Summary
GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구 세포는 이식 후 호스트 피질에 통합 시냅스 개발하고, 분산. 이 세포는 쉽게 유전자 변형 GABA 성 전구 물질의 생체 내 연구에 이식하기 전에 형질 도입 할 수있다. 여기서 우리는 기존 Cre 호텔 라인과 Cre 호텔 의존 기자를 사용하여 특정 interneuron 하위 그룹을 대상으로 바이러스 성 라벨링 기술을 보여줍니다.
Abstract
배아 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE과 CGE)에서 파생 된 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 기능과 형태 학적으로 다양하다. 진출 별개 피질 interneuron 서브 그룹의 역할 이해를 만들어왔다 그러나, GABA 성 세포의 다른 유형의 발달 및 성숙에 기여할 수 손볼 여전히 많은 메커니즘이있다. 또한, 변경 GABA 성 신호는 자폐증, 정신 분열증과 간질의 표현형에 기여할 수있다. 특정 치운다 드라이버 라인은 고유 interneuron 서브 그룹의 기능을 소포 시작했다. 마우스 모델에서의 발전에도 불구하고, 효율적으로 생체 분자 접근법 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 연구하기가 어렵다. 이러한 세포의 세포 자율적 인 프로그램을 연구하는 데 중요한 기술은 호스트 피질에 MGE 세포의 이식이다. 이 이식 된 세포는 분화, 광범위하게 마이그레이션,차 기능적으로 통합 할 수 있습니다. 또한, MGE 세포를 효율적으로 접근 분자의 다수를 허용 이식 직전 렌티 바이러스 형질 도입 될 수있다. 여기서 사용할 치운다 드라이버 라인과 치운다 의존성 발현 벡터를 사용하여, 세부를 효율적으로 생체 내 이식 분석 전에 MGE 세포를 형질 도입하는데 사용되는 프로토콜 우리. 이 생체 내에서 크 셀형 특정 해상도를 허용하는, 이식 후 세포를 분산시키는 이들의 능력과 정확한 유전자 조작을 결합 때문에이 방법은 바람직하다.
Introduction
나머지는, 글루탐산 주요 신경 세포를 흥분에 해당하는 동안 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 포유류의 신피질에 신경 ~ 20 ~ 30 %를 포함한다. 의 interneurons는 전기 생리 학적 특성, 축삭과 수상 돌기의 형태와 1을 대상으로 시냅스 매우 다양하고, 흥분성 / 억제 톤의 불균형은 자폐증, 정신 분열증과 간질이 포함 신경 / 신경 정신 질환의 일부 표현형의 기초가 가설된다. 본원에 기술 된 프로토콜의 전반적인 목적은 효율적으로 유전자 분석을위한 생체 내 이식 전에 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 수정하는 수단을 제공하는 것이다.
대뇌 피질의 GABA 성에서의 interneurons는 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE 각각 CGE) 3,4뿐만 아니라 전핵 지역 5 태어난다. 두피 interneuron 전구 세포는 장거리 접선 마이그레이션이 다음 받다방사형 마이그레이션에 의해 최종 목표에 도달. 목적지에 도착하면,이 대뇌 피질의 interneurons 올바르게 기존의 신경 네트워크에 통합해야하며, 각각의 고유 interneuron 하위 그룹은 특정 방법으로 대뇌 피질의 회로에 기여할 것이다. 네 가지 주요 하위 그룹은 분자 마커에 의해 구별 할 수 있습니다 MGE 파생 소마토스타틴 (SST) + 및 parvalbumin (PV) + 서브 그룹 및 CGE 유래 혈관 활성 장 펩티드 (VIP) + 및 Reelin +; SST - 하위 그룹 6. 다른 대뇌 피질의 interneuron 하위 그룹이 MGE과 CGE 7, 8 배아 개발하는 동안 서로 다른 시간에 걸쳐 태어난다. 이들과 다른 대뇌 피질의 GABA 성을 interneuron 마커는 이러한 하위 그룹 9-11의 많은 특정 Cre 호텔 드라이버 라인을 생성하는 데 사용되었다.
MGE 전구 세포의 이식은 불균형으로 인해 발생할 수 있습니다 질환을 치료하는 잠재적 인 세포 기반 치료로 떠오르고있다24 - 12 여기 / 억제한다. 이 치료 혜택이 많은 근교 체세포 억제 PV + 세포가 MGE에서 파생 된 (차별화와 호스트 뇌에 통합, 분산), 또는 잠재적으로 있기 때문에 MGE 전구 세포의 고유 기능에 부분적으로 기인 할 수있다. MGE 세포는 시험관 내에서 유 전적으로 변형되어 생체 내에서 세포를 연구 할 수 있도록 신속하고 효율적으로 이식하기 전에 15 렌티 바이러스 형질 도입 될 수있다. 이 방법을 개발하기위한 이론적 근거는 GABA 성 피질 interneuron 개발 및 성숙을 연구하는 장애물을 극복하고자 하였다. 특히, MGE 이식 돌연변이 마우스가 다른 방법으로는 초기 시점에서 사망 할 때 연구팀은 생체 내에서 돌연변이 세포의 개발을 연구 할 수 있었다. 더욱이, 이식 전에 관심 유전자를 도입함으로써, 변이 표현형 특정 유전자의 효과 EFF에서 평가 될 수있다icient 방법.
여기서는 이식 이전에 렌티 MGE 세포를 형질 도입하기 상세한 프로토콜을 제공한다. 또한, 우리는이 기술 치운다 의존성 발현 렌티 가능한 치운다 드라이버 마우스 라인의 조합을 사용하여, 피질 interneuron 전구체의 이종 그룹에서 특정 interneuron 서브 그룹에서 관심 유전자를 발현하도록 적응 될 수있는 방법을 보여준다. 유 전적으로 독특한 방식으로 생체 내 연구 GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구체를 수정하려면 또한,이 프로토콜은 기술과 연구자를위한 플랫폼을 소개합니다. 다른 현재의 접근법을 통해이 기술의 장점은 세포 이식 MGE 멀리 주사 부위에서 분산시키는 것이다. 또한, 초점 바이러스 주사와는 달리, MGE 세포가 분산 후 자신의 형태는 평가하기가 쉽습니다. 이 접근법은 특정 세포 유형을 도입, 돌연변이 또는 야생형 세포에 목적 유전자를 도입의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다기자는 생체 내에서 질병 대립 유전자의 효과를 연구하기 위해 잠재적 형태를 평가, 또는합니다.
