Summary
GABAergic progenitores Interneuron cortical dispersar, desenvolver e synaptically integrar em um córtex hospedeiro após o transplante. Estas células podem ser facilmente transduzidas antes do transplante para estudos in vivo de precursores GABAergic geneticamente modificados. Aqui, vamos mostrar técnicas de marcação virais alvo subgrupos Interneuron específicos usando linhas Cre existentes e repórteres Cre-dependentes.
Abstract
GABAergic interneurons corticais, derivados da medial embrionário e eminências ganglionares caudal (MGE e CGE), são funcionalmente e morfologicamente diverso. Incursões foram feitas na compreensão dos papéis dos diferentes subgrupos Interneuron corticais, no entanto, ainda existem muitos mecanismos a serem trabalhados que podem contribuir para o desenvolvimento e maturação de diferentes tipos de células GABAergic. Além disso, a sinalização GABAérgica alterada pode contribuir para fenótipos de autismo, esquizofrenia e epilepsia. Linhas Cre-driver específico começaram a dividir as funções de subgrupos Interneuron únicas. Apesar dos avanços em modelos de ratos, muitas vezes é difícil de estudar de forma eficiente GABAergic progenitores Interneuron cortical com abordagens moleculares in vivo. Uma técnica importante para estudar a programação autónoma celular destas células é o transplante de células MGE em córtexes hospedeiros. Estas células transplantadas migrar extensivamente, diferenciar, umand funcionalmente integrar. Além disso, as células podem ser eficientemente MGE transduzidas com lentivírus imediatamente antes do transplante, o que permite uma grande variedade de abordagens moleculares. Aqui nós detalhe de um protocolo para a transdução de forma eficiente as células MGE antes do transplante para análise in vivo, utilizando linhas de Cre-driver disponíveis e vectores de expressão Cre-dependentes. Esta abordagem é vantajosa porque combina manipulação genética precisa com a capacidade destas células para dispersar após o transplante, que permite uma maior resolução específica do tipo celular in vivo.
Introduction
GABAergic interneurons corticais compreendem ~ 20-30% dos neurônios no neocórtex de mamíferos, enquanto o restante corresponde a excitatórios, neurônios principais glutamatérgicos. Interneurons são altamente diversificada em propriedades eletrofisiológicas, axônio e dendritos e morfologia sináptica alvo 1, e os desequilíbrios em tom excitatório / inibitória são hipoteticamente subjacentes alguns fenótipos de distúrbios neurológicos / neuropsiquiátricos, incluindo autismo, esquizofrenia e epilepsia 2. O objetivo geral do protocolo aqui descrito é o de proporcionar um meio para modificar de forma eficiente geneticamente GABAergic progenitores Interneuron corticais antes do transplante para análise in vivo.
Interneurons Cortical GABAergic nascem nas eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE, respectivamente) 3,4, bem como a área pré-óptica 5. Progenitores Interneuron corticais submetidos a migração tangencial de longa distância seguidopela migração radial para alcançar os seus objectivos finais. Após a chegada ao seu destino, estes interneurônios corticais deve integrar corretamente na rede neuronal existente, e cada subgrupo interneuron única contribuirá para circuitos cortical de maneiras específicas. Quatro subgrupos principais podem ser distinguidos por meio de marcadores moleculares: MGE-derivado de somatostatina (SST) + e parvalbumina (PV) + subgrupos, e peptídeo derivado CGE-intestinal vasoactivo (VIP) e Reelin + +; - SST 6 subgrupos. Diferentes subgrupos Interneuron corticais nascem ao longo de diferentes tempos durante o desenvolvimento embrionário na CGE MGE e 7, 8. Estes e outros marcadores Interneuron GABAérgicos corticais foram usadas para gerar linhas de Cre-controlador específico para muitos destes subgrupos 9-11.
O transplante de células progenitoras MGE emergiu como uma terapia baseada em células potencial para doenças que podem ser causadas por desequilíbrios tratarem excitação / inibição 12-24. Estes benefícios terapêuticos pode ser devido, em parte, à capacidade única de progenitores MGE (para dispersar, diferenciar e integrar um cérebro hospedeiro), ou potencialmente porque muitos peri-somáticas PV inibidora + células são derivadas do MGE. MGE células também podem ser rapidamente e eficientemente transduzidas com lentivírus antes do transplante 15, permitindo que as células que são geneticamente modificadas in vitro para ser estudada in vivo. A justificativa para o desenvolvimento desta abordagem foi a de superar obstáculos em estudar GABAergic desenvolvimento interneuron cortical e maturação. Em particular, o transplante MGE permitiu aos pesquisadores para estudar o desenvolvimento de células mutantes in vivo, quando o rato mutante forma teriam morrido em um ponto de tempo inicial. Além disso, através da introdução de genes de interesse antes do transplante, os efeitos de genes específicos em um fenótipo mutante pode ser avaliado em um efforma icient.
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para transdução de células MGE com lentivírus antes do transplante. Além disso, mostramos como essa técnica pode ser adaptada para expressar um gene de interesse em subgrupos específicos Interneuron a partir de um grupo heterogêneo de precursores Interneuron corticais, usando uma combinação de lentivírus de expressão Cre-dependentes e disponíveis linhas de rato Cre-driver. Além disso, este protocolo introduz técnicas e uma plataforma para pesquisadores para modificar geneticamente GABAergic precursores Interneuron cortical para estudos in vivo de uma forma única. Uma vantagem desta técnica em relação a outros métodos correntes é que as células transplantadas MGE irá dispersar longe do local de injecção. Além disso, ao contrário de injecções virais focais, depois que as células MGE dispersar sua morfologia é mais fácil de avaliar. Esta abordagem pode ser utilizada para estudar o efeito da introdução de genes de interesse em células de tipo selvagem ou mutantes, a introdução de um tipo de célula específicorepórter para avaliar a morfologia, ou, potencialmente, para estudar o efeito dos alelos da doença in vivo.
