Summary
GABAerge kortikalen Internvorläuferzellen zu verteilen, zu entwickeln und synaptisch in eine Wirtsrinde nach der Transplantation zu integrieren. Diese Zellen können leicht vor der Transplantation für in vivo-Studien mit gentechnisch veränderten GABAerge Vorläufer transduziert werden. Hier zeigen wir virale Markierungstechniken auf bestimmte Interngruppen mit bestehenden Linien und Cre Cre-abhängigen Reporter Ziel.
Abstract
GABAerge kortikale Inter, aus dem embryonalen medialen und kaudalen Ganglien Eminenzen (MGE und CGE) abgeleitet ist, sind funktionell und morphologisch vielfältig. Eingriffe in das Verständnis der Rolle der unterschiedlichen kortikalen Interngruppen hergestellt worden ist, aber es gibt immer noch viele Mechanismen ausgearbeitet werden, die zur Entwicklung und Reifung von verschiedenen Arten von GABAergen Zellen beitragen können. Darüber hinaus kann verändert GABAergen Signalisierung an Phänotypen von Autismus, Schizophrenie und Epilepsie beitragen. Spezifische Cre-Treiberleitungen begonnen, parzellieren die Funktionen einzigartige Interngruppen. Trotz der Fortschritte in Maus-Modellen, ist es oft schwierig, GABAergen kortikalen Intern Progenitoren effizient Studie mit molekularen Ansätzen in vivo. Eine wichtige Technik verwendet, um die Zelle autonom Programmierung dieser Zellen zu studieren, ist die Transplantation von MGE Zellen in Wirts Rinden. Diese transplantierten Zellen wandern ausführlich, zu differenzieren, einend funktional zu integrieren. Zusätzlich kann MGE Zellen effizient mit Lentivirus unmittelbar vor der Transplantation transduziert werden, so dass für eine Vielzahl von molekularen Ansätzen. Hier werden wir ausführlich ein Protokoll zu MGE-Zellen effizient zu transduzieren vor der Transplantation für die in vivo-Analyse, unter Verwendung verfügbarer Cre-Treiberleitungen und Cre-abhängigen Expressionsvektoren. Dieser Ansatz ist vorteilhaft, weil sie vereint präzise genetische Manipulation die Fähigkeit dieser Zellen nach einer Transplantation zu dispergieren, der eine größere Zelltyp-spezifische Auflösung in vivo.
Introduction
GABAerge kortikalen Interneuronen umfassen ~ 20-30% der Neuronen im Säuger-Neocortex, der Rest entsprechen, glutamatergen Neuronen Haupt exzitatorischen. Inter sind sehr unterschiedlich in elektrophysiologischen Eigenschaften, Axon und Dendriten Morphologie und synaptischen Ziel 1 und Ungleichgewichte in exzitatorischen / hemmende Ton werden die Hypothese aufgestellt, einige Phänotypen der neurologischen / neuropsychiatrische Störungen einschließlich Autismus, Schizophrenie und Epilepsie 2 zugrunde liegen. Das Gesamtziel des hierin beschriebenen Protokolls ist es, eine Einrichtung zu GABAergen kortikalen Intern Progenitoren vor der Transplantation in vivo Analysen effizienter genetisch zu verändern ist.
Kortikale GABAergen Interneuronen sind in den medialen und kaudalen Ganglien Eminenzen (MGE und CGE, beziehungsweise) 3,4 sowie die präoptischen Bereich 5 geboren. Kortikale Intern Vorfahren unterziehen Fern tangentiale Migration gefolgtdurch radiale Migration ihrer endgültigen Ziele zu erreichen. Nach der Ankunft am Zielort, müssen diese kortikale Inter richtig in die bestehende neuronale Netzwerk zu integrieren, und jedes einzelne Interngruppe wird auf kortikale Schaltkreise in spezifischer Weise bei. Vier Hauptgruppen können durch molekulare Marker unterscheiden: MGE-abgeleitete Somatostatin (SST) + und Parvalbumin (PV) + Untergruppen und CGE-abgeleitete vasoaktive intestinale Peptid (VIP) + und Reelin +, SST - 6 Untergruppen. Verschiedenen kortikalen Interngruppen werden über verschiedenen Zeiten während der Embryonalentwicklung im MGE und CGE 7, 8 getragen. Diese und andere kortikalen GABAergen Intern Marker wurden verwendet, um spezifische Cre-Treiberleitungen für viele dieser Untergruppen 9-11 zu erzeugen.
Die Transplantation von MGE Vorfahren hat als potenzielle zellbasierte Therapie zu Störungen, die durch Ungleichgewichte verursacht werden können, zu behandeln tauchtin Anregungs- / Hemmung 12-24. Diese therapeutische Nutzen kann zum Teil auf der einzigartigen Fähigkeit von MGE Vorfahren (zu zerstreuen, zu differenzieren und in eine Wirts Gehirn integriert) oder möglicherweise, weil viele Rand somatischen hemmende PV + Zellen aus dem MGE abgeleitet sein. MGE Zellen können auch schnell und effizient mit Lentiviren vor der Transplantation 15 transduziert, so dass Zellen, die in vitro genetisch modifiziert sind, um in vivo untersucht werden. Der Grund für die Entwicklung dieses Ansatzes war es, Hindernisse bei der Untersuchung GABAergen kortikalen Intern Entwicklung und Reifung zu überwinden. Insbesondere erlaubt MGE Transplantation Forscher die Entwicklung von mutierten Zellen in vivo zu untersuchen, wenn das mutierte Maus sonst haben starb in einem frühen Zeitpunkt. Weiterhin kann durch die Einführung von Genen von Interesse vor der Transplantation, die Auswirkungen spezifischer Gene auf einem mutierten Phänotyp könnte in einer eff beurteileniziente Weise.
Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll zu MGE Zellen mit Lentiviren vor der Transplantation zu transduzieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie diese Technik angepasst werden, um ein Gen von Interesse an bestimmten Interngruppen aus einer heterogenen Gruppe von kortikalen Intern Vorläufer zu exprimieren, mit einer Kombination von Cre-abhängige Expression Lentiviren und verfügbare Cre-Treibermauslinien. Außerdem führt dieses Protokoll Techniken und eine Plattform für Forscher auf genetisch GABAergen kortikalen Intern Vorstufen zur in-vivo-Studien zu modifizieren in einer einzigartigen Weise. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber anderen aktuellen Ansätzen ist, dass die transplantierten Zellen MGE wird von der Injektionsstelle zu zerstreuen. Auch im Gegensatz zu Schwervirusinjektionen nach MGE Zellen verteilen ihre Morphologie ist leichter zu beurteilen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um den Effekt der Einführung von Genen von Interesse in Wildtyp- oder mutierte Zellen, die Einführung eines Zelltyp-spezifische studierenReporter Morphologie beurteilen, oder potentiell, um die Wirkung des Krankheits Allele in vivo zu studieren.