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Protocol
윤리 문 : 다음 절차는 우리의 기관과 동물의 프로토콜에 의해 승인되었습니다. 실험을 시작하기 전에 생존 수술과 관련된 모든 절차에 대한 승인을 얻을 수 있는지 확인하고 모든 프로토콜이 최신 확인합니다.
1. 렌티 준비 (선택적 단계)
- 10 ㎖의 DMEM / 10 % FBS의 존재 하에서 제조 될 각 렌티 대해 HEK293T 세포 세 10cm 플레이트를 분할하고, ~ 60 % ~ 70 % 합류로 성장한다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포를 성장.
- 1.2 μg의 pMD2.G이 (VSV-G를 인코딩) 1.2 (표 1에서 제공하는 DNA 벡터 순서) 6.4 μg의 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스 벡터, 다음 어떤 형질 시약을 사용하여 각 플레이트에 DNA 플라스미드 (10 μg의 총) 형질 μg의 pRSV 반전, 1.2 μg의 pMDLg / pRRE을. 세 렌티 바이러스 벡터를 패키징 시판되고있다 (표
참고 :이 특정 접근 방식은 3 세대 lentivir을 활용알 벡터하지만 2 세대 벡터 및 관련 플라스미드도 작동합니다. - 연락 또는 렌티 바이러스가 포함 된 용액 또는 장치를 불 활성화 BSL2 인증 후드 내에서 10 % 표백제 용액을 함유 폐기물 용기를 준비합니다. 다음으로, 완전히, 표백제 용액에 형질 전환 후 용지를 4-6 시간을 제거 새로운 미디어의 동일한 볼륨으로 대체하고 세포 성장 할 수 있습니다.
- 15 분은 어떤 세포 파편 펠렛 4 일 후, 1000 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 미디어를 수집합니다. 다음으로, 0.45 μm의 멤브레인을 통해 뜨는을 필터링 할 수 있습니다. 부족한 단백질 결합 필터는 PVDF처럼 잘 작동합니다. 주의 : 표백제로 장소 모두 고체 및 액체 폐기물 바이러스.
- 로드 30 ml의 초 원심 분리기 튜브에와 초 원심 분리기로 상층 액을 여과. 4 ℃에서 2.5 시간 동안 100,000 XG에 원심 분리기. BSL2 후드에 원심 분리기 튜브를 열고 10 % 표백제에 뜨는을 제거합니다. 체육에 PBS의 ~ 100 μl를 추가1 × ^ 7-8 전염성 단위 / ㎖의 역가를 산출 llet. -80 ºC에서 다음 날 및 저장 나누어지는. 렌티 바이러스 씩 적어도 6 개월 -80 ° C에서 안정적이다.
- 중요한 고려 사항 : 많은 기관은 지금 바이러스 성 코어를 가지고있다. 최적의 결과를 위해 1 × 7 감염성 단위 / ml의 최소 역가, 농축 바이러스를 획득.
MGE 해부 2. 기부자 마우스
- 첫째, 관심 Cre 호텔 발현 라인과 야생형 (WT) 마우스 중 하나 또는 Cre 호텔 - 중재 재조합 후 기자를 표현하는 마우스 사이의 시간 제한 짝짓기를 설정합니다.
참고 : 많은 Cre 호텔 드라이버 라인은 형질 전환하고 유지 hemizygous 상태에서 자란있다. 따라서, 배아의 절반은 Cre 호텔의 형질 전환 유전자를 포함합니다. DNA 신속 Cre 호텔 대립 유전자를 검출하기위한 PCR 단편 배아로부터 제조 될 수있다. 원하는 유전자형 만 MGE 조직이 사용되도록 Cre 호텔 + 배아 후 수확 할 수있다. 교류 직류vely, Cre 호텔 의존 기자 MGE의 해부 및 이식 배아를 선택, 사용할 수있다. - E13.5에 해당되는 일 계산합니다. 동물 전에 저녁을 쌍으로 된 경우, 플러그의 날입니다 0.5입니다. 주문 시간이 초과 임신 쥐 또는 출생 후 (P)을 갖는 시간 순서대로 P1 새끼와 WT 여성 기증자의 조직 E13.5 될 일에 1 마우스. 또한, 기증자 동물 페어링하기 전에 일주 집에서이 교배를 설정합니다.
참고 : E13.5 및 P1 배아를 모두 생성하는 전 전략 / 같은 날에 대한 새끼가 안정적으로 수행하기가 어렵다.
미디어, 도구 및 장비 3. 준비.
- MGE 셀 준비 (표 2)의 시약과 도구를 준비합니다.
- 깨끗한 표면을 준비하고 표면에 깨끗한 집게, 가위 및 미세 수술 칼이나 미세 집게 중 (정확한 조직 해부)를 배치합니다.
- 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)를 준비, F해부하고, 전달 10 % 소 태아 슈어엠 (FBS)와 Dulbeco의 수정 독수리의 매체 (DMEM), 또는.
- 약 1 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 Preincubate 20 ~ 30 ml의 DMEM는 / 10 % FBS를. 뚜껑은 미디어의 가스 교환 및 산도 평형 수 있도록 느슨하게해야합니다.
주 : 미디어 예비 배양 단지 절개를 시작하기 전에 제조 될 수있다.
4. MGE 셀 준비
- 승인 동물 프로토콜에 따른 임신 마우스를 희생 빙냉 HBSS를 함유 10cm 페트리 접시에 배아를 제거한다.
- (한 번에 하나를 얼음처럼 차가운 HBSS에서 배아의 나머지를 떠나)을 해부하여 각 배아로부터 뇌를 제거하고 MGE 조직을 잘라 진행.
아래에 자세히, 그림 1, MGE를 제거하는 방법을 보여주는 주요 단계는 다음과 같습니다 있습니다. 또한,도 2는 전체를 나타내는 절개 영화이다절차.- (그림 1A, ')를 위로 향하도록 복부 측면과 뇌를 놓습니다. 주 : 등쪽면이 위를 향하도록하는 것도 괜찮습니다. 두 조각을 생성하는 져널면을 따라 반으로 자르고 뇌. 예를 hemisected 뇌는 (그림 1B, B '), 그 지느러미 (상부 피질)과 뇌 커버의 복부 측면을 감지하고 신경절 예하 (GE) 조직을 둘러싸고를받습니다.
