Summary
GABAergic الأسلاف عصبون القشرية تفريق وتطوير وsynaptically الاندماج في القشرة المضيف بعد الزرع. هذه الخلايا يمكن transduced بسهولة قبل الزرع لفي الدراسات المجراة السلائف GABAergic المعدلة وراثيا. هنا، وتبين لنا تقنيات وضع العلامات الفيروسية لاستهداف مجموعات فرعية عصبون محددة باستخدام خطوط جنة المساواة العرقية القائمة وصحفيين لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على.
Abstract
GABAergic interneurons القشرية، والمستمدة من الإنسي الجنينية والفضيلة العقدية الذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري)، وظيفيا ومتنوعة شكليا. من إحراز تقدم في فهم أدوار متميزة مجموعات فرعية عصبون القشرية، ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الآليات التي عملت بها التي قد تسهم في تطوير ونضوج أنواع مختلفة من الخلايا GABAergic. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهم تغيير GABAergic يشير إلى الظواهر التوحد والفصام والصرع. وقد بدأت لجنة المساواة العرقية خطوط سائق محددة للا يتجزأ من مهام فرعية عصبون فريدة من نوعها. وعلى الرغم من التقدم في نماذج الماوس، غالبا ما يكون من الصعب دراسة GABAergic الأسلاف عصبون القشرية بكفاءة مع النهج الجزيئية في الجسم الحي. أسلوب واحد الهامة المستخدمة لدراسة الخلية البرمجة مستقلة من هذه الخلايا هي زرع الخلايا MGE إلى القشور المضيف. هذه الخلايا المزروعة تهاجر على نطاق واسع، تمييز، وهوالثانية دمج وظيفيا. وبالإضافة إلى ذلك، وخلايا MGE يمكن transduced بكفاءة مع الفيروسة البطيئة السابقة على الفور لزراعة الأعضاء، مما يسمح للعديد من الأساليب الجزيئية. نحن هنا بالتفصيل بروتوكول لتنبيغ الخلايا MGE بكفاءة قبل زرع في الجسم الحي التحليل، وذلك باستخدام خطوط جنة المساواة العرقية سائق المتاحة وناقلات التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على. هذا النهج هو مفيد لأنه يجمع بين التلاعب الجيني الدقيق مع قدرة هذه الخلايا لتفريق بعد الزرع، والسماح بمزيد من قرار معين الخلية من نوع في الجسم الحي.
Introduction
تشمل GABAergic interneurons القشرية ~ 20-30٪ من الخلايا العصبية في القشرة المخية الحديثة الثدييات، في حين أن بقية تتوافق مع مثير، الخلايا العصبية الرئيسية glutamatergic. Interneurons ومتنوعة للغاية في الخصائص الكهربية، محور عصبي والتغصنات التشكل ومتشابك استهداف 1، وافترض الاختلالات في مثير لهجة / المثبطة لتكمن وراء بعض الظواهر من الاضطرابات العصبية والنفسية / العصبية بما في ذلك مرض التوحد والفصام والصرع 2. الهدف العام للبروتوكول الموصوفة هنا هو توفير وسيلة لتعديل بكفاءة وراثيا GABAergic الأسلاف عصبون القشرية قبل زرع في الجسم الحي التحليلات.
ولدت interneurons القشرية GABAergic في الفضيلة العقدية وسطي والذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري، على التوالي) 3،4 وكذلك الباحة أمام البصرية 5. الأسلاف عصبون القشرية تخضع جاءت لمسافات طويلة الهجرة عرضيةالهجرة شعاعي للوصول إلى الأهداف النهائية. لدى وصولهم إلى وجهاتهم، يجب هذه interneurons القشرية تدمج بشكل صحيح في شبكة الخلايا العصبية الموجودة، وسيكون على كل عصبون فرعية فريدة تسهم في الدوائر القشرية بطرق محددة. أربع مجموعات فرعية رئيسية يمكن تمييزها بواسطة الواسمات الجزيئية: السوماتوستاتين MGE المشتقة (SST) + وparvalbumin (PV) + مجموعات فرعية، وفريق الخبراء الاستشاري المستمدة من الببتيد المعوي الفعال في الأوعية (VIP) + وريلين reelin +. SST - مجموعات فرعية 6. ولدت مختلفة مجموعات فرعية عصبون القشرية على أوقات مختلفة أثناء التطور الجنيني في MGE وفريق الخبراء الاستشاري 7 و 8. وقد استخدمت هذه وغيرها من القشرية GABAergic علامات عصبون لتوليد خطوط جنة المساواة العرقية سائق محددة للعديد من هذه المجموعات الفرعية 9-11.
برزت زرع الأسلاف MGE كعلاج خلية القاعدة المحتملة لعلاج الاضطرابات التي قد تكون ناجمة عن اختلال التوازنفي الإثارة / تثبيط 12 - 24. قد تكون هذه الفوائد العلاجية يرجع ذلك جزئيا إلى قدرة فريدة من الأسلاف MGE (لتفريق، التفريق والاندماج في الدماغ المضيف)، أو يحتمل أن تكون لأنه يتم الحصول العديد من شبه جسدية PV المثبطة + الخلايا من MGE. خلايا MGE يمكن أن يكون أيضا بسرعة وكفاءة transduced مع lentiviruses قبل زرع 15، مما يسمح للخلايا التي يتم تعديلها وراثيا في المختبر ليتم دراستها في الجسم الحي. كان المبرر لتطوير هذا النهج للتغلب على الحواجز في دراسة GABAergic تطوير عصبون القشرية والنضج. على وجه الخصوص، يسمح زرع MGE الباحثين لدراسة تطوير خلايا متحولة في الجسم الحي، عندما الماوس متحولة، لولا ذلك لقوا حتفهم في نقطة الوقت المبكر. وعلاوة على ذلك، من خلال إدخال جينات من الفائدة قبل الزرع، يمكن تقييم آثار جينات معينة على النمط الظاهري متحولة في المؤسسة فكرةالطريقة icient.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتنبيغ الخلايا MGE مع lentiviruses قبل الزرع. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف يمكن تكييف هذه التقنية للتعبير عن الجينات في المصالح في مجموعات فرعية عصبون محددة من مجموعة غير متجانسة من السلائف عصبون القشرية، وذلك باستخدام مزيج من lentiviruses التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على والمتاحة خطوط الماوس لجنة المساواة العرقية سائق. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يقدم تقنيات ومنبرا للباحثين لتعديل وراثيا GABAergic السلائف عصبون القشرية لفي الدراسات المجراة بطريقة فريدة من نوعها. ميزة واحدة من هذه التقنية على النهج الحالية الأخرى هي أن الخلايا المزروعة MGE سوف تفريق بعيدا عن موقع الحقن. أيضا، على عكس الحقن الفيروسية التنسيق، بعد تفريق خلايا MGE التشكل هو أسهل لتقييم. هذا النهج يمكن أن تستخدم لدراسة تأثير إدخال جينات من الفائدة في النوع البري أو خلايا متحولة، وإدخال نوع من الخلايا المحددةمراسل لتقييم التشكل، أو يحتمل أن تكون لدراسة تأثير الأليلات المرض في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: وقد تمت الموافقة على الإجراءات التالية لدينا من قبل المؤسسة والحيوان البروتوكول. تأكد من الحصول على موافقة لجميع الإجراءات التي تنطوي على عملية جراحية البقاء على قيد الحياة قبل بداية التجارب والتحقق من جميع البروتوكولات هي حتى الآن.