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Protocol
Declaração de Ética: Os seguintes procedimentos foram aprovados pelo nosso protocolo da instituição e animal. Certifique-se de obter a aprovação de todos os procedimentos que envolvem cirurgias de sobrevivência antes de iniciar experiências e verificar todos os protocolos estão em dia.
1. Preparação Lentivirus (Passo Opcional)
- Dividir três placas de 10 cm de células HEK293T por cada lentivírus para ser feita, na presença de 10 ml de DMEM / FBS a 10%, e crescer até ~ 60-70% de confluência. Cultivar células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Transfectar as seguintes plasmídeos de ADN (10? G no total) para cada placa utilizando qualquer reagente de transfecção: 6,4 ug CAG-Flex-GFP (sequência de vector lentiviral vector de ADN fornecida na Tabela 1), 1,2 ug pMD2.G (codifica VSV-g), 1,2 ug pRSV-Rev, e 1,2 ug pMDLg / pRRE. Os três vectores lentivirais de embalagem estão disponíveis comercialmente (Tabela
Nota: Esta abordagem particular utiliza lentivir 3ª geraçãovetores al mas vetores de 2ª geração e plasmídeos associados também irá funcionar. - Prepare um recipiente de resíduos contendo uma solução de água sanitária a 10% dentro de um BSL2 certificada capa de inativar quaisquer soluções ou dispositivos que contenham ou contatados lentivírus. Em seguida, remova completamente os media 4-6 horas após a transfecção para a solução de água sanitária, substitua com o mesmo volume de novas mídias, e permitir que as células a crescer.
- Após 4 dias, recolher meios em tubos cónicos de 50 ml e centrifugar a 1000 xg durante 15 min para sedimentar os detritos celulares qualquer. Em seguida, filtrar o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 um. Qualquer filtro de baixa proteína de ligação, como PVDF, funciona bem. Cuidado: lugar tanto resíduos sólidos e líquidos viral na solução de água sanitária.
- Carregar 30 ml de sobrenadante filtrado em tubos de ultracentrífuga e numa ultracentrífuga. Centrifuga-se a 100.000 x g durante 2,5 horas a 4 ° C. Abra os tubos de centrífuga em uma capa BSL2 e remover o sobrenadante para 10% Bleach. Adicionar ~ 100 ul de PBS para o pellet, que produz títulos de 1x10 ^ 7-8 unidades infecciosas / ml. Alíquota do dia e armazenar seguinte à -80 ° C. Alíquotas de lentivírus são estáveis à temperatura de -80 ° C durante pelo menos seis meses.
- Consideração importante: Muitas instituições têm agora núcleos virais. Adquirir vírus concentrado com um título mínimo de 1x10 7 infecciosas unidades / ml, para melhores resultados.
2. Ratos de Doadores para MGE Dissection
- Em primeiro lugar, estabelecer um acasalamento cronometrado entre uma linha Cre-expressando de interesse e quer um mouse tipo selvagem (WT) ou um rato que vai expressar um repórter após recombinação Cre-mediada.
Nota: Muitas linhas de Cre-driver são transgênicos e são mantidos e criados no estado hemizygous. Assim, apenas metade dos embriões irá conter o transgene Cre. O ADN pode ser rapidamente preparados a partir dos embriões durante um curto de PCR para detectar o alelo Cre. Os embriões + Cre pode então ser colhida, de modo que apenas o tecido MGE do genótipo desejado é usado. Alternativamente, um repórter Cre-dependente pode ser usado, para selecionar os embriões para MGE dissecção e transplante. - Calcule qual dia corresponderá a E13.5. Se os animais foram pareados na noite anterior, no dia da ficha é de 0,5. Encomendar camundongos dura entrada grávidas ou uma fêmea com filhotes WT P1, a fim de ter tempo de pós-natal (P) 1 ratos no dia do tecido do doador será E13.5. Como alternativa, configurar esses acasalamentos em casa uma semana antes de emparelhar os animais doadores.
Nota: A primeira estratégia de gerar tanto E13.5 e embriões P1 / filhotes para o mesmo dia é muitas vezes difícil de fazer de forma confiável.
3. Preparação dos meios de comunicação, ferramentas e equipamentos.
- Prepare os reagentes e ferramentas para preparação de células MGE (Tabela 2).
- Prepare uma superfície limpa e coloque forceps limpas, tesoura e uma faca ou microcirúrgica ou pinça fina (para dissecção dos tecidos preciso) na superfície.
- Preparar a solução de sal equilibrada de Hank (HBSS), fou dissecação, e meio de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM) com 10% surem fetal bovino (FBS), durante a transdução.
- Pré-incubar 20-30 ml de DMEM / FBS a 10% em uma temperatura de 37 ° C cultura de tecidos incubadora durante cerca de 1 h. A tampa deve ser solto para permitir a troca de gases e de equilíbrio do pH dos meios de comunicação.
Nota: A pré-incubação de mídia podem ser preparadas imediatamente antes do início da dissecção.
4. MGE celular Preparação
- Sacrificar o ratinho grávida de acordo com um protocolo aprovado animais e remover os embriões numa placa de Petri contendo 10 centímetros de gelo-HBSS frio.
- Remover o cérebro de cada embrião usando um escopo de dissecação (fazer um de cada vez, deixando o resto dos embriões em gelada HBSS) e, em seguida, proceder para cortar o tecido MGE.