- 비 지배적 인 손에 의해 개최 집게로 반구을 고정하는 동안 다음, 지배적 인 손으로, 매우 미세한 집게 또는 stabknife (표 2)를 누르고 있습니다. (반구의 안쪽면은 위로 향하도록해야한다). 기본 GE 조직 (그림 1C 그림 1C '에 도시)를 나타 내기 위해 지느러미와 복부 조직 집게와 자상 칼을 펼칩니다.
참고 : 해부 페트리 접시에서 일부 미디어를 제거하면 쉽게 체육 동안 조직을 안정화 할 수 있습니다MGE의 해부를 rforming. - CGE, LG 전자와 중격 조직을 분리하는 stabknife 또는 미세 집게로 직선 컷 확인 (빨간색으로 표시 참조 예를 인하 점선, '1D와 D도). 이러한 삭감은 임의의 순서로 이루어질 수있다.
주 : 주변 조직으로부터 잘라 '상자'로 MGE을 상상해보십시오. 이렇게하면 재현성 따라서 조직 해부의 변동성을 줄여, 각 해부 비슷한 컷을 만드는 데 도움이됩니다. - 마지막으로, 옆으로 MGE를 켜고 바닥 (뇌의 좌우 측면 무엇) 떨어져 트림. 이 MGE의 나머지 MGE의 맨틀 영역 (그림 1E 및 1E에 폐기 ') 제거합니다. MGE의 나머지 측면은 주로 심실 영역과 거의 모든 MGE의 전구 세포를 포함하는 MGE의 뇌실 영역 부분을 포함하고 있습니다. 이 조직을 진행합니다.
- 중요한 고려 사항 : 페트리 접시 캘리포니아의 바닥에 실리콘 겔의 추가이 집게의 섬세한 팁을 보호하고 집게로 조직을 달아 위해 부드러운 표면을 제공하기 때문에 n은 우수한 해부 표면의 역할을한다.
MGE 해부 4.3 추가 전략.
- 신속하게 뇌를 제거하기 위해 가위처럼 집게를 사용하여 태아의 피부를 잘라. 태아가 옆에 낳는다으로 조직을 고정하는 데 사용되는 집게로 머리의 바닥에있는 조직을 보유. 먼저, 뇌 뇌 후방 복부 앞쪽 복부 절단하고 배아의 두 측면을 따라 절단 연결한다. 그리고 피부의 플랩을 잡고 뇌의 맨 위에 당깁니다. 뇌는 신속하게 남아있는 조직에서 멀리 해부 할 수 있습니다.
- 또한, 피질 뒤에 뇌 전체의 후방 측면을 고정. 한편, 피질의 가장 지느러미 꼬리 측면에서 각각의 반구를 잡고 전방 방향으로 멀리 고정 된 조직에서 피질을 찢어. 이와 같이, 모두 Cortices 제거 할 수 있고, 양자 신경절 eminences 여전히 내측 측방 해부학 보존 조직의 나머지에 부착 드러난다.
- 자상 나이프로 전환 각 반구에 MGE 주위에 정확한 컷을 확인합니다. MGE 또는 큰 팁 피펫 (예., P1000)를 수집하기 위해 집게 별도의 깨끗한 세트를 사용합니다.
참고 : MGE가 수집 될 때 일부 미디어가 불가피 전송되면, 다른 모든 해부 물질로부터 멀리 수집 된 조직을 유지합니다. - MGE 모아서 DMEM / 10 % FBS를, (500 μL의 부피 MGEs를 수집하기에 충분하다)를 함유하는 1.5 ml의 수집 튜브로 조직을 넣어. 같은 포집 관의 다른 반구와 장소를 반복합니다. 모든 조직이 수집 될 때까지 얼음에 샘플을 유지합니다.
5. 렌티 바이러스 라벨 및 이식
- BSL2 인증 후드에 MGE 조직의 튜브를 이동하고 용지를 제거합니다.
참고 :MGE 티슈의 눈으로 확인할 수있는 상태로 냉 매체 쉽고 부드럽게 제거 할 수 있도록 튜브의 바닥에 침전 충분히 큰 것이다. - DMEM / 10 % FBS 미디어의 ~ 500 UL을 추가, 그는 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 미리 배양 하였다. 다음에, 8 ㎍ / ml의 최종 농도로 각 튜브에 전달을 용이하게하기 위해 폴리 브렌을 추가한다. P1000 피펫 팁을 사용하여, 단일 세포 현탁액을 만들 MGE 조직을 연화. 마지막으로 각 관에 ~ 집중 렌티 바이러스의 15 ~ 20 μl를 추가합니다.
- 중요한 고려 사항 : 10 ~ 12 배의 분쇄가 단일 배아 MGE 조직을 파괴하기에 충분하지만, 여러 MGEs 함께 풀링하는 경우 더 triturations이 요구 될 수있다. 가장 적합한 결정하기 위해 다른 분쇄 조건을보십시오.
- 안전하게 37 ° C 배양기에서 장소보다, 혼합 반전, 모든 튜브를 각 튜브를 닫습니다. 적어도 30 분 동안 1 시간까지 렌티에서 세포를 배양한다. 긴 시간은 드에 성공접혔 세포 생존. 시간이 다 될 때까지 튜브를 10 분마다 전환.
- 렌티 바이러스 배양 한 후, 세포 펠렛 3 분 ~ 700 XG에 인큐베이터와 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. BSL2 후드에서, 상층 액을 제거하고 10 % 표백제로 폐기합니다. 이어서, 1 ㎖의 DMEM / 10 % FBS를 추가 한 다음, 세척 펠릿 세포 다시 동일한 속도로 원심 분리하여 펠렛을 2-3 회 연화. 초과 바이러스를 제거하기 위해 세척 단계를 2 ~ 3 번 이상 반복합니다.
참고 : 짧은 스핀이 RT에서 수행 할 때 4 ° C에서 원심 분리 단계를 수행하지만, 감소 가능성은 관찰되지 않았다. - 최종 세척 후, 가능한 한 많은 미디어를 제거하고 얼음에 각 튜브를 넣어. 인해 튜브의 측면에 잔류 미디어, 미디어 ~ 2-3 μL는 이식 절차가 시작된 시간 세포 펠렛을 덮는 끝낼 것이다.