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Protocol
Ethics Statement: Die folgenden Verfahren wurden von unserer Institution und Tier Protokoll genehmigt. Achten Sie darauf, die Genehmigung für alle Verfahren, die das Überleben Operationen vor Beginn der Experimente erhalten und sicherzustellen, dass alle Protokolle sind auf dem neuesten Stand.
1. Lentivirus Vorbereitung (Optionaler Schritt)
- Aufgeteilt drei 10 cm-Platten von HEK293T Zellen für jede Lentivirus vorgenommen werden soll, in Gegenwart von 10 ml DMEM / 10% FBS, und wachsen auf ~ 60-70% Konfluenz. Wachsen Zellen in einem Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Transfizieren folgende DNA-Plasmide (10 ug gesamt) in jeder Platte mit jeder Transfektionsreagenz: 6,4 ug CAG-Flex-GFP lentiviralen Vektor (DNA-Vektorsequenz in Tabelle 1), 1,2 ug pMD2.G (kodiert für VSV-G), 1,2 ug pRSV-Rev und 1,2 ug pMDLg / pRRE. Die drei lentiviralen Verpackungsvektoren sind im Handel erhältlich (Tabelle
Hinweis: Dieser besondere Ansatz nutzt Generation lentivir 3.al-Vektoren, aber der 2. Generation Vektoren und die zugehörigen Plasmide wird auch funktionieren. - Bereiten Sie einen Abfallbehälter, der eine 10% Bleichmittel-Lösung in einem BSL2 zertifiziert Haube, alle Lösungen oder Geräte, die kontaktiert oder enthalten Lentivirus inaktivieren. Als nächstes vollständig nach der Transfektion in die Bleichlösung der Medien 4-6 h zu ersetzen mit dem gleichen Volumen der neuen Medien und damit die Zellen zu wachsen.
- Nach 4 Tagen gesammelt Medium in 50 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 1.000 × g für 15 min, um jede Zelltrümmer zu pelletieren. Als nächstes Den Überstand durch ein 0,45 um Membran. Jede niedrige Proteinbindungsfilter, wie PVDF, funktioniert gut. Achtung: Ort fester und flüssiger Abfälle in die virale Bleichlösung.
- Last 30 ml filtrierte Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen und in einer Ultrazentrifuge. Zentrifugieren bei 100.000 · g für 2,5 h bei 4 ° C. Öffnen Sie die Zentrifugenröhrchen in einem BSL2 Kapuze und Überstand zu entfernen, in 10% Bleichmittel. In ~ 100 ul PBS in die pellet, die Titer von 1x10 ^ 7-8 infektiösen Einheiten / ml ergibt. Aliquot am nächsten Tag und bei -80 ° C. Lentivirus Aliquots bei -80 ° C für mindestens sechs Monate stabil.
- Wichtiger Aspekt: Viele Institutionen haben jetzt Viruskerne. Erwerben Sie konzentrierte Virus mit einer minimalen Titer von 1x10 7 infektiöse Einheiten / ml, für optimale Ergebnisse.
2. Spender Mäuse für MGE Dissection
- Erstens, die Einrichtung eines zeitlich Paarung zwischen einem Cre-exprimierenden Linie von Interesse und entweder ein Wildtyp (WT) Maus oder einer Maus, die ein Reporter nach Cre-vermittelte Rekombination äußern wird.
Hinweis: Viele Cre-Treiberleitungen sind Transgenen und eingehalten werden und in der hemizygot Zustand gezüchtet. Daher wird nur die Hälfte der Embryonen des Cre-Transgen enthalten. DNA kann schnell aus den Embryos für eine kurze PCR, um die Cre-Allel erkennen, hergestellt werden. Die Cre + Embryonen können dann geerntet, so daß nur die MGE Gewebe des gewünschten Genotyps verwendet wird. Alternatively kann eine Cre-abhängigen Reporter verwendet werden, um die Embryonen für MGE Dissektion und Transplantation zu wählen. - Berechnen Sie, welcher Tag um E13.5 entsprechen wird. Wenn Tiere wurden am Abend vor dem gepaarten, dem Tag des Stopfens ist 0,5. Bestellen timed-trächtigen Mäusen oder ein WT Weibchen mit Jungtieren P1, um Zeit mit der postnatalen (P) 1-Mäusen am Tag das Spendergewebe wird E13.5 sein. Alternativ können Sie sich diese Paarung im Haus eine Woche vor der Spendertiere Paarung.
Hinweis: Die erste Strategie zur Erzeugung von sowohl E13.5 Embryonen und P1 / Welpen am gleichen Tag ist oft schwierig, zuverlässig zu tun.
3. Herstellung der Medien, Geräte und Zubehör.
- Bereiten Sie die Reagenzien und Instrumente für MGE Zellpräparation (Tabelle 2).
- Bereiten Sie eine saubere Fläche und legen sauber Zangen, Scheren und entweder ein mikro Messer oder einer feinen Pinzette (genaue Gewebedissektion) auf der Oberfläche.
- Bereiten Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), foder Dissektion und Dulbeco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinder Surem (FBS), für die Transduktion.
- Vorinkubieren 20-30 ml DMEM / 10% FBS in einer 37 ° C Brutschrank für ca. 1 Std. Der Deckel sollte gelöst werden, um für den Gasaustausch und pH-Äquilibrierung des Mediums zu ermöglichen.
Hinweis: Die Medien Vorinkubation kann nur vor dem Start der Präparation vorbereitet werden.
4. MGE Zellpräparation
- Opfern die schwangere Maus nach einer genehmigten Tier Protokoll und entfernen Sie die Embryonen in einer 10 cm Petrischale mit eiskaltem HBSS.
- Entfernen Sie das Gehirn von jedem Embryo mit einem Binokular (gehen Sie zu einer Zeit, so dass der Rest der Embryonen in eiskaltem HBSS) und fahren Sie dann schneiden Sie die MGE Gewebe.
