपेट देते हैं तो, stereotaxic डिवाइस पर सवार माउंट। हाइड्रोलिक ड्राइव का उपयोग कर, एक साफ एक साफ कागज तौलिया के साथ बाहर फैल कि खनिज तेल निकालने, कांच पिपेट में आधे रास्ते के बारे में सवार चाल है।
    1. वैकल्पिक रूप से एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए, खनिज तेल में पिपेट के पीछे के अंत डूब और केशिका क्रिया से भर दिया। Pipett में हवाई बुलबुले को रोकने के लिएई, कांच पिपेट पूरी तरह से बाहर तक सिरिंज पर सकारात्मक दबाव बनाए रखें।
      नोट: अन्य उपकरणों को सफलतापूर्वक MGE 14 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। से या इस प्रक्रिया के लिए अच्छी तरह से 100 nl काम करता है के पास एक मात्रा कम वितरित कर सकते हैं कि किसी भी डिवाइस।
  3. ठीक एक बिंदु में मुड़ कोने नाजुक MGE सेल गोली से ऊपर अतिरिक्त मीडिया को दूर करने के साथ अगला, एक बाँझ कागज तौलिया, या किसी भी शोषक सामग्री का उपयोग करें। यह कदम छोटे इंजेक्शन संस्करणों प्राप्त किया जा सकता है, ताकि सेल घनत्व केंद्रित है। अगला, धीरे-धीरे सेल गोली आकर्षित और एक हाइड्रोफोबिक सतह पर सेल निलंबन जाने से पहले 1-2 बार triturate करने के लिए (p2 पसंद किया जाता है) पिपेट एक कम मात्रा का उपयोग करें। मात्रा बस के नीचे एक μl होना चाहिए। सेल निलंबन में सुई की नोक पर ले जाएँ और हाइड्रोलिक ड्राइव का प्रयोग, पिपेट में सेल निलंबन आकर्षित।
  4. हाइपोथर्मिया के माध्यम से एक P1 के पिल्ला चतनाशून्य (एक लेटेक्स दस्ताने में लपेट और ~ के लिए बर्फ पर 2-4 मिनट डाल)।एक हानिकारक उत्तेजना के साथ संज्ञाहरण की प्रभावशीलता के लिए जाँच करें। ठीक संदंश के साथ पैर की उंगलियों के बीच त्वचा चुटकी: pinched अगर पिल्ला अनुत्तरदायी होना चाहिए। अगला, इंजेक्शन डिवाइस के अंतर्गत है कि एक मोल्ड पर पिल्ला जगह है, तो सिर पर त्वचा वापस खींच और मानक प्रयोगशाला टेप के साथ हासिल करने से तना हुआ त्वचा बनाने के।
    नोट: हाइपोथर्मिया नवजात चूहों और कम मृत्यु दर में परिणामों पर बहुत प्रभावी है जबकि पिल्ले 10 मिनट के अंतर्गत में ठीक करने के लिए शुरू हो जाएगा के रूप में, प्रक्रियाओं, जल्दी से किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बर्फ पर 4 मिनट सहन किया जा सकता है की एक ऊपरी सीमा है। एक लंबे समय के इंजेक्शन के लिए आवश्यक है, तो केवल एक बार हाइपोथर्मिया प्रेरित करने के लिए प्रयास करें। एक पिल्ला जल्दी ठीक हो जाए, तो हालांकि, पहली पिल्ला पूरी तरह से फिर से हाइपोथर्मिया उत्प्रेरण से पहले ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, केवल हाइपोथर्मिया एक इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए और अधिक समय के लिए प्रेरित। पिल्ले हाइपोथर्मिया के 5-10 मिनट के भीतर ठीक हो जाएगी। इस कूड़े और माँ के साथ पिल्ले रखकर या एक गर्म surfac पर पिल्ला रखकर की जा सकती हैई ठीक करने के लिए।
  5. एक stereotaxic डिवाइस का उपयोग करना, सिर की सतह को सीधा, पिल्ला के सिर पर सतह पर कांच पिपेट की नोक स्थिति। पिपेट सिर के साथ संपर्क में है, तो '0' के रूप में इस पर विचार करें। अगला, सम्मिलित तो, कॉर्टेक्स में त्वचा और खोपड़ी की सतह के माध्यम से पिपेट धक्का और रोक से पहले ~ 2 बार पिपेट वापस लेना। Micropipette 0.1 मिमी की गहराई पर है जब नियोकॉर्टेक्स में कोशिकाओं के लक्षित कर इष्टतम के लिए, इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इस प्रयोक्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए (नीचे नोट देखें)।
    नोट: इस गहराई मज़बूती से ऊपर वर्णित उपकरणों के साथ गहरी neocortical परतों को लक्षित करता है, वहीं कुछ गहराई अनुभव से निर्धारित परीक्षण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, विभिन्न समास में प्रयुक्त रूप-दुम और Medio-पार्श्व स्थिति में गहराई की एक श्रृंखला प्रत्येक स्थल पर इष्टतम है क्या गहराई निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। नियोकॉर्टेक्स में धीमी गति से प्रवेश ग करने की क्षमता कम हो के रूप में इसके अलावा, प्रारंभिक पंचर, तेजी से होना चाहिएleanly ऊतक घुसना। पहला सबसे अच्छा क्या काम करता है खोजने के लिए इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए जब अलग गति की कोशिश करें। रंगों स्थिति निरूपित करने के लिए अविश्वसनीय किया गया है के रूप में इसके अलावा, परीक्षण निर्देशांक के लिए, लेबल की कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए कोई वास्तविक विकल्प नहीं है।
  6. सुई की स्थिति में है, तो कोर्टेक्स में सेल निलंबन का एक सेट मात्रा धक्का गिलास पिपेट में सवार अग्रिम करने के लिए हाइड्रोलिक डिवाइस को घुमाएगी। साइट के अनुसार 50-70 एनएलएस इंजेक्षन। लक्ष्य नियोकॉर्टेक्स भर में कोशिकाओं की एक विस्तृत वितरण प्राप्त करने के लिए है कि अगर अलग व्याख्यान चबूतरे वाला दुम स्तरों पर 3-6 विभिन्न स्थलों पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
    नोट: 100 nl या अधिक से अधिक का वॉल्यूम घावों का कारण है और कुशलता से इंजेक्शन साइट से बाहर की ओर पलायन करने में विफल है कि इंजेक्शन कोशिकाओं के बड़े clumps के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इस प्रकार, छोटे इंजेक्शन मात्रा (~ 70 nl या कम) यदि समय परमिट अधिक साइटों पर, इष्टतम हैं।
  7. इंजेक्शन पूरा कर रहे हैं, पैर के अंगूठे की कतरन पी की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है (मंच से पिल्ला को हटाने और यह निशानउतार बाद में)। पिल्ला बरामद किया है और अपने दम पर ले जाने में सक्षम है है एक बार, माँ और कूड़े के साथ इसे वापस डाल (इस मंच से उन्हें हटाने के मिनट के भीतर होता है)।
    नोट: यह एक न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है चूंकि पिल्ला स्वतंत्र रूप से चलती है और गरम है एक बार कोई पोस्ट-सर्जिकल प्रक्रियाओं कर रहे हैं। हालांकि, पिल्ले न केवल प्रक्रिया है लेकिन यह भी आश्वस्त करने के लिए अगले दिन के बाद वे स्वास्थ्य बिगड़ती के कोई संकेत नहीं है जाँच की जानी चाहिए।
  8. अगले पिल्ला पर प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक बाँझ कार्य क्षेत्र बनाए रखने के लिए 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र के नीचे स्प्रे। इंजेक्शन के पिल्ले को विकसित करने और उसके बाद उपयुक्त विकास मंच (एस) में ऊतक का आकलन करने की अनुमति दें।