6. 이식 및 검증
- 호스트 P1 새끼를 획득 절차를 준비70 % 에탄올로 아래로 분사하여 지역. 절차를 수행하는 동안 무균 상태를 유지하기 위해서는 전용 청소 절차 룸에서이 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 또한, 사용 중 멸균 된 수술 도구는 새끼는 70 % 에탄올을 사용하여 접촉 표면을 소독한다. 이식 절차와 대표 영역을 수행하기 위해 필요한 장비의 대표적인 예는도 3에 도시된다.
참고 :이 절차는 소량의 주입, 그리고 절개, 아물지 않은 상처 또는 봉합을 필요로 수술이지만, 여전히 각 마우스를 주입하는 새로운 마이크로 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 마이크로 피펫을 뽑아 70 % 에탄올을 밀봉 된 용기에 저장되는 분무 된 표면 상에 경 사진 때 가열 멸균이다.
- 40-80 μm의 사이에 선단 직경으로 마이크로 피펫을 생성한다. 이러한 차원을 따르면 최적 얻을 것입니다결과. 열은 인출 할 때 마이크로 피펫을 소독하고 경 사진 표면과 밀폐 용기에 마이크로 피펫을 저장하기 전에 70 % 에탄올로 스프레이.
주 : (표 2)이 바늘을 만드는 데 필요한 장치에 대한 액세스가 제한되면 다른 방법으로, 임의의 다른 사출 장치를 사용한다. 그러나 이러한 다른 직경으로 인해 마이크로 피펫로 적합하지 않을 수 있습니다. - 1 ml의 시린지에 광유를 도출해 및 1/2 30 G 바늘, 광유 완전히 유리 피펫을 채운다. 다음으로, 플런저에 정위 장치와 부하에 유리 피펫을 첨부 한 후, 정위 장치에 플런저를 탑재합니다. 유압 드라이브를 사용하여, 깨끗한 깨끗한 종이 타월로 밖으로 유출 미네랄 오일을 제거, 유리 피펫에 대한 중간 플런저를 이동합니다.
- 대안으로 주사기를 사용하여, 미네랄 오일 피펫의 후단 잠수함과 모세관 현상에 의해 채워진. pipett에 공기 방울을 방지하기 위해즉, 유리 피펫에서 완전히 될 때까지 주사기에 긍정적 인 압력을 유지한다.
주 : 기타 장치 MGE 셀 (14)을 이식하기 위해 사용될 수있다. 이외의 제품을 사용하거나 절차도 100 NL 작품 근처에 볼륨이 적은 제공 할 수있는 모든 장치.
- 대안으로 주사기를 사용하여, 미네랄 오일 피펫의 후단 잠수함과 모세관 현상에 의해 채워진. pipett에 공기 방울을 방지하기 위해즉, 유리 피펫에서 완전히 될 때까지 주사기에 긍정적 인 압력을 유지한다.
- 좋은 점으로 꼬인 구석 섬세 MGE의 세포 펠렛 이상 초과 용지를 제거하여 다음, 멸균 종이 타월 또는 흡수 소재를 사용. 이 단계는 더 작은 주사 부피가 달성 될 수 있도록 셀 밀도를 집중한다. 그 다음, 천천히 세포 펠렛을 작성하여 소수성 표면 상에 세포 현탁액을 이동하기 전에 1-2 회 연화하기 (P2가 바람직하다) 피펫 낮은 볼륨을 사용한다. 볼륨이 바로 아래 1 μL해야합니다. 세포 현탁액 내로 바늘 끝을 이동하여 유압 구동을 이용하여, 피펫으로 세포 현탁액을 그린다.
- 저체온증을 통해 P1 강아지를 마취시키다 (라텍스 장갑에 감싸 ~ 얼음에 2-4 분을 넣어).유해 자극과 마취의 효과를 확인합니다. 미세 집게로 발가락 사이의 피부를 꼬집어 : 끼면 강아지가 응답해야합니다. 다음으로, 분사 장치 아래에있는 금형 위에 강아지를 배치 한 후 머리에 피부를 뒤로 당겨 및 표준 실험실 테이프를 확보하여 팽팽하게 피부를합니다.
참고 : 저체온증 신생아 마우스와 낮은 사망률의 결과에 매우 효과적이지만 새끼는 10 분에서 회복하기 시작으로, 절차는 신속하게 수행해야합니다. 또한, 얼음에 4 분 허용 될 수 있는지의 상한이다. 더 긴 시간이 주사가 필요한 경우 한 번만 저체온증을 유도하려고합니다. 강아지 조기 복구 경우, 먼저 강아지가 완전히 다시 저체온을 유도하기 전에 복구 할 수 있습니다. 더욱이, 단지 하나 저체온증에게 주사를 수행하는데 더 많은 시간을 유도한다. 새끼 저체온증의 5 ~ 10 분 이내에 복구합니다. 이 쓰레기와 엄마와 새끼를 배치하거나 따뜻한 SURFAC에 강아지를 배치하여 용이하게 할 수있다전자 복구합니다. - 정위 장치를 사용하여 헤드의 표면에 수직, 강아지의 머리 표면에 유리 피펫의 끝을 위치. 피펫은 머리와 접촉하는 경우, '0'으로 이것을 고려하십시오. 다음으로, 삽입 한 후, 피질에 피부와 두개골의 표면을 통해 피펫을 누르고 중지하기 전에 ~ 2 회를 피펫을 철회. 마이크로 피펫이 0.1 mm의 깊이 인 때 신피질 세포로 표적화 최적의 경우, 주사를 행한다. 그러나 이것은 사용자가 최적화되어야한다 (아래 주 참조).