1. إعداد الفيروسة البطيئة (خطوة اختيارية)
- تقسيم ثلاثة 10 سم لوحات الخلايا HEK293T لكل الفيروسة البطيئة يتعين القيام بها، في ظل وجود 10 مل DMEM / 10٪ FBS، وتنمو إلى ~ 60-70٪ التقاء. تنمو الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- بالنقل البلازميدات التالية DNA (10 ميكروغرام الكل) في كل لوحة باستخدام أي كاشف ترنسفكأيشن: 6.4 ميكروغرام CAG-فليكس GFP ناقلات lentiviral (تسلسل الحمض النووي ناقلات المنصوص عليها في الجدول رقم 1)، و 1.2 ميكروغرام pMD2.G (بترميز VSV-ز)، 1.2 ميكروغرام pRSV-القس، و 1.2 ميكروغرام pMDLg / pRRE. هي ناقلات التعبئة والتغليف lentiviral الثلاثة المتاحة تجاريا (الجدول
ملاحظة: هذا نهج معين يستخدم الجيل 3 lentivirسوف ناقلات القاعدة لكن ناقلات 2nd جيل والبلازميدات المرتبطة بها تعمل أيضا. - إعداد حاوية النفايات التي تحتوي على محلول التبييض 10٪ ضمن BSL2 شهادة غطاء محرك السيارة لتعطيل أي حلول أو الأجهزة التي اتصلت أو تحتوي على الفيروسة البطيئة. وبعد ذلك، إزالة وسائل الإعلام 4-6 ساعة بعد ترنسفكأيشن في محلول التبييض، مع استبدال نفس الحجم من وسائل الإعلام الجديدة، والسماح للخلايا أن تنمو.
- بعد 4 أيام، وجمع وسائل الاعلام الى 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير أي حطام خلية. التالي، تصفية طاف عبر غشاء 0.45 ميكرون. أي منخفض البروتين مرشح ملزم، مثل PVDF، يعمل بشكل جيد. الحذر: مكان كل من النفايات الفيروسية الصلبة والسائلة في محلول التبييض.
- تحميل 30 مل تصفيتها طاف في أنابيب نابذة فائقة السرعة وإلى نابذة فائقة السرعة. الطرد المركزي في 100،000 x ج لمدة 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. فتح أنابيب الطرد المركزي في غطاء BSL2 وإزالة طاف في 10٪ التبييض. إضافة ~ 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى المؤسسة العامةllet والتي ينتج التتر من 1X10 ^ 7-8 وحدات المعدية / مل. قسامة اليوم والمخزن التالي في -80 درجة مئوية. مأخوذة الفيروسة البطيئة هي مستقرة في -80 درجة مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل.
- لدينا العديد من المؤسسات الآن النوى الفيروسية: النظر الهامة. اكتساب فيروس مركزة مع الحد الأدنى من عيار 1X10 7 المعدية وحدة / مل، لأفضل النتائج.
2. الفئران المانحة لMGE تشريح
- أولا، إنشاء التزاوج بين توقيت خط لجنة المساواة العرقية، معربا عن المصالح وإما نوع البرية (WT) الماوس أو الفأرة التي من شأنها التعبير عن مراسل بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة.
ملاحظة: العديد من خطوط جنة المساواة العرقية سائق هي البذور المعدلة وراثيا ويتم الاحتفاظ بها ولدت في ولاية فرداني الزيجوت. وهكذا، فإن نصف فقط من الأجنة تحتوي على التحوير لجنة المساواة العرقية. الحمض النووي يمكن أن يكون مستعدا بسرعة من الأجنة لPCR قصيرة للكشف عن أليل لجنة المساواة العرقية. ومن ثم يمكن حصاد لجنة المساواة العرقية + الأجنة بحيث يتم استخدام سوى نسيج MGE من النمط الجيني المطلوب. Alternatively، يمكن استخدام مراسل لجنة المساواة العرقية التي تعتمد، لتحديد الأجنة لMGE تشريح وزرعها. - حساب أي يوم سوف تتوافق مع E13.5. إذا تم إقران الحيوانات المساء قبل، وهو اليوم من المكونات هو 0.5. ترتيب الفئران توقيت الحوامل أو أنثى WT مع الجراء P1 من أجل وجود الوقت بعد الولادة (P) 1 الفئران في اليوم فإن الأنسجة المانحة يكون E13.5. بدلا من ذلك، إنشاء هذه التزاوج في منزل أسبوع واحد قبل الاقتران الحيوانات المانحة.
ملاحظة: هذه الاستراتيجية السابقة لتوليد كل من E13.5 والأجنة P1 / الجراء لنفس اليوم في كثير من الأحيان من الصعب القيام به بشكل موثوق.
3. إعداد وسائل الإعلام، وأدوات ومعدات.
- تحضير الكواشف وأدوات لإعداد خلية MGE (الجدول 2).
- إعداد سطح نظيف ووضع ملقط نظيفة، مقص، وإما بسكين المجهرية أو ملقط غرامة (للتشريح الأنسجة الدقيق) على السطح.
- إعداد محلول ملحي متوازن هانك (HBSS)، وأو تشريح، ومتوسطة النسر Dulbeco لتعديل و(DMEM) مع 10٪ surem بقري جنيني (FBS)، لالتنبيغ.
- يحضن مسبقا 20-30 مل DMEM / 10٪ FBS في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 1 ساعة. يجب أن خففت غطاء للسماح لتبادل الغاز ودرجة الحموضة موازنة وسائل الإعلام.
ملاحظة: حضن مسبق سائل الإعلام يمكن أن يكون مستعدا تماما قبل البدء في تشريح.
4. MGE خلية التحضير
- التضحية الماوس حاملا وفقا لبروتوكول الحيوانية المعتمدة وإزالة الأجنة في طبق بتري 10 سم تحتوي على الجليد الباردة HBSS.
- إزالة الدماغ من كل جنين باستخدام نطاق تشريح (القيام في وقت واحد، وترك بقية الأجنة في الجليد الباردة HBSS) ومن ثم المضي قدما لقطع الأنسجة MGE.
ملاحظة: مفصلة أدناه، وفي الشكل 1، هي الخطوات الرئيسية التي تبين كيفية إزالة MGE. وبالإضافة إلى ذلك، الشكل 2 هو فيلم يبين تشريح كاملالإجراء.- ضع الدماغ مع الجانب البطني مواجهة (أرقام 1A، A '). ملاحظة: كما أنها بخير لديك الجانب الظهري مواجهة. قطع المخ في نصف طول الطائرة saggital لتوليد قطعتين. ويرد مثال hemisected الدماغ (أرقام 1B، B ')، لاحظ أن الظهرية (القشرة الفوقية) والجوانب البطنية من غطاء الدماغ وتحيط الأنسجة البارزة العقدية (GE).