Hinweis: Detaillierte unten und in Abbildung 1 sind die Schlüsselschritte zeigt, wie die MGE entfernen. Zusätzlich ist, Figur 2 ein Film, die die gesamte PräparationVerfahren.- Positionieren Sie das Gehirn mit Bauchseite nach oben (1A, A '). Hinweis: Es ist auch in Ordnung, haben die dorsalen nach oben zeigt. Schneiden Sie das Gehirn in der Hälfte entlang der Sagittalebene, zwei Stücke zu erzeugen. Ein Beispiel hemiseziert Gehirn gezeigt (1B, B '), feststellen, dass die dorsale (die darüber liegende Hirnrinde) und ventralen Aspekte des Gehirns Abdeckung und umgeben den Ganglienhügel (GE) Gewebe.
- Als nächstes wird mit einem dominanten Hand, halten Sie eine sehr feine Pinzette oder eine stabknife (Tabelle 2), während die Immobilisierung der Halbkugel mit einer Pinzette von einem nicht-dominanten Hand. (Medialen Seite der Hemisphäre sollte nach oben). Klappen Sie den dorsalen und ventralen Gewebe mit einer Zange und einen Stich Messer, um die zugrunde liegenden GE Gewebe (1C und 1C 'schematisch dargestellt) zu offenbaren.
Hinweis: Das Entfernen einige Medien aus dem Sezieren Petrischale können es einfacher machen, um das Gewebe zu stabilisieren, während performing den MGE-Dissektion. - Stellen Sie gerade Schnitte mit dem stabknife oder feinen Pinzette, um die CGE, LGE und Scheidewandgewebe zu trennen (siehe Beispiel Schnitte durch das rote Symbol gestrichelten Linien, Figuren 1D und D '). Diese Schnitte können in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
Hinweis: Stellen Sie sich die MGE als "Box", die aus dem umgebenden Gewebe geschnitten wird. Dies hilft reproduzierbar machen ähnliche Schnitte für jede Sektion, wodurch Schwankungen der Gewebe Dissektionen reduzieren. - Schließlich drehen Sie das MGE auf die Seite und schneiden Sie die Unterseite (was war der lateralen Seite des Gehirns). Dadurch wird die Mantelzone des MGE (verwerfen in 1E und 1E ') von dem Rest der MGE. Die verbleibende Aspekt MGE enthält in erster Linie ventrikulären Zone und Subventrikularzone Teile der MGE, die fast alle MGE Vorläuferzellen enthält. Fahren Sie mit diesem Gewebe.
- Wichtige Überlegung: Die Zugabe von Silikon-Gel auf dem Boden einer Petrischale can dienen als hervorragende Präparation Oberfläche schützt die empfindlichen Spitzen der Pinzette und bietet eine weiche Unterlage für Pinning Gewebe mit einer Pinzette.
4.3 Weitere Strategien für MGE Dissection.
- Schneiden Sie die Haut des Embryos mit einer Pinzette wie eine Schere, um das Gehirn schnell zu entfernen. Da der Embryo legt auf seiner Seite, halten das Gewebe an der Basis des Kopfes mit den zur Herstellung des Gewebeankers Pinzette. Zuerst schneiden vordere Bauch zum Gehirn und hinteren Bauch an das Gehirn, und schließen Sie dann die zwei Schnitte entlang der Seite des Embryos. Dann ergreifen Sie die Klappe der Haut und ziehen Sie sie über die Oberseite des Gehirns. Das Gehirn kann dann schnell von dem verbleibenden Gewebe befreit werden.
- Alternativ Verankerung des hinteren Teil des gesamten Gehirns hinter dem Kortex. Inzwischen greifen jede Hemisphäre am meisten dorsalen Schwanz Aspekt der Rinde und reißen die Rinde vom verankerten Gewebe in eine Richtung nach vorne. Auf diese Weise werden sowohl cortices kann entfernt werden, und die bilateralen ganglionic Ballen enthüllt werden, noch mit dem Rest der Erhaltung der medial-lateralen Anatomie Gewebe befestigt.
- Wechseln Sie in die Stich Messer, um präzise Schnitte auf der MGE auf jeder Hemisphäre leisten. Verwenden Sie entweder eine separate saubere Reihe von Pinzette, um die MGE oder einer Pipette mit einer großen Spitze (dh., P1000) zu sammeln.
Hinweis: Bewahren Sie die gesammelten Gewebe weg von allen anderen seziert Material, wie einige Medien unvermeidbar übertragen, wenn der MGE gesammelt. - Sammeln Sie die MGE und legte das Gewebe in ein 1,5 ml Sammelröhrchen, das DMEM / 10% FBS, (ein Volumen von 500 ul ausreicht, um die MGEs sammeln). Wiederholen Sie für die andere Halbkugel und in der gleichen Sammelröhrchen. Halten Sie Proben auf Eis, bis alle Gewebe gesammelt.
5. Lentivirale Kennzeichnung und Transplantation
- Bewegen Sie die Röhren von MGE Gewebe in einem BSL2 zertifiziert Haube und entfernen Sie die Medien.
Hinweis: DasMGE Gewebe ist groß genug für das Auge sichtbar zu sein, und wird zu dem Boden des Rohrs so dass für die kalten Medien leicht und schonend entfernt absetzen. - Hinzufügen ~ 500 ul DMEM / 10% FBS-Medium, wurde diese in einem 37 ° C Brutschrank vorinkubiert. Als Nächstes fügen Polybren Transduktion in jedes Röhrchen auf eine Endkonzentration von 8 & mgr; g / ml zu erleichtern. Man reibt die MGE Gewebe, um eine Einzelzellsuspension zu schaffen, mit einem P1000 Pipettenspitze. Schließlich fügen ~ 15-20 ul konzentrierter Lentivirus in jedes Röhrchen.
- Wichtige Überlegung: Ein Verreiben 10-12 mal reicht aus, um von einem einzigen Embryo brechen MGE Gewebe, aber mehr Verreibungen erforderlich, wenn mehrere MGEs werden vereinigt werden. Probieren Sie verschiedene Verreiben Bedingungen, um festzustellen, was am besten funktioniert.
- Sicher in einem 37 ° C Inkubator schließen jedes Rohr, kehren zu mischen, als Ort, alle Rohre. Inkubieren der Zellen in Lentivirus für mindestens 30 min und bis zu 1 Stunde. Längere Zeiten haben in de FolgeFalten Lebensfähigkeit der Zellen. Drehen Sie die Rohre alle 10 Minuten, bis die Zeit abgelaufen ist.
- Nach der Inkubation mit Lentiviren, entfernen Sie die Rohre aus dem Brutschrank und Zentrifuge bei ~ 700 xg für 3 Minuten, um die Zellen zu pelletieren. In der BSL2 Haube, den Überstand verwerfen und in 10% Bleichmittel. Als Nächstes fügen Sie 1 ml DMEM / 10% FBS und verreiben das Pellet 2-3 Mal zu waschen, dann zentrifugieren wieder mit der gleichen Geschwindigkeit, um die Zellen zu pelletieren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 2-3 weitere Male, um überschüssige Virus zu entfernen.