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Representative Results

MGE कोशिकाओं की ओर पलायन और एक मेजबान के नियोकॉर्टेक्स 16 में प्रत्यारोपित जब एकीकृत करने के लिए अद्वितीय क्षमता है, वे इन विवो अध्ययनों से पहले आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं। इस के साथ साथ, हम एक E13.5 भ्रूण से MGE ऊतक अलग कर सकते हैं कि कैसे शो (आंकड़े 1 और 2), तो इन विट्रो में या vivo अध्ययन के लिए प्रत्यारोपण से पहले एक तेजी से तरीके से या तो lentiviruses साथ transduced किया जा सकता है। Lentiviruses के माध्यम से लेबल MGE GABAergic न्यूरॉन्स 15 में GFP ड्राइविंग एक बढ़ाने का उपयोग करने से पहले प्रदर्शन किया गया है। प्रत्यारोपण बहुत इन कोशिकाओं को 'प्रसार और एकीकरण की पढ़ाई सहायता कर सकते हैं हालांकि, इससे पहले की क्षमता एक विषम जनसंख्या से विशिष्ट उपसमूहों में जीन व्यक्त करने के लिए। इस के साथ साथ, हम एक विशिष्ट interneuron उपसमूह, (एसएसटी) + सोमेटोस्टैटिन व्यक्त कि उन लोगों के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को लक्षित करने के लिए एक साधन विकसित करने की मांग की।