Nota: detalhado abaixo, e na Figura 1, são passos importantes que mostram como remover a MGE. Além disso, a Figura 2 é um filme que mostra toda a dissecçãoprocedimento.- Posicione o cérebro com o lado ventral para cima (Figuras 1A, A '). Nota: também é bom ter o dorso virado para cima. Cortar o cérebro em metade ao longo do plano sagital para gerar duas peças. Um exemplo hemisected cérebro é mostrado (Figuras 1B, B '), observe que aspectos ventrais da tampa do cérebro dorsal (o córtex sobreposta) e e cercam o tecido eminência ganglionar (GE).
- Em seguida, com a mão dominante, segure o auxílio de pinças muito finas ou um stabknife (Tabela 2), enquanto que a imobilização do hemisfério com uma pinça na posse de uma mão não-dominante. (Aspecto medial do hemisfério deve ser voltada para cima). Desdobrar o dorsal e ventral de tecido com uma pinça e uma faca facada para revelar o tecido subjacente GE (Figura 1C e diagramado na Figura 1C).
Nota: A remoção de alguns meios de comunicação do prato dissecção petri pode tornar mais fácil para estabilizar o tecido enquanto performing a dissecção MGE. - Faça cortes retos com o stabknife ou uma pinça fina para separar o CGE, LGE e tecidos do septo (ver exemplo cortes indicados por linhas quebradas vermelhas, as Figuras 1D e D '). Estes cortes podem ser feitos em qualquer ordem.
Nota: Imagine a MGE como uma 'caixa' que é cortada para fora do tecido circundante. Fazer isso ajuda reproducibly fazer cortes semelhantes para cada dissecção, reduzindo a variabilidade nas dissecções de tecido. - Por fim, vire a MGE de lado e retire o fundo (o que foi o aspecto lateral do cérebro). Isto remove a zona do manto da MGE (descartar nas Figuras 1E e 1E ') a partir do resto do MGE. O aspecto remanescente de MGE contém principalmente zona ventricular e porções zona subventricular da MGE, que contém quase todas as células progenitoras MGE. Continue com este tecido.
- Consideração importante: A adição do gel de silicone para o fundo de uma placa de Petri cAn servir como uma superfície excelente dissecação, pois protege as pontas delicadas de uma pinça e proporciona uma superfície macia para fixar o tecido com uma pinça.
4.3 estratégias adicionais para MGE dissecação.
- Cortar a pele do embrião utilizando fórceps como tesouras para remover rapidamente o cérebro. À medida que o embrião fixa no seu lado, manter o tecido na base da cabeça com as pinças utilizadas para fixar o tecido. Primeiro, corte anterior ventral para o cérebro e posterior ventral para o cérebro, e em seguida, conecte os dois cortes ao longo do lado do embrião. Em seguida, pegue o pedaço de pele e puxe-o sobre a parte superior do cérebro. O cérebro pode então ser rapidamente dissecado afastado do restante tecido.
- Alternativamente, ancorar o aspecto posterior do cérebro inteiro atrás do córtex. Enquanto isso, segure cada hemisfério no aspecto caudal mais dorsal do córtex e rasgar o córtex longe do tecido ancorado em uma direção anterior. Desta forma, tanto cortices pode ser removido e os eminencias ganglionares bilaterais são revelados, ainda ligado ao resto do tecido preservando a anatomia medial-lateral.
- Alterne para a facada-faca para fazer cortes precisos em todo o MGE em cada hemisfério. Utilize qualquer um jogo limpo separado de fórceps para recolher o MGE ou uma pipeta com uma grande ponta (ie., P1000).
Nota: Mantenha o tecido coletado longe de todos os outros materiais dissecado, como alguns meios de comunicação social é inevitavelmente transferida quando a MGE é coletado. - Recolhe-se o MGE e colocar o tecido num tubo de recolha de 1,5 ml contendo DMEM / FBS a 10%, (um volume de 500 ul é suficiente para recolher os EGM). Repita para o outro hemisfério e colocar no mesmo tubo de coleta. Manter as amostras em gelo até todo o tecido é coletado.
5. Lentivirus rotulagem e Transplante
- Mova os tubos de tecido MGE em um BSL2 certificada capô e remova a mídia.
Nota: AMGE tecido é suficientemente grande para ser visível a olho nu e vai assentar no fundo do tubo permitindo que os meios frios e poderem ser facilmente removidos cuidadosamente. - Adicionar ~ 500 ul de meio DMEM / FBS a 10%, que foi pré-incubada em um temperatura de 37 ° C incubadora de cultura de tecidos. Em seguida, adicionar polibreno para facilitar a transdução de cada tubo para uma concentração final de 8 ug / ml. Tritura-se o tecido MGE para criar uma suspensão de células simples, utilizando uma ponta de pipeta P1000. Finalmente, adicionar ~ 15-20 ul de lentivírus concentrou-se para cada tubo.
- Consideração importante: A trituração de 10-12 vezes é suficiente para quebrar o tecido MGE a partir de um único embrião, mas mais triturações pode ser necessária se vários EGM são agrupados. Experimente diferentes condições de trituração para determinar o que funciona melhor.
- Feche bem cada tubo, inverta para misturar, de lugar todos os tubos em um 37 ° C incubadora. Incubar as células em lentivírus durante pelo menos 30 minutos e até 1 hora. Tempos maiores resultaram em deviabilidade celular vincado. Inverta os tubos a cada 10 minutos até que o tempo acabou.