Anmerkung: Führen Zentrifugationsschritte bei 4 ° C, aber eine verminderte Lebensfähigkeit wurde nicht beobachtet, wenn kurze Spins bei RT. - Nach dem letzten Waschen, entfernen Sie so viel wie möglich zu Medien und legte jedes Röhrchen auf Eis. Aufgrund von Restmedium an den Seiten des Rohrs, ~ 2-3 ul Medium wird am Ende für den Zellpellets durch die Zeit der Transplantationsverfahren begonnen.
6. Transplantation und Validierung
- Erwerben Host P1 Welpen und bereiten das VerfahrenBereich durch Spritzen nach unten mit 70% Ethanol. Um die Sterilität während des Verfahrens aufrecht zu erhalten, wird empfohlen, diese Verfahren in einem speziellen Reinraumverfahren durchzuführen. Darüber hinaus verwenden entweder autoklaviertem chirurgische Instrumente sterilisieren Oberflächen, die Welpen werden in Kontakt mit mit 70% Ethanol. Ein Beispiel eines repräsentativen Geräte benötigt, um die Transplantation und ein repräsentatives Verfahren Bereich durchzuführen, ist in 3 gezeigt.
Hinweis: Obwohl dieses Verfahren eine Einspritzung von kleinen Volumina, und nicht ein chirurgisches Verfahren, ein Einschnitt, offene Wunden oder Nähte erfordern würde, wird es immer noch empfohlen, dass ein neuer Mikropipette wird verwendet für jede Maus injiziert werden. Die Mikropipetten Hitze sterilisiert, wenn es gezogen und auf einer Oberfläche, die mit 70% Ethanol in einem versiegelten Behälter gelagert gesprüht wurde abgeschrägt.
- Generieren Mikro einen Durchmesser an der Spitze zwischen 40-80 um haben. Im Anschluss an diese Dimensionen wird eine optimale AusbeuteErgebnisse. Wärmesterilisation der Mikropipetten, wenn er gezogen und auf einer abgeschrägten Oberfläche und Spray mit 70% igem Ethanol vor der Lagerung der Mikropipetten in einem versiegelten Behälter.
Hinweis: Alternativ, wenn Zugang zu den notwendig, um diese Nadeln zu erstellen (Tabelle 2) Geräte zu begrenzen, verwenden Sie eine andere Injektionsvorrichtung. Diese können jedoch nicht so gut geeignet, wie die Mikro aufgrund unterschiedlichen Durchmessern sein. - Erstellen Sie Mineralöl in einer 1 ml Spritze und mit einem 30 1/2 G Nadel, füllen Sie die Glaspipette vollständig mit Mineralöl. Anschließend montieren Sie den Kolben auf den stereotaktischen Gerät und dann das Glaspipette zu der stereotaktischen Gerät und Last auf den Kolben. Mit dem hydraulischen Antrieb, bewegen Sie den Kolben etwa zur Hälfte in die Glaspipette, die Beseitigung Mineralöl, das mit einem sauberen einem sauberen Papiertuch heraus schwappt.
- Alternativ zur Verwendung einer Spritze, tauchen das hintere Ende der Pipette in Mineralöl und durch Kapillarwirkung gefüllt. Um Luftblasen in der pipett verhinderne, aufrechtzuerhalten positiven Druck auf die Spritze, bis sie vollständig aus dem Glaspipette.
Hinweis: Andere Geräte können verwendet werden, um erfolgreich zu trans MGE Zellen 14 werden. Jedes Gerät, das ein Volumen von weniger als oder in der Nähe von 100 nl funktioniert gut für dieses Verfahren liefern kann.
- Alternativ zur Verwendung einer Spritze, tauchen das hintere Ende der Pipette in Mineralöl und durch Kapillarwirkung gefüllt. Um Luftblasen in der pipett verhinderne, aufrechtzuerhalten positiven Druck auf die Spritze, bis sie vollständig aus dem Glaspipette.
- Als Nächstes verwenden Sie einen sterilen Papiertuch oder ein absorbierendes Material, mit der Ecke in einer feinen Spitze verdreht, um zart zu entfernen überschüssige Medien über der MGE Zellpellet. Dieser Schritt konzentriert das Zelldichte, die für kleinere Einspritzmengen erzielt werden kann. Als Nächstes verwenden Sie ein geringes Volumen (P2 bevorzugt) Pipette langsam erarbeiten das Zellpellet und verreiben 1-2 mal, bevor die Zellsuspension auf eine hydrophobe Oberfläche. Das Volumen sollte knapp 1 ul sein. Bewegen Sie die Spitze der Nadel in die Zellsuspension und mit dem hydraulischen Antrieb, Erstellung der Zellsuspension in die Pipette.
- Betäuben eine P1 Welpen über Hypothermie (wickeln Sie in einem Latex-Handschuh und steckte auf Eis ~ 2-4 min).Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie mit einem schädlichen Reiz. Klemmen Sie die Haut zwischen den Zehen mit feinen Pinzette: der Welpe sollte nicht mehr reagiert, wenn eingeklemmt. Als nächstes legen Sie den Welpen auf eine Form, die im Rahmen der Injektionsvorrichtung ist, dann machen die Haut durch Zurückziehen des Haut auf dem Kopf und die Sicherung mit Standard-Labor Band straff.
Hinweis: Während der Hypothermie ist sehr effektiv bei neugeborenen Mäusen und führt zu einer geringen Sterblichkeit müssen Verfahren schnell durchgeführt werden, wie Welpen beginnen, unter 10 Minuten erholen. Zusätzlich 4 min auf Eis ist eine obere Grenze dessen, was tolerierbar ist. Versuchen, Hypothermie nur einmal induzieren, wenn eine längere Zeit für Injektionen erforderlich. Allerdings, wenn ein Welpe wieder früh, zunächst damit der Welpe in vollem Umfang vor dem erneuten Induktion von Hypothermie erholen. Zudem ist nur veran Hypothermie ein weiteres Mal, um Injektionen durchzuführen. Welpen werden innerhalb von 5-10 min an Unterkühlung erholen. Dies kann durch die Welpen mit Einstreu und Mama oder indem Sie den Welpen an einem warmen surfac erleichtert werdene sich zu erholen. - Mit Hilfe eines stereotaktischen Gerät, positionieren Sie die Spitze der Glaspipette auf der Oberfläche auf den Kopf des Welpen, senkrecht auf der Oberfläche des Kopfes. Wenn die Pipette ist in Kontakt mit dem Kopf, betrachten dies als '0'. Als nächstes drücken Sie die Pipette durch die Oberfläche der Haut und Schädel in die Rinde, dann Ein- und Ausfahren von Pipetten ~ 2 Mal vor dem Anhalten. Für eine optimale Ausrichtung der Zellen in der Großhirnrinde, sind Injektionen durchgeführt, wenn die Mikropipette ist in einer Tiefe von 0,1 mm. Dies sollte jedoch durch den Anwender optimiert werden (siehe Hinweis unten).