हम फाईRST एक lentiviral रीढ़ की हड्डी में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Cre निर्भर GFP संवाददाता (वेक्टर जानकारी, तालिका 2) subcloned। वेक्टर (इस कैसेट केवल कैग प्रमोटर के कुछ निहित) पहली एएवी वेक्टर से loxP साइटों द्वारा flanked GFP युक्त कैसेट subcloning और XbaI और PflMI प्रतिबंध साइटों का उपयोग कर एक lentiviral वेक्टर रीढ़ की हड्डी 15, में यह ligating द्वारा तैयार की गई थी। अगला, सीएजी प्रमोटर के शेष SpeI और XbaI साइटों के साथ एक pCAGGS स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर से excised और pLenti-कैग-फ्लेक्स-GFP उत्पन्न करने के लिए lentiviral वेक्टर के XbaI साइट में ligated गया था। 5 'डालने का SpeI साइट XbaI के लिए स्वतंत्र है और इस प्रकार 5 नष्ट कर दिया' 3 'XbaI साइट संरक्षित किया गया था, जबकि साइट। जिसके परिणामस्वरूप वेक्टर (स्कीमा चित्रा -4 ए, वेक्टर अनुक्रम तालिका 1) पहली Cre (इन विट्रो परख की स्कीमा, 4B चित्रा) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में इन विट्रो में परीक्षण किया गया था। MGE Ai14 Flox / + E13.5 भ्रूण से प्राथमिक न्यूरॉन्स सुसंस्कृत और lentiviruses के संयोजन के साथ transduced थे। कोई + GFP या tdTomato + कोशिकाओं को कुछ कैग फ्लेक्स-GFP के lentivirus (आंकड़े 4C, 4F और 4i) का ही पारगमन के साथ मनाया गया। TdTomato प्रतिदीप्ति एक सीएमवी-Cre lentivirus, रचनात्मक अभिव्यक्ति का सूचक (आंकड़े 4D, 4G और 4J) के साथ transduced MGE कोशिकाओं में उपस्थित थे। अंत में, MGE कोशिकाओं के सह-पारगमन कैग फ्लेक्स-GFP के lentivirus की उम्मीद (आंकड़े 4E, 4H और 4K) के रूप में काम कर रहा था यह दर्शाता है कि यह भी GFP व्यक्त की है कि कई tdTomato + कोशिकाओं में हुई। कुछ दुर्लभ GFP + कोशिकाओं मनाया गया है कि नहीं थे tdTomato + transduced संवाददाता अगले सभी GFP + कोशिकाओं की <2% के लिए जिम्मेदार है, जो एक मजबूत प्रमोटर, को शामिल संभावित कारण।

सामग्री "मेजबान नियोकॉर्टेक्स, परिपक्व फैलाने और मेजबान नियोकॉर्टेक्स 16 E13.5 एसएसटी-IRES-Cre + में एकीकृत एक जंगली प्रकार में प्रत्यारोपित> MGE कोशिकाओं;। Ai14 Flox / + MGE कोशिकाओं P1 पर गुम्मट neocortices में प्रत्यारोपित किया गया (स्कीमा, चित्रा 5A) और उनके वितरण 7 और 35 दिनों के बाद प्रत्यारोपण (डीपीटी)। दोनों की उम्र में, tdTomato + कोशिकाओं नियोकॉर्टेक्स (आंकड़े 5 ब और 5C) भर में देखा जा सकता है पर जांच की। आंकड़े 5 ब और 5C में छवियों MGE उपयोग प्रतिनिधि प्रत्यारोपण कर रहे हैं । एक एकल भ्रूण कोशिकाओं से एसएसटी-IRES-Cre + से, इस के साथ साथ MGE कोशिकाओं वर्णित प्रोटोकॉल के साथ लेबल किया जा सकता है कि कैसे कुशलतापूर्वक MGE कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए; Ai14 Flox / + भ्रूण कैग फ्लेक्स-GFP के lentivirus के साथ transduced और में प्रत्यारोपित किया गया conce के एक ही तरीके से। इन प्रयोगों के लिए, ~ 15 उलntrated lentivirus (~ 1x10 7 संक्रामक इकाइयों / एमएल) प्रत्येक प्रत्यारोपण के लिए एक भ्रूण से संयुक्त MGEs के साथ उपयोग किया गया था। कोशिकाओं तो एक P1 के गुम्मट मेजबान कोर्टेक्स में प्रत्यारोपित और 7 डीपीटी (आंकड़े 5D -5 F) पर विश्लेषण किया गया। प्रतिरोपित कोशिकाओं (tdTomato +) के लगभग 20% कैग फ्लेक्स-GFP के lentivirus (चित्रा 5G) के साथ पारगमन का संकेत है, + GFP थे। इन आंकड़ों lentivirus की राशि और अनुमापांक ऊपर वर्णित के साथ, ~ प्रत्यारोपित MGE कोशिकाओं का 20% लेबल किया जा सकता है कि सलाह देते हैं। वायरस की राशि या तो कमी आई है या वृद्धि हुई है, या वायरल ऊष्मायन की अवधि की तरह संभावित अन्य चर sparser या सघन सेल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, बदला जा सकता है किया जा सकता है।