- Após incubação com lentivírus, remover os tubos da incubadora e centrifugar a 700 xg durante ~ 3 min para sedimentar as células. Na capa BSL2, remover o sobrenadante e descartar em lixívia a 10%. Em seguida, adicionar 1 ml de DMEM / FBS a 10% e tritura-se o sedimento de 2-3 vezes para lavar, depois centrifugar de novo à mesma velocidade para sedimentar as células. Repita esta lavagem passo 2-3 vezes mais para remover o excesso de vírus.
Nota: executar os passos de centrifugação a 4 ° C, no entanto, reduziu a viabilidade não foi observada quando rodadas curtas são realizados à temperatura ambiente. - Após a lavagem final, retire o máximo de mídia quanto possível e colocar cada tubo em gelo. Devido aos meios de comunicação residual sobre os lados do tubo, ~ 2-3 uL de meios vai terminar cobrindo o pellet celular no momento em que o procedimento de transplante começou.
6. Transplante e Validação
- Adquirir filhotes P1 hospedeiras e preparar o procedimentoa área por baixo de pulverização com 70% de etanol. Para manter a esterilidade durante o procedimento, recomenda-se realizar esses procedimentos em uma sala dedicada procedimento limpo. Além disso, use um instrumentos cirúrgicos autoclavada esterilizar superfícies que os filhotes estarão em contato com a utilização de 70% de etanol. Um exemplo de equipamento representativo necessário para realizar os transplantes e uma área procedimento representativo é mostrado na Figura 3.
Nota: Embora este procedimento é uma injecção de pequenos volumes, e não um procedimento cirúrgico, que exigiria uma incisão, ferida aberta ou suturas, é ainda recomendado que um novo micropipeta é utilizado para cada rato para ser injectada. As micropipetas são esterilizada pelo calor quando puxada e chanfrado numa superfície que foi pulverizada com etanol a 70% a ser armazenado num contentor selado.
- Gerar micropipetas para ter um diâmetro na ponta entre 40-80 mm. Seguindo estas dimensões irá produzir óptimaresultados. Calor esterilizar as micropipetas quando puxado e chanfrado sobre uma superfície e spray com etanol 70% antes de guardar as micropipetas em um recipiente fechado.
Observação: Como alternativa, se o acesso aos dispositivos necessários para criar estas agulhas (Tabela 2) é limitativo, utilizar qualquer outro dispositivo de injecção. No entanto, estes podem não ser tão adequados como as micropipetas devido a diferentes diâmetros. - Elaborar óleo mineral em uma seringa de 1 ml, e com uma agulha de 30 G 1/2, encher a pipeta de vidro completamente com óleo mineral. Em seguida, monte o êmbolo para o dispositivo estereotáxico, em seguida, anexar a pipeta de vidro para o dispositivo estereotáxico e carga para o êmbolo. Usando a unidade hidráulica, mover o êmbolo na metade do caminho para a pipeta de vidro, remoção de óleo mineral que sai com uma toalha de papel limpa limpa.
- Como alternativa ao uso de uma seringa, submergir a extremidade traseira da pipeta em óleo mineral, sendo preenchido por acção capilar. Para evitar bolhas de ar na pipetae, manter uma pressão positiva na seringa até completamente para fora da pipeta de vidro.
Nota: Outros dispositivos podem ser utilizados para o transplante com sucesso células MGE 14. Qualquer dispositivo que pode entregar um volume menor ou perto de 100 obras nl bem para este procedimento.
- Como alternativa ao uso de uma seringa, submergir a extremidade traseira da pipeta em óleo mineral, sendo preenchido por acção capilar. Para evitar bolhas de ar na pipetae, manter uma pressão positiva na seringa até completamente para fora da pipeta de vidro.
- Em seguida, use uma toalha de papel estéril, ou qualquer material absorvente, com o canto torcido em uma ponta fina para remover delicadamente o excesso de mídia acima do pellet celular MGE. Este passo concentra a densidade de células, de modo que o volume de injecção mais pequenos podem ser atingidos. Em seguida, utilizar um volume baixo (P2 é o preferido) a pipeta para desenhar-se lentamente o pellet celular e tritura-se 1-2 vezes antes de passar a suspensão de células para uma superfície hidrofóbica. O volume deve ser um pouco menos de 1 ml. Mover a ponta da agulha no interior da suspensão de células e o uso da unidade hidráulica, chamar-se a suspensão de células para a pipeta.
- Anestesiar um filhote P1 via hipotermia (embrulhe em uma luva de látex e colocar em gelo durante ~ 2-4 min).Verifique se há eficácia da anestesia com um estímulo nocivo. Aperte a pele entre os dedos dos pés com uma pinça fina: o filhote deve ser responder se beliscou. Em seguida, coloque o filhote em um molde que está sob o dispositivo de injecção, em seguida, fazer a pele firmemente puxando para trás a pele da cabeça e prenda com fita do laboratório padrão.
Nota: Enquanto a hipotermia é muito eficaz em ratos neonatais e resulta em baixa taxa de mortalidade, os procedimentos devem ser feitos rapidamente, como filhotes começará a se recuperar em menos de 10 min. Além disso, 4 min em gelo é um limite superior do que pode ser tolerado. Tente apenas induzir hipotermia uma vez se for necessário um tempo maior para injectáveis. No entanto, se um filhote de cachorro recupera cedo, primeiro permitir que o filhote de cachorro para se recuperar totalmente antes de induzir hipotermia novamente. Além disso, só induzir hipotermia mais uma vez para efectuar injecções. Os filhotes de cachorro vai se recuperar dentro de 5-10 min de hipotermia. Isso pode ser facilitado, colocando os filhotes com maca e mãe ou colocando o filhote em um surfac quentee para se recuperar. - Usando um dispositivo estereotáxico, posicionar a ponta da pipeta de vidro sobre a superfície sobre a cabeça do filhote, perpendicular à superfície da cabeça. Quando a pipeta está em contato com o chefe, considere isso como '0'. Em seguida, empurrar a pipeta através da superfície da pele e do crânio para o córtex, e, em seguida, inserir retrair a pipeta ~ 2 vezes antes de parar. Para um óptimo de células alvo para o neocórtex, injecções são realizadas quando a micropipeta está a uma profundidade de 0,1 mm. No entanto, este deve ser otimizado pelo utilizador (ver nota abaixo).