Anmerkung: Obwohl diese Tiefe zuverlässig zielt tiefer neokortikalen Schichten mit den oben beschriebenen Geräten sollte ein paar Tiefen getestet empirisch ermittelt werden. Darüber hinaus sollte ein Bereich von Tiefen, in unterschiedlichen rostro-kaudale und medio-lateralen Position geprüft, um zu bestimmen, welche die optimale Tiefe an jedem Standort werden. Auch sollte die anfängliche Punktion schnell sein, da langsame Eindringen in den Neocortex vermindert die Fähigkeit, cleanly in das Gewebe eindringen. Probieren Sie verschiedene Geschwindigkeiten beim ersten Start dieses Verfahren zu finden, was am besten funktioniert. Zusätzlich zum Testen von Koordinaten, gibt es keine echte Alternative für die Verwendung von markierten Zellen, wie Farbstoffe waren unzuverlässig bezeichnen Position. - Sobald die Nadel in Position ist, drehen Sie den hydraulischen Einrichtung, um den Kolben in die Glaspipette zu fördern und schob einen Satz Volumen Zellsuspension in die Rinde. Injizieren 50-70 nls pro Standort. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei 3-6 verschiedenen Standorten in unterschiedlichen rostral-kaudale Ebenen, wenn das Ziel ist es, eine breite Verteilung der Zellen im ganzen Neokortex zu erhalten.
Hinweis: Volumen von 100 nl oder höher können Verletzungen verursachen und zu große Klumpen von injizierten Zellen, die effizient von der Injektionsstelle Migration fehl. So kleineren Injektionsvolumina (~ 70 nl oder weniger) optimal sind, über mehrere Standorte, wenn es die Zeit erlaubt. - Bei Injektionen abgeschlossen sind, entfernen Sie die Welpen von der Bühne aus und markieren Sie ihn (Zehen Clipping ist ein zuverlässiger Weg, um die p identifizierenups später). Sobald der Welpe hat sich erholt und ist in der Lage, aus eigener Kraft bewegen (in diesem Fall innerhalb von Minuten von ihnen von der Bühne zu entfernen), setzen Sie ihn wieder mit der Mutter und Wurf.
Hinweis: Da es sich um ein minimal-invasives Verfahren gibt es keine post-chirurgischen Verfahren, wenn die Welpen frei bewegt und erwärmt. Allerdings sollten Welpen überprüft werden, nicht nur nach dem Eingriff, sondern auch den folgenden Tag, um sicherzustellen, sie keine Anzeichen einer Verschlechterung der Gesundheit haben. - Vor dem Start des Verfahrens auf der nächsten Welpen, sprühen Sie den Bereich mit 70% Ethanol, um eine sterile Arbeitsbereich zu halten. Ermöglichen, dass die eingespritzte Welpen zu entwickeln und dann beurteilen die Gewebe an der entsprechenden Entwicklungsstufe (n).
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Representative Results
Seit MGE Zellen haben die einzigartige Fähigkeit, Migration und Integration, wenn in eine Wirts Neocortex 16 transplantiert, bieten sie eine ausgezeichnete Modellsystem für die genetische Manipulation vor der in vivo-Studien. Hier zeigen wir, wie man MGE Gewebe von E13.5 Embryonen zu isolieren (1 und 2), die dann mit Lentiviren entweder in vitro oder in einer schnellen Art und Weise vor der Transplantation in vivo Studien transduziert werden kann. Labeling MGE über Lentiviren hat, bevor Sie einen Enhancer Fahr GFP in GABAergen Neuronen 15 durchgeführt. Jedoch ist die Fähigkeit, Gene in spezifischen Untergruppen von einer heterogenen Population exprimieren vor der Transplantation kann eine große Hilfe Studien der Zerstreuung und Integration dieser Zellen. Hierbei haben wir versucht, ein Mittel zur Expression eines fluoreszierenden Proteins zu einer bestimmten Untergruppe Intern, diejenigen, Somatostatin (SST) + exprimieren Ziel zu entwickeln.
Wir first subkloniert ein handelsübliches Cre-abhängigen GFP-Reporter (Vektorinformationen, Tabelle 2) in einen lentiviralen Backbone. Der Vektor wurde hergestellt durch zunächst Subklonieren der Kassette, die GFP von loxP-Stellen aus dem AAV-Vektor, flankiert und Ligierung in einem lentiviralen Vektorgerüst 15 mit XbaI und PflMI Restriktionsstellen erzeugt (dieser Kassette enthalten nur einige der CAG-Promotor). Als nächstes wurde der Rest des CAG-Promotors aus einem pCAGGS Säugerexpressionsvektor mit SpeI und XbaI ausgeschnitten und in die XbaI-Stelle des lentiviralen Vektors zur pLenti-CAG-Flex-GFP erzeugen ligiert. Der 5'-SpeI-Stelle des Einsatzes wird kostenlos XbaI und damit zerstört die 5'-Seite, während der 3'-XbaI-Stelle wurde konserviert. Der resultierende Vektor (Schema 4A Vektorsequenz der Tabelle 1) wurde zuerst in vitro in Gegenwart oder Abwesenheit von Cre (Schema des in-vitro-Assay, 4B) getestet. MGE primären Neuronen aus Ai14 Flox / + E13.5 Embryonen wurden kultiviert und mit einer Kombination von Lentiviren transduziert. Nur wenige bis gar keine GFP + oder tdTomato + Zellen wurden nur mit der Weiterleitung des CAG-Flex-GFP-Lentivirus (4C, 4F und 4I) beobachtet. TdTomato Fluoreszenz war in den MGE-Zellen mit einem CMV-Cre Lentivirus, was auf eine Cre-Expression (Abbildung 4D, 4G und 4J) transduziert vorhanden. Schließlich Co-Transduktion der MGE-Zellen führte zu vielen tdTomato + Zellen, die auch zum Ausdruck GFP, was darauf hinweist, dass die CAG-Flex-GFP Lentivirus wurde wie erwartet (4E, 4H und 4K) arbeiten. Einige seltene GFP + Zellen beobachtet, die nicht tdTomato +, möglicherweise aufgrund der transduzierten Reporter Einbeziehung neben einem starken Promotor, die für <2% aller GFP + -Zellen bilanziert.