कैग फ्लेक्स-GFP के lentivirus के साथ संयोजन के रूप में एक रचनात्मक निर्भर रिपोर्टर माउस लाइन से MGE ऊतक का उपयोग immunofluorescence द्वारा लिए जांच की जा सकती है कि अतिरिक्त मार्कर की संख्या को सीमित कर सकते हैं। इसलिए, एसएसटी-IRES-Cre + < / Sup> E13.5 MGE ऊतक एकत्र और रचनात्मक व्यक्त की है कि उन प्रत्यारोपित MGE कोशिकाओं कल्पना करने के क्रम में सीएजी फ्लेक्स-GFP के lentivirus के साथ transduced गया था (+ GFP) हो जाएगा। इन कोशिकाओं को P1 के गुम्मट कोर्टेक्स में प्रत्यारोपित और 35 डीपीटी (प्रायोगिक डिजाइन, चित्रा 6A देखें), परिपक्व interneuron मार्करों व्यक्त कर रहे हैं जब एक समय बिंदु पर मूल्यांकन किया गया। 35 डीपीटी में, ~ GFP + कोशिकाओं का 85% एसएसटी-व्यक्त सह, लेकिन केवल ~ 4% पी.वी. (आंकड़े 6B-6H) व्यक्त की है। ये संख्या नक्शे भी जो भाग्य एसएसटी-IRES-Cre माउस लाइन के वंश विश्लेषण, के साथ संगत कर रहे हैं करने के लिए ~ पीवी + कोशिकाओं 9 (Vogt और Rubenstein, अप्रकाशित परिणाम) के 5-10%। इन आंकड़ों MGE के वायरल लेबलिंग कुशल है और इन विवो विश्लेषण से पहले एक पत्रकार या संभावित ब्याज की एक जीन को शुरू करने के लिए एक लागू दृष्टिकोण हो सकता है कि सलाह देते हैं।