참고 :이 깊이가 안정적으로 위에서 설명한 장치와 깊은 신피질 층을 대상으로하지만, 몇 가지 깊이는 경험적으로 결정 테스트해야합니다. 또한, 다른 rostro-꼬리와 메디 오 - 측면 위치에서 깊이의 범위는 각 사이트에서 최적의 어떤 깊이를 확인하기 위해 테스트해야합니다. 신피질에 느린 침투가 다 할 수있는 능력을 감소로 또한, 초기 구멍은 빠른해야leanly 조직을 침투. 먼저 가장 적합한 찾으려면이 절차를 시작할 때 다른 속도를보십시오. 염료의 위치를 표시하기 위해 신뢰할 수 있었다으로 또한, 테스트 좌표를 들어, 레이블 세포를 사용하는 실제 대체가 없습니다. - 바늘 위치에 오면, 피질에 세포 현탁액 세트 볼륨을 밀어 유리 피펫으로 플런저를 전진 회전 유압 장치. 사이트 당 50 ~ 70 NLS를 주입한다. 목표는 신피질에 걸쳐 세포의 넓은 분포를 얻을 경우 다른 주동이의 - 꼬리 수준에서 3-6 다른 사이트에서이 절차를 반복합니다.
참고 : 100 NL 이상의 볼륨은 병변의 원인이 효율적으로 주사 부위에서 마이그레이션 실패 주입 된 세포의 큰 덩어리로 이어질 수 있습니다. 따라서, 작은 주입 볼륨 (~ 70 NL 이하) 시간이 허락하면 더 많은 사이트를 통해 최적입니다. - 주입이 완료되면, 발가락 클리핑의 실체를 확인하기 위해 신뢰할 수있는 방법이다 (무대에서 강아지를 제거하고 표시UPS 이상). 강아지가 복구 자체에 이동 할 수 있습니다되면, 엄마와 쓰레기로 다시 넣어 (이 단계에서 제거 분 이내에 발생).
참고 :이 최소 침습적 절차이기 때문에 강아지가 자유롭게 이동하고 따뜻하게 한 번 더 수술 후 절차는 없습니다. 그러나, 새끼뿐만 아니라 절차뿐만 아니라 보장하기 위해 다음 날 후가 건강 악화의 징후가없는 확인해야합니다. - 다음에 강아지 절차를 시작하기 전에 무균 작업 영역을 유지하기 위해 70 % 에탄올로 영역을 스프레이. 주입 된 새끼가 개발 한 다음 적절한 발달 단계 (들)에서 조직을 평가하도록 허용합니다.
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Representative Results
MGE 세포가 이주와 호스트 신피질 (16)에 이식 될 때 통합하는 독특한 능력을 가지고 있기 때문에, 이들은 생체 내 시험 전에 유전자 조작에 대한 우수한 모델 시스템을 제공한다. 여기서, 우리는 하나의 E13.5 태아로부터 MGE 조직을 분리하는 방법을 보여준다 (도 1 및도 2) 다음, 시험 관내 또는 생체 내 연구에 이식하기 전에 신속하게 하나 렌티 바이러스로 형질 도입 될 수있다. 렌티 바이러스를 통해 레이블 MGE는 GABA 성 뉴런 (15)에 GFP를 구동 인핸서를 사용하기 전에 수행되었습니다. 이식이 크게 이러한 세포 '분산과 통합의 연구를 도움이 될 수 전에 그러나, 능력은 이기종 인구의 특정 하위 그룹의 유전자를 표현. 여기서, 우리는 특정 서브 그룹 interneuron (SST) + 소마토스타틴을 발현있는 것에 형광 단백질의 발현을 대상으로하는 방법을 개발하기 위해 노력했다.
우리는 Fi를RST는 렌티 바이러스 골격 내로 시판 치운다 종속 GFP 리포터 (벡터 정보, 표 2)를 서브 클로닝. 벡터 (이 카세트에만 CAG 프로모터의 일부를 포함) 제 AAV 벡터로부터에 loxP 부위에 의해 측면 GFP를 함유하는 카세트를 클로닝 및 XbaI로하고 PflMI 제한 부위를 사용하는 렌티 바이러스 벡터의 백본 (15)로 결찰에 의해 생성 하였다. 다음에, CAG 프로모터의 나머지를 SpeI 및 XbaI로 사이트와는 pCAGGS 포유 동물 발현 벡터로부터 절제 및 pLenti-CAG 플렉스-GFP를 생성하는 렌티 바이러스 벡터는 XbaI 부위에 결찰시켰다. 5 '인서트를 SpeI 사이트를 XbaI에 무료이며, 따라서 5 파괴'3 '를 XbaI 사이트를 보존하고있는 동안이 사이트를. 생성 된 벡터 (스키마도 4a, 벡터 순서 표 1) 제 Cre 호텔 (시험 관내 분석의 스키마,도 4b)의 존재 또는 부재하에 시험 관내에서 시험 하였다. MGE Ai14 플록스 / + E13.5 배아에서 차 신경 세포 배양 및 렌티 바이러스의 조합으로 형질 도입했다. 아니 GFP + 또는 tdTomato + 세포에 몇 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스 (그림 4C, 4 층과 4I) 만 전달 관찰되었다. TdTomato 형광은 CMV-Cre 호텔 렌티 바이러스, Cre 호텔 표현을 나타내는 (그림 4D, 4G 및 4J) 형질 도입 MGE 세포에 존재했다. 마지막으로, MGE 세포의 공동 형질는 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스 예상 (그림 4E, 4H 및 4K)로 일하고되었음을 나타내는 또한 GFP를 표명 많은 tdTomato + 세포에서 발생했습니다. 일부 드문 GFP + 세포가 관찰되었다 그 사람이 아닙니까 tdTomato +, 형질 기자가 다음의 모든 GFP + 세포의 <2 %를 차지 강한 프로모터에 통합 잠재적으로 인해.