Inhalt "> MGE-Zellen in einem Wildtyp-Wirts Neokortex zu zerstreuen, ausgereift und in die Wirts Neocortex 16 E13.5 SST-IRES-Cre + integrieren transplantiert;. Ai14 Flox / + MGE Zellen wurden bei P1 in WT neocortices transplantiert (Schema Abbildung 5A) und deren Verteilung auf 7 und 35 Tage nach der Transplantation (DPT). In beiden Altersgruppen könnte tdTomato + Zellen im ganzen Neokortex (5B und 5C) gesehen werden untersucht. Die Bilder in den 5B und 5C sind Vertreter Transplantation unter Verwendung der MGE . Zellen aus einem Embryo zu testen, wie effizient MGE Zellen konnte mit dem hier von SST-IRES-Cre + beschrieben, MGE-Zellen-Protokoll zu kennzeichnen; Ai14 Flox / + Embryonen wurden mit der CAG-Flex-GFP Lentivirus transduziert und in das transplantierte gleiche Weise. Für diese Experimente ~ 15 ul des concentrated Lentivirus (~ 1x10 7 infektiöse Einheiten / ml) wurde mit den vereinigten MGEs von einem Embryo für jede Transplantation verwendet. Die Zellen wurden dann in eine P1 WT Host Cortex transplantiert und bei 7 DPT (5D-5F) analysiert. Der transplantierten Zellen (tdTomato +), waren etwa 20% GFP +, was anzeigt, Transduktion mit dem CAG-Flex-GFP Lentivirus (5G). Diese Daten legen nahe, dass mit der Menge und der Titer von Lentivirus oben beschrieben, ~ 20% der transplantierten MGE Zellen markiert werden. Die Menge des Virus kann entweder verringert oder erhöht werden, oder möglicherweise andere Variablen wie Dauer der viralen Inkubation kann verändert werden, um spärlicher oder dichtere Markierung von Zellen zu erzielen.Verwendung MGE Gewebe einer Cre-abhängigen Reportermauslinie in Verbindung mit dem CAG-Flex-GFP Lentivirus kann die Anzahl der zusätzlichen Markern, die durch Immunfluoreszenz untersucht werden kann, zu begrenzen. Daher SST-IRES-Cre + < / Sup> E13.5 MGE Gewebe wurde gesammelt und mit CAG-Flex-GFP Lentiviren, um diese transplantierten Zellen, die MGE Cre ausgedrückt visualisieren transduziert (wird GFP + sein). Diese Zellen wurden in P1 WT Cortex transplantiert und bei 35 DPT (siehe Versuchsplan, 6A), einem Zeitpunkt, zu reifen Intern Marker exprimiert beurteilt. Bei 35 DPT, ~ 85% der GFP + -Zellen coexprimiert SST, aber nur ca. 4%, ausgedrückt PV (Figuren 6B bis 6H). Diese Zahlen, die mit der Linie Analyse der SST-IRES-Cre Mauslinie, die auch das Schicksal Karten sind ~ 5-10% der PV + Zellen 9 (Vogt und Rubenstein, unveröffentlichte Ergebnisse). Diese Daten legen nahe, dass die virale Kennzeichnung MGE ist effizient und kann ein geeigneter Ansatz für die Einführung eines Reporter oder potentiell ein Gen von Interesse vor dem in vivo-Analyse sein.
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Abbildung 1. Representative Verfahren für die Präparation der E13.5 MGE Gewebe. Beispiel Dissektion der MGE Gewebe entweder für Primärkulturen oder Transplantationen. (AE) Bilder von E13.5 Gehirn Dissektionen und (A'-E ') Schaltpläne, Strukturen markieren und wichtige Schritte in der Prozedur. (A, A ') Vertreter E13.5 Gehirn von der ventralen Seite angesehen. Rote Linie zeigt den ersten Schnitt gemacht, die das Gehirn in zwei Stücke. (B, B ') Blick auf eine Gehirn Hemisektion hemisect wird. Die medial sichtbar ist, mit lateralen unten. Gewebe aus dem dorsalen Kortex (blaue Farbe) liegt über den Ganglien Eminenzen. Zusätzlich wird ventralen Gewebe, die entfernt werden orange dargestellt. (C, C ') anzeigen und Darstellung der freiliegenden Ganglien Eminenzen nach darüberliegenden Gewebe hat abgeschält worden. (D, D') Gleiche Blick ausgesetzt Ganglien emi nences wie in (C, C '), aber mit detaillierten Schnitt-Sites als rot gestrichelte Linien sichtbar. Nach MGE erfolgt nach der in (D, D ') bezeichnet Linien geschnitten (wird das Gewebe auf die Seite E, E) eingeschaltet ", und die laterale Seite wird abgeschnitten und verworfen. Vertreter Schritte in der Präparation und Isolierung von MGE Gewebe. Abkürzungen: (CGE) Schwanzganglienhügel, (LGE) lateralen Ganglienhügel, (MGE) medial ganglionice Eminenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2 zeigt einen Film E13.5 MGE Dissektion. Film zeigt die Entfernung eines E13.5 Gehirn mit nachfolgender Entfalten und Entfernen des darüber liegenden Gewebes. Die MGE ist beschriftet und die Schnitte gemacht, um das umliegende Gewebe zu entfernen sind, zeigen schrittweise um.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
Abbildung 3. Repräsentative Vorschrift Bereich und Beispiel für Injektionsnadel für die Neugeborenen-Transplantationen. (A, A ') Bilder, die ein Beispiel-Setup, um Transplantationen in neugeborenen Mäusen durch. Mikroskop (1) oberhalb einer Bühne angeordnet ist, die eine Form, die eine neonatale Maus (5) und einen stereotaktischen Gerät (2). (A ') ein vergrößertes Bild (A), die die Region des stereotaktischen Gerät, hält halten kann die Glasinjektionsnadel (6) mit einem eingesetzten Kolben (7). Der Kolben wird durch eine feine Hydraulikantrieb (4) mit einer abgeschrägten Spitze kontrolliert und bewegt Mineralöl innerhalb des Glas Nadel, die nach innen und außen vermittelt fließen von der Nadel. (B) Beispiel eines Glasinjektionsnadel. Für die Herrscher in (B), jede Haupt Abgrenzung = 100 & mgr; m. (C) Bestands Liste der Elemente in (A, A '). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 4 In-vitro-Tests zeigen, die Expression von GFP aus einem CAG-Flex-GFP Lentivirus in Gegenwart von Cre. (A) Schema, wie der lentiviralen CAG-Flex-GFP-Vektor wird in Gegenwart von Cre. (B) Schema Primär MGE Zellkulturexperiment zu beurteilen, ob die lentiviralen CAG-Flex-GFP würde GFP in diesen Zellen mit Cre-Expression zum Ausdruck bringen. Kurz gesagt, MGE Zellen aus einer Cre-abhängigen Reporter Ai14 (drückt tdTomato in Gegenwart von Cre), wurden in vitro gezüchtet und mit Cre und / oder Flex-GFP Lentiviren. (CK) Immunfluoreszenzbilder von E13.5 MGE Primärkulturen, die mit einer CMV-Cre, CAG-Flex-GFP oder beides transduziert wurden transduziert. Die Kulturen wurden für native tdTomato Ausdruck, GFP und DAPI abgebildet. Balken in (K) = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Repräsentative Bilder von transplantierten und transduziert, SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + MGE-Zellen. (A) Schema der Versuchsanordnung, um entweder MGE-Zellen zu trans allein oder nach lentivirale Transduktion in einem Wildtyp (WT) Host (DPT) Tagen nach der Transplantation. Kurz gesagt, E13.5 SST-IRES-Cre +,. Ai14 Flox / + MGE Zellen entweder transplantiert oder mit dem CAG-Flex-GFP Lentivirus vor Transplantation in WT neocortices transduziert und 7 DPT beurteilt (B, C) Immunfluoreszenzbilder von neocortices 7 oder 35 DPT, die repräsentativ MGE transplantierten Zellen (tdTomato +). (DF) Immunfluoreszenzbilder von MGE Zellen mit dem CAG-Flex-GFP Lentivirus 7 DPT beurteilt transduziert. (G) Quantifizierung des Anteils tdTomato + Zellen, Ausdruck GFP bei 7 DPT. Maßstabsbalken in (C) und (F) = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 6. Repräsentative Bilder der CAG-Flex-GFP Lentivirus transduziert, SST-IRES-Cre + MGE Transplantate-ausdrücken co MGE abgeleitete Interngruppe Marker. (A) Schema von E13.5 SST-IRES-Cre + MGE Zellernte und Weiterleitung mit einer CAG-Flex-GFP Lentivirus und Transplantation in der Großhirnrinde von P1 WT Gastgeber vor Bewertung bei 35 DPT. Entweder Somatostatin (SST) (C) oder Parvalbumin (PV) (F) Vertreter Bilder von Neocortex von transplantierten Hosts zeigt die Expression von GFP, von der Flex-Vektor (B, E), co-gefärbt. (D, G) zusammengeführt Bilder zusammen mit DAPI gefärbt. (H) Quantifizierung der Anteil der Zellen, die GFP koexprimieren SST oder PV. Die Daten stellen ± SEM (n) = 3. Maßstabsbalken in (G) = 100 um./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Tabelle 1 FASTA-Datei des pLentiviral-CAG-Flex-GFP-DNA-Vektor.
| Chemikalien und Geräte für MGE Zellpräparation und Transduktion | Catalog # | Unternehmen | ||||||
| 1) | Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit hohem Glucose | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS), kein Kalzium oder Magnesium | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (oder andereSammelröhrchen mit Deckel) | 3810X | Eppendorf Deutschland | |||||
| 5) | Polybrene | sc-134220 | Santacruz Biotechnology | |||||
| 6) | Stab Messer gerade 22,5 ° (optional) | REF 72-2201 | Chirurgische Spezialitäten Corporation | |||||
| 7) | Petrischale (10 cm), für die Gewebe Dissektionen | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | 2 feine Spitze Pinzette, wie Dumont # 5 | 11.254-20 | Feine Wissenschaftlichen Tools | |||||
| 9) | 37 ° C Brutschrank mit 5% CO 2 Eingangs | C150 | Bindemittel | |||||
| 10) | Tischzentrifuge, die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen drehen kann | |||||||
| 11) | Jede P1000 Pipette, die für die Zell Zerreiben verwendet werden können | |||||||
| 12) | Biosafety Level 2 Haube | |||||||
| Chemikalien und Geräte für in-vitro-MGE Primärkulturen | Catalog # | Unternehmen | ||||||
| 1) | Lab-TekII chamberslides mit Deckel, 8 gut | 154.941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | Poly-L-Lysin 0,1% Gewicht / Volumen | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Maus-Laminin, 0,5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Neurobasalmedium | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | B27 Serum kostenlose Beilage | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, 100x Stock | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penicillin-Streptomycin, 100x Stock | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glucose, (Vorbereitung einer 25% Lösung in Wasser) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| Chemikalien und Geräte für MGE Zelltransplantation | Catalog # | Unternehmen | ||||||
| 1) | 1 ml Spritze | REF 309.602 | BD Becton Dickinson und Unternehmen | |||||
| 2) | 30 1/2 G Nadel | 305.106 | BD Becton Dickinson und Unternehmen | |||||
| 3) | VorPräzision Bohrung bis 5 & mgr; liefern (kommt mit Kolben) | 5-000-1005 | Drummond wissenschaftlichen Unternehmen | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Stereomikroskop mit boomstand | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Digitale nur für Mäuse stereotaktischen Instrument | 51725D | Stölting Unternehmen | |||||
| 7) ** | Einachs-Ölhydraulik feinen Mikromanipulator | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Diamantbeschichtete Dreh beveler | n / a | im Haus gebildet | |||||
| 9) | Nadelpipettete Zieher | 730 | Kopf Instruments | |||||
| 10) | Mineralöl | n / a | Jede Drogerie oder Apotheke | |||||
| 11) | Jede Pipette und Tipps, die Maßnahme reliaby kann 1 ul Volumen | |||||||
| ** Dies sind die speziellen Modelle, die wir verwenden, aber viele andere Setups sollte funktionieren | ||||||||
| Optional Reagenzien (zur Herstellung von Lentiviren) | Catalog # | Unternehmen | ||||||
| 1) | 25 mm, 0,45 & mgr; m-Filter | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Ultraklar Zentrifugenröhrchen (25 x 89 mm) | 344.058 | Beckman Coulter | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1,5 ml Größe) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Andere im Handel erhältliche Versorgung | Catalog # | Unternehmen | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE Plasmid, das gag / pol | 12.251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev-Plasmid-Codierung Rev | 12.253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G Plasmid, das VSVG | 12.259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28.304 | Addgene | |||||
Tabelle 2. Inventarliste von Reagenzien und Instrumente. Eine Bestandsaufnahme der im Handel erhältlichen Reagenzien einschließlich Medien, Dissektion Werkzeuge, repräsentativen Anlagen für die Transplantation und DNA-Vektoren. (Na) nicht verfügbar oder anwendbar.