740fig1.jpg "/>
प्राथमिक संस्कृतियों या प्रत्यारोपण के लिए या तो MGE ऊतक के E13.5 MGE ऊतक। उदाहरण के विच्छेदन के विच्छेदन के लिए चित्रा 1. प्रतिनिधि प्रक्रिया। E13.5 मस्तिष्क dissections की (एई) छवियों, और (A'-ई ') संरचनाओं को उजागर करने के schematics और प्रक्रिया। (ए, ए ') प्रतिनिधि E13.5 मस्तिष्क में महत्वपूर्ण कदम उदर पहलू से देखा। रेड लाइन के दो टुकड़े। (बी, बी ') एक मस्तिष्क hemisection दृश्य में मस्तिष्क Hemisect जाएगा जो बना पहली कट, अर्थ। औसत दर्जे का पहलू नीचे पार्श्व पहलू के साथ, दिख रहा है। पृष्ठीय कॉर्टेक्स (नीला रंग) से ऊतक ganglionic eminences overlies। इसके अलावा, हटा दिया जाएगा कि उदर ऊतक नारंगी में दिखाया गया है। (सी, सी ') देखें और ऊतक overlying के बाद उजागर ganglionic eminences का चित्रण दूर खुली दिया गया है। (डी, डी') उजागर ganglionic ईएमआई का एक ही दृश्य (सी, सी ') में है, लेकिन लाल के रूप में दिखाया विस्तृत कटौती साइटों के साथ के रूप में nences लाइनें धराशायी। MGE (डी, डी ') में चिह्नित लाइनों के अनुसार बाहर कट जाने के बाद (ऊतक अपने पक्ष ई, ई) चालू है' और पार्श्व पहलू से छंटनी और खारिज कर दिया है। MGE ऊतक के विच्छेदन और अलगाव में प्रतिनिधि कदम। लघुरूप: (CGE) दुम ganglionic श्रेष्ठता, (LGE) पार्श्व ganglionic श्रेष्ठता, MGE () औसत दर्जे का ganglionice श्रेष्ठता। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2. फिल्म एक E13.5 MGE विच्छेदन दिखा। मूवी बाद में खुलासा और overlying ऊतक को हटाने के बाद एक E13.5 मस्तिष्क को हटाने के दर्शाया गया है। MGE लेबल और आसपास के ऊतकों को दूर करने के लिए बनाई गई कटौती एक stepwise क्रम में शो कर रहे हैं।। MGEdissect movie.mov "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि प्रक्रिया क्षेत्र और नवजात प्रत्यारोपण के लिए इंजेक्शन की सुई का उदाहरण है। (ए, ए ') नवजात चूहों में प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए एक उदाहरण सेटअप दिखा छवियाँ। एक माइक्रोस्कोप (1) एक नवजात माउस (5) और मानती है कि stereotaxic डिवाइस के क्षेत्र दिखा एक stereotaxic डिवाइस (2)। (ए ') के एक बढ़े हुए छवि (ए) पकड़ कर सकते हैं कि एक फफूंदी से युक्त एक मंच के ऊपर तैनात है एक सम्मिलित सवार के साथ कांच के इंजेक्शन की सुई (6) (7)। सवार (4) ठीक एक हाइड्रोलिक ड्राइव द्वारा नियंत्रित और सुई से प्रवाह आवक और जावक mediates कि गिलास सुई के भीतर खनिज तेल चलता रहता है। एक गिलास इंजेक्शन सुई (बी) उदाहरण एक beveled टिप के साथ। में शासक (बी), प्रत्येक प्रमुख सीमांकन = 100 माइक्रोन के लिए। में दिखाया गया आइटम (सी) सूची की सूची (ए, ए ')। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 में इन विट्रो परीक्षण Cre की उपस्थिति में एक सीएजी फ्लेक्स-GFP के lentivirus से GFP की अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है। Lentiviral कैग फ्लेक्स-GFP वेक्टर Cre की उपस्थिति में कैसे काम करता है (ए) स्कीमा। (बी) स्कीमा lentiviral कैग फ्लेक्स-GFP के रचनात्मक अभिव्यक्ति के साथ उन कोशिकाओं में GFP व्यक्त करेंगे अगर प्राथमिक MGE सेल संस्कृति प्रयोग का आकलन करने के लिए। संक्षेप में, एक रचनात्मक निर्भर रिपोर्टर से MGE कोशिकाओं, Ai14 (सीआर की उपस्थिति में tdTomato व्यक्त कियाई), इन विट्रो में उगाई और रचनात्मक और / या फ्लेक्स-GFP के lentiviruses। (सी) एक सीएमवी-Cre, कैग फ्लेक्स-GFP या दोनों के साथ transduced थे कि E13.5 MGE प्राथमिक संस्कृतियों के Immunofluorescent छवियों के साथ transduced थे। संस्कृति देशी tdTomato अभिव्यक्ति, GFP और DAPI के लिए imaged थे। (कश्मीर) में स्केल बार 100 माइक्रोन =। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
+ प्रतिरोपित और transduced,-Cre एसएसटी-IRES चित्रा 5. प्रतिनिधि छवियों; Ai14 Flox / + MGE कोशिकाओं। (ए) प्रयोगात्मक डिजाइन की स्कीमा अकेले या एक जंगली प्रकार में lentiviral पारगमन (डब्ल्यूटी) मेजबान, (डीपीटी) दिनों के बाद MGE कोशिकाओं या तो प्रत्यारोपण पोस्ट प्रत्यारोपण। संक्षेप में, E13.5 एसएसटी-IRES-Cre +;। के Ai14 Flox / + MGE कोशिकाओं या तो प्रत्यारोपित या WT neocortices में प्रत्यारोपण से पहले कैग फ्लेक्स-GFP के lentivirus के साथ transduced और 7 डीपीटी पर मूल्यांकन किया गया (बी, सी) Immunofluorescent छवियों प्रतिनिधि MGE प्रतिरोपित कोशिकाओं (tdTomato +) दिखा 7 या 35 डीपीटी पर neocortices। (लोमो) 7 डीपीटी पर मूल्यांकन सीएजी फ्लेक्स-GFP के lentivirus के साथ transduced MGE कोशिकाओं की Immunofluorescent छवियों। (जी) tdTomato + कोशिकाओं का अनुपात की मात्रा का ठहराव है कि 7 डीपीटी में व्यक्त GFP। (सी) और (च) = 100 माइक्रोन में स्केल सलाखों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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E13.5 की कैग फ्लेक्स-GFP के lentivirus के चित्रा 6. प्रतिनिधि छवियों एसएसटी-IRES-Cre MGE व्युत्पन्न interneuron उपसमूह मार्करों-एक्सप्रेस सह कि + MGE प्रत्यारोपण, transduced। (ए) स्कीमा एसएसटी-IRES-Cre + MGE सेल फसल और 35 डीपीटी में मूल्यांकन से पहले P1 के गुम्मट सेनाओं के नियोकॉर्टेक्स में एक सीएजी फ्लेक्स-GFP के lentivirus और प्रत्यारोपण के साथ पारगमन। फ्लेक्स वेक्टर (बी, ई) से GFP की अभिव्यक्ति दिखा प्रत्यारोपित सेनाओं के नियोकॉर्टेक्स से छवियों प्रतिनिधि, (डी, जी)। सोमेटोस्टैटिन (एसएसटी) (सी) या parvalbumin (पीवी) (एफ) के लिए या तो सह दाग विलय छवियों सह दाग DAPI के साथ। सह-Express कि एसएसटी या पीवी GFP कोशिकाओं के अनुपात से (एच) मात्रा। डाटा ± SEM, (एन) 3. स्केल (जी) में बार = 100 माइक्रोन = प्रतिनिधित्व करते हैं।/52740fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