- وبعد ذلك، مع يد المهيمنة، الاستمرار على أي ملقط غرامة جدا أو stabknife (الجدول 2)، في حين شل حركة نصف الكرة مع ملقط التي عقدت من قبل جهة غير المهيمنة. (الجانب الأنسي ونصف الكرة الغربي يجب أن تواجه متابعة). تتكشف ظهري وبطني الأنسجة مع ملقط وسكين طعنة لكشف الكامنة GE الأنسجة (الشكل 1C بشكل تخطيطي في الشكل 1C).
ملاحظة: يمكن إزالة بعض وسائل الاعلام من الطبق تشريح بتري يجعل من الاسهل لتحقيق الاستقرار في الأنسجة أثناء بيrforming تشريح MGE. - إجراء تخفيضات على التوالي مع stabknife أو ملقط غرامة لفصل فريق الخبراء الاستشاري، إل جي والأنسجة الحاجز (انظر تخفيضات سبيل المثال الرمز بواسطة أحمر الخطوط المتقطعة، أرقام 1D و D '). هذه التخفيضات يمكن إجراؤها في أي أمر.
ملاحظة: تخيل MGE ك "مربع" أن يتم قطع من الأنسجة المحيطة بها. القيام بذلك يساعد على جعل بتكاثر تخفيضات مماثلة لكل تشريح، وبالتالي الحد من التقلبات في تشريح الأنسجة. - وأخيرا، وتحويل MGE على جانبها وتقليم قبالة الجزء السفلي (ما كان الجانب الوحشي للدماغ). هذا يزيل منطقة عباءة MGE (تجاهل في أرقام 1E و1E ') من بقية MGE. الجانب المتبقي من MGE يحتوي على منطقة البطين في المقام الأول وأجزاء منطقة subventricular من MGE، الذي يحتوي على ما يقرب من جميع الخلايا الاصلية MGE. المضي قدما في هذا النسيج.
- اعتبار هام: إضافة هلام السيليكون إلى الجزء السفلي من كاليفورنيا طبق بترين تكون بمثابة سطح تشريح ممتازة كما أنه يحمي نصائح الحساسة من الملقط ويوفر سطح ناعم لتعلق الأنسجة بالملقط.
4.3 استراتيجيات إضافية لMGE تشريح.
- قطع الجلد للجنين باستخدام ملقط مثل المقص لإزالة بسرعة الدماغ. كما يضع الجنين على جانبها، وعقد الأنسجة في قاعدة الرأس مع ملقط يستخدم لترسيخ الأنسجة. أولا، وقطع الأمامي بطني إلى الدماغ وبطني الخلفي للدماغ، ومن ثم ربط تخفيضات اثنين على طول الجانب من الجنين. ثم الاستيلاء على رفرف من الجلد وتسحبه فوق الجزء العلوي من الدماغ. ويمكن بعد ذلك أن الدماغ تشريح بسرعة بعيدا عن الأنسجة المتبقية.
- بدلا من ذلك، ترسيخ الجانب الخلفي من الدماغ كله وراء القشرة. وفي الوقت نفسه، فهم كل نصف الكرة على الجانب الذيلية الأكثر الظهري من القشرة وتمزق القشرة بعيدا عن الأنسجة الراسية في اتجاه الأمامي. وبهذه الطريقة، سواء جortices يمكن إزالتها، وكشف عن الفضيلة العقدية الثنائية، لا تزال تعلق على بقية الأنسجة الحفاظ على التشريح وسطي الأطراف.
- التبديل إلى سكين طعنة لجعل تخفيضات دقيقة حول MGE على كل نصف الكرة الغربي. استخدام أي مجموعة نظيفة منفصل من ملقط لجمع MGE أو ماصة مع طرف كبير (أي.، P1000).
ملاحظة: الحفاظ على الأنسجة التي تم جمعها بعيدا عن كل مادة تشريح أخرى، كما يتم نقل بعض وسائل الاعلام حتما عندما يتم جمع MGE. - جمع MGE ووضع الأنسجة إلى 1.5 مل جمع أنبوب يحتوي DMEM / 10٪ FBS، (وبلغ حجم التداول 500 ميكرولتر كافية لجمع MGEs). تكرار لنصف الكرة الأرضية ومكان أخرى في نفس أنبوب جمع. الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى يتم جمع جميع الأنسجة.
5. وضع العلامات Lentiviral وزرع
- نقل أنابيب من أنسجة MGE إلى BSL2 شهادة غطاء محرك السيارة وإزالة وسائل الإعلام.
ملاحظة:الأنسجة MGE كبيرة بما يكفي لتكون واضحة للعين، وسوف تستقر في قاع الأنبوب السماح لوسائل الإعلام الباردة لإزالتها بسهولة وبلطف. - إضافة ~ 500 من المجاهدين وسائل الاعلام DMEM / 10٪ FBS، التي كانت preincubated في ثقافة حاضنة 37 درجة مئوية الأنسجة. المقبل، إضافة polybrene لتسهيل التنبيغ إلى كل أنبوب بتركيز نهائي من 8 ميكروغرام / مل. يسحن الأنسجة MGE لإنشاء تعليق خلية واحدة، وذلك باستخدام طرف P1000 ماصة. وأخيرا، إضافة ~ 15-20 ميكرولتر من الفيروسة البطيئة المركزة إلى كل أنبوب.
- الاعتبارات المهمة: A سحن من 10-12 مرة كافية لتفتيت الأنسجة MGE من جنين واحد، ولكن قد تكون هناك حاجة أكثر triturations إذا يتم تجميع MGEs متعددة معا. جرب الظروف سحن مختلفة لتحديد أفضل ما يمكن عمله.
- آمن إغلاق كل أنبوب، عكس لخلط، من مكان جميع الأنابيب في الحاضنة 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا في الفيروسة البطيئة لمدة 30 دقيقة على الأقل، وتصل إلى 1 ساعة. أسفرت مرات أطول في ديبقاء الخلية مجعدة. عكس أنابيب كل 10 دقيقة حتى يحين الوقت.
- بعد الحضانة مع الفيروسة البطيئة، وإزالة أنابيب من الحاضنة وأجهزة الطرد المركزي في ~ 700 x ج لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه. في غطاء محرك السيارة BSL2، وإزالة طاف وتجاهل في التبييض 10٪. المقبل، إضافة 1 مل DMEM / 10٪ FBS ويسحن بيليه 2-3 مرات أن يغسل، ثم الطرد المركزي مرة أخرى في نفس السرعة لخلايا بيليه. كرر هذه الخطوة يغسل 2-3 مرات أكثر لإزالة فيروس الزائد.
ملاحظة: إجراء الخطوات الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، ومع ذلك، لم وحظ انخفاض الجدوى عندما يتم تنفيذ يدور قصيرة في RT. - بعد غسل النهائي، وإزالة وسائل الإعلام قدر الإمكان ووضع كل أنبوب على الجليد. بسبب وسائل الاعلام المتبقية على جانبي الأنبوب، ~ 2-3 ميكرولتر من وسائل الاعلام في نهاية المطاف تغطي الخلية بيليه في الوقت الذي بدأت إجراء الزرع.