콘텐츠 "호스트 신피질, 성숙한 분산 호스트 신피질 16 E13.5 SST-IRES-Cre 호텔 +에 통합 야생형에 이식> MGE 세포;. Ai14 플록스 / + MGE 세포 P1에서 WT의 neocortices에 이식 (스키마, 그림 5A)과 그 분포가 7 삼십오일 후 이식 (DPT). 모두 나이에, tdTomato + 세포 신피질 (그림 5B 및 5C)를 통해 볼 수 있었다에서 살펴 보았다.도 5B 및 5C의 이미지는 MGE를 사용하는 대표적인 이식은 . 하나의 배아에서 세포는 SST-IRES-Cre 호텔 +에서, 여기에 MGE 세포를 설명하는 프로토콜을 표시 할 수있는 방법을 효율적으로 MGE 세포를 테스트하려면, Ai14 플록스 / + 배아는 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스로 형질과에 이식 conce의 동일한 방법.이 실험의 경우, 15 ~ ULntrated 렌티 바이러스는 (~ 1 × 7 전염성 단위 / ml)를 각각 이식 한 배아에서 결합 MGEs로 사용 하였다. 세포를 P1 WT 호스트 피질에 이식 7 DPT (도 5D-5F)에서 분석 하였다. 이식 된 세포 (tdTomato +)로, 약 20 %는 플렉스 CAG-GFP 렌티 (도 5G)로 형질을 나타내는, GFP의 +이었다. 이러한 데이터는 렌티 바이러스의 양과 역가 상술 함께 ~ MGE 이식 세포의 20 %를 표시 할 수 있음을 시사한다. 바이러스의 양을 증가 또는 감소하거나, 또는 바이러스의 배양 기간 같은 잠재적으로는 다른 변수 또는 밀도가 성긴 셀 라벨링을 달성하기 위해, 변경 될 수있다.CAG 플렉스-GFP의 렌티 바이러스와 함께 치운다 종속 리포터 마우스 라인으로부터 MGE 조직을 사용하여 면역 형광에 의해 프로브 할 수있는 추가 마커의 수를 제한 할 수있다. 따라서, SST-IRES-Cre 호텔 + < / SUP> E13.5 MGE 조직 수집 먹어 치운다을 표현 그 이식 MGE 세포를 시각화하기 위해 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스로 형질 도입 된 (GFP의 +됩니다). 이러한 세포 P1 WT 피질에 이식하고 35 DPT (실험 설계,도 6a 참조), 성숙한 interneuron 마커가 발현되는 시점에서 평가 하였다. 35 DPT에서 ~ GFP + 세포의 85 %는 SST를 발현 공동, 만 ~ 4 %는 PV (그림 6B-6H)를 표명했다. 이 번호는 매핑 또한 운명 SST-IRES-Cre 호텔 마우스 라인의 혈통 분석과 일치에 ~ PV + 세포 구 (보그와 루벤스 타인, 게시되지 않은 결과)의 5 ~ 10 %. 이러한 데이터는 MGE의 바이러스 라벨이 효율적이고 생체 분석하기 전에 기자 또는 잠재적으로 관심의 유전자를 도입에 대한 적용 방법이 될 수 있음을 시사한다.
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차 문화 또는 이식 중 하나에 대한 MGE 조직의 E13.5 MGE 조직. 예 절제술의 해부 그림 1. 대표 절차. E13.5 뇌 해부의 (AE) 이미지, 및 (A'-E ') 구조를 강조 회로도 및 절차. (A, A ') 대표 E13.5 뇌의 중요한 단계는 복부 측면에서 볼. 레드 라인은 두 가지. (B, B ') 뇌의 반 절단보기로 뇌를 hemisect됩니다 만든 첫 번째 컷을 의미한다. 안쪽면은 아래로 측면 측면으로 볼 수있다. 등의 피질 (파란색)에서 조직은 신경절 eminences을 덮는다. 또한, 제거됩니다 복부 조직은 주황색으로 표시됩니다. (C, C ')보기 및 조직 위에 놓인 후 노출 된 신경절 eminences의 그림 박리하고있다. (D, D') 노출 신경절 EMI의 동일보기 (C, C ')뿐만 빨간색으로 표시 상세 용접 사이트와 같은 nences는 점선. MGE는 (D, D ')에 표시된 선에 따라 절단 한 후 (조직을 옆으로 E, E되어)'과 측면 측면은 다듬어 및 삭제됩니다. MGE 조직의 절개 및 격리에 대표 단계. 약어 : (CGE) 꼬리 신경절 예하 (LG 전자) 측면 신경절 예하 (MGE) 내측 ganglionice 예하. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 영화는 E13.5 MGE 절제술을 표시합니다. 영화는 이후의 전개와 상부 조직의 제거하여 E13.5 두뇌의 제거를 보여줍니다. MGE는 표지와 주변 조직을 제거하기 위해 만든 상처는 단계적 순서로 표시되어 있습니다.. MGEdissect의 movie.mov "대상 ="_ 빈 ">이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대표 절차 영역과 신생아 이식에 대한 주사 바늘의 예. (A, A ') 신생아 쥐에 이식을 수행하는 예제 설정을 보여주는 이미지. 현미경 (1) 신생 마우스 (5)와 보유 정위 장치의 영역을 도시 한 정위 장치 (154). (A ')의 확대 된 이미지를 (A) 수납 할 수있는 금형을 포함하는 스테이지 상에 위치되고 삽입 된 플런저 유리 주사 바늘 (6) (7). 플런저 (4) 미세 유압 구동에 의해 제어되고 바늘에서 내측 및 외측 유동 매개 유리 바늘 광유 내를 이동한다. 유리 주사 바늘의 (B) 예를 경사 팁. 의 통치자 (B), 각 주요 경계 = 100 μm의하십시오.에 나타난 항목의 (C) 재고 목록 (A, A '). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 시험 관내 시험은 Cre 호텔의 존재 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스에서 GFP의 발현을 보여줍니다. 렌티 바이러스 CAG 플렉스-GFP 벡터 Cre 호텔의 존재에서 작동하는 방법의 (A) 스키마. (B) 스키마 렌티 바이러스 CAG 플렉스-GFP가 Cre 호텔 식 이들 세포에서 GFP를 표현하면 차 MGE 세포 배양 실험의 평가입니다. 간단히, Cre 호텔 의존 기자의 MGE 세포는 Ai14는 크롬 (Cr의 존재에 tdTomato을 표현E), 체외에서 성장 먹어 치운다 및 / 또는 Flex-GFP 렌티 바이러스. (CK) CMV-Cre 호텔, CAG 플렉스-GFP 또는 둘 모두 형질 도입 된 E13.5 MGE 차 문화의 면역 형광 이미지로 형질 도입되었다. 문화는 기본 tdTomato 표현, GFP 및 DAPI에 대한 몇 군데 있었다. (K)의 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
+ 이식 및 형질 도입,-Cre 호텔 SST-IRES 그림 5. 대표 이미지; Ai14 플록스 / + MGE 세포. (A) 실험 설계의 스키마는 혼자 또는 야생 타입으로 렌티 바이러스 전달 (WT) 호스트 (DPT) 일 이내에 MGE 세포를 이식하는 포스트 이식. 간단히, E13.5 SST-IRES-Cre 호텔 +;.의 Ai14 플록스 / + MGE 세포 중 하나를 이식 또는 중량 neocortices에 이식하기 전에 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스로 형질 7 DPT에서 평가 하였다 (B, C) 면역 형광 이미지 대표 MGE 이식 된 세포 (tdTomato +)를 보여주는 7 또는 35 DPT에서 neocortices. (DF) 7 DPT에서 평가 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스로 형질 MGE 세포의 면역 형광 이미지. (G) tdTomato + 세포의 비율의 정량화 그 7 DPT에서 GFP를 표현한다. (C)와 (F) = 100 ㎛의 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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E13.5의 CAG 플렉스-GFP의 렌티 바이러스의 그림 6. 대표 이미지 SST-IRES-Cre 호텔 MGE 파생 interneuron 하위 그룹 마커를 특급 공동 + MGE 이식, 형질 도입. (A) 스키마 SST-IRES-Cre 호텔 + MGE 세포 수확 35 DPT에서 평가 전에 P1 WT 호스트의 신피질에 CAG 플렉스-GFP의 렌티 바이러스 및 이식 전달. 플렉스 벡터 (B, E)에서 GFP의 발현을 보여주는 이식 호스트의 신피질에서 대표 이미지는, (D, G). 소마토스타틴 (SST) (C) 또는 parvalbumin (PV) (F) 중 하나에 대한 공동 스테인드 합병 이미지 공동 염색 DAPI와 함께. 공동 명시 SST 또는 PV를 GFP 세포의 비율 (H) 부량. 데이터는 ± SEM (n은) 3. 스케일 (G) 바 = 100 μm의 = 나타냅니다./52740fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
pLentiviral - CAG 플렉스-GFP DNA 벡터 표 1. FASTA 파일.