PLentiviral-कैग-फ्लेक्स-GFP के डीएनए वेक्टर की तालिका 1. FASTA फ़ाइल।

MGE सेल तैयारी और पारगमन के लिए अभिकर्मकों और उपकरणों सूचि # कंपनी
1) उच्च ग्लूकोज के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, 12491-015 जीवन टेक्नोलॉजीज
2) गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम 10437-077 जीवन टेक्नोलॉजीज
3) हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HbSS), कोई कैल्शियम और मैग्नीशियम 14170-112 जीवन टेक्नोलॉजीज
4) 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (या अन्यlids के साथ संग्रह ट्यूब) 3810X Eppendorf इंटरनेशनल
5) Polybrene अनुसूचित जाति-134,220 सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी
6) चाकू चाकू सीधे 22.5 डिग्री (वैकल्पिक) रेफरी 72-2201 शल्य चिकित्सा विशेषता निगम
7) ऊतक dissections के लिए पेट्री डिश (10 सेमी), FB0875713 फिशर साइंटिफिक
8) ड्यूमॉन्ट # 5 की तरह दो ठीक टिप संदंश, 11,254-20 ललित वैज्ञानिक उपकरण
9) 5% सीओ 2 इनपुट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर C150 बाइंडर
10) 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्पिन कर सकते हैं कि tabletop अपकेंद्रित्र
1 1) सेल विचूर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि किसी भी P1000 विंदुक
12) जैव सुरक्षा स्तर 2 हुड
इन विट्रो MGE प्राथमिक संस्कृतियों के लिए अभिकर्मकों और उपकरण सूचि # कंपनी
1) लैब-TekII अच्छी तरह से कवर, 8 के साथ chamberslides 154,941 थर्मो फिशर
2) पाली एल Lysine 0.1% वजन / मात्रा P8920 सिग्मा Aldrich
3) माउस Laminin, 0.5-2 मिलीग्राम / मिलीलीटर 23017-015 जीवन टेक्नोलॉजीज
4) Neurobasal मध्यम 21103-049 जीवन टेक्नोलॉजीज
5) B27 सीरम मुक्त पूरक 17504044 जीवन टेक्नोलॉजीज
6) Glutamax, 100x शेयर 35050-061 जीवन टेक्नोलॉजीज
7) पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100x शेयर 15070-063 जीवन टेक्नोलॉजीज
8) ग्लूकोज, (पानी में एक 25% समाधान तैयार) G5400 सिग्मा Aldrich
MGE कोशिका प्रत्यारोपण के लिए अभिकर्मकों और उपकरण सूचि # कंपनी
1) 1 मिलीलीटर सिरिंज रेफरी 309,602 बी.डी., Becton डिकिंसन और कंपनी
2) 30 1/2 जी सुई 305,106 बी.डी., Becton डिकिंसन और कंपनी
3) प्रीcision बोर 5 μl वितरित करने के लिए (सवार के साथ आता है) 5-000-1005 ड्रमंड वैज्ञानिक कंपनी
4) Parafilm पीएम-999 Polysciences, इंक
5) ** Boomstand साथ स्टीरियो माइक्रोस्कोप MZ6 लीका
6) ** सिर्फ चूहों stereotaxic साधन के लिए डिजिटल 51725D Stoelting कंपनी
7) ** एकल अक्ष तेल हाइड्रोलिक ठीक micromanipulator एमओ-10 Narishige
8) डायमंड लेपित रोटरी beveler NA घर में बनाया
9) सुई pipetते डांड़ी 730 Kopf उपकरणों
10) खनिज तेल NA किसी भी दवा की दुकान या फार्मेसी
1 1) उपाय मात्रा का एक μl reliaby सकता है किसी भी पिपेट और सुझावों
** इन उपयोग हम विशेष मॉडल हैं, लेकिन कई अन्य setups के काम करना चाहिए
Optiona(lentiviruses बनाने के लिए) एल अभिकर्मकों सूचि # कंपनी
1) 25 मिमी, 0.45 माइक्रोन फिल्टर 09-719B फिशर साइंटिफिक
2) अल्ट्रा स्पष्ट अपकेंद्रित्र ट्यूब (25 X 89 मिमी) 344,058 बैकमैन Coulter®
3) 2000 Lipofectamine (1.5 मिलीलीटर आकार) 11668019 Invitrogen
अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आपूर्ति सूचि # कंपनी
1) pMDLg / pRRE प्लाज्मिड एन्कोडिंग ढकोसला / पीओएल 12,251 Addgene
2) pRSV-रेव प्लाज्मिड एन्कोडिंग रेव 12,253 Addgene
3) pMD2.G प्लाज्मिड एन्कोडिंग VSVG 12,259 Addgene
4) pAAV-फ्लेक्स-GFP 28,304 Addgene

अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका 2. सूची की सूची। प्रत्यारोपण और डीएनए वैक्टर के लिए मीडिया, विच्छेदन उपकरण, प्रतिनिधि उपकरणों सहित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों की एक सूची। (एनए) उपलब्ध है या लागू नहीं है।

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Discussion

सेल आधारित चिकित्सा के लिए भ्रूण ganglionic eminences (GES) से GABAergic कॉर्टिकल interneuron व्यापारियों का उपयोग कई स्थितियों 12 -1 4 के लिए वादा दिखा रहा है। सटीक आणविक तकनीक पर नज़र रखने के लिए, और विशिष्ट interneuron उपसमूहों में ब्याज की जीन को व्यक्त करने की जरूरत है। यहाँ हम प्रत्यारोपण से पहले lentiviruses साथ भ्रूण MGE कोशिकाओं लेबलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और इस तकनीक में विवो विश्लेषण के लिए विशिष्ट कॉर्टिकल interneuron उपसमूहों में ब्याज की जीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा।

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल मज़बूती हालांकि, इष्टतम reproducibility के लिए यह कुछ महत्वपूर्ण कदम का पालन करने के लिए आवश्यक है, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वायरल पारगमन कुशल होने के लिए सबसे पहले, शारीरिक तापमान और पीएच जरूरी हैं। इन मानकों से मुलाकात कर रहे हैं, MGE कोशिकाओं ~ 30 मिनट में transduced किया जा सकता है। दूसरा, आगे बढ़ने से पहले एक घने MGE गोली है सुनिश्चित करेंएक प्रत्यारोपण करने के लिए। केवल एक सीमित मात्रा क्षति वसूल किए बिना प्रत्येक स्थल पर नवजात माउस मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जा सकता है, और कोशिकाओं दूर इंजेक्शन साइट से विस्थापित करेगा, ताकि प्रत्यारोपण के समय में उनके घनत्व हो सकता है की तुलना में एक चिंता का कम है क्योंकि यह महत्वपूर्ण है उम्मीद थी। अंत में, गहराई इष्टतम क्या कर रहे हैं इंजेक्शन निर्धारित करने के लिए एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर व्यक्त कि MGE कोशिकाओं के साथ कुछ परीक्षण की स्थिति को चलाते हैं। इस प्रोटोकॉल MGE कोशिकाओं का इस्तेमाल करते हैं, CGE कोशिकाओं को भी एक ही तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है। एक दोष यह पूरे CGE करने के लिए या CGE व्युत्पन्न interneurons की विशेष उपसमूहों को अभिव्यक्ति प्रतिबंधित है कि कई रचनात्मक-चालक लाइनों वहाँ नहीं कर रहे हैं। हालांकि, vasoactive आंतों पेप्टाइड (वीआईपी) 9 CGE व्युत्पन्न कोशिकाओं के इस उपसमूह बाहर अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक विश्वसनीय Cre-रेखा है। नई लाइनें उपलब्ध हो जाते हैं, इसे और अधिक आनुवंशिक परिशुद्धता के साथ इस प्रोटोकॉल को रोजगार के लिए संभव हो जाएगा।

इससे पहले, और हम दूसरों से पता चला हैइन तकनीकों में विवो विश्लेषण के लिए जीन को शुरू करने में प्रभावी थे। electroporation के माध्यम से या lentivirus के 15, 17 के साथ प्रत्यारोपण से पहले MGE कोशिकाओं में जीन शुरू करने की उपयोगिता, MGE ऊतक विषम है और कई interneuron उपसमूहों को जन्म के साथ ही गैर neuronal कोशिकाओं देता है 4। इसके अलावा, यह केवल एक विशिष्ट interneuron उपसमूह में ब्याज की एक जीन व्यक्त करने के लिए मुश्किल हो गया है। उल्लेखनीय प्रगति सहित कई कॉर्टिकल interneuron उपसमूहों की अभिव्यक्ति पैटर्न पुनरावृत्ति कि ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करने के लिए बनाया है, लेकिन एक घ वीआईपी Cre 9 एसएसटी-IRES-Cre, पी.वी.-IRES-Cre, पी.वी.-2A-Cre तक ही सीमित नहीं किया गया है -11, और नई लाइनों के आगमन के भविष्य में अतिरिक्त संभव आबादी को स्पष्ट करने में मदद करेगा। इसके अलावा, Cre निर्भर पत्रकारों और इस के साथ साथ इस्तेमाल किया Cre निर्भर रिपोर्टर वैक्टर सहित अभिव्यक्ति वैक्टर, की पीढ़ी के साथ ब्याज की जीन का एक और अधिक सटीक अभिव्यक्ति प्राप्त किया जा सकता है।