6. زرع والتحقق من صحة
- الحصول على المضيف الجراء P1 وإعداد الإجراءمنطقة عن طريق الرش أسفل مع الايثانول 70٪. للحفاظ على عقم أثناء إجراء فمن المستحسن أن تنفيذ هذه الإجراءات في غرفة الإجراء نظيفة مخصصة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم إحدى الأدوات الجراحية تعقيمها تعقيم الأسطح التي الجراء ستكون على اتصال مع استخدام 70٪ من الإيثانول. ويرد مثال المعدات اللازمة لأداء تمثيلية للزرع ومنطقة الإجراء ممثل في الشكل 3.
ملاحظة: في حين أن هذا الإجراء هو حقن كميات صغيرة، وليس إجراء العمليات الجراحية التي تتطلب شق، جرح مفتوح أو الغرز، لا يزال المستحسن أن يتم استخدام ممص مكروى جديد لكل الماوس ليتم حقنه. على بال micropipettes هي حرارة تعقيم عندما سحبت ومشطوف على سطح الذي تم رش مع 70٪ من الإيثانول يجري تخزينها في حاوية مغلقة.
- توليد بال micropipettes أن يكون قطره في طرف بين 40-80 ميكرومتر. سوف يلي هذه الأبعاد تسفر الأمثلالنتائج. الحرارة تعقيم بال micropipettes عندما سحبت ومشطوف على سطح ورذاذ مع الايثانول 70٪ قبل تخزين بال micropipettes في حاوية مغلقة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، إذا الوصول إلى الأجهزة اللازمة لإنشاء هذه الإبر (الجدول 2) يحد من استخدام أي جهاز حقن الآخرين. ومع ذلك، هذه قد لا تكون مناسبة كذلك بال micropipettes بسبب أقطار مختلفة. - وضع الزيوت المعدنية في حقنة 1 مل، مع وجود إبرة G 30 1/2، وملء ماصة الزجاج تماما مع الزيوت المعدنية. وبعد ذلك، جبل الغطاس على الجهاز التجسيمي، ثم إرفاق ماصة الزجاج إلى الجهاز التجسيمي وتحميل على المكبس. باستخدام محرك هيدروليكي، حرك المكبس في منتصف المسافة تقريبا في ماصة الزجاج، وإزالة الزيوت المعدنية التي تسرب بها مع نظيفة منشفة ورقية نظيفة.
- بدلا من ذلك باستخدام حقنة، غمر نهاية الجزء الخلفي من ماصة في الزيوت المعدنية ويشغلها عمل شعري. لمنع فقاعات الهواء في pipettه، والحفاظ على ضغط إيجابي على حقنة حتى تماما من ماصة الزجاج.
ملاحظة: أجهزة أخرى يمكن استخدامها لزرع خلايا MGE 14 بنجاح. أي الجهاز الذي يمكن أن يحقق حجم أقل من أو بالقرب منها 100 أعمال نيكولا لانغ جيدا لهذا الإجراء.
- بدلا من ذلك باستخدام حقنة، غمر نهاية الجزء الخلفي من ماصة في الزيوت المعدنية ويشغلها عمل شعري. لمنع فقاعات الهواء في pipettه، والحفاظ على ضغط إيجابي على حقنة حتى تماما من ماصة الزجاج.
- المقبل، واستخدام منشفة ورقية معقمة، أو أي مواد ماصة، مع زاوية الملتوية الى نقطة غرامة لإزالة بدقة وسائل الإعلام الزائد فوق الخلية بيليه MGE. هذه الخطوة تركز كثافة الخلية بحيث لا يمكن أن يتحقق من حجم الضخ أصغر. المقبل، واستخدام حجم منخفض (ويفضل P2) ماصة لرسم ببطء بيليه الخلية ويسحن 1-2 مرات قبل أن ينتقل تعليق الخلية على سطح مسعور. يجب أن يكون حجم أقل بقليل من 1 ميكرولتر. تحريك رأس الإبرة في تعليق خلية وباستخدام محرك هيدروليكي، ووضع تعليق خلية في ماصة.
- تخدير الجرو P1 عبر انخفاض حرارة الجسم (لف في القفازات المطاطية ووضع على الجليد ل~ 2-4 دقيقة).تحقق من فعالية التخدير مع التحفيز الضارة. قرصة الجلد بين أصابع القدم مع ملقط غرامة: يجب أن يكون الجرو لا تستجيب إذا مقروص. وبعد ذلك، وضع الجرو على قالب هذا هو تحت جهاز حقن، ثم جعل الجلد مشدود قبل الانسحاب الجلد على الرأس وتأمين مع الشريط المختبر القياسية.
ملاحظة: على الرغم من انخفاض حرارة الجسم هي فعالة جدا على الفئران حديثي الولادة والنتائج في معدل وفيات منخفض، ويجب أن يتم الإجراءات بسرعة، وسوف تبدأ الجراء لاسترداد في أقل من 10 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، 4 دقيقة على الجليد هو الحد الأعلى لما يمكن السكوت عليها. محاولة للحث على انخفاض حرارة الجسم مرة واحدة فقط إذا كنت بحاجة لوقت أطول لحقن. ومع ذلك، إذا كان الجرو يتعافى في وقت مبكر، والسماح لأول مرة الجرو حتى يتعافى تماما قبل إحداث انخفاض حرارة الجسم مرة أخرى. وعلاوة على ذلك، حث انخفاض حرارة الجسم واحد فقط مزيدا من الوقت لإجراء الحقن. والجراء على التعافي في غضون 5-10 دقيقة من انخفاض حرارة الجسم. وهذا يمكن أن يتيسر من خلال وضع الجراء مع القمامة وأمي أو عن طريق وضع الجرو على السطحية الدافئةالبريد لاسترداد. - باستخدام جهاز التجسيمي، ضع غيض من ماصة الزجاج على السطح على رأس الجرو، وعمودي على سطح الرأس. عندما ماصة على اتصال مع الرأس، واعتبار ذلك "0". وبعد ذلك، دفع ماصة من خلال سطح الجلد والجمجمة في القشرة، ثم أدخل وسحب ماصة ~ 2 مرات قبل التوقف. لأفضل استهداف الخلايا في القشرة المخية الحديثة، يتم تنفيذ الحقن عندما ممص مكروى هو على عمق 0.1 مم. ومع ذلك، وهذا ينبغي أن يكون الأمثل من قبل المستخدم (انظر الملاحظة أدناه).
ملاحظة: على الرغم من هذا العمق يستهدف موثوق طبقات أعمق القشرة المخية الحديثة مع الأجهزة المذكورة أعلاه، وعدد قليل أعماق ينبغي اختبار تحديد تجريبيا. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي اختبار مجموعة من أعماق في rostro-الذيلية وميديو الاطراف موقفا مختلفا لتحديد ما هي العمق هو الأمثل في كل موقع. أيضا، يجب أن يكون ثقب الأولي السريع، والاختراق بطيئة في القشرة المخية الحديثة يقلل من القدرة على جleanly اختراق الأنسجة. حاول بسرعة مختلفة عندما بدأت لأول مرة هذا الإجراء للعثور على ما يعمل بشكل أفضل. وبالإضافة إلى ذلك، لإحداثيات الاختبار، وليس هناك بديل حقيقي لاستخدام الخلايا المسمى، كما كانت الأصباغ لا يمكن الاعتماد عليها للدلالة على الموقف. - وبمجرد أن الإبرة في الموقف، وتناوب الجهاز الهيدروليكي لدفع المكبس في ماصة الزجاج، ودفع حجم مجموعة من تعليق خلية في القشرة. حقن 50-70 NLS في الموقع. كرر هذا الإجراء في 3-6 مواقع مختلفة على مستويات مختلفة منقاري الذيلية إذا كان الهدف هو الحصول على توزيع واسعة من الخلايا في جميع أنحاء القشرة المخية الحديثة.