Nota: Enquanto esta profundidade atinge de forma confiável as camadas mais profundas neocortical com os dispositivos descritos acima, algumas profundidades devem ser testados determinada empiricamente. Além disso, uma variedade de diferentes profundidades em rostro-caudal e médio-lateral posição deveria ser testado para se determinar que profundidade é óptima em cada local. Além disso, a punção inicial deve ser rápida, pois a penetração lenta no neocórtex diminui a capacidade de cleanly penetrar no tecido. Tente diferentes velocidades quando a primeira partida este procedimento para descobrir o que funciona melhor. Além disso, para as coordenadas de teste, não há nenhum substituto real para usando células marcadas, como corantes têm sido pouco confiável para indicar posição. - Uma vez que a agulha esteja em posição, rodar o dispositivo hidráulico para fazer avançar o êmbolo para a pipeta de vidro, que empurra um volume definido da suspensão celular no córtex. Injectar 50-70 nls por site. Repita este procedimento em 3-6 locais diferentes em diferentes níveis rostral-caudal se o objetivo é a obtenção de uma ampla distribuição de células de todo o neocórtex.
Nota: Volumes de 100 nl ou maior pode causar lesões e levar a grandes aglomerações de células injectadas que não migrem para fora de forma eficiente no local da injecção. Assim, o volume de injeção de menores (~ 70 nl ou menos) são ótimas, mais de mais sites se o tempo permitir. - Quando as injeções são concluída, remova o filhote do palco e marcá-lo (recorte dedo do pé é uma maneira confiável para identificar o pups mais tarde). Uma vez que o filhote se recuperou e é capaz de se mover por conta própria (o que ocorre dentro de minutos de removê-los do palco), colocá-lo de volta com a mãe e ninhada.
Nota: Uma vez que este é um procedimento minimamente invasivo, não existem procedimentos pós-cirúrgicos, uma vez que o filhote está se movendo livremente e aquecido. No entanto, os filhotes devem ser verificadas, não só após o procedimento, mas também no dia seguinte para garantir que eles não têm sinais de deterioração da saúde. - Antes de iniciar o procedimento na próxima cachorro, pulverize a área com etanol 70% para manter uma estéril área de trabalho. Permitir que os filhotes injectados para desenvolver e avaliar em seguida o tecido no estádio de desenvolvimento apropriado (s).
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Representative Results
Como as células MGE tem a capacidade única de migrar e integrar, quando transplantadas para um neocórtex anfitrião 16, eles proporcionam um excelente sistema modelo para a manipulação genética antes de estudos in vivo. Aqui, vamos mostrar como se pode isolar o tecido MGE a partir de embriões E13.5 (Figuras 1 e 2), que, em seguida, pode ser transduzidas com lentivírus in vitro ou de forma rápida antes do transplante para estudos in vivo. MGE Labeling via lentivírus foi realizada antes de usar um intensificador de condução GFP em neurônios GABAérgicos 15. No entanto, a capacidade de expressar genes em subgrupos específicos de uma população heterogênea antes do transplante pode ajudar muito os estudos de dispersão e integração dessas células. Nisto, procurou-se desenvolver um meio para atingir a expressão de uma proteína fluorescente a um subgrupo específico interneurónio, aquelas que expressam somatostatina (SST) +.
Nós fiprimeiro subclonado um repórter comercialmente disponível Cre-GFP dependente (informação vectorial, Tabela 2) em uma espinha dorsal de lentivírus. O vector foi gerado por subclonagem da primeira cassete contendo GFP flanqueado pelos sítios loxP do vector de AAV e ligando-o em um vector lentiviral espinha dorsal 15 utilizando os locais de restrição Xbal e PflMI, (esta cassete continha apenas alguns do promotor CAG). Em seguida, o restante do promotor CAG foi excisada de um vector de expressão de mamífero pCAGGS com sítios Spel e Xbal e ligado no sítio Xbal do vector lentiviral para gerar plenti-CAG-Flex-GFP. O local 5 'Spel da inserção é de cortesia aos XbaI e, portanto, destruiu o local 5', enquanto o site da 3 'XbaI foi conservada. O vector resultante (esquema Figura 4A, a sequência do vector Tabela 1) foi testado em primeiro lugar in vitro na presença ou ausência de Cre (esquema de ensaio in vitro, Figura 4B). MGE neurônios primários de Ai14 Flox / + E13.5 embriões foram cultivados e transduzidas com uma combinação de lentivírus. Poucos ou nenhum GFP + células ou tdTomato + foram observados apenas com a transdução do CAG-Flex-GFP lentivírus (Figuras 4C, 4F e 4I). TdTomato fluorescência estava presente nas células MGE transduzidas com um lentivírus CMV-Cre, indicativos de expressão de Cre (Figuras 4D, 4G e 4J). Finalmente, co-transdução de células MGE resultou em muitas células tdTomato + que também expressaram a GFP, indicando que o CAG-Flex-GFP lentivírus foi funcionando como esperado (Figuras 4E, 4H e 4K). Foram observadas algumas células GFP + raros que não eram tdTomato +, potencialmente devido ao repórter transduced incorporando ao lado de um promotor forte, que representou <2% de todas as células GFP +.