इस तकनीक के लिए एक सीमा एक मज़बूती से एक lentiviral वेक्टर में पैकेज कर सकते हैं कि टुकड़ा के आकार का हो सकता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण अभी तक AAVs के साथ परीक्षण नहीं किया गया है। इस तकनीक को एक व्यक्ति द्वारा अनुकूलित है हालांकि, एक बार, इस दृष्टिकोण के कई रूपों में इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे पहले, दृष्टिकोण शोधकर्ताओं विशिष्ट रचनात्मक-चालक लाइनों की MGE दाता कोशिकाओं के साथ संयोजन के रूप में एक रचनात्मक निर्भर रिपोर्टर lentivirus का उपयोग करते हुए संवाददाताओं से व्यक्त करने की अनुमति देगा यहाँ का वर्णन किया। इस तकनीक को व्यक्तिगत MGE कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक दूसरे जीन वेक्टर में क्लोन है, तो संभवतः विभिन्न उपसमूहों में ब्याज की एक जीन व्यक्त करने के लिए। दूसरा, यह भी रिपोर्टर MGE दाता कोशिकाओं या क्षमता Cre निर्भर साथ एक रचनात्मक व्यक्त वायरस का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता हैlly एक विषम जनसंख्या से कोशिकाओं के अलग आबादी में अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए संरक्षित डीएनए तत्वों, प्रमोटरों और enhancers, उभरती उपयोग।

मानव व्युत्पन्न प्रेरित स्टेम सेल या भ्रूण स्टेम कोशिकाओं लेबलिंग किया जाएगा पर काबू पाने के लिए एक भविष्य बाधा संभावित शुद्ध और / या कोशिकाओं के एक विशिष्ट समूह का अध्ययन। दिलचस्प है, संरक्षित डीएनए enhancers के भी वल्कल में इंजेक्शन के बाद, प्राथमिक संस्कृतियों में GABAergic न्यूरॉन्स लक्षित करने के लिए वायरल अभिव्यक्ति प्रणालियों में इस्तेमाल किया जा सकता है, और MGE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण से पहले 15, 18, ​​19। Enhancers इस बाधा के लिए एक जवाब हो सकता है और हो जाएगा नई तकनीक चिकित्सा में इन कोशिकाओं की उपयोगिता का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं के रूप में आणविक उपकरण, के रूप में ब्याज की। दरअसल, खोज enhancers के लिए पैठ संभावित glutamatergic न्यूरॉन्स 21 सहित GABAergic interneurons 20 या अन्य न्यूरोनल उपप्रकार या तो लेबल सकता है कि, जिस तरह के तहत कर रहे हैं। इस के साथ साथ वायरल लेबलिंग विधि का प्रयोग,यह प्रत्यारोपण से पहले और vivo विश्लेषण में रुचि के विशिष्ट कोशिकाओं लेबल सेल प्रकार विशिष्ट enhancers के साथ भेदभाव मानव व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं transduce करने के लिए संभव हो सकता है।

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Acknowledgments

इस काम से JLRR को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया: आत्मकेंद्रित बोलती, नीना आयरलैंड, वेस्टन वाले देश फाउंडेशन, NiMH R01 MH081880, और एच R37 MH049428। PRW ताइवान की राष्ट्रीय विज्ञान परिषद से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। एसएफएस F32 (MH103003) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe REF 309602 BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G needle 305106 BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) 5-000-1005 Drummond scientific company
Parafilm PM-999 Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand ** MZ6 Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument ** 51725D Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** MO-10 Narishige
Diamond coated rotary beveler made in house
Needle pipette puller 730 Kopf instruments
Mineral oil Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter 09-719B Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) 344058 Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) 11668019 Invitrogen
Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol 12251 Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev 12253 Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG 12259 Addgene
pAAV-Flex-GFP 28304 Addgene

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 98 MGE interneuron प्रत्यारोपण lentivirus सेल लेबलिंग सोमेटोस्टैटिन Cre
के लिए वायरल की मध्यस्थता लेबल और औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता का ट्रांसप्लांटेशन MGE () प्रकोष्ठों<em&gt; Vivo</em&gt; अध्ययन
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Vogt, D., Wu, P. R., Sorrells, S.… More

Vogt, D., Wu, P. R., Sorrells, S. F., Arnold, C., Alvarez-Buylla, A., Rubenstein, J. L. R. Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies. J. Vis. Exp. (98), e52740, doi:10.3791/52740 (2015).

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