ملاحظة: وحدات التخزين من 100 NL أو أكبر يمكن أن تسبب آفات وتؤدي إلى كتل كبيرة من حقن الخلايا التي لا تهاجر بكفاءة من موقع الحقن. وهكذا، وأحجام حقن أصغر (~ 70 NL أو أقل) هي الأمثل، على المزيد من المواقع إذا سمح الوقت. - عند اكتمال الحقن، وإزالة الجرو من مرحلة ووضع علامة عليه (اصبع القدم لقطة هو وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد صيو بي إس في وقت لاحق). مرة واحدة تعافى الجرو وغير قادرة على التحرك من تلقاء نفسها (يحدث هذا في غضون دقائق من حرمانهم من المرحلة)، ووضعها مرة أخرى مع أمي والقمامة.
ملاحظة: بما أن هذا هو الإجراء مينيملي لا توجد إجراءات ما بعد الجراحة مرة واحدة الجرو تتحرك بحرية والدفء. ومع ذلك، يجب فحص الجراء ليس فقط بعد إجراء العملية ولكن أيضا في اليوم التالي للتأكد من لديهم أي علامات على تدهور الحالة الصحية. - قبل البدء في الإجراء على الجرو المقبل، رش أسفل المنطقة مع الايثانول 70٪ للحفاظ على منطقة عمل معقمة. السماح للالجراء حقن لتطوير وثم تقييم الأنسجة في هذه المرحلة التنموية المناسبة (ق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
منذ خلايا MGE لديها قدرة فريدة على الهجرة والاندماج عندما زرعها في القشرة المخية الحديثة المضيف 16، لأنها توفر نظام نموذجا ممتازا للتلاعب الجيني قبل الدراسات في الجسم الحي. هنا، وتبين لنا كيف يمكن للمرء أن عزل الأنسجة MGE من أجنة E13.5 (الشكلان 1 و 2)، والتي يمكن بعد ذلك transduced مع lentiviruses سواء في المختبر أو بطريقة سريعة قبل الزرع للدراسات في الجسم الحي. وقد أجريت وضع العلامات MGE عبر lentiviruses قبل استخدام محسن القيادة GFP في الخلايا العصبية GABAergic 15. ومع ذلك، فإن القدرة على التعبير عن الجينات في مجموعات فرعية محددة من السكان غير متجانسة قبل الزرع قد تساعد كثيرا من الدراسات تشتت هذه الخلايا والتكامل. هنا، سعينا إلى تطوير وسيلة لاستهداف التعبير عن بروتين فلوري لمجموعة فرعية عصبون محددة، وتلك التي تعبر عن السوماتوستاتين (SST) +.
نحن الفرنسيسكانRST subcloned مراسل المتاحة تجاريا لجنة المساواة العرقية التي تعتمد GFP (ناقل المعلومات، الجدول 2) في العمود الفقري lentiviral. تم إنشاؤها متجه من استنساخ فرعي أولا الكاسيت التي تحتوي على GFP يحيط بها مواقع loxP من ناقلات AAV وligating قبل أن تتحول إلى lentiviral ناقلات العمود الفقري باستخدام 15 XbaI وPflMI مواقع التقييد، (هذا كاسيت يتضمن فقط بعض من المروج CAG). وبعد ذلك، تم رفعه الباقي من المروج CAG من pCAGGs الثدييات ناقلات التعبير مع مواقع SpeI وXbaI وو ligated إلى الموقع XbaI من ناقلات lentiviral لتوليد pLenti-CAG-فليكس GFP. 5 'الموقع SpeI من إدراج مجاني للXbaI وبالتالي تدمير 5' الموقع، بينما تم حفظها الموقع 3 'XbaI. تم اختبار ناقلات الناتجة (مخطط الشكل 4A، ناقلات تسلسل الجدول 1) أولا في المختبر في وجود أو عدم وجود لجنة المساواة العرقية (مخطط في المختبر فحص، الشكل 4B). MGE وكانت الخلايا العصبية الأولية من Ai14 Flox / + E13.5 أجنة مثقف وtransduced مع مزيج من lentiviruses. لوحظ عدد قليل من أي GFP + أو tdTomato + الخلايا مع فقط تنبيغ من CAG-فليكس GFP الفيروسة البطيئة (أرقام 4C، 4F و4I). كان TdTomato مضان موجودة في خلايا MGE transduced مع الفيروسة البطيئة CMV-لجنة المساواة العرقية، يدل على لجنة المساواة العرقية التعبير (أرقام 4D، 4G و4J). وأخيرا، أدى التعاون تنبيغ الخلايا MGE في العديد من tdTomato + الخلايا التي أعربت أيضا عن GFP، مشيرا إلى أن CAG-فليكس GFP الفيروسة البطيئة كان يعمل كما هو متوقع (أرقام 4E، 4H و4K). وقد لوحظت بعض الخلايا GFP + النادرة التي لم تكن tdTomato +، يحتمل أن تكون نتيجة لمراسل transduced دمج بجوار المروج قوي، والتي تمثل <2٪ من جميع GFP + الخلايا.