content "> células MGE transplantadas para um tipo selvagem neocortex hospedeiras dispersar, maduro e integrar-se no neocórtex anfitrião 16 E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE células foram transplantadas para neocórtices WT no P1 (esquema, Figura 5A) e sua distribuição examinado em 7 e 35 dias após o transplante (DPT). Em ambas as idades, as células tdTomato + podiam ser vistos em todo o neocórtex (Figuras 5B e 5C). As imagens das Figuras 5B e 5C são representativos transplantes utilizando o MGE . células de um único embrião Para testar a eficiência com que as células MGE poderia ser rotulado com o protocolo descrito aqui, as células MGE de SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + embriões foram transduzidas com o lentivírus CAG-Flex-GFP e transplantados em mesmo modo. Para estas experiências, ~ 15 ul de concelentivírus ntrated (~ 1x10 7 unidades infecciosas / ml) foi utilizado com as EGM combinados de um embrião para cada transplante. As células foram em seguida transplantadas para um hospedeiro córtex P1 WT e analisados em 7 DPT (figuras 5D-5F). Das células transplantadas (tdTomato +), aproximadamente 20% estavam GFP +, indicando a transdução com o CAG-Flex-GFP lentivírus (Figura 5G). Estes dados sugerem que, com a quantidade e titulação de lentivírus descrito acima, ~ 20% das células transplantadas MGE pode ser rotulada. A quantidade de vírus pode ser diminuída ou aumentada, ou potencialmente outras variáveis como duração de incubação viral pode ser alterada, para atingir marcação celular sparser ou mais denso.Utilizando tecido MGE partir de uma linha de Cre-repórter dependente do rato em conjunto com o lentivírus CAG-Flex-GFP pode limitar o número de marcadores adicionais que podem ser sondados para por imunofluorescência. Portanto, SST-IRES-Cre + < / Sup> tecido E13.5 MGE foi recolhido e transduzidas com lentivírus CAG-Flex-GFP, a fim de visualizar as células transplantadas MGE que expressavam Cre (será GFP +). Estas células foram transplantadas em P1 WT córtex e avaliado em 35 DPT (ver desenho experimental, Figura 6A), um ponto de tempo em que os marcadores Interneuron maduros são expressas. Aos 35 DPT, ~ 85% de células GFP + co-expressa SST, mas apenas 4% ~ expresso PV (Figuras 6B-6H). Estes números são consistentes com a análise de linhagem da rato SST-IRES-Cre, que também destino mapeia para ~ 5-10% de células PV + 9 (Vogt e Rubenstein, resultados não publicados). Estes dados sugerem que a rotulagem viral da MGE é eficiente e pode ser uma abordagem aplicável para a introdução de um repórter ou potencialmente um gene de interesse antes da análise in vivo.
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Figura 1. procedimento Representante para a dissecação de E13.5 MGE tecido. Exemplo dissecção do tecido MGE tanto para culturas primárias ou transplantes. (AE) Imagens de E13.5 dissecções cérebro, e esquemas para realçar estruturas (A'-E ') e as etapas importantes do processo. (A, A ') representativas E13.5 cérebro visto do aspecto ventral. Linha vermelha representa o primeiro corte feito, que vai hemisect o cérebro em duas partes. (B, B ') Exibição de um hemisection cérebro. O aspecto medial é visível, com aspecto lateral para baixo. Tissue do córtex dorsal (cor azul) se sobrepõe as eminências ganglionares. Além disso, o tecido ventral que será removido é mostrado em laranja. (C, C ') Ver e ilustração das eminências ganglionares exposto depois que recobre o tecido foi descascado longe. (D, D') Same vista ganglionar exposto emi nences como em (C, C '), mas com os locais de corte detalhados mostrados como linhas quebradas vermelhas. Após MGE é cortado de acordo com as linhas denotados em (D, D '), o tecido está ligada no seu lado (E, E') e a face lateral é cortada e desprezada. Etapas representante na dissecção e isolamento de tecido MGE. Abreviaturas: (CGE) da eminência ganglionar caudal, (LGE) eminência ganglionar lateral, (MGE) medial ganglionice eminência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Filme exibindo uma dissecção E13.5 MGE. Filme descreve a remoção de um cérebro E13.5 seguido por subsequente desdobramento e remoção do tecido de revestimento. A MGE é marcado e os cortes feitos para remover o tecido circundante são mostrados em uma ordem passo a passo.. "Target =" _ MGEdissect movie.mov blank "> Clique aqui para ver este vídeo.