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Discussion
Die Verwendung von GABAergen kortikalen Internvorstufen aus den embryonalen Ganglien Eminenzen (GES) für Zelltherapien ist vielversprechend für viele Bedingungen 12 -1 4. Präzise molekulare Techniken sind erforderlich, um zu verfolgen und Express Gene von Interesse in bestimmten Interngruppen. Hier stellen wir ein ausführliches Protokoll zur Markierung embryonalen MGE Zellen mit Lentiviren vor der Transplantation, und zeigen, wie diese Technik verwendet werden, um Gene von Interesse in spezifischen kortikalen Interngruppen für die in vivo-Analyse exprimieren.
Das hier beschriebene Protokoll kann zuverlässig verwendet werden, jedoch ist es für eine optimale Reproduzierbarkeit wesentlichen auf wenige kritische Schritte zu haften. Zuerst für die virale Transduktion effizient, physiologischer Temperatur und pH erforderlich. Wenn diese Parameter erfüllt sind, kann MGE Zellen in ~ 30 Minuten transduziert werden. Zweitens stellen Sie sicher, um eine dichte MGE Pellet, bevor Sie fortfahren habenum eine Transplantation zu tun. Dies ist wichtig, da nur eine begrenzte Volumen kann ohne Zerstörung in den neonatalen Mausgehirn an jeder Stelle injiziert werden, und die Zellen werden entfernt von der Injektionsstelle zu migrieren, so dass ihre Dichte bei der Transplantation von geringerer Bedeutung als sein könnte ist erwartet. Schließlich führen Sie einige Testbedingungen mit MGE-Zellen, die einen fluoreszierenden Reporter zu bestimmen, welche Injektionstiefen sind optimal zum Ausdruck bringen. Während dieses Protokolls verwendet MGE Zellen könnte CGE Zellen ebenfalls in der gleichen Weise verwendet werden. Ein Nachteil ist, dass es nicht viele Cre-Treiberleitungen, welche die Expression auf die gesamte CGE oder bestimmte Untergruppen von CGE abgeleiteten Inter beschränken. Ist das vasoaktive intestinale Peptid (VIP) 9 jedoch eine zuverlässige Cre-Linie, die verwendet werden könnten, sich zu trennen, diese Untergruppe von CGE-abgeleiteten Zellen. Als neue Zeilen zur Verfügung stehen, wird es möglich sein, dieses Protokoll mit mehr genetische Präzision zu verwenden.
Früher haben wir und andere haben gezeigt,Die Nützlichkeit der Einführung von Genen in MGE-Zellen vor der Transplantation über Elektroporation oder mit Lentivirus 15, 17. Während diese Techniken waren effektiv bei der Einführung von Genen in vivo-Analyse ist MGE Gewebe heterogene und gibt Anlass zu mehreren Interngruppen als auch nicht-neuronale Zellen 4. Außerdem ist es schwierig gewesen, ein Gen von Interesse nur in einer bestimmten Untergruppe Intern auszudrücken. Große Fortschritte gemacht worden, um transgene Linien, die die Expressionsmuster von vielen kortikalen Interngruppen, einschließlich rekapitulieren erzeugen, aber nicht beschränkt auf, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre ein d VIP-Cre 9 begrenzt -11, und die Einführung von neuen Linien helfen aufzuklären weitere mögliche Bevölkerung in der Zukunft. Außerdem mit der Erzeugung von Cre-abhängigen Reporter und Expressionsvektoren, einschließlich Cre abhängigen hierin verwendete Reportervektoren, kann eine genauere Expression von Genen von Interesse erreicht werden.
Eine Einschränkung dieser Technik kann die Grße des Fragments, das man zuverlässig in einem lentiviralen Vektor zu verpacken. Darüber hinaus ist dieser Ansatz noch nicht mit AAVs getestet. Sobald jedoch diese Technik wird durch eine individuelle Optimierung können viele Variationen dieses Ansatzes verwendet werden. Erstens, die hier beschriebene Vorgehensweise wird es den Forschern ermöglichen Reportern mit einem Cre-abhängigen Reporter Lentivirus in Verbindung mit MGE Spenderzellen spezifischer Cre-Treiberleitungen zum Ausdruck bringen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Morphologie der einzelnen MGE Zellen beurteilen oder möglicherweise ein Gen von Interesse in verschiedenen Untergruppen auszudrücken, wenn ein zweites Gen in den Vektor kloniert. Zweitens kann es auch denkbar, eine Cre-exprimierenden Virus mit Cre-abhängigen Reporter MGE Donorzellen oder potentia verwendenlly nutzen entwickelnden konservierte DNA-Elemente, Promotoren und Enhancer, um die Expression in unterschiedlichen Populationen von Zellen aus einer heterogenen Population fahren.
Eine Zukunft Hürde wird die Kennzeichnung vom Menschen stamm induzierten pluripotenten Stammzellen oder embryonale Stammzellen potenziell zu reinigen und / oder zu studieren eine bestimmte Gruppe von Zellen. Interessanterweise können konservierte DNA Enhancer auch bei viralen Expressionssystemen verwendet werden, um GABAerge Neuronen in Primärkulturen zielen, nach Injektion in den Cortex und vor der Transplantation von MGE Zellen 15, 18, 19. Enhancers kann eine Antwort auf dieses Hindernis, und werden in der von Interesse als molekulare Werkzeuge, als neue Techniken erforderlich, um die Nützlichkeit dieser Zellen in der Therapie zu untersuchen. In der Tat, Einbrüche zu entdecken, Enhancer, die möglicherweise zu kennzeichnen könnte entweder GABAergen Interneuronen 20 oder andere neuronale Subtypen, einschließlich glutamatergen Neuronen 21, sind im Gange. Mit der viralen Markierungsmethode hier,kann es möglich sein, unterschiedliche Menschen abgeleiteten Stammzellen mit zelltypspezifischen Enhancern transduzieren, um verschiedene interessierende Zellen vor der Transplantation in vivo-Analyse zu markieren.
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Acknowledgments
Nina Irland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 und NIMH R37 MH049428 Autism Speaks,: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus JLRR unterstützt. PRW wurde durch ein Stipendium der National Science Council von Taiwan unterstützt. SFS wurde durch F32 (MH103003) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
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