المحتوى "> خلايا MGE زرعها في نوع البرية القشرة المخية الحديثة المضيف تفريق، ناضجة والاندماج في القشرة المخية الحديثة المضيف 16 E13.5 SST-IRES-لجنة المساواة العرقية +؛ Ai14 Flox / + MGE خلايا تم زرعها في neocortices WT في P1 (المخطط الشكل 5A) وتوزيعها درست في 7 و 35 يوما زرع آخر (DPT). وفي كلا الأعمار، يمكن أن ينظر tdTomato + الخلايا في جميع أنحاء القشرة المخية الحديثة (الأرقام 5B و5C). الصور في أرقام 5B و5C هي زرع التمثيلية الاستفادة من MGE . خلايا من جنين واحد لاختبار مدى كفاءة خلايا MGE يمكن أن يكون المسمى مع بروتوكول الموصوفة هنا، وخلايا MGE من SST-IRES-لجنة المساواة العرقية +؛ وtransduced Ai14 Flox / + الأجنة مع الفيروسة البطيئة CAG-فليكس GFP وزرعها في بنفس الطريقة. وبالنسبة لهذه التجارب، ~ 15 ماي من بغية دراسته واقرارهالفيروسة البطيئة ntrated (~ 1X10 7 وحدات المعدية / مل) وتستخدم مع MGEs مجتمعة من جنين واحد لكل زرع. الخلايا ثم تم زرعها فى المضيف القشرة P1 WT وتحليلها في 7 DPT (أرقام 5D-5F). للخلايا المزروعة (tdTomato +)، كانت حوالي 20٪ GFP +، مشيرا إلى التنبيغ مع CAG-فليكس GFP الفيروسة البطيئة (الشكل 5G). وتشير هذه البيانات إلى أن مع كمية وعيار من الفيروسة البطيئة المذكورة أعلاه، ~ 20٪ من خلايا MGE المزروعة يمكن أن توصف. كمية الفيروس يمكن أن تكون إما انخفض أو ارتفع، أو متغيرات محتملة أخرى مثل مدة حضانة الفيروس يمكن تغيير، لتحقيق وضع العلامات خلية تناثرا أو أكثر كثافة.يمكن استخدام الأنسجة MGE من خط مراسل الماوس لجنة المساواة العرقية التي تعتمد بالتزامن مع الفيروسة البطيئة CAG-فليكس GFP لحد من عدد من علامات الإضافية التي يمكن بحثها عليها المناعي. ولذلك، SST-IRES-لجنة المساواة العرقية + < / sup> في الأنسجة E13.5 MGE تم جمعها وtransduced مع CAG فليكس GFP الفيروسة البطيئة من أجل رؤية تلك الخلايا المزروعة MGE التي أعربت عن لجنة المساواة العرقية (سيكون GFP +). وقد تم زرع هذه الخلايا في P1 WT القشرة وتقييمها في 35 DPT (انظر التصميم التجريبي، الشكل 6A)، نقطة زمنية عندما يتم التعبير عن علامات عصبون ناضجة. في 35 DPT، ~ 85٪ من الخلايا GFP + شارك أعرب-SST، ولكن أعرب فقط ~ 4٪ PV (أرقام 6B-6H). هذه الأرقام تتفق مع تحليل النسب من خط الماوس SST-IRES-لجنة المساواة العرقية، والتي أيضا مصير يعين ~ 5-10٪ من PV + 9 خلايا (فوغت وروبنشتاين، ونتائج غير منشورة). وتشير هذه البيانات إلى أن وضع العلامات الفيروسي من MGE فعال ويمكن أن يكون هذا النهج ينطبق على إدخال مراسل أو يحتمل أن الجين من الفائدة قبل في الجسم الحي التحليل.
740fig1.jpg "/>
الشكل 1. إجراء تمثيلية للتشريح E13.5 MGE الأنسجة. مثال تشريح الأنسجة MGE إما الثقافات الأولية أو زرع. (AE) صور تشريح الدماغ E13.5، والخطط لتسليط الضوء على الهياكل (A'-E ') والخطوات الهامة في هذا الإجراء. (A، A ') الممثل E13.5 الدماغ نظر من الجانب البطني. خط أحمر يدل على أول خفض المبذولة والتي سوف hemisect الدماغ إلى قطعتين. (B، B ') مشاهدة واحد تنصيف الدماغ. الجانب الأنسي مرئيا، مع الجانب الوحشي أسفل. الأنسجة من القشرة الظهرية (اللون الأزرق) يعتلي على الفضيلة العقدية. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر الأنسجة البطنية التي سيتم إزالتها في البرتقال. (C، C ') عرض والتوضيح من الفضيلة العقدية يتعرض بعد المغطي الأنسجة تم مقشر بعيدا. (D، D') نفس وجهة النظر عقدي يتعرض EMI nences كما في (C، C ') ولكن مع مواقع قطع مفصلة كما هو موضح الحمراء الخطوط المتقطعة. بعد قطع MGE وفقا لخطوط تدل في (D، D ')، يتم تشغيل الأنسجة على جانبها (E، E')، وقلص الجانب الوحشي قبالة والتخلص منها. خطوات تمثيلية في تشريح والعزلة من الأنسجة MGE. المختصرات: (CGE) البارزة العقدية الذيلية، (إل جي) البارزة العقدية الجانبية، (MGE) وسطي ganglionice سماحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الفيلم يظهر على تشريح E13.5 MGE. الفيلم يصور إزالة من الدماغ E13.5 تليها لاحقا تتكشف وإزالة الأنسجة الفوقية. هو المسمى MGE والتخفيضات التي أجريت لإزالة الأنسجة المحيطة بها وتظهر في ترتيب متدرج.. MGEdissect movie.mov "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
الشكل 3. منطقة التمثيلية الداخلي ومثال على إبرة الحقن لزرع الولدان. (A، A ') الصور تظهر الإعداد سبيل المثال لإجراء عمليات زرع في الفئران حديثي الولادة. المجهر (1) يتم وضع فوق مرحلة تحتوي على العفن التي يمكن أن تعقد ماوس حديثي الولادة (5) وجهاز التجسيمي (2). (A ') صورة مكبرة ل(A) تظهر المنطقة من الجهاز التجسيمي الذي يحمل إبرة الحقن الزجاج (6) مع الغطاس إدراج (7). يتم التحكم المكبس من قبل محرك هيدروليكي غرامة (4) ويتحرك الزيوت المعدنية داخل إبرة الزجاج الذي يتوسط الداخل والخارج تتدفق من الإبرة. (ب) مثال من إبرة حقن الزجاج مع تلميح مشطوف. للحاكم في (B)، كل ترسيم كبير = 100 ميكرون. (C) قائمة جرد من البنود الواردة في (A، A '). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. في المختبر اختبارات تثبت التعبير عن GFP من الفيروسة البطيئة CAG-فليكس GFP في وجود لجنة المساواة العرقية. (A) مخطط لكيفية عمل lentiviral CAG-فليكس GFP ناقلات الأمراض في وجود لجنة المساواة العرقية. (ب) مخطط من MGE تجربة زراعة الخلايا الأولية لتقييم إذا كان lentiviral CAG-فليكس GFP أن التعبير عن GFP في تلك الخلايا مع لجنة المساواة العرقية التعبير. لفترة وجيزة، وخلايا MGE من مراسل لجنة المساواة العرقية التي تعتمد، Ai14 (عن tdTomato في وجود الكرومه)، كانت تزرع في المختبر، وtransduced مع لجنة المساواة العرقية و / أو فليكس GFP lentiviruses. (CK) صور مناعي الثقافات الأولية E13.5 MGE التي تم transduced مع CMV-لجنة المساواة العرقية، CAG-فليكس GFP أو كليهما. تم تصوير الثقافات للتعبير tdTomato الأصلي، GFP ودابي. شريط النطاق في (K) = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. صور الممثل من زرع وtransduced، SST-IRES-لجنة المساواة العرقية +. Ai14 Flox / + MGE الخلايا. (A) مخطط التصميم التجريبي لزرع خلايا إما MGE وحدها أو بعد lentiviral التنبيغ إلى نوع البرية (WT) المضيف، (DPT) يوما زرع ما بعد. لفترة وجيزة، E13.5 SST-IRES-لجنة المساواة العرقية +؛ Ai14 Flox / + MGE خلايا إما تم زرعها أو transduced مع الفيروسة البطيئة CAG-فليكس GFP قبل الزرع في neocortices WT وتقييمها في 7 DPT (B، C) وصور مناعي لل neocortices في 7 أو 35 DPT تظهر خلايا MGE زرع التمثيلية (tdTomato +). (DF) صور مناعي خلايا MGE transduced مع الفيروسة البطيئة CAG-فليكس GFP تقييمها في 7 DPT. (G) الكمي لنسبة tdTomato + الخلايا التي التعبير عن GFP في 7 DPT. الحانات النطاق في (C) و (F) = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
2740fig6.jpg "/>
حصاد خلية الشكل 6. صور الممثل CAG-فليكس GFP الفيروسة البطيئة transduced، SST-IRES-لجنة المساواة العرقية + MGE الزرع التي تشارك في التعبير عن عصبون علامات فرعية المستمدة MGE. (A) مخطط من E13.5 SST-IRES-لجنة المساواة العرقية + MGE والتنبيغ مع الفيروسة البطيئة CAG-فليكس GFP وزرع في القشرة المخية الحديثة الجنود P1 WT قبل تقييم في 35 DPT. صور تمثيلية من القشرة المخية الحديثة الجنود المزروع تظهر التعبير عن GFP، من متجه فليكس (B، E)، وشارك الملون وإما السوماتوستاتين (SST) (C) أو parvalbumin (PV) (F). (D، G) مدموجة الصور مع دابي الملطخة المشترك. (H) الكمي لنسبة الخلايا GFP أن تشارك في التعبير عن طائرة أسرع من الصوت أو PV. تمثل البيانات ± SEM، (ن) = شريط 3. مقياس في (G) = 100 ميكرون./52740fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. ملف FASTA من متجه pLentiviral-CAG-فليكس GFP DNA.