Figura 3. Representante área procedimento e exemplo de agulha de injecção para o transplante neonatal. (A, A ') Imagens que mostram um exemplo de configuração para realizar transplantes em ratinhos neonatais. Um microscópio (1) está posicionado acima de uma fase contendo um molde que pode conter um rato neonatal (5) e um dispositivo estereotáxico (2). (A ') uma imagem ampliada de (A) mostra a região do dispositivo estereotáxico que detém da agulha de injecção de vidro (6) com um êmbolo inserida (7). O êmbolo é controlado por uma unidade hidráulica fina (4) e move-se óleo mineral no interior da agulha de vidro que medeia a fluir para dentro e para fora da agulha. (B) Exemplo de uma agulha de injecção de vidro com uma ponta chanfrada. Para o governante, em (B), cada um dos principais demarcação = 100 mm. (C) lista de inventário de itens mostrados na (A, A '). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os testes in vitro demonstram a expressão de GFP, a partir de um lentivírus CAG-Flex-GFP na presença de Cre. (A) Esquema de lentivírus como o CAG-Flex-GFP funciona na presença de Cre. (B) Esquema MGE de cultura de células primárias experimento para avaliar se o lentivírus CAG-Flex-GFP poderia expressar GFP em células com expressão Cre. Resumidamente, células a partir de um repórter MGE Cre-dependente, Ai14 (expressa tdTomato na presença de Cre), foram cultivadas in vitro e transduzidas com Cre e / ou Flex-GFP lentivírus. (CK) imagens de imunofluorescência de E13.5 MGE culturas primárias que foram transduzidas com um CMV-Cre, CAG-Flex-GFP ou ambos. As culturas foram fotografadas para expressão tdTomato nativa, GFP e DAPI. Barra de escala em (K) = 100 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagens representativas de transplantados e transduzidas, SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + MGE células. (A) Esquema do projeto experimental para transplantar a utilização de células MGE sozinho ou após a transdução lentiviral em um tipo selvagem (WT) de acolhimento, (DPT) dias transplante post. Resumidamente, E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE células foram transplantadas quer ou transduzidas com o lentivírus CAG-Flex-GFP antes do transplante em neocórtices WT e avaliado em 7 DPT (B, C) imagens de imunofluorescência neocórtices em 7 ou 35 DPT mostrando MGE transplantadas células representativas (tdTomato +). (DF) imagens de imunofluorescência de células MGE transduzidas com o lentivírus CAG-Flex-GFP avaliado em 7 DPT. (G) Quantificação da proporção de células tdTomato + que expressar GFP em 7 DPT. Barras de escala em (C) e (F) = 100 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6. Imagens representativas de CAG-Flex-GFP lentivírus transduced, SST-IRES-Cre + MGE transplantes que Interneuron marcadores subgrupos derivados do MGE co-express. (A) Esquema de E13.5 SST-IRES-Cre + MGE colheita de células e transdução com um lentivírus CAG-Flex-GFP e transplantação no neocórtex de P1 WT anfitriões antes da avaliação em 35 DPT. Imagens representativas do neocórtex de hospedeiros transplantados mostrando a expressão de GFP, a partir do vector de Flex (B, E), co-coradas quer para a somatostatina (SST) (C) ou parvalbumina (PV) (F). (D, L) fusionado imagens co-coradas com DAPI. (H) A quantificação da proporção de células que co-GFP expressa SST ou PV. Os dados representam média ± SEM (n) = barra 3. Escala em (G) = 100 pm."Target =" _ /52740fig6large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. arquivo FASTA do vector pLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA.
| Os reagentes e equipamentos para a preparação de células MGE e transdução | Catalogo | Companhia | ||||||
| 1) | Dulbecco Modified Eagle Médium, com alto teor de glucose | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Inactivado pelo calor Soro Fetal Bovino | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Solução salina equilibrada de Hanks (HBSS), sem cálcio ou magnésio | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | Tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (ou outratubos de coleta com tampa) | 3810X | Eppendorf Internacional | |||||
| 5) | Polybrene | sc-134220 | Biotecnologia SantaCruz | |||||
| 6) | Stab faca reta 22,5 ° (opcional) | REF 72-2201 | Especialidades cirúrgicas corporação | |||||
| 7) | Placa de petri (10 cm), por dissecção de tecidos | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | 2 pinça de ponta fina, como Dumont # 5 | 11254-20 | Belas ferramentas científicas | |||||
| 9) | 37 ° C incubadora de cultura de tecido com 5% de CO 2 de entrada | C150 | Encadernador | |||||
| 10) | Tabletop centrífuga que pode girar 1,5 ml microtubos | |||||||
| 11) | Qualquer pipeta P1000 que pode ser utilizado para a trituração da célula | |||||||
| 12) | Nível de Biossegurança 2 hood | |||||||
| Os reagentes e equipamentos para in vitro MGE culturas primárias | Catalogo | Companhia | ||||||
| 1) | Lab-Tekii chamberslides com tampa, 8 bem | 154941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | A poli-L-lisina a 0,1% peso / volume | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Rato A laminina, 0,5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Meio Neurobasal | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | B27 soro suplemento livre | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, estoque 100x | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penicilina-estreptomicina, estoque 100x | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glicose, (preparar uma solução a 25% em água) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| Os reagentes e equipamentos para o transplante de células MGE | Catalogo | Companhia | ||||||
| 1) | Seringa de 1 ml | REF 309602 | BD, Becton Dickinson e companhia | |||||
| 2) | 30 1/2 G agulha | 305106 | BD, Becton Dickinson e companhia | |||||
| 3) | Prebore Cision para entregar 5 jul (vem com o êmbolo) | 5-000-1005 | Drummond empresa científica | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Microscópio estéreo com boomstand | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Digital apenas para instrumento camundongos estereotáxica | 51725D | Empresa Stoelting | |||||
| 7) ** | Óleo de eixo único micromanipulator fina hidráulica | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Diamante beveler rotativo revestido | n / d | feita em casa | |||||
| 9) | Pipeta Needlete extrator | 730 | Instrumentos Kopf | |||||
| 10) | Óleo mineral | n / d | Qualquer loja de droga ou farmácia | |||||
| 11) | Qualquer pipeta e dicas que podem reliaby medida 1 ml de volume de | |||||||
| ** Estes são os modelos específicos que usamos, mas muitas outras configurações devem trabalhar | ||||||||
| Optional Os reagentes (para fazer Lentiviruses) | Catalogo | Companhia | ||||||
| 1) | 25 mm, 0,45 um filtro | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Tubos de centrífuga de Ultra-claros (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1,5 ml tamanho) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Outras fontes comercialmente disponíveis | Catalogo | Companhia | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE plasmídeo gag / pol | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev plasmídeo que codifica Rev | 12253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G plasmídeo que codifica VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |||||
Tabela 2. lista Inventário de reagentes e ferramentas. Um inventário de reagentes disponíveis comercialmente, incluindo meios de comunicação, instrumentos de dissecação, equipamento representativo para o transplante e DNA vetores. (Na) Não disponível ou aplicável.