| MGE 세포의 준비와 전달을위한 시약 및 장비 | 카탈로그 번호 | 회사 | ||||||
| 1) | 높은 포도당 둘 베코의 수정 이글 중간, | 12491-015 | Life 기술 | |||||
| 2) | 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 | 10437-077 | Life 기술 | |||||
| 3) | 행크스 균형 염 용액 (HBSS), 더 칼슘 또는 마그네슘 없다 | 14170-112 | Life 기술 | |||||
| 4) | 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 (또는 다른뚜껑 수집 튜브) | 3810X | 에펜 도르프 국제 | |||||
| 5) | 폴리 브렌 | SC-134220 | 기도 Santacruz 생명 공학 | |||||
| 6) | 찌르기 칼 똑바로 22.5 ° (선택 사항) | REF 72-2201 | 외과 전문 기업 | |||||
| 7) | 조직의 해부에 대한 페트리 접시 (10cm) | FB0875713 | 피셔 과학 | |||||
| 8) | 뒤몽 # 5 추천 미세 팁 포셉, | 11254-20 | 파인 과학 도구 | |||||
| 9) | 5 % CO 2 입력 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 | C150 | 바인더 | |||||
| 10) | 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 회전 할 수 있습니다 탁상 원심 분리기 | |||||||
| 11) | 세포 분쇄에 사용할 수있는 상관 P1000 피펫 | |||||||
| 12) | 바이오 안전성 수준이 후드 | |||||||
| 체외 MGE 차 배양을위한 시약 및 장비 | 카탈로그 번호 | 회사 | ||||||
| 1) | 랩 TekII 잘 커버, 8 chamberslides | 154941 | 써모 피셔 | |||||
| 2) | 폴리 -L- 라이신 0.1 % 중량 / 부피 | P8920 | 시그마 알드리치 | |||||
| 3) | 마우스 라미닌, 0.5 ㎎ / ㎖ | 23017-015 | Life 기술 | |||||
| 4) | 로 Neurobasal 매체 | 21103-049 | Life 기술 | |||||
| 5) | B27 혈청 무료 보충 | 17504044 | Life 기술 | |||||
| 6) | 루타, 100 배 재고 | 35050-061 | Life 기술 | |||||
| 7) | 페니실린 - 스트렙토 마이신, 100 배 재고 | 15070-063 | Life 기술 | |||||
| 8) | 포도당, (물 중 25 % 용액을 조제) | G5400 | 시그마 알드리치 | |||||
| MGE 세포 이식을위한 시약 및 장비 | 카탈로그 번호 | 회사 | ||||||
| 1) | 1 ML의 주사기 | REF 309602 | BD 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) 및 회사 | |||||
| 2) | 30 1/2 G 바늘 | 305106 | BD 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) 및 회사 | |||||
| 3) | 사전정밀도 범위 보어 5 μl를 제공하기 위해 (플런저와 함께 제공) | 5-000-1005 | Drummond는 과학 회사 | |||||
| 4) | 파라 필름 | PM-999 | Polysciences, 주식 회사 | |||||
| 5) ** | boomstand 스테레오 현미경 | MZ6 | 라이카 | |||||
| 6) ** | 단지 마우스 정위 악기 디지털 | 51725D | Stoelting 기업 | |||||
| 7) ** | 단일 축 유압 미세 미세 조작기 | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | 다이아몬드 코팅 회전 beveler | NA | 집에서 만든 | |||||
| 9) | 니들 피펫테 풀러 | (730) | KOPF 악기 | |||||
| 10) | 광유 | NA | 모든 약국 또는 약국 | |||||
| 11) | 측정을 볼륨의 1 μl를 reliaby 수있는 모든 피펫 팁 | |||||||
| **이 우리가 사용하는 특정 모델이지만, 다른 많은 설정 작업을해야합니다 | ||||||||
| Optiona(렌티 만들기위한) L 시약 | 카탈로그 번호 | 회사 | ||||||
| 1) | 25mm, 0.45 μm의 필터 | 09-719B | 피셔 과학 | |||||
| 2) | 울트라 클리어 원심 분리기 튜브 (25 X 89mm) | 344058 | 베크 Coulter® | |||||
| 3) | 리포 펙 타민 2000 | (1.5 ml의 크기) | 11668019 | 인비 트 로젠 | ||||
| 다른 시중에서 판매하는 공급 | 카탈로그 번호 | 회사 | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE을 플라스미드 인코딩 개그 / 폴 | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV 반전 플라스미드 인코딩 레브 | 12253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G 플라스미드 부호화 VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV 플렉스-GFP | 28304 | Addgene | |||||
시약 및 도구 표 2. 재고 목록. 이식과 DNA 벡터에 대한 미디어, 해부 도구, 대표 장비를 포함한 시중에서 판매하는 시약의 재고. (NA)를 사용할 수 없거나 해당 사항 없음.