| الكواشف والمعدات اللازمة لإعداد خلية MGE والتنبيغ | كتالوج # | شركة | ||||||
| 1) | Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، مع ارتفاع نسبة الجلوكوز | 12491-015 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 2) | الحرارة المعطل مصل بقري جنيني | 10437-077 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 3) | هانكس محلول ملحي متوازن (HBSS)، لا الكالسيوم أو المغنسيوم | 14170-112 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 4) | 1.5 مل أنابيب microcentrifuge (أو غيرهاأنابيب جمع مع الأغطية) | 3810X | إيبندورف الدولية | |||||
| 5) | Polybrene | SC-134220 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | |||||
| 6) | سكين طعنة مباشرة 22.5 درجة (اختياري) | REF 72-2201 | التخصصات الجراحية شركة | |||||
| 7) | طبق بتري (10 سم)، لتشريح الأنسجة | FB0875713 | فيشر العلمية | |||||
| 8) | 2 ملقط غيض غرامة، مثل دومون # 5 | 11254-20 | أدوات العلمية الجميلة | |||||
| 9) | 37 ° C زراعة الأنسجة حاضنة مع 5٪ CO 2 المدخلات | C150 | غلاف | |||||
| 10) | منضدية أجهزة الطرد المركزي التي يمكن أن تدور 1.5 مل أنابيب microcentrifuge | |||||||
| 11) | أي ماصة P1000 التي يمكن استخدامها لسحن خلية | |||||||
| 12) | مستوى السلامة الحيوية 2 غطاء محرك السيارة | |||||||
| الكواشف والمعدات اللازمة لفي المختبر MGE الثقافات الأولية | كتالوج # | شركة | ||||||
| 1) | مختبر TekII chamberslides مع غطاء، 8 جيدا | 154941 | الحرارية فيشر | |||||
| 2) | بولي-L-يسين الوزن 0.1٪ / حجم | P8920 | سيغما الدريتش | |||||
| 3) | الماوس Laminin، 0.5-2 ملغ / مل | 23017-015 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 4) | Neurobasal المتوسطة | 21103-049 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 5) | B27 المصل ملحق مجانا | 17504044 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 6) | Glutamax، والأوراق المالية 100X | 35050-061 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 7) | البنسلين، الستربتوميسين، والأوراق المالية 100X | 15070-063 | تكنولوجيا الحياة | |||||
| 8) | الجلوكوز، (إعداد محلول 25٪ في الماء) | G5400 | سيغما الدريتش | |||||
| الكواشف والمعدات اللازمة لزرع الخلايا MGE | كتالوج # | شركة | ||||||
| 1) | 1 مل حقنة | REF 309602 | BD، بيكتون ديكنسون وشركة | |||||
| 2) | 30 1/2 G إبرة | 305106 | BD، بيكتون ديكنسون وشركة | |||||
| 3) | قبلCISION تحمل لتسليم 5 ميكرولتر (يأتي مع المكبس) | 5-000-1005 | شركة دروموند العلمية | |||||
| 4) | بارافيلم | PM-999 | Polysciences، وشركة | |||||
| 5) ** | المجهر ستيريو مع boomstand | MZ6 | لايكا | |||||
| 6) ** | الرقمية لمجرد أداة الفئران التجسيمي | 51725D | شركة Stoelting | |||||
| 7) ** | النفط محور واحد مياداة مجهرية غرامة الهيدروليكي | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | الماس المصقول beveler دوارة | غ | المحرز في المنزل | |||||
| 9) | إبرة الماصةالشركة المصرية للاتصالات مجتذب | 730 | أدوات KOPF | |||||
| 10) | زيوت معدنية | غ | أي تخزين المخدرات أو الصيدلة | |||||
| 11) | أي ماصة والنصائح التي يمكن أن reliaby مقياس 1 ميكرولتر من حجم | |||||||
| ** هذه هي نماذج معينة نستخدمها، ولكن ينبغي أن العديد من الاجهزة الاخرى تعمل | ||||||||
| اختياريهالكواشف ل (لصنع Lentiviruses) | كتالوج # | شركة | ||||||
| 1) | 25 ملم، 0.45 ميكرون فلتر | 09-719B | فيشر العلمية | |||||
| 2) | أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح (25 × 89 مم) | 344058 | بيكمان Coulter® | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1.5 مل حجم) | 11668019 | إينفيتروجن | ||||
| غيرها من الإمدادات المتاحة تجاريا | كتالوج # | شركة | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE ترميز البلازميد هفوة / بول | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-القس ترميز البلازميد القس | 12253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G ترميز البلازميد VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-فليكس GFP | 28304 | Addgene | |||||
الجدول 2. قائمة جرد الكواشف والأدوات. جرد من الكواشف المتاحة تجاريا بما في ذلك وسائل الإعلام، وأدوات التشريح، والمعدات تمثيلية للزرع وDNA ناقلات. (غير متوفر) غير متوفر أو قابلا للتطبيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام GABAergic السلائف عصبون القشرية من الفضيلة العقدية الجنينية (غيس) للعلاجات الخلايا استنادا تبدو واعدة للعديد من الحالات 12 -1 4. وهناك حاجة إلى تقنيات جزيئية دقيقة لتتبع، والتعبير عن جينات الفائدة في مجموعات فرعية عصبون محددة. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوصفها الخلايا الجنينية MGE مع lentiviruses قبل الزرع وإظهار كيف يمكن استخدام هذه التقنية للتعبير عن الجينات في المصالح في مجموعات فرعية محددة عصبون القشرية للتحليل في الجسم الحي.