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Discussion
O uso de GABAergic precursores Interneuron cortical das eminências ganglionares embrionárias (BEE) para terapias à base de células está mostrando a promessa para muitas condições 12 -1 4. São necessárias técnicas moleculares precisos para acompanhar e expressar genes de interesse em subgrupos Interneuron específicos. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a marcação das células embrionárias com lentivírus MGE antes do transplante e mostrar como esta técnica pode ser utilizada para expressar genes de interesse em subgrupos específicos Interneuron corticais para a análise in vivo.
O protocolo aqui descrito pode ser usado com fiabilidade, contudo, a reprodutibilidade óptima é essencial para aderir a alguns passos críticos. Em primeiro lugar, para a transdução virai para ser eficiente, a temperatura e pH fisiológico são necessárias. Se forem cumpridos esses parâmetros, as células MGE podem ser transduzidas em ~ 30 minutos. Em segundo lugar, certifique-se de ter um pellet MGE densa antes de prosseguirpara fazer um transplante. Isto é importante, porque apenas um volume limitado pode ser injectado no cérebro do rato neonatal em cada local, sem a ocorrência de danos, e as células vão migrar para longe do local de injecção, de modo que a sua densidade no momento do transplante é uma preocupação menor do que pode ser esperado. Finalmente, execute algumas condições de teste com células MGE que expressam um repórter fluorescente para determinar que a injeção profundidades são ideais. Embora este protocolo utilizado MGE células, células EGC também poderia ser usado da mesma maneira. Uma desvantagem é que não há muitas linhas Cre-motorista que restringem a expressão a toda a CGE ou para subgrupos específicos de interneurons CGE derivados. No entanto, o péptido intestinal vasoactivo (VIP) 9 é uma Cre-linha fiável que pode ser usada para separar deste subgrupo de células derivadas CGE. À medida que novas linhas tornam-se disponíveis, será possível empregar este protocolo com precisão mais genética.
Anteriormente, nós e outros têm mostradoo utilitário de introdução de genes em células MGE antes do transplante através de electroporação com lentivírus ou 15, 17. Embora estas técnicas foram eficazes na introdução de genes para a análise in vivo, tecido MGE é heterogéneo e dá origem a vários subgrupos Interneuron bem como as células não-neuronais 4. Além disso, tem sido difícil de expressar um gene de interesse em apenas um subgrupo específico interneurónio. Grandes avanços têm sido feitos para gerar linhas transgénicas que recapitulam os padrões de muitos subgrupos Interneuron corticais, incluindo a expressão, mas não se limitando a, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre um d VIP-Cre 9 -11, e com o advento de novas linhas irão ajudar a elucidar as populações adicionais possíveis no futuro. Além disso, com a geração de repórteres Cre-dependentes e vectores de expressão, incluindo vectores repórteres de Cre-dependentes aqui utilizado, uma expressão mais precisa dos genes de interesse pode ser conseguida.
Uma limitação para esta técnica podem ser o tamanho do fragmento que se pode embalar de forma fiável a um vector lentiviral. Além disso, esta abordagem não foi ainda testada com AAV. No entanto, uma vez que esta técnica é optimizada por um indivíduo, podem ser utilizados muitos tipos de esta abordagem. Em primeiro lugar, a abordagem descrita aqui permitirá que pesquisadores de expressar repórteres usando um lentivírus repórter Cre-dependente em conjunto com células de doadores MGE de linhas de Cre-driver específico. Esta técnica pode ser utilizada para avaliar a morfologia das células MGE individuais ou, potencialmente, para expressar um gene de interesse em diferentes subgrupos se um segundo gene é clonado no vector. Em segundo lugar, pode também ser viável a utilização de um vírus que expressam Cre com Cre-dependente células repórter MGE dadores ou potentially utilizar a evolução elementos de ADN conservados, promotores e potenciadores, para dirigir a expressão em populações distintas de células a partir de uma população heterogénea.
Um obstáculo para superar futuro será rotular as células-tronco pluripotentes induzidas de origem humana ou células-tronco embrionárias para potencialmente purificar e / ou estudar um grupo específico de células. Curiosamente, os potenciadores de DNA conservadas também pode ser usado em sistemas de expressão virais para alvejar neurónios GABAérgicos em cultura primária, após injecção no córtex, e antes do transplante de células MGE 15, 18, 19. Os potenciadores pode ser uma resposta a esse obstáculo e será de interesse como ferramentas moleculares, como novas técnicas são necessárias para estudar a utilidade destas células em terapia. Na verdade, incursões para potenciadores descobrindo que poderia rotular tanto interneurônios GABAérgicos 20 ou outros subtipos neuronais, incluindo neurônios glutamatérgicos 21, estão em andamento. Usando o método de marcação viral aqui,pode ser possível para transduzir células estaminais diferenciadas de origem humana com potenciadores específicos do tipo de célula para marcar células distintas de interesse antes do transplante e na avaliação in vivo.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações para JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 e NIMH R37 MH049428. PRW foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan. SFS foi apoiada por F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
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