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Discussion
세포 기반 치료를위한 배아 신경절 eminences (GE 나)에서 GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구체의 사용은 많은 조건 (12) -1 4 약속을 보이고있다. 정확한 분자 기법을 추적하고, 특정 interneuron 하위 그룹에 대한 관심의 유전자를 표현하기 위해 필요하다. 여기에서 우리는 이식하기 전에 렌티 바이러스로 배아 MGE 세포를 라벨에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고이 기술은 생체 분석을위한 특정 대뇌 피질의 interneuron 하위 그룹에 대한 관심의 유전자를 표현하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
본원에 기재된 프로토콜은 확실하지만, 최적의 재현성이 중요한 몇 단계에 부착하는 것이 필수적이며, 사용할 수있다. 바이러스의 형질 도입 효율성을 높일 수 먼저, 생리 학적 온도 및 pH는 필요하다. 이들 파라미터가 충족되면 MGE 세포 ~ 30 분 형질 도입 될 수있다. 둘째, 진행하기 전에 치밀한 MGE 펠렛을 가지고 있는지 확인하십시오이식을 할 수 있습니다. 제한된 볼륨이 손상을 초래하지 않고 각 사이트 신생 마우스의 뇌에 주입 할 수있어, 세포가 떨어져 주사 부위에서 이동되므로, 이식시의 그들의 밀도가있을보다 우려 작 때문에 중요 예상. 마지막으로, 깊이가 최적의 무엇을 주입 결정하는 형광 기자를 표현 MGE 세포와 몇 가지 테스트 조건을 실행합니다. 이 프로토콜은 MGE 세포를 사용하는 동안, CGE 세포는 또한 동일한 방식으로 사용될 수있다. 한가지 단점은 전체 CGE 또는 CGE 유래의 interneurons의 특정 서브 그룹에 많은 제한을 발현 치운다 드라이버 라인이 없기 때문이다. 그러나, 혈관 활성 장내 펩티드 (VIP) 9 CGE 유래 세포의 서브 그룹들을 분리하는 데 사용될 수있는 신뢰성있는 치운다 라인이다. 새로운 라인을 사용할 수있게되면, 그것은 유전 적 정밀이 프로토콜을 사용하는 것이 가능합니다.
이전에, 우리와 다른 사람들이 보여이러한 기술은 생체 분석을 위해 유전자 도입에 효과적이지만. 전기를 통해 또는 렌티 바이러스 (15), (17) 이식 전에 MGE 세포에 유전자를 도입하는 유틸리티는 MGE 조직은 이질적인 여러 interneuron 하위 그룹에 상승뿐만 아니라 비 신경 세포를 제공합니다 4. 또한, 단지 특정 interneuron 서브 그룹에서 관심 유전자를 발현하는 것은 곤란 하였다. 장족의 발전을 포함한 많은 대뇌 피질의 interneuron 하위 그룹의 발현 패턴을 요점을 되풀이 형질 전환 라인을 생성하기 위해 만들었지 만, D VIP-Cre 호텔 9 SST-IRES-Cre 호텔, PV-IRES-Cre 호텔, PV-2A-Cre 호텔, 제한되지 않은 -11, 새로운 라인의 출현은 미래에 추가 가능한 개체군 해명 도울 것이다. 또한, 종속 치운다 기자 본원에서 사용 치운다 종속 리포터 벡터를 포함한 발현 벡터의 생성과, 관심 유전자의보다 정확한 표현이 달성 될 수있다.
이 기술에 대한 하나의 제한은 하나가 안정적으로 렌티 바이러스 벡터에 패키징 할 수있는 조각의 크기 일 수있다. 또한,이 방법은 아직 AAVs 테스트되지 않았습니다. 이 기술은 개인이 최적화되면 그러나,이 방법의 다양한 변형이 사용될 수있다. 첫째, 접근 방식은 연구자가 특정 Cre 호텔 드라이버 라인의 MGE 공여 세포와 함께 Cre 호텔 의존 기자 렌티 바이러스를 사용하여 기자를 표현 할 수 있도록 여기에 설명. 이 기술은 개인 MGE 세포의 형태를 평가하기 위해 이용 될 수 있거나, 제 유전자는 벡터로 클로닝하는 경우 잠재적으로 상이한 서브 그룹들에 대한 관심을 표현하는 유전자. 둘째, 또한 리포터 MGE 공여체 세포 또는 potentia 치운다 의존적으로 치운다 발현하는 바이러스를 사용하는 것이 적합 할 수있다에서야 이기종 인구에서 세포의 고유 한 인구의 발현을 구동하기 위해 보존 DNA 요소, 프로모터 및 증강을 진화 활용합니다.
인간 유래로 유도 된 다 능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포를 라벨링한다 극복 미래 장애물은 잠재적으로 정화 및 / 또는 세포의 특정 그룹을 연구한다. 흥미롭게도, 보존 DNA 증진제는 또한 피질 내로 주입 한 후, 차 배양에서 GABA 성 뉴런을 대상 바이러스 발현 시스템에서 사용될 수 있고, MGE 세포를 이식하기 전에 15, 18, 19. 인핸서는이 장애물에 대답 할 수있다되고 새로운 기술은 치료에 이러한 세포의 유용성을 연구하는 데 필요한 분자 도구와 같은 관심. 실제로, 발견 증강에 진출 잠재적 글루타메이트 신경 세포 (21)를 포함하여, GABA 성에서의 interneurons (20) 또는 다른 신경 하위 유형 중 하나를 레이블 수있는, 진행 중이다. 본원 바이러스 표식 방법을 사용하여,그것은 이식하기 전에 생체 분석에 관심이 별개의 셀에 레이블을 세포 형 특정 증강과 차별화 된 인간 유래 줄기 세포를 형질 도입하는 것이 가능할 수있다.
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Acknowledgments
이 작품에서 JLRR하는 보조금에 의해 지원되었다 : 자폐증은 언어, 니나 아일랜드, 웨스턴 항구 '재단, NIMH R01 MH081880 및 NIMH R37 MH049428을. PRW는 대만의 국립 과학위원회에서 친교에 의해 지원되었다. SFS는 F32 (MH103003)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
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