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن استخدام موثوق، ولكن لاستنساخ الأمثل من الضروري التمسك بضع خطوات حاسمة. أولا، لتنبيغ الفيروسية لتكون فعالة، ودرجة الحرارة الفسيولوجية ودرجة الحموضة ضرورية. إذا تم استيفاء هذه المعايير، وخلايا MGE يمكن transduced في ~ 30 دقيقة. ثانيا، تأكد من أن يكون بيليه MGE كثيف قبل المتابعةللقيام الزرع. هذا أمر مهم لأن فقط حجم محدود ويمكن حقنها في مخ الفأر حديثي الولادة في كل موقع دون تكبد الضرر، والخلايا سوف تهاجر بعيدا عن موقع الحقن، وذلك كثافتها في وقت الزرع هو أقل من القلق مما قد يكون من المتوقع. وأخيرا، تشغيل بعض ظروف الاختبار مع الخلايا MGE التي تعبر عن مراسل الفلورسنت لتحديد ما هي حقن أعماق هي الأمثل. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم خلايا MGE، ويمكن أيضا أن تستخدم الخلايا فريق الخبراء الاستشاري بنفس الطريقة. عيب واحد هو أنه لا توجد العديد من خطوط جنة المساواة العرقية سائق أن تقييد حرية التعبير لفريق الخبراء الاستشاري كله أو إلى مجموعات فرعية معينة من interneurons فريق الخبراء الاستشاري مشتقة. ومع ذلك، فإن الببتيد المعوي الفعال في الأوعية (VIP) 9 هو خط لجنة المساواة العرقية موثوق التي يمكن أن تستخدم لفصل هذه المجموعة الفرعية من خلايا فريق الخبراء الاستشاري مشتقة. عندما تصبح خطوط جديدة المتاحة، وسوف يكون من الممكن استخدام هذا البروتوكول بمزيد من الدقة الوراثية.
سابقا، نحن وغيرنا وقد أظهرت الأداة المساعدة لإدخال الجينات إلى خلايا MGE قبل الزرع عبر Electroporation للأو مع الفيروسة البطيئة 15، 17. وبينما كانت هذه التقنيات الفعالة في إدخال جينات في الجسم الحي التحليل، والأنسجة MGE هي غير متجانسة ويثير مجموعات فرعية عصبون متعددة وكذلك الخلايا غير العصبية 4. وعلاوة على ذلك، فقد كان من الصعب للتعبير عن الجينات في المصالح فقط في مجموعة فرعية عصبون محددة. وقد بذلت خطوات كبيرة لتوليد خطوط المعدلة وراثيا أن ألخص أنماط التعبير من العديد من المجموعات الفرعية عصبون القشرية، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، SST-IRES-لجنة المساواة العرقية، PV-IRES-لجنة المساواة العرقية، PV-2A-لجنة المساواة العرقية ود VIP-لجنة المساواة العرقية 9 -11، وظهور خطوط جديدة سوف تساعد على توضيح السكان إضافي محتمل في المستقبل. وعلاوة على ذلك، مع جيل من الصحفيين لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على وناقلات التعبير، بما في ذلك ناقلات مراسل لجنة المساواة العرقية التي تعتمد المستخدمة هنا، لا يمكن أن يتحقق تعبير أكثر دقة من الجينات في المصالح.
معشوقة = "jove_content"> وفي حين حقن الفيروسات مراسل لجنة المساواة العرقية التي تعتمد في أدمغة الفئران معربا عن لجنة المساواة العرقية في الخلايا مقيد هو وسيلة قوية والفيروسات لا ينتشر بعيدا عن موقع الحقن. وهذا قد يؤدي إلى منطقة كثيفة من خلايا متداخلة مما يجعل من الصعب لدراسة الخلايا transduced بطريقة فردية أو بعيدا عن مواقع الحقن. في المقابل، خلايا MGE لديها قدرة فريدة على الهجرة بعيدا عن موقع الحقن، والسماح لتقييم أنظف من خصائص الخلايا الفردية. والعيب من حقن الخلايا في القشرة المخية الحديثة هو أنها لن تجتاز طرق الهجرة عرضية العادية. خيار واحد لاستكشاف الهجرة عرضية باستخدام هذا الاختبار هو إعداد الخلايا بنفس الطريقة ولكن ضخها إلى MGE العمر المتطابقة من الجنين المضيف WT بدلا من الجرو حديثي الولادة. في هذه التجربة، فإن الخلايا المزروعة الخضوع لطرق عرضية العادية. من خلال الجمع بين زرع MGE مع تقييد مكانيا، لجنة المساواة العرقية التي تعتمد علىالتعبير عن مراسل، وتبين لنا جدوى للتعبير عن الجينات في المصالح أو مراسل ضمن مجموعة فرعية معينة من الخلايا التي هي في حد ذاتها مناسبة تماما للدراسات المورفولوجية.
واحد الحد إلى هذا الأسلوب قد يكون حجم الجزء الذي يمكن للمرء أن حزمة موثوق في ناقلات lentiviral. وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم حتى الآن اختبار هذا النهج مع AAVs. ومع ذلك، مرة واحدة هو الأمثل هذه التقنية من قبل فرد، ويمكن استخدام العديد من الاختلافات من هذا النهج. أولا، وصف نهج هنا سوف تسمح للباحثين للتعبير عن صحفيين باستخدام مراسل الفيروسة البطيئة لجنة المساواة العرقية التي تعتمد بالتزامن مع الخلايا المانحة MGE خطوط جنة المساواة العرقية سائق محددة. هذه التقنية يمكن أن تستخدم لتقييم مورفولوجيا الخلايا MGE الفردية أو يحتمل أن تكون للتعبير عن الجينات في المصالح في مجموعات فرعية مختلفة إذا تم استنساخ الجين الثاني في ناقلات. ثانيا، قد يكون من الممكن أيضا استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية، معربا عن مع لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على خلايا مراسل MGE المانحة أو امكانيهالاستفادة LLY المتطورة العناصر DNA يحفظ والمروجين ومحسنات، لدفع التعبير في السكان متميزة من خلايا من السكان غير متجانسة.
وهناك عقبة المستقبلية للتغلب سيتم وضع العلامات الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة البشرية أو الخلايا الجذعية الجنينية إلى يحتمل تنقية و / أو دراسة مجموعة معينة من الخلايا. ومن المثير للاهتمام، يمكن أن تستخدم أيضا القدرة على الحمض النووي المحفوظة في نظم التعبير الفيروسية لاستهداف الخلايا العصبية GABAergic في الثقافات الأولية، وبعد الحقن في القشرة، وقبل زرع الخلايا MGE 15 و 18 و 19. قد يكون معززات الإجابة على هذه العقبة، وسيكون من مصلحة كأدوات الجزيئية، كما هو مطلوب تقنيات جديدة لدراسة جدوى هذه الخلايا في العلاج. وبالفعل، فلسوف إلى القدرة على اكتشاف أن من المحتمل أن تسمية إما interneurons GABAergic 20 أو فرعية العصبية الأخرى، بما في ذلك الخلايا العصبية glutamatergic 21، جارية. باستخدام طريقة وضع العلامات الفيروسية هنا،قد يكون من الممكن لتنبيغ الخلايا الجذعية المستمدة البشرية المتباينة مع القدرة محددة الخلية من نوع لتسمية خلايا متميزة من الفائدة قبل زرع والتحليل في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة لJLRR من: التوحد يتحدث، نينا ايرلندا، مؤسسة الملاذات ويستون، NIMH R01 MH081880، وNIMH R37 MH049428. وأيد PRW من قبل زمالة من مجلس العلوم الوطني لتايوان. وأيد SFS التي كتبها F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
